JP6213461B2

JP6213461B2 - ウイルス様粒子およびその調製プロセス

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Publication number: JP6213461B2
Application number: JP2014509577A
Authority: JP
Inventors: ルクレール、デニス; サヴァード、ピエール
Original assignee: フォリアバイオテックインコーポレイテッド
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-01
Publication date: 2017-10-18
Anticipated expiration: 2032-05-01
Also published as: WO2012155261A1; NO2800866T3; US20140255439A1; EP2707480A4; JP2014514350A; EP2707480B1; EP2707027A1; MX2013013228A; JP2014519817A; CA2835967A1; WO2012155262A1; CA2835972A1; DK2707480T3; US20140154288A1; JP6093926B2; CN103648528A; EP2707027A4; BR112013029143A2; CN103687942A; EP2707480A1

Description

本発明は、アジュバントおよび免疫調節剤の分野に関するものであり、特に、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびＶＬＰの調製方法に関するものである。

パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が有する抗原の免疫原性を高める能力が、下記の特許および特許出願に記載されている。

米国特許第７，６４１，８９６号明細書（特許文献１）、カナダ特許出願第２，４３４，０００号明細書（特許文献２）、および国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５号明細書（国際公開第２００４／００４７６１号パンフレット）（特許文献３）には、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来のＶＬＰを、動物において抗原に対する免疫応答を増強するために使用することが記載されている。前記抗原（１以上）は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは、前記抗原を、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）（特許文献４）には、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶＶＬＰをベースとする、インフルエンザワクチンが記載されている。前記ワクチンは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶＶＬＰと、１以上のインフルエンザ抗原とを含有している。前記インフルエンザ抗原は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）（特許文献５）には、ＰａｐＭＶをベースとする、免疫原性を有する親和性により複合体化された抗原系が記載されている。この出願には、外被タンパク質と、対象とする抗原に結合可能な複数の親和性ペプチドとの融合物が記載されている。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）（特許文献６）には、チフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉ）および他の腸内細菌性病原体に対するＰａｐＭＶベースのワクチンが記載されている。前記ワクチンは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶＶＬＰと、１以上の腸内細菌性抗原とを含有している。前記腸内細菌性抗原は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット）（特許文献７）には、ＰａｐＭＶ成分と１以上の抗原とを含有する多価ワクチン、ならびに、ある病原体の複数の株または１を超える病原体に対する防御を提供するための前記ワクチンの使用が記載されている。前記ワクチンは、サルモネラ菌種のポリン成分を任意に含むことができる。

単離したＰａｐＭＶ外被タンパク質からのＰａｐＭＶＶＬＰの調製が、これまでに記載されている。最初に、ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＢａｎｃｒｏｆｔ（１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０：３６−４６＆１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０：４７−５３（非特許文献１））は、単離したＰａｐＭＶ外被タンパク質およびＰａｐＭＶＲＮＡのインビトロでの自己集合によるＰａｐＭＶＶＬＰの調製を記載した。これらの実験で使用されたＰａｐＭＶ外被タンパク質調製物は、ＰａｐＭＶから単離したものであり、その大部分が、当該タンパク質の多量体型（３Ｓ、１４Ｓ、および２５Ｓで沈降）であった。これらの１以上が、ＶＬＰ形成の開始に必須であると考えられた。Ｓｉｔ，ｅｔａｌ．（１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９：２３８−２４２（非特許文献２））によるその後の研究で、ＰａｐＭＶゲノムの最初の３８個〜４７個のヌクレオチドが、集合の開始に必要であることが証明され、さらに、開始複合体は、１４Ｓの重合体種を必要とすることも提唱された。

その後、ＰａｐＭＶＶＬＰは、大腸菌内に発現させたＰａｐＭＶ外被タンパク質の単量体型から調製可能であることも明らかになった。組換え外被タンパク質は前記菌体内で自己集合し、前記菌体の破砕によりＶＬＰを単離でき、次いで、界面活性剤処理を含む、数回の精製工程が行われる（Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．２００６，ＦＥＢＳＪ．，２７３：１４−２５（非特許文献３）；国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）（特許文献８）、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）（特許文献９）、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）（特許文献１０）、および国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット）（特許文献１１）参照）。

この背景情報は、出願人が本発明に関連する可能性があると考える情報を明らかにするために提供するものである。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術であることを必ずしも認めるものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

米国特許第７，６４１，８９６号明細書カナダ特許出願第２，４３４，０００号明細書国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５号明細書（国際公開第２００４／００４７６１号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット

ＥｒｉｃｋｓｏｎａｎｄＢａｎｃｒｏｆｔ，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０：３６−４６＆１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９０：４７−５３Ｓｉｔ，ｅｔａｌ．，１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９：２３８−２４２Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．２００６，ＦＥＢＳＪ．，２７３：１４−２５

本発明は、パパイヤモザイクウイルス様粒子およびその調製プロセスの提供を目的とする。

本発明の一態様では、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するためのインビトロプロセスであり、ａ）組換えポテックスウイルス外被タンパク質とｓｓＲＮＡとを組み合わせる処理を、重量比で約５：１〜５０：１のタンパク質対ＲＮＡ比率（タンパク質：ＲＮＡ）で、約６．０から約９．０のｐＨ、約２℃から約３７℃の温度で、ＶＬＰの集合に十分な時間行う工程と、ｂ）前記ＶＬＰをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているＲＮＡを除去する工程と、ｃ）前記ＶＬＰを、他のプロセス成分から分離する工程とを含む、インビトロプロセスが提供される。

別の態様によれば、本発明のプロセスによって調製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

別の態様によれば、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰを含む医薬組成物が提供される。

別の態様によれば、アジュバントとして使用するための、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰが提供される。

別の態様では、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するために使用される、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰが提供される。

別の態様では、１以上の抗原と組み合わせてワクチンとして使用される、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰが提供される。

別の態様によれば、医薬品の製造における、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰが提供される。

別の態様によれば、対象における抗原に対する免疫応答を高める方法であり、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰを含むアジュバントを前記対象に投与することを含む方法が提供される。

別の態様によれば、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減する方法であり、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰを前記対象に投与することを含む方法が提供される。

別の態様によれば、対象における免疫応答を刺激する方法であり、本発明のプロセスによって調製されたＶＬＰを１以上の抗原と組み合わせて前記対象に投与することを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

本発明の別の態様では、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む医薬組成物であり、かつ、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、医薬組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、アジュバントとして使用するためのパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

本発明の別の態様によれば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するために使用される、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

本発明の別の態様によれば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、１以上の抗原と組み合わせてワクチンとして使用するためのパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

本発明の別の態様によれば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む、医薬品の製造におけるパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における抗原に対する免疫応答を高める方法であり、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むアジュバントを前記対象に投与することを含み、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減する方法であり、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を前記対象に投与することを含み、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における免疫応答を刺激する方法であり、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、１以上の抗原と組み合わせて前記対象に投与することを含み、前記ｓｓＲＮＡが、約５０ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、配列番号５もしくは６に示す核酸配列に対応する配列またはそのフラグメントを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するためのインビトロプロセスであり、ａ）組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質とｓｓＲＮＡとを組み合わせる処理を、重量比で約５：１および４０：１のタンパク質対ＲＮＡ比率（タンパク質：ＲＮＡ）で、約６．５から約８．５のｐＨ、約２２℃から約３７℃の温度の緩衝液中で、ＶＬＰの集合に十分な時間行う工程であり、前記組換えＰａｐＭＶが、主として２０量体未満の低分子量種の形態にある工程と、ｂ）前記ＶＬＰをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているＲＮＡを除去する工程と、ｃ）前記ＶＬＰを、他のプロセス成分から分離する工程を含む、インビトロプロセスが提供される。

本発明のこれらおよびその他の特徴は、添付図面を参照する以下の詳細な説明により、より明らかとなる。

図１において、（Ａ）は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、（Ｂ）は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。

図２において、（Ａ）は、改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸配列（配列番号３）を示し、（Ｂ）は、改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＰａｐＭＶＣＰｓｍのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

図３は、本発明の一実施形態によるインビトロ集合ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰの調製工程を概説したフローチャートである（ｒＣＰ＝組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質；ＳＲＴ＝合成ＲＮＡ鋳型；ｒＶＬＰ＝組換えＶＬＰ）。

図４は、本発明の一実施形態によるインビトロ集合ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰの調製工程を概説したフローチャートである（略語は図３と同じ；ｐｒＣＰ＝ｒＣＰをコードするプラスミド）。

図５は、本発明の一実施形態によるインビトロ集合ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰの調製工程を概説したフローチャートである（略語は図４と同じ）。

図６は、本発明の一実施形態によるインビトロ集合ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰの調製工程を概説したフローチャートである（略語は図４と同じ；Ｅｃ．ｐｒＣＰ＝ｒＣＰをコードするプラスミドを含む大腸菌；Ｅｃ．ｐＳＲＴ＝ＳＲＴをコードするプラスミドを含む大腸菌）。

図７において、（Ａ）は、本発明のプロセスの一実施形態で使用される合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）の配列［配列番号５］、（Ｂ）は、本発明のプロセスの別の実施形態で使用される合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）の配列［配列番号６］を示す。ＡＴＧコドンは全て、ＴＡＡ終止コドン（太字）へと変異させている。最初の１６個のヌクレオチド（下線）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ発現ベクター内に位置するＴ７転写開始部位から開始している。配列は、ｒＶＬＰの集合のためのＰａｐＭＶ核形成部位を含む（（Ａ）において四角で囲んでいる）。

図８において、（Ａ）は、ｓｓＲＮＡと共に自己集合させたＰａｐＭＶＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｄｓＲＮＡ）と共に自己集合させたＰａｐＭＶＶＬＰの電子顕微鏡写真である。

図９は、ＰａｐＭＶＶＬＰがインフルエンザ感染を制御する抗ウイルス応答を誘導することを実証する結果を示している。（Ａ）は、ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ、６０μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ、３μｇのｓｓＲＮＡ、３μｇのｐｏｌｙＩ：Ｃ、６０μｇのＰａｐＭＶＣＰモノマー、またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）を鼻腔内投与し、２００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジしたＢａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）の体重低下を示す。（Ｂ）は、感染中にマウスに生じた症状の概要を示す（症状０：症状なし、１：軽い毛の逆立ち、若干の背の湾曲。２：毛の逆立ち、背の湾曲。３：毛の逆立ち、背の湾曲、動作困難、および軽い脱水症状。４：毛の逆立ち、背の湾曲、動作困難、重篤な脱水症状、閉眼、および眼から分泌物）。

図１０は、ＰａｐＭＶＶＬＰ（６０μｇ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１５μｇ）、またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）を鼻腔内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中におけるＩＰ−１０（Ａ）およびＩＬ−９（Ｂ）の存在を示すグラフである。各点は、各マウスで検出されたサイトカインのレベルに対応する。同マウスから採取した鼻咽頭洗浄液（「ＬＮＰ」）に存在するＩＰ−１０またはＩＬ−９の量も、あわせて示している。

図１１ａ−ｃは、ＰａｐＭＶＶＬＰ（６０μｇ）またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）の１回または２回鼻腔内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中における、（Ａ）ＭＩＰ−１α、（Ｂ）ＭＩＰ−１β、（Ｃ）ＭＩＰ−２、（Ｄ）ＫＣ、（Ｅ）ＴＮＦ−α、（Ｆ）ＲＡＮＴＥＳ、（Ｇ）ＶＥＧＦ、（Ｈ）ＭＣＰ−１、（Ｉ）ＩＰ−１０、（Ｊ）ＩＬ−１７、（Ｋ）ＩＬ−１３、（Ｌ）ＩＬ−１２（ｐ７０）、（Ｍ）ＩＬ−９、（Ｎ）ＩＬ−６、（Ｏ）ＩＬ−１α、（Ｐ）ＩＬ−１β、（Ｑ）ＧＭ−ＣＳＦ、および（Ｒ）Ｇ−ＣＳＦの存在を示すグラフである。各点は、各マウスで検出されたサイトカインのレベルに対応する。

図１２は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ（１００μｇ）またはＰＢＳによる免疫の２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウス、ＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス、ＭＹＤ８８ＫＯマウス、およびＩＲＦ５／７ＫＯマウスのＤＣ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＢ細胞における、（Ａ）ＣＤ８６および（Ｂ）ＣＤ６９の発現を集計したグラフである。結果はＦＡＣＳにより分析し、ＰＢＳサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比率として示す。

図１３は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、抗ＢＳＴ２抗体による処理あり、なしのいずれかの条件下、ＰａｐＭＶＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡで免疫した２４時間後における、（Ａ）ＣＤ６９、（Ｂ）ＭＨＣ−Ｉ、および（Ｃ）ＣＤ８６の発現についてのフローサイトメトリー分析の結果を集計したグラフである。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意ではない。

図１４は、１００μｇＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）血清中および（Ｂ）脾臓中のＩＦＮ−α産生動態をＥＬＩＳＡにって評価した結果を示すグラフである。（Ｃ）は、１００μｇＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたはＰＢＳによる免疫の６時間後におけるＣ５７ＢＬ／６および異なるノックアウトマウスの血清ＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡにより定量した結果を示すグラフである。

図１５は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたはＰＢＳによる免疫の２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲＫＯマウスの脾臓から採取した、（Ａ）Ｂリンパ球および（Ｂ）樹状細胞内におけるＣＤ８６、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ６９の発現を集計したグラフである。（Ｃ）は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる免疫後の異なる時点におけるＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲＫＯマウスの血清中のＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量したグラフである。

図１６は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３（力価は血液１ミリリットル当たりのＰＦＵとして表示、ＬＯＤ：検出限界）感染の６時間前において、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ（黒四角）またはＰＢＳ（白丸）により処理したＣ５７ＢＬ／６マウスの血液中のＬＣＭＶクローン１３のウイルス動態を示すグラフである。

図１７は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３感染の１５日後におけるＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウスの、（Ａ）脾臓、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）肝臓、および（Ｄ）脳におけるウイルス力価を示すグラフである。前記マウスは、感染の６時間前に、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７、またはＰＢＳで処理した（力価は臓器当たりのＰＦＵとして表示）。ＬＯＤ：検出限界。

図１８は、２×ｌ０^６ｐｆｕのＬＣＭＶクローン１３感染の６時間前に１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７、またはＰＢＳで免疫し、感染１５日後に屠殺したマウスから単離した脾細胞をＧＰ３３で再刺激した後における、（Ａ）ＩＦＮ−γ、（Ｂ）ＴＮＦ−α、および（Ｃ）両サイトカインを産生するＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。（Ｄ）は、ＧＰ３３による再刺激後にＣＤ８^＋Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ−γ量、（Ｅ）は、同ＴＮＦ−α量であり、（Ｆ）は、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球におけるＰＤ−１発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）であり、（Ｇ）は、脾細胞におけるＤｂＧＰ３３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋のパーセンテージである。

図１９は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３感染の４５日後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）脾臓、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）脳、および（Ｄ）肝臓におけるウイルス力価を示すグラフである。前記マウスは感染の６時間前に、１００μｇＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたはＰＢＳで処理した（力価は臓器当たりのＰＦＵとして表示）。ＬＯＤ：検出限界。

図２０は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる刺激の１８時間後のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４^＋ＣＤｌｌｂ^＋細胞集団）におけるＣＤ８６発現のフローサイトメトリー分析を示したチャートである（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。

図２１は、致死未満量の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によるチャレンジに先立ち、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡを２週間間隔で２回投与して処理したマウスの生存率を示すグラフである。

図２２は、ＬＣＭＶに慢性感染させ、１日１回の１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡを静脈内投与したマウスにおけるウイルス量を示すグラフである。（Ａ）は、感染後１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に処理を行った場合のデータであり、（Ｂ）は、感染後６日目および７日目にのみ処理を行った場合のデータである（力価はＰＦＵ／ｍＬで表示）。

図２３は、図２２に関して述べた方法で処理を行ったマウスの異なる臓器における１５日目（実験終了時）のウイルス力価を示すグラフである。

図２４は、１週間間隔でＰａｐＭＶＶＬＰ処理を１回（１×）、２回（２×）、５回（５×）、および１０回（１０×）行い、最後の処理の３日後にインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジしたマウスの体重低下を示すグラフである。

図２５は、マウスから採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中で発見された細胞を示す電子顕微鏡写真である（好中球を丸で囲んでいる）。（Ａ）は、マウスを緩衝液で処理した場合であり、（Ｂ）は、ＰａｐＭＶＶＬＰで処理した場合であり、（Ｃ）は、前記ＢＡＬ中の好中球数を示すグラフである。

図２６は、ＰａｐＭＶＶＬＰと３価不活性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の組み合わせの鼻腔内投与により免疫したマウスの血液中で測定したＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ力価を示すグラフである。（Ａ）は、１回の免疫後の総ＩｇＧ力価であり、（Ｂ）は、１４日間隔で行った２回の免疫後の総ＩｇＧ力価であり、（Ｃ）は、２回の免疫後に測定したＩｇＧ２ａ力価である。

図２７は、図２３に関して述べた方法で免疫したマウスにおいて、２回の免疫後に測定した抗体力価を示すグラフである。（Ａ）は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＩｇＡ力価であり、（Ｂ）は、前記ＢＡＬ中の総ＩｇＧ力価であり、（Ｃ）は、糞中のＩｇＡである。

図２８は、図２６に関して述べた方法で免疫し、１５日目に１ＬＤ_５０のインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジしたマウスにおける体重低下を示すグラフである。体重低下は、１４日間追跡調査した。

図２９は、菌体内で製造したＰａｐＭＶＶＬＰは、ヒト単球系細胞株（ＴＨＰ−１）においてＴＬＲ−２およびＣＤ１４と相互作用すること、ならびに、この相互作用はＴＬＲ−２およびＣＤ１４に対する抗体（Ａｃ）によりブロックされることを実証するグラフである。

図３０は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１Ａ／カリフォルニア／７／２００９のＮＰ１０μｇを、種々の量のアジュバントとしてのＰａｐＭＶＶＬＰと組み合わせて接種したマウスにおけるＩｇＧ２レベルを示すグラフである（ＮＰ（１０μｇ）単独との比較において、＊ｐ＜０．０５）。

図３１は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１Ａ／カリフォルニア／７／２００９のＮＰ単独、またはＮＰとアジュバントとしてのＰａｐＭＶＶＬＰとの混合物で免疫し、ヘテロサブタイプ株Ｈ１Ｎ１ＷＳＮ／３３でチャレンジしたマウスにおける、（Ａ）体重低下、（Ｂ）症状を示すグラフである。症状は、図９の説明で記載した通りである。

図３２は、ＰａｐＭＶｓｍＶＬＰ（「ＰａｐＭＶｓｍ」）および本発明のプロセスによって調製されたＰａｐＭＶＶＬＰ（「ＰａｐＭＶｎｅｗ」）の、３価インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）に対するアジュバント効果を比較した図である。（Ａ）は、ＴＩＶに対する総ＩｇＧの力価であり、（Ｂ）は、ＴＩＶに対するＩｇＧ２の力価である。

本発明は、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡからパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するインビトロプロセスであり、高収率でのＰａｐＭＶＶＬＰの大量生産を可能にするプロセスを提供する。

単量体の組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質からＰａｐＭＶＶＬＰを調製する従来の方法（Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔａｌ．，２００６、同上に記載の方法）によれば、発現したＰａｐＭＶ外被タンパク質の総量のおよそ２０％をＶＬＰの形態で回収することができる。発現した外被タンパク質を宿主細胞から単離させて超遠心分離にかけると、ＶＬＰを含有するペレットのみが保持され、上清中（単量体、二量体、および２０量体までのディスクを含む、より低分子量型のＰａｐＭＶ外被タンパク質を含有）に残存するおよそ８０％のＰａｐＭＶ外被タンパク質は廃棄される。これに対し、本明細書中に記載のインビトロプロセスは、宿主細胞から回収されるＰａｐＭＶ外被タンパク質の低分子量型（限定はされないが、主に単量体）を使用し、約８０％までのＰａｐＭＶ外被タンパク質のＶＬＰへの変換を提供できる。よって、ある実施形態では、本発明のプロセスは、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の損失を３〜４分の１に低減する（よって、結果的に、細胞培養物１リットル当たりから得られるＶＬＰの収率が３〜４倍に増加する）。このような改善は、大規模製造に有利であり、また、生産コストも削減される。

さらに、本発明のインビトロプロセスによれば、界面活性剤が不要となる。界面活性剤は、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔａｌ．に記載の方法（２００６、同上）ではＶＬＰの形態で菌体から単離されるＰａｐＭＶ外被タンパク質から、ＬＰＳを除去するために必要とされるものである。当該技術分野で公知のように、界面活性剤は、タンパク質調製物からの除去が難しい場合があり、よって、従来の方法で調製されたＶＬＰの最終調製物において、界面活性剤の残存量が見られる場合がある。したがって、ある実施形態では、本発明のプロセスは、最低限のバッチ間変動でＶＬＰの調製を可能にする。

種々のｓｓＲＮＡが本発明のプロセスで使用できるが、ある実施形態では、合成ｓｓＲＮＡを使用している。合成配列の使用により、例えば、最終生成物の均一性が実現でき、さらに、インビボ転写の可能性を最小限に抑える必要がある場合には、配列を操作することができる。

本発明のある実施形態は、本明細書中に記載のプロセスによって調製されたｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰを提供する。本明細書中に記載のように、ある実施形態は、エンドソーム内に存在するトール様受容体７（ＴＬＲ−７）の活性化および／またはインターフェロン−アルファ産生の刺激を行うｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰを提供する。これに対し、大腸菌の菌体内での自己集合により製造されるＰａｐＭＶＶＬＰは、免疫系細胞表面に存在するＴＬＲ−２およびＣＤ１４を標的とする傾向がより強いものと思われる。ＶＬＰの調製に界面活性剤を使用すれば、構造が変化し、細胞表面のＴＬＲ−２との相互作用がより顕著となるが、一方、本発明のプロセスによるＶＬＰの調製によれば、特定の理論にとらわれず、ＶＬＰがより効率的にエンドソーム内へと侵入し、ＴＬＲ−７と相互作用するようになると考えられる。さらに、本発明のプロセスによって調製されたｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰは、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔａｌ．に記載の方法で調製されたＰａｐＭＶＶＬＰ（２００６、同上）と比べ、より免疫原性が高い、より効果的なアジュバントとなる傾向がある（例えば、実施例１９参照）。

本発明により提供されるｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰは、市販のワクチンを含む抗原の免疫原性を増強するためのアジュバントとして有用であり、また、単独で使用した場合には、予防効果および／または治療効果をもたらす自然免疫応答の刺激因子として有用である。

＜定義＞
特に定義しない限り、本明細書中で使用するあらゆる技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書中で使用される「約」という用語は、所与の数値から±１０％前後の変動を指す。そのような変動は、本明細書中に記載のあらゆる数値に常に含まれるものと解釈すべきである。

本明細書中で「ａ」または「ａｎ」という単語を「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と共に使用した場合、それは「１（ｏｎｅ）」を意味する場合もあるが、「１以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」「少なくとも１（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」および「１または１を超える（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅｔｈａｎｏｎｅ）」という意味も有しうる。

本明細書中で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等、その文法的変化形）、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および「ｈａｖｅ」や「ｈａｓ」等、その文法的変化形）、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」や「ｉｎｃｌｕｄｅ」等、その文法的変化形）、または「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｉｎｇ）」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」や「ｃｏｎｔａｉｎ」等、その文法的変化形）という単語は、包括的または非限定的な表現であり、記載されていない追加の構成要素や方法工程を除外するものではない。

本明細書中で使用される「天然由来の」は、物体について述べる場合、物体が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、生物、または生物内に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列で、自然界のソースから単離可能で、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないものは、天然由来である。

本明細書中で使用される「弱める」、「阻害する」、「予防する」という用語およびその文法的変化形は、所与のパラメータまたは事象の測定可能な減少を指す。

本明細書中で使用される「ワクチン」という用語は、対象に投与された際、有益な免疫応答を生じさせることができる組成物を指す。

本明細書中で使用される「病原体」という用語は、宿主に疾患または障害を生じさせることが可能な生物を指し、細菌、ウイルス、原虫、真菌、および寄生虫を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、治療を必要とする動物を指す。

本明細書で使用される「動物」という用語は、哺乳動物、鳥類、および魚類を含むが、これらに限定されない、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指し、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、または他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、非ヒト霊長動物、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター、およびマウス等の、飼育動物、家畜、動物園の動物、実験動物、ならびに野生動物を包含する。

１以上のさらに別の治療薬と「組み合わせた」ＶＬＰの投与とは、同時（並行）投与および連続投与を含むことを意図している。連続投与とは、（１以上の）治療薬および前記ＶＬＰの、種々の順序での対象への投与を包含することを意図するものであり、前記治療薬および前記ＶＬＰの投与の間隔は、短く設定されてもよいし（例えば、数分程度）、長く設定されていてもよい（例えば、数日または数週間程度）。

本明細書中で同義に用いられる「ｉｍｍｕｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（免疫刺激）」および「ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（免疫刺激）」いう用語は、動物の病原体または疾患に無関係な分子が、前記病原体による感染または前記疾患に対する防御を、当該感染または疾患に応答するように免疫系を刺激する、および／または、当該感染または疾患に応答する前記動物の免疫系の能力を向上させることにより提供する能力を指す。免疫刺激は、予防効果、治療効果、またはこれらの組み合わせを有してもよい。

核酸またはアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、ある核酸またはアミノ酸配列が、例えば以下で述べる方法を用いて最適に整列されたとき、規定の第２の核酸またはアミノ酸配列（または「参照配列」）に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することを指す。「実質的な同一性」は、完全長配列、機能性ドメイン、コードおよび／または調節配列、プロモーター、およびゲノム配列等、様々なタイプおよび長さの配列を指すために使用され得る。２つのアミノ酸または核酸配列の間の同一性パーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎＡｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄＭ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）ＪＭｏｌＢｉｏｌ１４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒＰｌｕｓ（商標）に組み込まれている「ＢｅｓｔＦｉｔ」（ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１）），ＳｃｈｗａｒｚａｎｄＤａｙｈｏｆ（１９７９）ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄｐｐ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔａｌ．（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）、およびＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、およびＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含むそれらのバリエーション等、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内である様々な方法で決定され得る。加えて、当業者は、比較する配列の全長にわたり最大の一致を達成するために必要なアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。一般に、アミノ酸配列に関しては、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸である。当業者であれば、実際の長さは比較する配列の全長によって左右され、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、または少なくとも２００アミノ酸となるか、あるいは、当該アミノ酸配列の全長となる場合もあることを理解するであろう。核酸に関しては、比較配列の長さは一般的に少なくとも２５ヌクレオチドであるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、または少なくとも６００ヌクレオチドとなるか、あるいは当該核酸配列の全長となる場合もある。

「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏまたはｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏ）」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部または一部と同一であることを指す。対照的に、「相補的」という用語は、本明細書中では、核酸配列が参照核酸配列の相補鎖の全部または一部と同一であることを指すために使用される。例を挙げると、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。「に対応する」という用語を、本明細書中において、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の相互参照に用いた場合には、ＤＮＡ配列が、参照ＲＮＡ配列の全部または一部と同一であることを指す（逆もまた同様である）。ただし、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）残基に対応する位置にはチミン（Ｔ）残基を含有する。それゆえ、例を挙げると、ＤＮＡ配列「ＴＡＴＡＣ」は、ＲＮＡ参照配列「ＵＡＵＡＣ」に対応する。

本発明のあらゆる方法または組成物について、本明細書中に記載のあらゆる実施形態が実施可能であり、逆もまた同様と企図するものである。さらに、本発明の組成物およびキットを使用して本発明の方法を達成することができる。

＜ウイルス様粒子の調製プロセス＞
本発明のプロセスは、組換え外被タンパク質およびｓｓＲＮＡ（以下、ｓｓＲＮＡ鋳型または「ＳＲＴ」という）をインビトロで集合させ、ＶＬＰを形成させる。

ＰａｐＭＶ外被タンパク質を用いた場合を例に挙げて前記プロセス全体を説明するが、当該プロセスは、他のポテックスウイルス外被（またはカプシド）タンパク質にも同様に適用できることを、当業者であれば容易に理解するであろう。多数のポテックスウイルスの外被タンパク質およびゲノムの配列が当該技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共のデータベースから入手可能である。

本発明のプロセスの例示的な実施形態を、図３〜６に示す。簡潔には、前記プロセスは、組換え外被タンパク質とＳＲＴとの組み合わせ処理を、中性のｐＨおよび約２℃〜３７℃の温度で、重量比で約１：１〜約５０：１のタンパク質対ＲＮＡ比率で、ＶＬＰ形成が起こるのに十分な時間行うことを含む。続いて、得られたＶＬＰをヌクレアーゼで処理して前記ＶＬＰから突出しているＲＮＡを除去し、次いで、１以上の精製工程を経て最終的な組換えＶＬＰが提供される（例えば、図３参照）。前記プロセスのある実施形態は、前記組換えタンパク質を、当該タンパク質を発現させた宿主細胞から単離させること（例えば、図４参照）、および／または、プラスミドＤＮＡから前記ＳＲＴを調製すること（例えば、図５参照）を、さらに備えていてもよい。

本発明のプロセスは、大規模化も可能であり、よって、ある実施形態では、本発明は、高収率でのＶＬＰの大量生産に好適な大規模プロセスを提供する。

＜ＰａｐＭＶ外被タンパク質＞
ＶＬＰの調製に使用されるＰａｐＭＶ外被タンパク質は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質全体とすることもできるし、またはその一部とすることもできる。あるいは、例えば、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換等を含む野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変体を使用することもできるが、この場合は、当該外被タンパク質が、自己集合によりＶＬＰとなる能力を保持していることが条件である。野生型ＰａｐＭＶ外被（またはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり（Ｓｉｔ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３２５−２３３１、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０４４３３４．１参照）、本明細書中においては、配列番号１として示す（図１Ａ参照）。この配列の変異体が公知であり、例えば、Ｎｏａ−Ｃａｒｒａｚａｎａ氏およびＳｉｌｖａ−Ｒｏｓａｌｅｓ氏によって記載された、ＰａｐＭＶのメキシコ分離株の外被タンパク質の配列（２００１、ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ、８５：５５８）は、配列番号１に対し、８８％の配列同一性を有しており、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。ＰａｐＭＶ外被タンパク質のヌクレオチド配列も、当該技術分野で公知であり（Ｓｉｔ，ｅｔａｌ．、同上、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００１７４８（ヌクレオチド５８８９−６５３６）参照）、本明細書中においては、配列番号２として示す（図１Ｂ参照）。

上述したように、ＰａｐＭＶ外被タンパク質（以下、ＰａｐＭＶＣＰともいう）のアミノ酸配列は、親（野生型）配列に厳密に対応する必要はない。すなわち、「変異体配列」であってもよい。例えば、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失により変異誘発し、その部位の残基が親（参照）配列に対応しないよう構成してもよい。しかしながら、このような変異は広範なものではなく、当該組換えＰａｐＭＶＣＰが集合してＶＬＰを形成する能力に劇的な影響を及ぼさない程度のものであることを、当業者であれば理解するであろう。

したがって、多量体化し、集合してＶＬＰを形成する能力を保持する野生型外被タンパク質のフラグメント（すなわち、「機能的」フラグメントである）を用いて調製される組換えＰａｐＭＶＣＰもまた、本発明において企図されている。例えば、フラグメントは、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部、またはこれらの組合せからのアミノ酸の欠失を１以上含んでもよい。一般的に、機能的フラグメントは、少なくとも１００アミノ酸長であり、例えば、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも１６０アミノ酸長、少なくとも１７０アミノ酸長、少なくとも１８０アミノ酸長、または少なくとも１９０アミノ酸長である。野生型タンパク質のＮ末端でなされる欠失は、当該タンパク質の自己集合能を保持するため、一般的に、１３未満のアミノ酸の欠失とすべきである。

本発明のある実施形態では、組換え外被タンパク質が変異体配列を含む場合、前記変異体配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％同一である。ある実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号１（図１Ａ）である。

本発明のある実施形態では、組換えＰａｐＭＶＶＬＰの調製に使用するＰａｐＭＶ外被タンパク質は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変体（すなわち変異体）である。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端から複数のアミノ酸を欠失させるように、および／または、アミノ酸置換を１以上含むように遺伝子改変されている。また、いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１〜約１０個のアミノ酸を欠失させるように遺伝子改変されている。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、野生型タンパク質のＮ末端の近位（すなわち、配列番号１の１位と６位）で生じ、翻訳を開始させることができる２個のメチオニンコドンのうちの１個を除去するよう、遺伝子改変されている。前記翻訳開始コドンの１個を除去することで、均質なタンパク質集団の産生が可能となる。選択したメチオニンコドンの除去は、例えば、前記コドンを構成するヌクレオチドの１以上を、前記コドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするように置換するか、またはナンセンスコドンとなるように置換することによって行える。あるいは、前記コドンの全部または一部、または前記選択コドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域を欠失させることもできる。本発明のいくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端から１〜５個のアミノ酸を欠失させるよう遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＰａｐＭＶ外被タンパク質は、配列番号３（図２Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、６個までのヒスチジン残基からなるヒスチジン標識を任意に含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列に特異的制限酵素部位を１以上組込みんだことにより生じる追加のアミノ酸（例えば、約１〜約８個のアミノ酸）をＣ末端に含むよう遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、配列番号４（図２Ｂ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、前記ヒスチジン標識を含んでも含まなくてもよい。

１以上のアミノ酸置換を含む変異ＰａｐＭＶ外被タンパク質配列を用いて組換えＰａｐＭＶＶＬＰを調製する場合、これらの置換は、「保存的」置換であっても、「非保存的」置換であってもよい。保存的置換は、１個のアミノ酸残基の、類似の側鎖特性を有する他の残基による置き換えを含む。当該技術分野で公知のように、２０個の天然由来のアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的特性に応じて分類できる。好適な分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン（疎水性側鎖）；グリジン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン（極性・無電荷側鎖）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖）；およびリジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。アミノ酸のもう１つの分類は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、あるアミノ酸の、同一群に属する他のアミノ酸による置換を含む。非保存的置換は、あるアミノ酸残基の、異なる側鎖特性を有する他の残基による置き換え、例えば、中性または塩基性残基による酸性残基の置き換え、酸性または塩基性残基による中性残基の置き換え、親水性残基による疎水性残基の置き換え等を含む。

本発明のある実施形態では、変異体配列は、１以上の非保存的置換を含む。１個のアミノ酸を、異なる特性を有する他のアミノ酸で置き換えることにより、外被タンパク質の特性が改善され得る。例えば、先に記載したように、外被タンパク質の残基１２８の変異により、当該タンパク質のＶＬＰへの集合が向上される（Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．２００６、ＦＥＢＳＪ．、２７３：１４−２５）。よって、本発明のいくつかの実施形態では、外被タンパク質は、当該外被タンパク質の残基１２８に変異を含み、この位置のグルタミン酸残基が中性残基で置換されている。いくつかの実施形態では、１２８位のグルタミン酸残基がアラニン残基で置換されている。

野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＦ１３位のフェニルアラニン残基を他の疎水性残基で置換すると、野生型タンパク質配列を使用した場合と比べて、当該組換えタンパク質を発現させた場合のほうが、形成されるＶＬＰの割合が高くなることがわかっている。（Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ−Ｇａｇｎｅ，ｅｔａｌ，２００８，ＦＥＢＳＪ．，２７５：１４７４−１４８４）。本発明との関係においては、以下に挙げるアミノ酸残基が、Ｆ１３位の置換に好適な疎水性残基と考えられる：Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒ。本発明のいくつかの実施形態では、外被タンパク質は、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒによる１３位のＰｈｅの置換を含む。いくつかの実施形態では、外被タンパク質は、ＬｅｕまたはＴｙｒによる１３位のＰｈｅの置換を含む。

ある実施形態では、前記ＣＰのＦ１３位の変異を、Ｅ１２８位の変異、Ｎ末端の欠失、またはこれらの組み合わせと併用している。

同様に、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質の調製に使用するＰａｐＭＶ外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照親配列に厳密に対応する必要はなく、遺伝暗号の縮重により、および／または、上述の変異アミノ酸配列をコードするように、異なっていてもよい。それゆえ、本発明のある実施形態では、変異外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一であり、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％同一である。ある実施形態では、参照核酸配列は、配列番号２（図１Ｂ）である。

ある実施形態では、前記外被タンパク質は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質またはその変異体を１以上の抗原ペプチドに融合させたものを含む、融合タンパク質である。前記ペプチドは、Ｃ末端、Ｎ末端、または内部のいずれが融合位置であってもよいが、ただし、前記外被タンパク質のＶＬＰへの集合能が保持されていなければならない（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）、ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）、ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）およびＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット）参照）。以下により詳しく述べるように、前記抗原ペプチドは、ウイルス、細菌、真菌、またはその他の病原体由来でもよいし、あるいは、アレルゲンまたは腫瘍関連抗原であってもよい。

好適な抗原ペプチドは様々な大きさとすることができるが、一般的には、約３アミノ酸〜約５０アミノ酸長であり、例えば、約３〜約４０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、前記抗原ペプチドは、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも７アミノ酸長から約５０、４０、３５、３０、２５、または２０アミノ酸長までの長さである。

＜組換え外被タンパク質の調製＞
ＰａｐＭＶＶＬＰを調製するための組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当業者により、標準的な遺伝子工学技術で容易に調製可能である。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質の配列（例えば、配列番号１および２参照）同様、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ参照）。

例えば、野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離とクローニングは、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．、同上参照）を用いて達成できる。例えば、標準的な技術によりＲＮＡを抽出し、次に、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成することにより（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより）、ＰａｐＭＶから核酸配列を直接得ることができる。ＰａｐＭＶは、モザイク症状を示す感染植物葉から標準的な技術により精製することができる。

次に、前記外被タンパク質をコードする核酸配列を、直接、または１以上のサブクローニング工程後に、好適な発現ベクターへと挿入する。使用するベクターそのものが本発明にとって決定的に重要ではないことを、当業者であれば理解するであろう。好適なベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、またはＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。外被タンパク質は、次いで、上述および後述のように、発現および精製することができる。一般的に、ベクターおよび対応する宿主細胞は、組換え外被タンパク質が、ＶＬＰとしてではなく、低分子量種として細胞内に発現するように選択される。この点に関して適切なベクターおよび宿主細胞の組み合わせの選択もまた、当該技術分野における通常技術の範囲内である。

あるいは、前記外被タンパク質をコードする核酸配列を、当該技術分野において周知の標準的なインビトロ部位特異的変異技術によって、上述のような１以上の変異を導入するようにさらに操作することができる。変異は、前記コード配列を構成する適切なヌクレオチドの１以上に欠失、挿入、置換、逆位、またはこれらの組合せを生じさせることで導入できる。これは、例えば、１以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入、または欠失を組み込むように設計したプライマーを用いたＰＣＲに基づく技術によって行える。変異の存在の確認は、例えば、制限分析またはＤＮＡ塩基配列決定等、多数の標準的な技術により可能である。

前記外被タンパク質をコードするＤＮＡを、コードされるタンパク質の活性に影響を及ぼさない範囲で、種々の方法で改変してもよいことを、当業者であれば理解するであろう。例えば、前記タンパク質の発現に使用する宿主細胞におけるコドン選択の最適化のためにＤＮＡ配列の改変を用いてもよいし、あるいは、発現を促進する他の配列変化を含むように改変してもよい。

発現ベクターは、外被タンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写に必要な、転写エレメント等の調節エレメントをさらに含んでもよいことを、当業者であれば理解するであろう。ベクターに組み込むことができる調節エレメントの例として、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。それゆえ、本発明のある実施形態では、遺伝子操作された外被タンパク質をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節エレメントを含むベクターが提供される。好適な調節エレメントの選択は、前記遺伝子操作された外被タンパク質の発現用に選択される宿主細胞に依存すること、ならびに、そのような調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む様々なソースに由来してもよいことを、当業者であれば理解するであろう。

本発明との関係においては、前記発現ベクターは、発現されたタンパク質の精製を容易にする異種核酸配列をさらに含有してもよい。このような異種核酸配列の例として、金属親和性標識、ヒスチジン標識、アビジン／ストレプトアビジンをコードする配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列、およびビオチンをコードする配列等の親和性標識が挙げられるが、これらに限定されない。異種核酸配列によってコードされたアミノ酸は、当該技術分野で公知の方法により、発現された外被タンパク質から使用前に除去することができる。あるいは、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸がその後のＶＬＰへの集合に干渉しない場合には、これらを外被タンパク質上に保持しておくこともできる。

本発明の一実施形態では、外被タンパク質は、ヒスチジン標識されたタンパク質として発現される。ヒスチジン標識は、外被タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に配置することができる。

発現ベクターは、当該技術分野で公知の様々な方法の１つによって、好適な宿主細胞または組織に導入することができる。このような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（同上）に概説されており、例えば、安定導入または一過性導入、リポフェクション、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。外被タンパク質の発現に好適な宿主細胞の選択は、選択したベクターに依存することを、当業者であれば理解するであろう。宿主細胞の例としては、細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用する宿主細胞そのものは、本発明にとって決定的に重要ではない。外被タンパク質は、原核生物の宿主（例えば、大腸菌、エロモナス・サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））または真核生物の宿主（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）；哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、またはＨｅＬａ細胞；昆虫細胞または植物細胞）内で産生できる。

ある実施形態では、前記外被タンパク質は、大腸菌またはピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内で発現される。

所望の場合、外被タンパク質は、当該技術分野で公知の標準的な技術（例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ参照）により宿主細胞から精製することができ、インタクトなタンパク質またはそのタンパク質分解フラグメントのいずれかを用いた標準的なペプチド配列決定技術によって配列決定ができ、それにより、当該タンパク質の同一性を確認する。

＜ｓｓＲＮＡ鋳型＞
本発明のプロセスで使用するｓｓＲＮＡ鋳型は、例えば、合成ｓｓＲＮＡ、天然由来のｓｓＲＮＡ、天然由来の修飾ｓｓＲＮＡ、天然由来または合成ｓｓＲＮＡのフラグメント等であってもよい。

インビトロ集合用のｓｓＲＮＡは、通常、少なくとも約５０ヌクレオチドかつ約５０００ヌクレオチドまでの長さであり、例えば、少なくとも約１００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチドかつ約５０００、４５００、４０００、または３５００ヌクレオチドまでの長さである。ある実施形態では、インビトロ集合用のｓｓＲＮＡは、約５００から約３０００ヌクレオチドの長さ、例えば、約１０００から約３０００ヌクレオチドの長さ、または約１２００から約２８００ヌクレオチドの長さである。

ある実施形態では、ｓｓＲＮＡ鋳型は、配列のインビボ転写の機会を最小限に抑えるため、ＡＴＧ（ＡＵＧ）開始コドンを含まないように設計されている。しかしながら、ｓｓＲＮＡがキャッピングされていなければインビボ転写が起こる可能性は低いため、ＡＴＧ開始コドンを含むｓｓＲＮＡ鋳型の使用を除外するものではない。

ある実施形態では、インビトロ集合用のｓｓＲＮＡは、未変性ＰａｐＭＶＲＮＡの５’末端から約３８個〜約１００個のヌクレオチドを含むが、推定パッケージングシグナルの少なくとも一部がこの配列内に含まれる。推定パッケージングシグナルを含まないｓｓＲＮＡ鋳型もまた、ある実施形態では使用可能である。ｓｓＲＮＡ鋳型の製造に使用できるＰａｐＭＶゲノムに基づく配列の非限定的な例を、図７に示す［配列番号５および６］。これらの配列のフラグメントもまた、最大５０００ヌクレオチドまでの長さのより長い変異体同様、本発明のある実施形態では、ｓｓＲＮＡ鋳型の製造用として企図されている。ある実施形態では、インビトロ集合用のｓｓＲＮＡは、配列番号５における第１７番目から第５４番目までのヌクレオチドに対応する配列を含む。ある実施形態では、インビトロ集合用のｓｓＲＮＡは、配列番号５における第１７番目から第６３番目までのヌクレオチドに対応する配列を含む。

ヌクレオチドＡおよびＣを多く含むｓｓＲＮＡ配列もまた、ＰａｐＭＶ外被タンパク質と共に集合することが知られている（Ｓｉｔ，ｅｔａｌ．、１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９：２３８−２４２）。よって、ある実施形態では、前記ｓｓＲＮＡ鋳型は、ポリＡおよびポリＣｓｓＲＮＡ鋳型を含む、Ａおよび／またはＣが豊富な配列である。ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、クローバー黄斑モザイクウイルス（ＣＹＭＶ）、ジャガイモ黄斑モザイクウイルス（ｐｏｔａｔｏａｕｃｕｂａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ、ＰＡＭＶ）、およびマルバモザイクウイルス（ｍａｌｖａｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ、ＭａＭＶ）等、他のポテックスウイルスの配列の全部または一部に基づくｓｓＲＮＡ鋳型もまた、いくつかの実施形態ではプロセスでの使用が企図されている。

＜ｓｓＲＮＡ鋳型の調製＞
ｓｓＲＮＡ鋳型は、当該技術分野で公知の標準的な技術により、単離および／または調製が可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ参照）。

例えば、合成ｓｓＲＮＡに関しては、ｓｓＲＮＡ鋳型をコードする配列を、適切な宿主細胞の形質転換に使用可能な好適なプラスミドに挿入できる。形質転換した宿主細胞を適切な細胞培養条件で培養した後、プラスミドＤＮＡを、標準的な分子生物学的手法により細胞培養物から精製し、制限酵素消化により直線化できる。

次いで、前記ｓｓＲＮＡを、好適なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、得られた転写産物を、標準的なプロトコールにより精製する。

所望の目的が達成できれば、使用するプラスミドそのものは本発明にとって決定的に重要ではないことを、当業者であれば理解するであろう。同様に、選択したプラスミドの増殖が可能であれば、使用する特定の宿主細胞も決定的に重要ではない。

標準的な技術を用い、より短いｓｓＲＮＡ鋳型を化学合成してもよい。また、多数の商用のＲＮＡ合成サービスも利用可能である。

最終的に得られたｓｓＲＮＡ鋳型は、使用前に任意に滅菌処理してもよい。

＜ＶＬＰへのインビトロ集合＞
集合反応は、調製した組換え外被タンパク質およびｓｓＲＮＡ鋳型を使用して、インビトロで行われる。通常、前記組換え外被タンパク質およびｓｓＲＮＡ鋳型の両方を、集合前に精製するが、未精製調製物または部分的に精製した外被タンパク質および／またはｓｓＲＮＡ鋳型の使用もまた、いくつかの実施形態で企図されている。

一般的には、同一アミノ酸配列を有する組換え外被タンパク質の調製物が集合反応に使用され、この結果、集合によって最終的に得られるＶＬＰは、同一の外被タンパク質サブユニットを含む。異なるアミノ酸配列を有する複数の組換え外被タンパク質を含む調製物を使用し、この結果、集合によって最終的に得られるＶＬＰでは、外被タンパク質サブユニットにばらつきが見られる態様もまた、いくつかの実施形態で企図されている。

集合反応に使用される組換え外被タンパク質は、その大部分が、主として単量体および二量体からなるが、２０量体未満の他の低分子量種も含む、低分子量種の形態にある。本発明との関係においては、組換え外被タンパク質調製物は、当該調製物に含まれる外被タンパク質の少なくとも約７０％が低分子量種として存在する場合に、大部分が低分子量種の形態にあると考えられる。ある実施形態では、集合反応に使用される組換え外被タンパク質調製物中の外被タンパク質の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が、低分子量種として存在する。本発明のある実施形態では、組換え外被タンパク質調製物は、少なくとも約５０％の単量体および二量体、例えば、約６０％、７０％、７５％、または８０％の単量体および二量体からなる。

集合反応は中性の水溶液中で行われ、他の特定のイオンを必要としない。通常、緩衝液が使用される。ｐＨは、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ９．０の範囲内とすべきであり、例えば、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ７．０〜約ｐＨ９．０、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．５、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．５、または約ｐＨ７．０〜約ｐＨ８．５とすべきである。

前記緩衝液の性質は、前述の範囲内のｐＨを維持できる限り、本発明にとって決定的に重要ではない。前述のｐＨ範囲内で使用される緩衝液の例としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸塩緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。

高濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の集合に影響を及ぼす場合がある。よって、ある実施形態では、ＮａＣｌを実質的に含まない溶液、例えば、ＮａＣｌの含有量が０．０５Ｍ未満の溶液中で、集合反応を行う。

集合反応は、種々のタンパク質対ｓｓＲＮＡ比率を用いて行える。一般的には、重量比で約１：１〜約５０：１のタンパク質対ｓｓＲＮＡ比率（タンパク質：ＲＮＡ）を使用してもよく、例えば、重量比で少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１〜５：１〜約５０：１、４０：１、または３０：１までとしてもよい。ある実施形態では、集合反応に使用するタンパク質対ｓｓＲＮＡ比率は、重量比で約５：１〜約４０：１、または約１０：１〜約４０：１である。

集合反応は、約２℃から約３７℃までの範囲内で変更可能な温度で行うことができ、例えば、少なくとも約３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃〜約３７℃、３５℃、３０℃または２８℃で行うことができる。ある実施形態では、集合反応は、約１５℃〜約３７℃の温度、例えば、約２０℃〜約３７℃、または約２２℃〜約３７℃で行っている。

集合反応は、ＶＬＰの形成に十分な時間進行させる。前記時間は、使用する組換え外被タンパク質およびｓｓＲＮＡの濃度、ならびに前記反応の温度に応じて変動するものであり、当業者であれば容易に決定できる。通常、少なくとも約６０分の反応時間が採用される。外被タンパク質のＶＬＰへの集合は、必要であれば、動的光散乱または電子顕微鏡観察等の標準的な技術により観測することができる。

前記集合反応を適切な時間進行させた後、得られたＶＬＰに対し、当該粒子から突出しているＲＮＡを除去する「平滑化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）」工程を行う。平滑化反応は、ＲＮＡを切断可能なヌクレアーゼを用いて実施できる。種々のヌクレアーゼが市販されており、それらの使用条件は、当該技術分野で公知である。

いったん集合したＶＬＰは、透析、ダイアフィルトレーション、またはクロマトグラフィー等の標準的な技術により、他の反応成分から精製することができる。

前記ＶＬＰ調製物は、例えば、前記精製工程（１以上）の前もしくは後に、超遠心分離またはダイアフィルトレーションによって、任意に濃度を高めてもよい（すなわち、濃縮させてもよい）。ＶＬＰは、所望される場合、電子顕微鏡観察等の標準的な技術を用いて可視化することができる。

＜組換えＶＬＰの特徴＞
集合により得られたＰａｐＭＶＶＬＰは、それぞれ外被タンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは、１２００超の外被タンパク質サブユニットを含み、約５００ｎｍの長さである。本発明のプロセスによって調製された組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、野生型ウイルスと同様のサイズであってもよいし、または野生型ウイルスよりも短いか、もしくは長くてもよい。本発明のある実施形態では、組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、外被タンパク質サブユニットを少なくとも４０個含む。いくつかの実施形態では、組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、約４０〜約１６００個の外被タンパク質サブユニットを含んでもよいが、これより多くの外被タンパク質を含むＶＬＰもまた企図されている。組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、通常、約１０〜２０ｎｍの幅であり、約４０ｎｍから数千ｎｍの長さである。ある実施形態では、組換えＰａｐＭＶＶＬＰの調製物は、その平均長さが約４０ｎｍ〜約６００ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約４００ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約３００ｎｍである。

組換えＰａｐＭＶＶＬＰは安定であり、室温で容易に保存できる。例えば、約２℃から約８℃の低温で保存した場合、組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、少なくとも数ヶ月から数年間安定である。

＜組換えＶＬＰの方法および使用＞
本発明は、組換えＰａｐＭＶＶＬＰの多数の応用例および用途を提供する。例えば、組換えＰａｐＭＶＶＬＰは、抗原の免疫原性を増強するためのアジュバントとして使用してもよいし、あるいは、抗原（１以上）と融合させた場合には、ワクチンとして使用し得る。ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰを単独で使用し、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより感染を治療または予防してもよい。よって、ワクチンを含む医薬品および／または医薬組成物の調製のための組換えＰａｐＭＶＶＬＰの使用もまた、本発明の範囲内である。

本発明のワクチンで治療または予防し得る疾患および障害の例として、例えば、感染症（ウイルス性または細菌性疾患等）、アレルギー反応、免疫性疾患、および癌が挙げられる。

ＰａｐＭＶＶＬＰとの併用、または組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質との融合に好適な抗原は、種々の疾患または障害に関連する抗原であってもよい。多種多様なこのような抗原が、当該技術分野で公知ある。当業者であれば、例えば、対象とする疾患または障害および／または投与対象の動物等、所望のＶＬＰの最終用途に基づき、適切な抗原を容易に選択できる。

例えば、前記抗原は、癌、感染症、アレルギー反応、または自己免疫性疾患等の疾患または障害を動物に生じさせることができる作用物質に由来する抗原とすることもできるし、あるいは、薬剤、ホルモン、もしくは毒素に関連する疾患または障害に対する免疫応答を誘導するための使用に好適な抗原とすることもできる。前記抗原は、例えば、細菌、ウイルス、原虫、真菌、寄生虫、または、プリオン等の感染性の粒子等、当該技術分野で公知の病原体由来であってもよいし、あるいは、腫瘍関連抗原、自己抗原、またはアレルゲンであってもよい。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰを、市販のワクチンの有効性を向上させる目的で、当該ワクチンと組み合わせて使用する。

有用な抗原としては、例えば、以下の科に属するウイルス由来のウイルス抗原が挙げられる：アデノウイルス科；アレナウイルス科（例えば、イッピーウイルス（Ｉｐｐｙｖｉｒｕｓ）およびラッサ熱ウイルス）；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科；コロナウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えば、ヒト単純ヘルペスウイルス１）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ）；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ウシ免疫不全ウイルス、およびネコ免疫不全ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、ならびにトガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）。一実施形態においては、組換えＰａｐＭＶＣＰは、主要なウイルス病原体、例えば、デングウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、各種インフルエンザウイルス、ウエストナイルウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ポリオーマウイルス、またはＳＡＲＳコロナウイルス等に由来する抗原ペプチドを１以上含む。

有用な抗原は、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、スクレイピー、伝染性ミンク脳症、および慢性の消耗性疾患の原因物質等の、非在来型ウイルスまたはウイルス様物質由来であってもよいし、あるいは、当該技術分野で公知のような、狂牛病に関連するプリオン等、タンパク質性の感染性粒子由来であってもよい。

有用な細菌性抗原としては、例えば、表在性の細菌性抗原成分、タンパク質性の莢膜抗原、または鞭毛成分が挙げられ、これら抗原は、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性肺炎、真菌性肺炎、コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢、サルモネラ症、レジオネラ症、ライム病、ハンセン病、マラリア、鉤虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症（ｔｒｙｐａｍａｓｏｍｉａｌｓｉｓ）、リーシュマニア症（ｌｅｈｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア症、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア症、および旋毛虫症等の疾患の原因となる既知の原因物質から得ることができるか、またはこれらに由来する。

有用な腫瘍関連抗原としては、例えば、Ｈｅｒ２（乳癌）；ＧＤ２（神経芽細胞腫）；ＥＧＦ−Ｒ（悪性神経膠芽腫）；ＣＥＡ（甲状腺髄様癌）；ＣＤ５２（白血病）；ヒトメラノーマタンパク質ｇｐ１００；ヒトメラノーマタンパク質メランＡ／ＭＡＲＴ−１；ＮＡ１７−Ａｎｔタンパク質；ｐ５３タンパク質；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３（ＨＬＡ−Ａ１ペプチド）およびＭＡＧＥ４を含む、各種ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）；各種チロシナーゼ（ＨＬＡ−Ａ２ペプチド）；変異型ｒａｓ；ｐ９７メラノーマ抗原；進行癌に関連するＲａｓペプチドおよびｐ５３ペプチド；子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原；乳癌に関連するＭＵＣ１−ＫＬＨ抗原；結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、肺癌に関連するＤＫＫ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１タンパク質）、および前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原が挙げられる。

有用なアレルゲンとしては、例えば、花粉、動物鱗屑、草、カビ、粉塵、抗生物質、刺咬昆虫毒物からのアレルゲン、ならびに種々の環境、薬物、および食品アレルゲンが挙げられる。一般的な樹木アレルゲンとしては、ハコヤナギ、ポプラ、セイヨウトリネコ、カバノキ、メープル、オーク、ニレ、ヒッコリー、およびペカンの木の花粉が挙げられる。一般的な植物アレルゲンとしては、ライ麦、ブタクサ、イギリスオオバコ、スイバ（ｓｏｒｒｅｌ‐ｄｏｃｋ）、およびアカザからのアレルゲンが挙げられ、植物接触アレルゲンとしては、ウルシ、ツタウルシ、およびイラクサからのアレルゲンが挙げられる。一般的な草アレルゲンとしては、オオアワガエリ、ジョンソングラス、ギョウギシバ、ウシノケグサ、およびブルーグラスアレルゲンが挙げられる。一般的なアレルゲンは、カビまたは真菌から、例えば、アルテルナリア属、フザリウム属、ホルモデンドラム属、アスペルギルス属、ミクロポリスポラ属、ケカビ属、および好熱性放線菌からも得ることができる。表皮性のアレルゲンは、ハウスダストまたは有機ダスト（通常、真菌由来）から、イエダニ（ヤケヒョウヒダニ）等の昆虫から、または羽毛、およびネコやイヌの鱗屑等の動物源から得ることができる。一般的な食物アレルゲンとしては、牛乳およびチーズ（乳製品）、卵、小麦、ナッツ（例えば、ピーナッツ）、魚介類（例えば、貝）、エンドウ豆、豆、およびグルテンアレルゲンが挙げられる。一般的な薬物アレルゲンとしては、局所麻酔薬およびサリチル酸塩アレルゲンが挙げられ、一般的な昆虫アレルゲンとしては、ハチ、スズメバチ、ジガバチ、およびアリ毒、ならびにゴキブリ貯卵嚢（ｃｏｃｋｒｏａｃｈｃａｌｙｘ）アレルゲンが挙げられる。

ある実施形態では、本発明は、対象における自然免疫応答を刺激するための、ＰａｐＭＶＶＬＰの使用を提供する。前記対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。ＰａｐＭＶＶＬＰは、本明細書中に記載のように、例えば、慢性感染を含む感染の治療または予防に使用してもよい（２０１２年５月１日出願の国際出願第＿号明細書「ＰａｐａｙａＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄＵｓｅｓＴｈｅｒｅｏｆｆｏｒＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＩｎｎａｔｅＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅ」も参照。その開示全体を、本明細書に援用する）。

ある実施形態では、本発明は、自然免疫応答を刺激し、これにより、病原体による感染の可能性から対象を防御するための、ＰａｐＭＶＶＬＰの使用を提供する。本発明のある実施形態によれば、ＰａｐＭＶＶＬＰは、鼻腔内または肺内経路介して投与され、粘膜および／または呼吸器系内で防御効果を誘導する。本発明の種々の実施形態において、前記病原体は、ウイルス病原体、細菌性病原体、または真菌性病原体の１以上である。

いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰは、病原体による感染から防御するための予防的または先制措置として対象に投与される。このようなアプローチは、例えば、免疫無防備状態の患者（ＡＩＤＳ患者、化学療法中の患者、または免疫抑制剤を服用している患者等）；世界的流行または流行時に、適切なワクチンの開発／普及に先立ち、集団に対して初期防御を提供するため；感染の可能性のある地域に赴く救助隊、医師、および看護師等の作業従事者を守るため；およびバイオテロ攻撃の脅威または発生がある状況下において有用である。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰを、例えば、競馬、犬の品評会、猫の品評会等、競争する環境にある非ヒト動物に対し、感染から防御するための先制措置として投与してもよい。流行／世界的流行下での家畜へのＰａｐＭＶＶＬＰの投与もまた、ある実施形態で企図されている。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰは、感染、例えば、ＨＩＶおよびＨＣＶ等の慢性感染を含む、ウイルス病原体、細菌性病原体、または真菌性病原体による感染を治療するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜表面、例えば、肺、腸、または泌尿生殖器系での感染を治療するために使用してもよい。

ある実施形態では、肺における自然免疫応答の抗腫瘍活性を刺激するため、肺内経路を介してＰａｐＭＶＶＬＰを肺癌患者に投与することができる。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰは、粘膜免疫応答を刺激し、これにより、腸、泌尿生殖路、ならびに、肺を含む他の粘膜表面における感染および疾患に対する防御を向上させるための粘膜アジュバントとして使用される。

＜医薬組成物＞
ある実施形態では、本発明は、有効量のＰａｐＭＶＶＬＰ、ならびに１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。所望される場合、例えば、追加の免疫刺激化合物、標準的な治療薬、ワクチン等の他の有効成分を、前記組成物に含有させてもよい。

前記医薬組成物は、様々な経路による投与用に製剤可能である。例えば、前記組成物は、経口、局所、直腸、鼻腔内、もしくは非経口投与用、または、吸入もしくは噴霧による投与用に製剤できる。本明細書中で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、胸骨内注射または注入技術を含む。対象への鼻腔内投与は、前記組成物を対象の鼻道または鼻腔の粘膜に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、粘膜投与用に製剤される。粘膜投与は、例えば、経口、鼻腔内、エアロゾル、直腸、または膣内投与を含む。前記粘膜投与用製剤としては、粘膜の部位に応じ、経皮デバイス、エアロゾル、クリーム、ローション、またはパウダーが挙げられる。ある実施形態では、前記医薬組成物は、鼻腔内または肺内投与用に製剤される。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、直腸または膣内投与用に製剤される。

水性懸濁液として製剤される組成物は、ＰａｐＭＶＶＬＰを、１以上の好適な賦形剤との混合物として含有してもよい。前記賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような懸濁化剤；天然由来のホスファチド、例えば、レシチン、または脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、または長鎖脂肪アルコールとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸とヘキシトールとから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン等の分散剤または湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液はまた、１以上の保存料、例えば、エチルもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１以上の着色剤、１以上の香味料、またはスクロースもしくはサッカリン等の１以上の甘味料を含有してもよい。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰを、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油等の植物油、または流動パラフィンのような鉱物油に懸濁することにより、前記医薬組成物を油性懸濁液として製剤してもよい。前記油性懸濁液は、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコールのような増粘剤を含有してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存可能である。

ある実施形態では、前記医薬組成物を分散性粉末または顆粒として製剤してもよい。前記分散性粉末または顆粒は、その後、水の添加によって水性懸濁液を調製するために使用できる。このような分散性粉末または顆粒は、ＰａｐＭＶＶＬＰを、１以上の分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および／または保存料との混合物として提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤の例としては、上述のものが挙げられる。例えば着色剤のような追加の賦形剤を、これらの組成物に含有させることもできる。

本発明の医薬組成物は、いくつかの実施形態では、水中油型エマルションとして製剤してもよい。油相は、例えば、オリーブ油もしくは落花生油のような植物油、または、例えば、流動パラフィンのような鉱物油とすることができる。あるいは、これらの油の混合物を油相としてもよい。これらの組成物に含有させる好適な乳化剤としては、天然由来のゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム；天然由来のホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン；または脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルもしくは部分エステル、無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが挙げられる。

ある実施形態では、前記医薬組成物は、前述のような好適な１以上の分散剤もしくは湿潤剤および／または懸濁化剤を使用して、当該技術分野で公知の方法により、滅菌注射用水性または油性懸濁液として製剤してもよい。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液とすることができ、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液とすることができる。使用可能なビヒクルおよび溶媒として、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、および等張食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。その他の例として、溶媒または懸濁媒として従来使用されている滅菌された不揮発性油、および、例えば、合成のモノまたはジグリセリドを含む種々の無刺激性不揮発性油が挙げられる。オレイン酸等の脂肪酸もまた、注射剤の製造に使用可能である。

前記医薬組成物は、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等の保存料、および／または炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、またはデキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）もしくはタンパク質含有物質（例えば、ウシ血清または脱脂乳）等の安定剤を、好適な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）と共に任意に含有してもよい。前記組成物の各種成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータにしたがって調整すればよい。

滅菌組成物は、例えば、必要量のＰａｐＭＶＶＬＰを、先に列挙した種々のその他の成分と共に適切な溶媒に混合し、次いで、必要に応じて、ろ過滅菌を行うことにより調製できる。一般的に、分散液は、ベースとなる分散媒および先に列挙したような他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、種々の滅菌済みの有効成分を加えることにより調製される。滅菌組成物の調製に滅菌粉末を使用する場合、いくつかの例示的な製剤方法として、真空乾燥技術および凍結乾燥技術が挙げられる。これらの技術によれば、予め滅菌ろ過した前記活性成分および追加の所望の成分の溶液より、これら成分の粉末が得られる。

本発明のある実施形態では、治療用製品の肺内または鼻腔内送達のために設計された種々の機械的デバイスの使用が企図されている。このようなデバイスとしては、ネブライザー、定量吸入器、粉末吸入器、および経鼻スプレーデバイスが挙げられるが、これらには限定されず、またこれらは全て当業者にはよく知られている。

定量吸入器は、通常、噴射ガスを使用しており、吸気の際に作動させる必要がある。乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を採用している。ネブライザーが溶液からエアロゾルを生じさせるのに対し、定量吸入器、乾燥粉末吸入器等は、小粒子のエアロゾルを生成する。

市販の機械的デバイスのいくつかの具体例としては、ＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ＡＣＯＲＮＩＩ（登録商標）ネブライザー（ＭａｒｑｕｅｓｔＭｅｄｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）、ＭＩＳＴＹ−ＮＥＢ（登録商標）ネブライザー（Ａｌｌｅｇｉａｎｃｅ，ＭｃＧｒａｗＰａｒｋ，Ｉｌｌ．）、ＡＥＲＯＥＣＬＩＰＳＥ（登録商標）ネブライザー（ＴｒｕｄｅｌｌＭｅｄｉｃａｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｎａｄａ）、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）経鼻スプレーデバイス（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ），ＭｕｃｏｓａｌＡｔｏｍｉｚａｔｉｏｎＤｅｖｉｃｅ（ＭＡＤ３００）（ＷｏｌｆｅＴｏｒｙＭｅｄｉｃａｌ）、ＯｐｔｉＮｏｓｅデバイス（ＯｐｔｉＮｏｓｅ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、ＮｅｋｔａｒＤＰＩシステム（ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＣａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＡＥＲｘ肺内薬物送達システム（ＡｒａｄｉｇｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｐｉｒｏｓ（登録商標）デバイス（ＤｕｒａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＲｅｓｐｉｍａｔ（登録商標）デバイス（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍ）が挙げられる。

このようなデバイスは全て、ＰａｐＭＶＶＬＰの供給に好適な製剤の使用を必要とする。また、当業者であれば理解可能と思われるが、通常、各製剤は、採用するデバイスのタイプに固有のものであり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、および／または担体に加えて、適切な噴霧材料の使用を伴ってもよい。さらに、リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接錯体、またはその他の種類の担体の使用も企図されている。

本発明のある実施形態では、前記医薬組成物は鼻腔内に投与され、よって、前記組成物は、鼻粘膜表面とのより持続的な接触を提供する経鼻ゲル、クリーム、ペースト、または軟膏として製剤される。これらの製剤は、通常、約１０〜約２５０，０００センチポイズ（ｃｐｓ）、例えば、約２５００〜約１００，０００ｃｐｓまたは約５，０００〜５０，０００ｃｐｓの粘度を有する。このような製剤は、例えば、アルキルセルロースおよび／または当該技術分野で周知の他の高粘度生体適合性担体をベースとしてもよい。アルキルセルロースの非限定的な例として、メチルセルロースが挙げられる。メチルセルロースは、好適な濃度、例えば、担体１００ｍｌ当たり約５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または担体１００ｍｌ当たり約２５ｍｇ〜約ｍｇの濃度で含有させることができる。ある実施形態では、ＰａｐＭＶＶＬＰを含有する担体を、鼻粘膜表面に貼り付けが可能な好適な基材、例えば、ガーゼ等の布材に吸収させ、前記ＰａｐＭＶＶＬＰを前記粘膜へ浸透させるようにしてもよい。

ある実施形態では、ゲル製剤は、透過促進剤（浸透促進剤）をさらに含んでもよい。透過促進剤としては、ジメチルスルホキシドおよびデシルメチルスルホキシド等のスルホキシド；ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ポロキサマー（２３１、１８２、１８４）、Ｔｗｅｅｎ（２０、４０、６０、８０）、およびレシチン等の界面活性剤；１−置換アザシクロヘプタン−２−オン、特に、１−ｎ−ドデシルシクラザシクロヘプタン−２−オン；ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール等の脂肪アルコール；ラウリン酸、オレイン酸、および吉草酸等の脂肪酸；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、メチルプロピオネート、およびオレイン酸エチル等の脂肪酸エステル；ポリオールおよびそのエステル（プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールモノラウレート等）、アミドおよび他の窒素化合物（尿素、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−ピロリドン、１−メチル−２−ピロリドン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン等）、テルペン；アルカノン、および有機酸、特に、サリチル酸およびサリチル酸塩、クエン酸およびコハク酸が挙げられるが、これらに限定されない。透過促進剤は、約０．１〜約３０％（ｗ／ｗ）の範囲で存在すればよい。ゲル組成物は、緩衝剤、例えば、炭酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、塩酸、乳酸、酒石酸、無機および有機塩基をさらに含有してもよい。緩衝剤は、当業者に公知のように、使用する緩衝剤（１以上）の種類に応じて、約１〜約１０重量パーセント、例えば、約２〜約５重量パーセントの濃度で存在してもよい。しかしながら、緩衝剤の濃度は変更可能であり、いくつかの実施形態では、緩衝剤は、組成物中で、最大１００％の量の水に置き換えられてもよい。

本発明のある実施形態では、前記医薬組成物を経直腸または膣内投与用に製剤する。前記医薬組成物は坐薬として提供してもよく、前記坐薬は、有効成分（１以上）を１以上の好適な非刺激性の賦形剤または担体と混合することによって調製してもよい。賦形剤または担体の非限定的な例としては、カカオ脂、ポリエチレングリコール、坐薬用ワックス、またはサリチル酸塩が挙げられる。これらは室温では固体であるが、体温では液体であり、よって、直腸または膣腔内で溶融して前記有効成分を放出する。膣内投与に好適な本発明の製剤として、当該技術分野で適切なものとして知られている担体を含有する腟坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレー式製剤が挙げられる。

また、市販のワクチンと併用される、ＰａｐＭＶＶＬＰを含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。

他の医薬組成物および医薬組成物の調製方法が当該技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ」（以前の「ＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。

＜キット＞
本発明は、ＶＬＰ調製のためのインビトロプロセスで使用する各種成分を含むキット、ならびに、ＰａｐＭＶＶＬＰを含む医薬キットをさらに提供する。

＜組換えＶＬＰ調製用キット＞
本発明のある実施形態は、本明細書中に記載のインビトロプロセスで使用する成分を含むキットを提供する。例えば、前記キットは、ＰａｐＭＶ外被タンパク質をコードするプラスミドおよび／またはｓｓＲＮＡ鋳型をコードするプラスミドを備えてもよいし、あるいは、前記キットは、精製した組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質および／または精製したｓｓＲＮＡ鋳型を備えてもよい。

前記キットは、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質もしくはｓｓＲＮＡの調製、集合反応、または組換えＶＬＰの精製に使用する、培地、ポリメラーゼ、制限酵素、緩衝液、誘導因子、ヌクレアーゼ等の１以上の他の成分を、任意にさらに備えてもよい。

前記キットの個々の成分は、別個の容器内に包装されるが、ある実施形態では、いくつかの成分を、乾燥または凍結乾燥させた形態で提供してもよい。前記キットは、使用説明書をさらに備えてもよい。

＜医薬キット＞
本発明のある実施形態は、アジュバント、免疫賦活剤、またはワクチンとして使用される組換えＰａｐＭＶＶＬＰを含む医薬キットを提供する。前記キットの個々の成分は、別個の容器内に包装すればよく、そして、このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関が規定する形態の表示が付随する場合がある。このような表示は、製造、使用、または販売に関する当該機関の認可を反映している。前記キットはまた、前記組換えＰａｐＭＶＶＬＰの使用方法または投与レジメンを概説した指示書または説明書を、任意に備えていてもよい。

前記キットがアジュバントとして使用される組換えＰａｐＭＶＶＬＰを備える場合、前記キットは、前記組換えＰａｐＭＶＶＬＰと併用される１以上の抗原をさらに備えていてもよい。ある実施形態では、前記抗原は、市販のワクチン等、ワクチンの形態であってもよい。

前記キットの成分の１以上が、例えば、水溶液または滅菌水溶液のような溶液として提供される場合、容器手段自体を、吸入器、注射器、ピペット、点眼器、またはその他類似の装置とし、これらから前記溶液を対象に投与してもよいし、または前記キットの他の成分に添加し、混合してもよい。

前記キットの成分は、乾燥または凍結乾燥させた形態で提供してもよく、前記キットは、前記凍結乾燥させた成分の再構成に好適な溶媒をさらに備えることができる。容器の個数または種類にかかわらず、本発明のキットは、患者への組成物の投与を助ける器具をさらに含んでもよい。このような器具としては、吸入器、経鼻スプレーデバイス、ネブライザー、注射器、ピペット、ピンセット（ｆｏｒｃｅｐｓ）、計量スプーン、点眼器、または同様の医学的に認可されている送達媒体が挙げられる。

本明細書に記載した発明のさらなる理解のため、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態について説明することを意図したものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと理解すべきである。

実施例１：ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ調製プロセス：概要
本実施例に記載のプロセスを、図６に示すフローチャートに概説している。このプロセスで製造された組換えＶＬＰ（ｒＶＬＰ）は、幅１５ｎｍ、長さ５０〜数千ｎｍの桿状のナノ粒子であった。代表的なｒＶＬＰ調製物は、平均サイズが１５×１００ｎｍであった。ｒＶＬＰのサイズを、集合反応後に、数個のｒＶＬＰを高分子重合させて最終的に得られるｒＶＬＰの長さが最大数千ｎｍとなるように、拡大することが可能である。

＜１．中間生成物１の製造（組換え外被タンパク質（ｒＣＰ））＞
ｒＣＰを、誘導性プロモーターの制御下にあるｒＣＰ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡで形質転換させた宿主細胞内において、製造した。形質転換した宿主細胞を、標準的な培地で培養した。前記培地に生化学的誘導因子を添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘導期間の終了時に、細胞を採取し、溶解用緩衝液に懸濁し、破砕した。細胞溶解物を、ゲノムＤＮＡおよび膜の除去により清澄化した。ｒＣＰを、イオンマトリックス親和性樹脂上に捕捉し、エンドトキシンおよび低分子量分子から精製した。最終的に得られた中間生成物１は、ろ過により滅菌したタンパク質溶液であった。２℃〜８℃で保存した滅菌生成物は、数年間安定である。

（１．１宿主とベクターの組み合わせ）
宿主：大腸菌菌株であるＤＨ５−α、ＢＬ２１、およびＢＤ７９２、ならびに、酵母のピキア・パストリスＧＳ１１５菌株を使用した。

ベクター：ｐＥＴ_２４およびｐＱＥ_８０プラスミドＤＮＡを原核細胞と共に使用し、ｐＰＩＣＺαプラスミドＤＮＡを、酵母細胞と共に使用した。

（１．２バイオマスの製造（培養））
原核生物バイオマスを、フラスコおよびバイオリアクター内の両方で製造した。

酵母バイオマスを、フラスコ内のみで製造した。

数種類の培地を、バイオマスの育成に使用した（唯一の炭素源としてグリセロールまたはグルコースを用いた限定培地、ならびに酵母抽出物およびトリプトンを炭素源として用いた、より一般的な培地）。

（１．３組換え遺伝子発現の誘導）
組換え遺伝子発現の誘導を、種々のＩＰＴＧ量（０．３〜２ｍＭ）および種々のインキュベーション時間（３〜２４時間）を用いて、２０℃、２２℃、２５℃、３２℃、または３７℃で行った。最適な誘導は、ＩＰＴＧ量０．７〜１ｍＭ、６〜９時間、２２℃〜２５℃の条件下で起こった。

特定のグルコース／グリセロール／ラクトース比率を有する自己誘導培地を、３２℃で使用した。

（１．４バイオマスの回収、濃縮、および緩衝液交換）
細胞は、遠心分離により濃縮できる。湿潤バイオマスは、−６０℃よりも低い温度で凍結させて、数ヶ月間保存することができる。細胞破砕の前に、細胞を、中性の高張溶解用緩衝液（例えば、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ）に懸濁させた。

細胞濃縮および緩衝液交換は、タンジェント流ろ過によっても行える。緩衝液交換の際には、ｒＣＰが細菌ＲＮＡ上にインビボ集合するのを防止するため、高張液を使用すべきである。細胞懸濁液は、−６０℃よりも低い温度で凍結させて数ヶ月間、または、２℃〜８℃で７２時間保存することができる。

（１．５細胞破砕）
細胞を、フレンチプレス、ホモジナイザー、またはソニケーターを使用して、機械的に破砕した。

（１．６細胞溶解物の液化および清澄化）
ＤＮａｓｅ処理を使用して、細菌ゲノムＤＮＡを断片化した。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商標）を含む、種々のＤＮａｓｅを使用した。

大型の細胞フラグメントおよび膜を、遠心分離またはタンジェント流ろ過（３００ｋＤａ〜０．４５μｍの分画分子量（ＭＷＣＯ）の膜）により、前記細胞溶解物から除去した。

低分子量の夾雑物は、タンジェント流ろ過（０〜３０ｋＤａＭＷＣＯの膜）により除去できる。

（１．７イオンマトリックスアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による捕捉および精製）
前記ｒＣＰは、６×Ｈｉｓ標識を内部に有し、イオンマトリックスアフィニティクロマトグラフィにより捕捉および精製した。前記清澄化した細胞抽出液をＩＭＡＣ充填する際のバックグラウンドを、低濃度のイミダゾールを使用して低減した。ｒＣＰは、ｐＨ勾配またはイミダゾールを用いてＩＭＡＣカラムから溶出できる。

（１．８エンドトキシン除去）
ｒＣＰ溶液中に存在する夾雑エンドトキシンは、陰イオン交換クロマトグラフィー／ろ過により除去できる。

（１．９イミダゾール除去）
ｒＣＰ溶液中に存在する夾雑イミダゾールは、透析またはタンジェント流ろ過（５〜３０ｋＤａのＭＷＣＯの膜）により除去できる。

＜２中間生成物２（ｓｓＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ））の製造＞
ＰａｐＭＶの多重変異（ｐｏｌｙ−ｍｕｔａｔｅｄ）ゲノムを、プラスミドＤＮＡに挿入した。前記組換えプラスミドを使用し、細菌を形質転換した。形質転換した細菌を培地で培養し、分子生物学的手法により、細胞培養物からの前記プラスミドＤＮＡの捕捉と精製を行った。

プラスミドＤＮＡを、合成ＲＮＡ転写物の終了箇所において、ＤＮＡ制限酵素消化により直線化した。

ＳＲＴの転写を、ＲＮＡポリメラーゼを使用して行った。発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから生じる転写物が、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ切断点から遊離されるように設計した。ＳＲＴをインビトロで製造し、ＤＮＡ、タンパク質、および遊離ヌクレオチドを除去して精製した。最終的に得られた中間生成物２は、ろ過により滅菌したＲＮＡ溶液であった。−６０℃よりも低い温度で保存した滅菌生成物は、数年間安定である。

（２．１宿主とベクターの組み合わせ）
プラスミドＤＮＡの複製を可能にする種々の細菌宿主を、選択した細菌宿主内で複製可能な種々の標準的な発現ベクターと共に使用してもよい。前記発現ベクターは、ＳＲＴの転写のための原核ＲＮＡポリメラーゼを内部に有しているべきである。

（２．２プラスミドＤＮＡの製造および精製）
前記プラスミドＤＮＡの調製および浄化には、当該技術分野で公知の種々のプラスミドＤＮＡの抽出方法および精製方法を使用することができる。

（２．３プラスミドＤＮＡの直線化）
前記プラスミドＤＮＡの直線化に用いる前記制限エンドヌクレアーゼは、以下の条件を満たすように選択した：（ｉ）前記制限酵素は、前記ＤＮＡ配列を、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとＳＲＴ内に存在させるべき最終のヌクレオチドとの間で切断してはならない。（ｉｉ）前記制限酵素は、前記ＤＮＡ配列を、ＳＲＴ内に存在させるべき最終のヌクレオチドの直後で切断しなければならない。

（３．３ＲＮＡ鋳型の合成）
ＳＲＴの５’末端は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質核形成シグナルを有しているが、一方、他のヌクレオチド配列は、前記ＰａｐＭＶ５’末端ゲノムの多重変異体（ｐｏｌｙｍｕｔａｔｅｄｖｅｒｓｉｏｎ）由来である。例示的なＳＴ配列コードするＤＮＡ配列を、図７に示している［配列番号５および６］。

（３．４ＳＲＴの精製）
全長ＳＲＴは、ＳＲＴの大きさとの関連で決定したＭＷＣＯの膜を用いたタンジェント流ろ過により、遊離リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから精製することができる。例えば、１５００ｎｔ長のＳＲＴを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用して遊離ヌクレオチドから精製した。

＜３．ｒＶＬＰの製造＞
中間生成物１および２を組み合わせることにより、ｒＶＬＰの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液中で行った。集合により新たに生じたｒＶＬＰを、少量のＲＮａｓｅと共にインキュベートし、ｒＶＬＰから突出しているＲＮＡを除去した。この操作により、ｒＶＬＰの溶解性が向上する。次いで、平滑化したｒＶＬＰを、夾雑物および遊離ｒＣＰ（集合しなかった単量体）から精製した。最終生成物は、ろ過により滅菌したｒＶＬＰ懸濁液であった。２℃〜８℃で保存した滅菌生成物は、数年間安定である。

（３．１集合反応）
前記集合反応過程は、中性の水系緩衝液中で行われ、他の特定のイオンを必要としない。集合反応は、ｓｓＲＮＡ上で集合するｒＣＰの天然の特性に基づいている。

前記集合反応は、種々のタンパク質対ＲＮＡ比率を用いて行うことができる。１５００ｎｔ長のＳＲＴとの最適な比率は、１ｍｇのＲＮＡに対し１５〜３０ｍｇのタンパク質である。

前記集合反応は、２℃〜３７℃の範囲内で変更可能な温度で、前記中間生成物の濃度および前記溶液の温度に応じた時間、実施することができる。

（３．２ｒＶＬＰの平滑化）
突出したＲＮＡは、種々のヌクレアーゼを使用し、標準的な条件下で前記ｒＶＬＰから除去すればよい。

（３．３ｒＶＬＰの濃縮および精製）
ｒＶＬＰ濃縮は、１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用したダイアフィルトレーションにより行ってもよい。

夾雑遊離ヌクレオチドは、１０〜１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を用いたダイアフィルトレーションにより除去できる。

夾雑ヌクレアーゼは、１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を使用したダイアフィルトレーションによって除去できる。

実施例２：例示的なｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ調製プロセス
（ｒＣＰの製造）
誘導性プロモーターの制御下にあるｒＣＰ遺伝子を含むＤＮＡ。簡潔には、６×Ｈｉｓ標識を内部に有するＰａｐＭＶＣＰを、制限酵素ＮｃｏｌおよびＢａｒｎＨＩに挟まれたｐＱＥ８０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングし、当該タンパク質をＴ５プロモーターの制御下で発現させた。大腸菌ＢＤ−７９２を前記プラスミドで形質転換し、標準的な培地で培養した。前記培地にＩＰＴＧを添加することにより（０．７〜１ｍＭＩＰＴＧを２２℃〜２５℃で６〜９時間）、タンパク質の発現を誘導した。

誘導期間の終了時に、細胞を採取し、溶解用緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭＮａＣｌ）に懸濁し、フレンチプレス、ホモジナイザー、またはソニケーターを使用して、機械的に破砕した。標準的なＤＮａｓｅ処理によるゲノムＤＮＡの除去、遠心分離またはタンジェント流ろ過（３００ｋＤａ〜０．４５μｍのＭＷＣＯ膜）による大型の細胞フラグメントおよび膜の除去により、細胞溶解物を清澄化した。ｒＣＰを、イオンマトリックス親和性樹脂上に捕捉し、標準的な手順を用いて、イミダゾールにより溶出した。前記ＰａｐＭＣ外被タンパク質は、２５０ｍＭ〜１Ｍのイミダゾールで溶出できる。溶出は、ｐＨ勾配を用いても達成できる。次いで、ｒＣＰを、陰イオン交換クロマトグラフィー／ろ過によりエンドトキシンから精製し、タンジェント流ろ過（０〜３０ｋＤａのＭＷＣＯの膜）により小型低分子から精製した。ｒＣＰ溶液中に存在する夾雑イミダゾールを、透析またはタンジェント流ろ過（５〜３０ｋＤａのＭＷＣＯの膜）により除去した。最終的に得られたｒＣＰタンパク質溶液を、ろ過により滅菌した。

（ＳＲＴの製造）
ＳＲＴをコードするＤＮＡの配列を、図７Ａに示す［配列番号５］。ＳＲＴは、ＰａｐＭＶのゲノムに基づき、ＰａｐＭＶ外被タンパク質核形成シグナルを５’末端に有している（図７Ａにおいて、四角で囲んでいる）。残りのヌクレオチド配列は、全ＡＴＧコドンをＴＡＡ終止コドンへと変異させるように、多重変異（ｐｏｌｙ−ｍｕｔａｔｅｄ）されている。前記配列の最初の１６個のヌクレオチド（図７Ａの下線部）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ発現ベクター内に位置するＴ７転写開始部位を含み、ＲＮＡ転写物内に存在している。五量体の繰り返し単位を、図７Ａにおいて下線部で示している。転写物全体としては、１５２２ヌクレオチドの長さである。図７Ｂに示すより長いＳＲＴ［配列番号６］もまた、問題なくインビトロ集合に使用できた。

前記ＳＲＴに対応するＤＮＡを、標準的な手順を用いて、原核ＲＮＡポリメラーを含むＤＮＡプラスミドに挿入した。前記組換えプラスミドを使用して大腸菌の菌体を形質転換し、続いて、前記形質転換した細菌を、標準的な培地で培養した。細胞培養物からの前記プラスミドＤＮＡの回収と精製を標準的な技術によって行い、次に、前記プラスミドＤＮＡを、そのＤＮＡ配列を、前記ＳＲＴ配列のヌクレオチドの直後の部位で制限酵素ＭｌｕＩによって切断することにより直線化した。

製造元が推奨するプロトコールにしたがってＲｉｂｏＭＡＸ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、ＳＲＴの転写を行った。発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから生じる転写物が、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ切断点から遊離されるように設計した。ＳＲＴの精製を、１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を用いたタンジェント流ろ過により、ＤＮＡ、タンパク質および遊離ヌクレオチドを除去することによって行った。最終的に得られたＲＮＡ溶液を、ろ過により滅菌した。

（ｒＶＬＰの製造）
ｒＣＰおよびＳＲＴを組み合わせることにより、ｒＶＴＰへの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）中で行った。集合反応は、１ｍｇのＲＮＡに対し、１５〜３０ｍｇのタンパク質というタンパク質対ＲＮＡ比率を用いて行った。集合により新たに生じたｒＶＬＰを、少量のＲＮａｓｅ（ＲＮＡ１μｇ当たりＲＮＡｓｅ０．０００１μｇ）でインキュベートし、ｒＶＬＰから突出しているＲＮＡを除去した。次いで、１０〜１００ｋＤａのＭＷＣＯの膜を用いたダイアフィルトレーションにより、夾雑物および遊離ｒＣＰ（集合しなかった単量体のｒＣＰ）から、平滑化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＶＬＰを精製した。最終的に得られたｒＶＬＰ懸濁液を、ろ過により滅菌した。

実施例３：合成ｓｓＲＮＡを含有するＰａｐＭＶＶＬＰの投与による、マウスにおける抗ウイルス応答の誘導
周知のトール様受容体３（ＴＬＲ−３）リガンドであるポリイノシン・ポリシチジン酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ；ｄｓＲＮＡ）は、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＪＥ、ＫＣ、ｍＧＣＳＦ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、およびＴＮＦ等の炎症性サイトカインの分泌を誘導することにより、肺における自然免疫応答を誘導する誘導因子であることがわかっている（Ｓｔｏｗｅｌｌｅｔａｌ．、２００９、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．、１０：４３）。また、ＴＬＲ−７が、ｓｓＲＮＡおよびＲ８３７（グアノシン類似体）等のリガンドの結合により、自然免疫応答を活性化することも知られている。

自然免疫応答および抗ウイルス応答の発達を誘導するＰａｐＭＶＶＬＰの能力を高める目的で、ｐｏｌｙＩ：ＣｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡのいずれかを含有するＰａｐＭＶＶＬＰを、実施例２に記載の方法により調製した。ＰａｐＭＶ外被タンパク質を、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｄｓＲＮＡ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｓｓＲＮＡと共にインビトロで集合させ、各ＲＮＡを含むＶＬＰを製造した。ｓｓＲＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａＴ７ＲｉｂｏｍａｘＥｘｐｒｅｓｓｌａｒｇｅｓｃａｌｅＲＮＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、インビトロで調製した。

集合により得られたＶＬＰを電子顕微鏡観察したところ、Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．に記載の方法（２００６、ＦＥＢＳＪ．、２７３：１４−２５）により調製したＶＬＰと似ていることがわかった（図８Ａに示すｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ、図８Ｂに示すｐｏｌｙＩ：Ｃ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ参照）。

前記２種類のＶＬＰについて、インフルエンザウイルスのチャレンジに対する防御誘導の有効性を評価した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ（「ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ」）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ（「ＰａｐＭＶＶＬＰｐｏｌｙＩ：Ｃ」）、または同量のＲＮＡ（すなわち、３μｇのｐｏｌｙＩ：ＣまたはｓｓＲＮＡ）で処理した。コントロール群のマウスを、６０μｇのＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＣＰ）モノマー（ＲＮＡを含まない）またはコントロールである緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）で処理した。マウスは、６０μｇのＰａｐＭＶＶＬＰを７日間隔で２回鼻腔内投与して処理し、最後の処理の３日後に、２００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジした。その後の１４日間、前記動物の体重、症状、および生存率を、１日１回測定した。２０％超の体重低下を示した動物を屠殺した。

結果を図９Ａおよび９Ｂに示す。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡで処理したマウスは、前記処理群の中でも最良の実験成績を示した。具体的には、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡで処理したマウスにおいては、有意な体重低下は見られず（図Ａ）、さらに、症状は、あったとしてもごくわずかであった（図９Ｂ）。ＰａｐＭＶＶＬＰｐｏｌｙＩ：ＣまたはｐｏｌｙＩ：Ｃ単独で処理した群は、チャレンジに対して部分的な防御を示し、コントロール群と比べて、体重低下の減少（図９Ａ）、症状の軽減（図９Ｂ）が見られた。ＰａｐＭＶＣＰモノマーによる処理では防御は得られず、前記モノマーで処理したマウスで観察された体重低下（図９Ａ）および症状（図９Ｂ）は、ＰＢＳコントロールで処理したマウスで観察されたものと同程度であった。次に、ＰａｐＭＶＶＬＰｐｏｌｙＩ：Ｃ分析を行った結果、これらのＶＬＰは、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ程は安定ではないことが示唆され、これにより、性能面で劣る結果となったものと考えられる。

実施例４：ＰａｐＭＶＶＬＰ＃１の投与による、マウスにおけるサイトカインの誘導
ＰａｐＭＶＶＬＰにより肺内で誘導されるメカニズムを解明するため、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰ、１５μｇのＰａｍＣＳＫ４（ＴＬＲ−２リガンドであり、１型ＩＦＮの非誘導因子）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、またはコントロールである緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣ１、ｐＨ８）を７日間隔で２回、マウス（５匹／群）の鼻腔内に接種した。２回目の処理の２４時間後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、Ｌｕｍｉｎｅｘｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭｉｌｌｉｐｌｅｘＭｏｕｓｅｃｙｔｏｋｉｎｅｐｒｅｍｉｘｅｄ３２−ｐｌｅｘｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、サイトカインの存在をスクリーニングした。

２つの主要なサイトカイン、すなわち、インターロイキン９（ＩＬ−９）およびインターフェロン−γ−誘導タンパク質１０ｋＤａ（ＩＰ−１０）が、ＰａｐＭＶＶＬＰまたはＰａｍＣＳＫ４処理により誘導された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。Ｔ細胞の増殖を促進し、アポトーシスを抑制するＩＬ−９は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球によって分泌されるサイトカインである。ＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γの分泌の結果出現し、刺激部位におけるＴリンパ球、樹状細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージの動員に重要な役割を果たす。ＰａｍＣＳＫ４（公知のＴＬＲ−２リガンドであり、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）分子）およびＰａｐＭＶＶＬＰによる両サイトカインの誘導は、前記ＶＬＰもまたＰＡＭＰである可能性を示唆するものである。

実施例５：ＰａｐＭＶＶＬＰ＃２の投与による、マウスにおけるサイトカインの誘導
処理の６時間後にＢＡＬを行い、前述の処理を１回または７日の間隔をあけて２回の接種とした以外は、実施例４と同様の方法で実験を行った。この実験においても、前述同様、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰを使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ（３２サイトカイン検出キット）を使用し、処理後早期にサイトカイン産生をスクリーニングした。

結果を図１１Ａ〜１１Ｒに示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰ処理を２回行うと、１回の処理の場合と比べ、マウスにおいてサイトカインおよびケモカインがより効率的に誘導されたことを示している。さらに、処理の６時間後においては、処理の２４時間後と比べ、より多くの種類のサイトカインおよびケモカインが検出された（図１１および図１０を比較）。

ＭＩＰ−ｌα、ΜＩΡ−Ιβ、ＭＩＰ−２、ｍＫＣ、ＴＮＦ−α、およびＭＣＰ−１が、ＰａｐＭＶＶＬＰ処理マウスから採取したＢＡＬ中に多量に存在することがわかった（図１１Ａ〜ΕおよびＨ）。これらのサイトカインおよびケモカインは、ヒト顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）を活性化し、これにより、急性好中球性炎症を誘導する場合がある。また、これらサイトカインおよびケモカインは、線維芽細胞およびマクロファージからのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−ｌα／β等の他の炎症性サイトカインの合成および放出を誘導するが（ＭａｕｒｅｒａｎｄｖｏｎＳｔｅｂｕｔ，２００４，ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，３６：１８８２−１８８６）、これらは、ＰａｐＭＶＶＬＰによっても誘導されることがわかった（図８Ｅ、Ｎ、Ｏ、およびＰの各図参照）。さらに、ＭＩＰ−１タンパク質は、インフルエンザウイルスをはじめとするウイルス（Ｍｅｎｔｅｎｅｔａｌ．，２００２，ＣｙｔｏｋｉｎｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｖｉｅｗｓ，１３：４５５−４８１）および寄生虫（Ａｌｉｂｅｒｔｉｅｔａｌ．，２０００，ＮａｔｕｒａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：８３−８７）等の感染性病原体に対する炎症反応を誘導することにより、健康を促進することができ、このことは、先の実施例に示した結果と一致している。

また、ＩＬ−６は、ＰａｐＭＶＶＬＰの投与に反応して分泌されることが観察された（図１１Ｎ）。興味深いことに、細菌である肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染に対する耐性に、ＩＬ−６分泌が必要であることがわかっている（ｖａｎｄｅｒＰｏｌｌｅｔａｌ．，１９９７，ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．，１７６（２）：４３９−４４）。

ＰａｐＭＶＶＬＰ処理により、ＩＰ−１０が強力に誘導された（図１１Ｉ）。ＩＰ−１０は、炎症部位におけるＴ細胞の動員、さらにナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖と活性化を助ける走化性ケモカインである。

インターロイキン１７もまた、ＰａｐＭＶＶＬＰ処理によって誘導された（図１１Ｊ）。ＩＬ−１７は、インターフェロンガンマと同様、種々の組織においてケモカイン産生を増加させることにより、単球および好中球を炎症部位に動員するよう作用するサイトカインである。ＩＬ−１７はヘルパーＴ細胞によって産生されるものであり、細胞外病原体の免疫系への侵入に反応する炎症性サイトカインでもある。ＩＬ−１７は、ＩＬ−６、顆粒球コロニー刺激因子、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＫＣ、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−２等の炎症性サイトカインおよびケモカインの発現上昇により、局所組織の炎症に対処するが（Ｚｅｐｐｅｔａｌ．，２０１１，ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ．Ａｐｒ１２．［印刷物に先駆けたオンライン出版］）、これらもまた、ＰａｐＭＶＶＬＰ処理によって誘導されることがわかった。

ＰａｐＭＶＶＬＰ処理（図１１Ｑおよび１１Ｒ）は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦも誘導したが、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生させることが知られている。単球は、血液循環を離脱して組織へと移動し、ここでマクロファージへと成熟する。よって、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、感染と闘う上で不可欠なプロセスである、少数のマクロファージを活性化してマクロファージ数を急速に増加させるという炎症性カスケードの一部をなしている（Ｍｅｔｃａｌｆ，２０１０，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ，２０：４２５−４３４）。

本実施例および実施例４に記載の結果は、マウスをＰａｐＭＶＶＬＰで処理することにより、免疫系細胞によって分泌されるサイトカインおよびケモカインのプロファイルが示すように、強力かつ全般的な炎症反応が誘導されることを実証している。サイトカインおよびケモカインのレベルは、処理の６時間後に最大となり、処理の２４時間後に有意に低下した。炎症性サイトカインおよびケモカインが、免疫系細胞および顆粒球の移動を誘導し、これにより、前記動物の５日間を超える抗ウイルス状態をもたらす可能性が高い。誘導されたサイトカインは、１型ＩＦＮを分泌させることもでき、そして、この１型ＩＦＮが抗インフルエンザ活性を提供することが知られている。

実施例６：ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによるＴＬＲ−７の活性化
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス、ＭＹＤ８８ＫＯマウス、およびＩＲＦ５／７ＫＯマウス（３〜５匹／群）を、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。免疫の２４時間後に脾細胞を単離し、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＢ細胞におけるＣＤ８６およびＣＤ６９の発現を分析した。ＦＡＣＳにより細胞をソーティングし、ＣＤ８６およびＣＤ６９の発現量を、ＣＤ６９またはＣＤ８６特異抗体の結合による蛍光強度により評価した。得られた結果を、ＰＢＳサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比率として、図１２に示す。

簡潔には、これらの結果は、ＤＣ、Ｂ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞等の抗原提示細胞は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子によって活性化されることを示している。ＩＲＦ５／７、Ｍｙｄ８８、またはＴＬＲ７を欠損させたマウスでは活性化は起こらないため、活性化は、ＩＲＦ５／７、Ｍｙｄ８８、およびＴＬＲ−７に依存している。ＴＬＲ−７は、ＶＬＰに含まれるｓｓＲＮＡによって誘導されると考えられる。ＰａｐＭＶの外被タンパク質（単量体または他の低分子量の形態）を使用して行った実験では、ＴＬＲ−７は活性化されなかった。

ＩＲＦ５／７は、ＴＬＲ−７の刺激によって誘導されるインターフェロン応答因子であり、インターフェロンアルファの産生を引き起こす。Ｍｙｄ８８分子は、ＴＬＲ−７によって誘導されるシグナルの伝達を担うアダプター分子である。前記反応のカスケードは、以下の通りであると考えられる：１）ＶＬＰ中のｓｓＲＮＡによるＴＬＲ−７の誘導、２）Ｍｙｄ８８の関与に続き、ＩＲＦ５／７が誘導され、これにより、インターフェロンアルファ産生の増加が起こる。最後に、インターフェロンアルファが、ＰａｐＭＶＶＬＰナノ粒子の免疫調節効果に貢献する。

実施例７：形質細胞様樹状細胞のＰａｐＭＶＶＬＰ免疫原性への関与
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５匹／群）を、ＢＳＴ２＋細胞を除去する前処理あり、なしのいずれかの条件下、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡの静脈内投与により免疫した。除去のため、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる免疫の４８時間前と２４時間前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに抗ＢＳＴ２抗体（ｍＡｂ９２７）を５００μｇ腹腔内注射した。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる免疫から２４時間後に、単離した脾細胞におけるＣＤ６９、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ８６の発現を、ＦＡＣＳによって分析した。

結果を図１３に示す。これらの結果は、マウスにおけるＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＰｖＮＡナノ粒子の免疫原性には、ＢＳＴ２^＋細胞（主に形質細胞様樹状細胞）が重要であることを示している。具体的には、ＢＳＴ２＋細胞を除去したマウスにおいては、Ｂ細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＤＣの活性化が起こらないという事実が観察され、これにより、活性化は形質細胞様樹状細胞を介して起こることが示唆された。

実施例８：ＰａｐＭＶＶＬＰ＃１による、インターフェロンα産生の刺激
２群のＣ５７ＢＬ／６マウスと、ＴＬＲ−７ＫＯマウスおよびＭＹＤ８８ＫＯマウス（４匹／群）とを、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群の一方を、実施例７に記載の方法により、まず、抗ＢＳＴ２抗体によって処理した。血清および脾臓におけるＩＦＮ−α産生を、免疫の６時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後、（図１４Ａ）、または免疫の６時間後（図１４Ｂ）に、ＥＬＩＳＡ（ＶｅｒｉＫｉｎｅ（商標）ＭｏｕｓｅＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＡｌｐｈａＥＬＩＳＡＫｉｔ；ＰＢＬＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）によって観測した。

その結果を、図１４に示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子によって刺激されるＩＦＮ−αの産生は、ＭＹＤ８８、ＴＬＲ７、およびＢＳＴ２^＋細胞に依存することを示している。

実施例９：ＰａｐＭＶＶＬＰ＃２による、インターフェロンα産生の刺激
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲＫＯマウス（３匹／群）を、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。前記マウスの脾臓から単離したＢリンパ球および樹状細胞におけるＣＤ８６、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ６９の発現を、免疫の２４時間後に、フローサイトメトリーにより評価した。

結果を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子によるマウス免疫系細胞の活性化には、Ｉ型ＩＦＮ受容体が必要であることを示している。Ｉ型ＩＦＮ受容体を欠損させたマウス（ＩＦＮＡＲＫＯ）においては、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子による免疫系細胞の活性化は見られなかった。

１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡによる免疫後、４日目、８日目、１２日目、２０日目、および３０日目における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲＫＯマウス（９匹／群）の血清中のＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡに対する抗体レベルを、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ被覆プレートに結合する総ＩｇＧを測定する間接ＥＬＩＳＡによって分析した。

結果を図１５Ｃに示す。これらの結果は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の不在下では、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子に対する抗体応答に有意な遅れが生じることを示している。

実施例１０：ＰａｐＭＶＶＬＰによる前処理は、慢性感染の制御を助ける
ＬＣＭＶは、慢性感染（ＨＣＶ感染等）の関連動物モデルである。ＬＣＭＶのクローン１３変異体により、マウスに持続感染が確立される。ＬＣＭＶ感染は、ＨＣＶ感染同様、主としてＣＴＬによって制御されており、ＣＴＬ応答の疲弊は、ＰＤ−１の発現と関連付けられる。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス（３〜６匹／群）を、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３に感染させる６時間前に（静脈内投与）、１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７（市販のＴＬＲ−７リガンド）、または１００μＬのＰＢＳを静脈内に投与することにより処理した。５日目、１１日目、１５日目、２５日目、および４５日目に血液サンプルを採取し、ＬＣＭＶフォーカス形成アッセイにより、ウイルス力価を評価した。感染の１５日後または４５日後にマウスを屠殺し、脾臓における免疫応答をＦＡＣＳにより分析すると共に、脾臓、肝臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、ラット抗ＬＣＭＶ−ＮＰモノクローナルＡｂ（ＶＬ−４）を使用したＭＣ５７線維芽細胞に対するＬＣＭＶフォーカス形成アッセイという、これまでに記載された方法（Ｌａｃａｓｓｅｅｔａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８２：７８５−７９４）によって分析した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血液におけるＬＣＭＶクローン１３のウイルス動態を、図１６に示す。これにより、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、ＬＣＭＶによって誘導される慢性感染を制御できることを示している。

感染後１５日目のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ＫＯマウスの脾臓、腎臓、肝臓、および脳におけるウイルス力価を、図１７に示す。この結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、市販のＴＬＲ７リガンド（Ｒ８３７）よりも優れた効率で、ＴＬＲ７依存的に異なる臓器におけるウイルス量を低減できることを実証している。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子中のＴＬＲ−７リガンドは、分子中のおよそ５％を占めるｓｓＲＮＡ成分であると考えられる。それゆえ、マウスにそれぞれを１００μｇ投与したが、前記マウスにおけるＬＣＭＶウイルス量の低減におけるＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子の効果は、Ｒ８３７の２０倍を上回る。

図１８は、ＬＣＭＶクローン１３による感染前にＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子を投与することにより、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能性が向上することを示している。ＮＰ３９６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に関しても、同様の結果が得られた。特に、図１４Ｆは、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球におけるＰＤ−１の発現量が有意に減少することを示している。ＰＤ−１は免疫疲弊の指標であり、その発現は、ＬＣＭＶクローン１３感染の特徴の一つである。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子によるマウスの前処理により、ＰＤ−１発現量が未感染マウスと同等の低レベルに維持された。このことは、これらのマウスにおいて免疫系が疲弊しておらず、このため、これらのマウスが感染に対して抵抗できることを示唆している。

図１９は、感染後４５日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、腎臓、肝臓、および脳におけるウイルス力価を示している。この結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理によるウイルス量の低減が、処理後数週間にわたって見てとれることを示している。

実施例１１：ＰａｐＭＶＶＬＰによるインビトロでのヒト単球の活性化
ヒトＰＢＭＣを、フィコール勾配により単離し、１００μｇ／ｍＬのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたはＰＢＳで処理した。処理の１８時間後、ＣＤ１４^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞集団（単球）について、フローサイトメトリーにより、ＣＤ８６発現を分析した。

結果を図２０に示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子により、ヒト単球も活性化されることを示している。これらの結果は、３回の独立した実験の結果を示すものである。

実施例１２：ＰａｐＭＶＶＬＰによる抗菌応答の誘導
一群当たり１０匹のマウスを、緩衝液のみ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８）または６０μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡを７日間隔で２回、鼻腔内経路を介して投与することにより処理した。処理後３日目に、前記マウスを肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の毒性株２２０ＣＦＵ（コロニー形成単位）に感染させた。

４日間にわたり、生存を１２時間毎に綿密に観測した。結果を図２１に示す。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子で処理した群のマウスは全て、前記感染を生き残った。緩衝液で処理した群では、生存率は７０％であった。

この実施例で使用した肺炎球菌の投与量は致死未満量であったが、得られたデータは、ＰａｐＭＶナノ粒子による前処理は、肺における自然免疫応答の誘導し、細菌感染に対する防御を提供することを強く示唆している。本実施例および前述の実施例は、ＰａｐＭＶナノ粒子によって付与される防御は、ウイルス感染および細菌感染のいずれにもに有効であることから、非特異的であることを実証している。

実施例１３：ＰａｐＭＶＶＬＰを使用したＬＣＭＶ慢性感染の治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（３匹／群）を、０日目に２×１０^６のＰＦＵＬＣＭＶクローン１３に静脈内投与により感染させ、一日一回の１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与を、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に行う（Ａ群）か、または６日目および７日目のみに行う（Ｂ群）ことにより処理した。血液サンプルを５日目、１０日目、および１５日目に採取し、感染から１５日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、ＬＣＭＶフォーカス形成アッセイにより分析した。

前記動物の血液中で計測されたウイルス力価を、図２２に示す。ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子で処理したマウスは、１５日目には、コントロール群と同じ力価を示したが、１０日目には、両群でウイルス力価の有意な低下が観察された（Ａ群の動物では１０に近い対数減少値）。この結果は、治療レジメンを調整することで、ＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡナノ粒子で処理したマウスにおいて、ウイルス量のさらなる低減が達成可能であることをことを強く示唆している。例えば、処理回数を増やすことが考えられる。１日目から５日目まで、または６日目および７日目に行われた処理によりＬＣＭＶ力価の低減が見られたが、６日目および７日目以降に処理の回数を増やせば、ウイルス量がさらに低減する可能性がある。処理回数の増加に代えて、または処理回数の増加に加えて、ＰａｐＭＶＶＬＰの投与量を、例えば、用量当たり２００μｇまで増加することが考えられる。

前記動物の各種臓器で計測されたウイルス力価を、図２３に示す。６日目および７日目に処理を行った動物（Ｂ群）の脳におけるウイルス量は有意に低減していたが、当該処理マウスの他の臓器におけるウイルス量には、有意な低減は見られなかった。この理由としては、力価の測定を１５日目に行ったため、処理後に感染が「勢いを取り戻す（ｋｉｃｋｂａｃｋ）」のに十分な時間があった可能性が最も高いと考えらえる。６日目および７日目以降に行う処理により、より有意なウイルス量の低減が起こると期待される

実施例１４：複数回のＰａｐＭＶＶＬＰ処理で防御期間が延長される
ＰａｐＭＶＶＬＰ処理により誘導される防御は、約５日間持続することが示された。ＰａｐＭＶＶＬＰの複数回投与による処理によれば、より長い防御期間を提供できるのかどうかを調べるため、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰを、１週間間隔で１回（１×）、２回（２×）、５回（５×）、または１０回（１０×）マウスに鼻腔内接種した。最後の処理の３日後に、マウスをインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルス（およそ１ＬＤ_５０）でチャレンジした。

マウスの体重低下を図２４に示す。前記動物は、前記複数回処理の影響を受けることなく、処理期間中も、コントロール群の動物と同様の、正常な体重増加を示したことも見てとれる。

これらの結果は、複数回処理により、ＰａｐＭＶＶＬＰナノ粒子によって誘導される防御期間を１０週間超まで延長できることを示している。これらの結果はまた、複数回のＰａｐＭＶＶＬＰ処理を行っても、動物の自然免疫は疲弊しないことを示している。最後に、ＰａｐＭＶＶＬＰに対する抗体は初回処理の７日後に出現し、追加免疫処理によって増加することが知られているように、これらの結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰの自然免疫応答誘導能は、抗体産生の影響を受けないことを実証している。

実施例１５：ＰａｐＭＶＶＬＰによる好中球動員の誘導
実施例３のプロトコールにしたがい、マウスに対してｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰの滴下投与（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ）を２回行い、２回目の処理から６時間後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。結果を図２５に示す。ＰａｐＭＶＶＬＰ処理マウスのＢＡＬで発見された好中球を、図２５Ｂにおいて丸で囲んでいる。処理マウスにおいては、コントロール群と比べて、３倍の好中球が観察された。

好中球は、防御機構の最前線である。この実施例は、ＰａｐＭＶＶＬＰ処理マウスにおいて、好中球が、処理後わずか６時間で、迅速に動員されることを示している。肺における細菌感染およびウイルス感染の制御において、好中球が重要な役割を果たすことが知られており、よって、好中球は、ＰａｐＭＶ処理マウスにおいて観察される防御においても、おそらくその役割を果たしているものと思われる。

実施例１６：ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰによる粘膜免疫応答の誘導
２μｇの３価不活性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）と組み合わせた２０μｇのＰａｐＭＶＶＬＰｓｓＲＮＡを、１４日間隔で２回滴下投与することにより、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を処理した。０日目、１４日目、および２８日目に出血を起こさせた。別の一群のマウスは、比較のため、同一のプロトコールにより、皮下経路で免疫した動物である。マウスを、１５日目に、１ＬＤ_５０のインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジし、体重低下を１４日間追跡調査した。

前記免疫動物の血液中のＩｇＧ力価を、ＴＩＶに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２６に示す。使用した免疫経路が同一である場合、ＴＩＶにＰａｐＭＶＶＬＰを添加することにより、総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ応答が、ＴＩＶのみで免疫した群と比べて有意に増加した。興味深いことに、動物の血液中における総ＩｇＧおよび総ＩｇＧ２ａ産生に関しては、鼻腔内経路よりも皮下経路での投与のほうが効率的であった。

前記免疫動物の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中および糞中の抗体力価を、ＴＩＶに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２７に示す。これらの結果から、鼻腔内投与による処理のみが、ＢＡＬ中のＩｇＡ産生を引き起こすことは明らかである。ＴＩＶにＰａｐＭＶＶＬＰを添加することにより、肺におけるＩｇＡ量が、ＴＩＶのみの滴下投与を行った場合と比べて有意に増加した。ＰａｐＭＶＶＬＰとＴＩＶを組み合わせて処理した動物においても、ＴＩＶ単独で処理した群と比べて、ＢＡＬ中の総ＩｇＧの有意な増加が観察された。ＰａｐＭＶＶＬＰの鼻腔内投与とＴＩＶの鼻腔内投与を組み合わせて処理したマウスから得たＢＡＬ中の総ＩｇＧ量は、前記組み合わせを皮下投与して処理したマウスのものと比べて、有意な差はなかった。最後に、興味深いことに、前記組み合わせを鼻腔内投与して処理したマウスの腸においても、ＴＩＶに対するＩｇＡがこの臓器に存在することからわかるように（図２７Ｃ）、粘膜免疫応答が観察された。

インフルエンザウイルスによるチャレンジ後のマウスの体重低下を、図２８に示す。前記チャレンジの結果、鼻腔内経路で免疫した場合、皮下経路で免疫した場合と比べて、より頑強かつ効率的にヘテロサブタイプ株からマウスを防御できることが判明した。ＰａｐＭＶＶＬＰとＴＩＶの組み合わせの鼻腔内投与により免疫した群では、マウスは体重増加を示し、症状も見られなかった。前記組み合わせを皮下投与した場合には、部分的な防御しか得られなかった。しかしながら、３μｇのＴＩＶを３０μｇのＰａｐＭＶＶＬＰと共に皮下投与すれば、完全な防御を得ることができる。ＴＩＶ単独（いずれかの経路で）、ＰａｐＭＶＶＬＰ単独、またはコントロール緩衝液で免疫した他の群は全て、防御が得られず、疾患の症状を示し、有意な体重低下が見られた。

この実験の結果は、ＰａｐＭＶＶＬＰが粘膜アジュバントとして作用し得ることを実証している。粘膜免疫応答を引き起こすアジュバントの能力は、粘模を介して身体に到達する微生物による感染および疾患（インフルエンザ、結核、およびピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染を含む）の効果的な予防または治療に重要である。免疫動物の糞中のＩｇＧの存在は、ＰａｐＭＶＶＬＰをアジュバントとして用いた鼻腔内ワクチン投与を、腸における細菌またはウイルス感染からの防御のために使用できることを示唆している。さらに、ＰａｐＭＶＶＬＰが引き起こす粘膜免疫応答は全般的であるため、ＰａｐＭＶＶＬＰをアジュバントとして用いた鼻腔内ワクチン投与は、膣粘膜における細菌またはウイルス感染（ＨＩＶ−１等）からの防御目的でも使用できる可能性がある。

この実験では、ＰａｐＭＶＶＬＰ単独の鼻腔内投与で処理したマウスでは防御は見られなかったが、これは、ＰａｐＭＶＶＬＰによって誘導される非特異的防御は約５日間しか持続しないことを示す先の実施例における結果と一致している。この実験では、チャレンジは、ＶＬＰの２回目の滴下投与の１４日後に行った。

実施例１７：ＰａｐＭＶＶＬＰによるＴＬＲ−２およびＣＤ１４の活性化
先の実施例で実証したように、細菌宿主細胞内で調製したＰａｐＭＶＶＬＰおよびｓｓＲＮＡと共にインビトロで自己集合させて調製したＰａｐＭＶＶＬＰは、いずれも自然免疫応答を刺激することが可能である。しかしながら、前記２つの異なる方法で調製したＶＬＰは、異なるＴＬＲを活性化する。先に示したように、ｓｓＲＮＡと共にインビトロで自己集合させて調製したＰａｐＭＶＶＬＰは、ＴＬＲ−７を活性化する。これに対し、これまでに記載の方法（Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．、２００６、同上）により、ＰａｐＭＶ外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて調製したＰａｐＭＶＶＬＰは、ＴＬＲ−２およびＣＤ１４を活性化する。

簡潔には、ＴＨＰｌ−ＸＢｌｕｅ（商標）−ＣＤ１４細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を、以下を用いて処理した：１００μｇのＰａｐＭＶＶＬＰ（Ｔｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．記載の方法で調製）または公知のＴＬＲリガンド（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＬＴＡ）由来のリポテイコ酸１００μｇ：ＴＬＲ２およびＣＤ１４リガンド；１μｇのＰａｍ３ＳＣＫ４：ＴＬＲ２リガンド；または１０μｇのフラゲリン：ＴＬＲ５リガンド）、および抗ＣＤ１４、抗ＴＬＲ２、抗ＴＬＲ５抗体のいずれか。ＴＨＰｌ−ＸＢｌｕｅ（商標）−ＣＤ１４細胞は、複数のＴＬＲ（ＴＬＲ２、４、５を含む）を内部に有し、ＴＬＲがリガンドに結合すると、青色を発色するように改変されている。結合すると、前記細胞は青色に変色し、分光光度計を用いて結合の強度を容易に評価できる。測定は、前記細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後に行った。

結果を図２９に示す。ＣＤ１４、ＴＬＲ２、またはＴＬＲ５に対する抗体（Ａｃ）は、各ＴＬＲまたはＣＤ１４の結合をブロックし、これにより、各テスト分子によりどのような相互作用が起こっているのかが判明した。抗ＴＬＲ２抗体をＰａｐＭＶＶＬＰと併用した場合には、光学密度の有意な低下が観察され、抗ＣＤ１４抗体を使用した場合には、大幅な低下が観察された。この実験では、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（公知のＴＬＲ２リガンド）使用時にはより大きな低下が観察されるはずであったのに、ＴＬＲ２に対する抗体は、予期した通りの働きを見せなかった。おそらく、本実験で使用したＰａｍ３ＣＳＫ４量が多すぎたものと考えられる。

細菌内での集合により得られたＰａｐＭＶＶＬＰに関して見られるＴＬＲ活性化における差は、菌体からの単離後に前記ＶＬＰに対して行った洗浄剤処理に起因する可能性がある。この処理は、ＰａｐＭＶＶＬＰの表面に対し、例えば、疎水性残基を露出させるという影響を与えることがあり、この結果、前記ＶＬＰがＴＬＲ２のリガンドとなる場合がある。エンドソームに存在するＴＬＲ７とは対照的に、ＴＬＲ２およびＣＤ１４は、いずれも免疫系細胞上にその表面が露出している。

実施例１８：ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰのアジュバント活性
Ｈ１Ｎ１世界的流行インフルエンザウイルス株Ａ／カリフォルニア／７／２００９の核タンパク質（ＮＰ）を、Ｈｉｓ標識タンパク質として大腸菌内に発現させ、ニッケルアフィニティーカラム上で精製した。ＮＰ抗原（１０μｇ）を、実施例２に記載の方法で調製したＰａｐＭＶＶＬＰ１０、３０、６０、または９０μｇと混合し、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）に接種した。接種の２１日後に、血液サンプルを採取し、体液性応答評価のため、ＧＳＴ−ＮＰ抗原を使用したＥＬＩＳＡによって分析した。

結果を図３０に示す。この結果は、１０μｇのＮＰと１０μｇのＰａｐＭＶＶＬＰとの組み合わせの使用は、ＮＰに対する体液性応答を飽和状態とさせるのに十分であることを実証している。

別の実験において、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を、１０μｇのＮＰ（Ｈ１Ｎ１型Ａ／カリフォルニア／７／２００９由来）を単独で、またはアジュバントとしてのＰａｐＭＶＶＬＰ（１０、３０、６０または９０μｇ）との混合物として含有する製剤を１４日間隔で３回皮下投与することにより免疫した。最後の免疫処理の１４日後に、前記マウスを、ヘテロサブタイプインフルエンザＨ１Ｎ１型ＷＳＮ／３３（およそ１ＬＤ_５０）でチャレンジした。チャレンジ後１４日間にわたり、症状を追跡調査した。体重低下および症状を、毎日点数化した。

結果を図３１に示す。これらの結果は、アジュバントを添加した製剤で免疫したマウスでは、インフルエンザによるチャレンジに対し、最も強力な防御が見られたことを示している。ＮＰ（１０μｇ）＋９０μｇのＰａｐＭＶを接種した群は、最も症状が軽く、体重低下も最も少なかった。インフルエンザのヘテロサブタイプ株に対して観察された防御は、高度に保存されたタンパク質ＮＰに対するＣＴＬ応答がＰａｐＭＶアジュバントによって誘導され、感染に対するより優れた防御が得られたことを強く示唆している。ＮＰは前記ウイルスの内部で発見されるため、図３０に示すＮＰに対する抗体が、感染を中和するとは考えにくく、このことから、チャレンジしたマウスで観察された防御にＣＴＬ応答が関与していることが示唆される。ＰａｐＭＶＶＬＰアジュバントと混合した場合におけるＮＰに対するＩｇＧ２ａアイソタイプの存在は、Ｔ_Ｈ１応答が誘導されたことを示しており、これは、ＣＴＬ応答の誘導と一致する。

それゆえ、この結果は、ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰをアジュバントとして使用すれば、抗体の誘導とＣＴＬ応答の両方が増強されることを示している。

実施例１９：ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶＶＬＰおよびＰａｐＭＶｓｍＶＬＰのアジュバント活性
本実施例では、本発明のプロセスによって調製されたＰａｐＭＶＶＬＰおよびＴｒｅｍｂｌａｙｅｔａｌ．（２００６、同上）に記載の方法で調製されたＰａｐＭＶＶＬＰ（ＰａｐＭＶｓｍ）のアジュバント活性を比較する。電子顕微鏡観察によれば、両ＶＬＰは、同一の外観を有している。

簡潔には、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を、市販の３価不活性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）（２００９−２０１０）単独、またはＰａｐＭＶｓｍもしくは実施例２に記載のプロセスで調製したＰａｐＭＶＶＬＰのいずれか３０μｇをアジュバントとして添加したＴＩＶの皮下注射により免疫した。前記マウスの血液を注射から１４日後に採取し、標準的なプロトコールにより血清を得た。ＴＩＶおよび総ＩｇＧまたはＩｇＧ２ａの力価に関するＥＬＩＳＡを、前記血清を用いて行った。

結果を図３２に示す。これらの結果は、実施例２に記載のプロセスで調製したＰａｐＭＶＶＬＰによれば、１回の注射後、総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ力価が、ＴＩＶ単独の場合と比べて、有意に高くなることを示している。また、実施例２に記載のプロセスで調製したＰａｐＭＶＶＬＰによって得られた力価は、アジュバントしてＰａｐＭＶｓｍを添加したＴＩＶを注射した群で観察された力価よりも優れていた。

この結果は、本発明のプロセスによって調製されたＰａｐＭＶＶＬＰは、ＰａｐＭＶｓｍと構造的に類似しているにもかかわらず、ＰａｐＭＶｓｍよりも強力なアジュバント効果の提供が可能であることを強く示唆している。

ＰａｐＭＶＶＬＰを単独で（ＴＩＶなしで）注射した実験でも、実施例２に記載のプロセスで調製したＶＬＰでは、当該ＶＬＰに対するＩｇＧ２応答が、ＰａｐＭＶｓｍを使用した場合と比べて強いことがわかった。

本明細書中に引用した全ての特許、公開された特許出願を含む刊行物、およびデータベースエントリによる開示内容は、その全体が、このような別個の特許、刊行物、およびデータベースエントリのそれぞれを明示的かつ個々に援用した場合と同程度に、本明細書に援用されるものとする。

本発明をある特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の趣旨および範囲内における種々の変更例が、当業者には明白であると考えられる。当業者に明白なこのような全ての変更例が、以下に記載の特許請求の範囲内に含まれるものと意図している。

Claims

パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するためのインビトロでの製造方法であり、
ａ）組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質とｓｓＲＮＡとを組み合わせる処理を、重量比で５：１〜５０：１のタンパク質対ＲＮＡ比率（タンパク質：ＲＮＡ）で、６．０から９．０のｐＨ、２℃から３７℃の温度で、ＶＬＰへの集合に十分な時間行う工程と、
ｂ）前記ＶＬＰをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているＲＮＡを除去する工程と、
ｃ）前記ＶＬＰを、他のプロセス成分から分離する工程を含み、
前記ａ）工程において、
少なくとも７０％の前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質が、２０量体未満の低分子量種の形態にあり、
前記ｓｓＲＮＡは、
２５０から５０００ヌクレオチドの長さであり、
５’末端にＰａｐＭＶ外被タンパク質核形成シグナルを有し、かつ
ＰａｐＭＶゲノムのＤＮＡ配列と同一の配列を有し、
前記ＤＮＡ配列が、全ＡＴＧコドンをＴＡＡ終止コドンへと変異させるように、多重変異され、
前記ＤＮＡ配列における全チミン（Ｔ）残基が、ウラシル（Ｕ）残基に置換されている、インビトロでの製造方法。
前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質が、遺伝子改変外被タンパク質である、請求項１記載の製造方法。
前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質が、１以上の抗原ペプチドに融合されている、請求項１または２記載の製造方法。
前記１以上の抗原ペプチドが、前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端またはＮ末端に融合されている、請求項３記載の製造方法。
前記タンパク質対ＲＮＡ比率が、重量比で５：１〜５０：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
前記タンパク質対ＲＮＡ比率が、重量比で１０：１〜５０：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ｐＨが、ｐＨ６．５からｐＨ８．５である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ｐＨが、ｐＨ７．０からｐＨ８．５である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
前記温度が、５℃から３７℃である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
前記温度が、１０℃から３７℃である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
前記温度が、２０℃から３７℃である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質が、大腸菌内で産生される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ｓｓＲＮＡが、５００から３０００ヌクレオチドの長さである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ｓｓＲＮＡが、１０００から３０００ヌクレオチドの長さである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
前記ＤＮＡ配列が、
ａ）配列番号５における第１７番目から第５４番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
ｂ）配列番号５に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
ｃ）配列番号６に示す核酸配列と同じ配列を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
組換えパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）外被タンパク質とｓｓＲＮＡとを含み、
前記ｓｓＲＮＡは、
２５０から５０００ヌクレオチドの長さであり、
５’末端にＰａｐＭＶ外被タンパク質核形成シグナルを有し、かつ
ＰａｐＭＶゲノムのＤＮＡ配列と同一の配列を有し、
前記ＤＮＡ配列が、全ＡＴＧコドンをＴＡＡ終止コドンへと変異させるように、多重変異され、
前記ＤＮＡ配列における全チミン（Ｔ）残基が、ウラシル（Ｕ）残基に置換されている、ＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質およびｓｓＲＮＡを含むパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ｓｓＲＮＡが、２５０から５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ、
ａ）配列番号５における第１７番目から第５４番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
ｂ）配列番号５に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
ｃ）配列番号６に示す核酸配列と同じ配列
を含み、
前記配列における全チミン（Ｔ）残基が、ウラシル（Ｕ）残基に置換されている、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
前記組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質が、前記ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＣ末端またはＮ末端で、１以上の抗原ペプチドに融合されている、請求項１６または１７記載のＰａｐＭＶＶＬＰ。
前記ｓｓＲＮＡが、５００から３０００ヌクレオチドの長さまたは１０００から３０００ヌクレオチドの長さである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のＰａｐＭＶＶＬＰ。
請求項１６から１９のいずれか一項に記載のＰａｐＭＶＶＬＰと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
１以上の抗原をさらに含む、請求項２０記載の医薬組成物。
前記１以上の抗原が、１以上のインフルエンザウイルス抗原、１以上の腫瘍関連抗原、または１以上のアレルゲンである、請求項２１記載の医薬組成物。
請求項１６から１９のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、医薬品。
前記医薬品が、対象における抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントである、請求項２３記載の医薬品。
前記免疫応答が、体液性免疫応答、ＣＴＬ免疫応答、または粘膜免疫応答である、請求項２４記載の医薬品。
前記医薬品が、対象における自然免疫応答を刺激することにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するためのものである、請求項２３記載の医薬品。
前記医薬品が、１以上の抗原と組み合わせてワクチンとして使用するためのものである、請求項２３記載の医薬品。
前記１以上の抗原が、１以上のインフルエンザウイルス抗原、１以上の腫瘍関連抗原、または１以上のアレルゲンである、請求項２７記載の医薬品。
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を調製するためのインビトロでの製造方法であり、
ａ）組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質とｓｓＲＮＡとを組み合わせる処理を、重量比で５：１から４０：１のタンパク質対ＲＮＡ比率（タンパク質：ＲＮＡ）で、６．５から８．５のｐＨ、２２℃から３７℃の温度の緩衝液中で、ＶＬＰへの集合に十分な時間行う工程であり、前記組換えＰａｐＭＶが、少なくとも７０％が２０量体未満の低分子量種の形態にある工程と、
ｂ）前記ＶＬＰをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているＲＮＡを除去する工程と、
ｃ）前記ＶＬＰを、他のプロセス成分から分離する工程を含み、
前記ａ）工程において、
前記ｓｓＲＮＡは、
２５０から５０００ヌクレオチドの長さであり、かつ
（ｉ）配列番号５における第１７番目から第５４番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
（ii）配列番号５に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
（iii）配列番号６に示す核酸配列と同じ配列を含み、
前記配列における全チミン（Ｔ）残基が、ウラシル（Ｕ）残基に置換されている、インビトロでの製造方法。