JP6213461B2 - ウイルス様粒子およびその調製プロセス - Google Patents
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Description
特に定義しない限り、本明細書中で使用するあらゆる技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明のプロセスは、組換え外被タンパク質およびssRNA(以下、ssRNA鋳型または「SRT」という)をインビトロで集合させ、VLPを形成させる。
VLPの調製に使用されるPapMV外被タンパク質は、PapMV外被タンパク質全体とすることもできるし、またはその一部とすることもできる。あるいは、例えば、1以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換等を含む野生型PapMV外被タンパク質の遺伝子改変体を使用することもできるが、この場合は、当該外被タンパク質が、自己集合によりVLPとなる能力を保持していることが条件である。野生型PapMV外被(またはカプシド)タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり(Sit,et al.,1989,J.Gen.Virol.,70:2325−2331、およびGenBankアクセッションNo.NP_044334.1参照)、本明細書中においては、配列番号1として示す(図1A参照)。この配列の変異体が公知であり、例えば、Noa−Carrazana氏およびSilva−Rosales氏によって記載された、PapMVのメキシコ分離株の外被タンパク質の配列(2001、Plant Science、85:558)は、配列番号1に対し、88%の配列同一性を有しており、GenBankから入手可能である。PapMV外被タンパク質のヌクレオチド配列も、当該技術分野で公知であり(Sit,et al.、同上、およびGenBankアクセッションNo.NC_001748(ヌクレオチド5889−6536)参照)、本明細書中においては、配列番号2として示す(図1B参照)。
PapMV VLPを調製するための組換えPapMV外被タンパク質は、当業者により、標準的な遺伝子工学技術で容易に調製可能である。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型PapMV外被タンパク質の配列(例えば、配列番号1および2参照)同様、当該技術分野において周知である(例えば、Ausubel et al.(1994&updates)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NewYork参照)。
本発明のプロセスで使用するssRNA鋳型は、例えば、合成ssRNA、天然由来のssRNA、天然由来の修飾ssRNA、天然由来または合成ssRNAのフラグメント等であってもよい。
ssRNA鋳型は、当該技術分野で公知の標準的な技術により、単離および/または調製が可能である(例えば、Ausubel et al.(1994&updates)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York参照)。
集合反応は、調製した組換え外被タンパク質およびssRNA鋳型を使用して、インビトロで行われる。通常、前記組換え外被タンパク質およびssRNA鋳型の両方を、集合前に精製するが、未精製調製物または部分的に精製した外被タンパク質および/またはssRNA鋳型の使用もまた、いくつかの実施形態で企図されている。
集合により得られたPapMV VLPは、それぞれ外被タンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは、1200超の外被タンパク質サブユニットを含み、約500nmの長さである。本発明のプロセスによって調製された組換えPapMV VLPは、野生型ウイルスと同様のサイズであってもよいし、または野生型ウイルスよりも短いか、もしくは長くてもよい。本発明のある実施形態では、組換えPapMV VLPは、外被タンパク質サブユニットを少なくとも40個含む。いくつかの実施形態では、組換えPapMV VLPは、約40〜約1600個の外被タンパク質サブユニットを含んでもよいが、これより多くの外被タンパク質を含むVLPもまた企図されている。組換えPapMV VLPは、通常、約10〜20nmの幅であり、約40nmから数千nmの長さである。ある実施形態では、組換えPapMV VLPの調製物は、その平均長さが約40nm〜約600nm、例えば、約40nm〜約500nm、約40nm〜約400nm、または約40nm〜約300nmである。
本発明は、組換えPapMV VLPの多数の応用例および用途を提供する。例えば、組換えPapMV VLPは、抗原の免疫原性を増強するためのアジュバントとして使用してもよいし、あるいは、抗原(1以上)と融合させた場合には、ワクチンとして使用し得る。ある実施形態では、PapMV VLPを単独で使用し、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより感染を治療または予防してもよい。よって、ワクチンを含む医薬品および/または医薬組成物の調製のための組換えPapMV VLPの使用もまた、本発明の範囲内である。
ある実施形態では、本発明は、有効量のPapMV VLP、ならびに1以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および/または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。所望される場合、例えば、追加の免疫刺激化合物、標準的な治療薬、ワクチン等の他の有効成分を、前記組成物に含有させてもよい。
本発明は、VLP調製のためのインビトロプロセスで使用する各種成分を含むキット、ならびに、PapMV VLPを含む医薬キットをさらに提供する。
本発明のある実施形態は、本明細書中に記載のインビトロプロセスで使用する成分を含むキットを提供する。例えば、前記キットは、PapMV外被タンパク質をコードするプラスミドおよび/またはssRNA鋳型をコードするプラスミドを備えてもよいし、あるいは、前記キットは、精製した組換えPapMV外被タンパク質および/または精製したssRNA鋳型を備えてもよい。
本発明のある実施形態は、アジュバント、免疫賦活剤、またはワクチンとして使用される組換えPapMV VLPを含む医薬キットを提供する。前記キットの個々の成分は、別個の容器内に包装すればよく、そして、このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関が規定する形態の表示が付随する場合がある。このような表示は、製造、使用、または販売に関する当該機関の認可を反映している。前記キットはまた、前記組換えPapMV VLPの使用方法または投与レジメンを概説した指示書または説明書を、任意に備えていてもよい。
本実施例に記載のプロセスを、図6に示すフローチャートに概説している。このプロセスで製造された組換えVLP(rVLP)は、幅15nm、長さ50〜数千nmの桿状のナノ粒子であった。代表的なrVLP調製物は、平均サイズが15×100nmであった。rVLPのサイズを、集合反応後に、数個のrVLPを高分子重合させて最終的に得られるrVLPの長さが最大数千nmとなるように、拡大することが可能である。
rCPを、誘導性プロモーターの制御下にあるrCP遺伝子を含むプラスミドDNAで形質転換させた宿主細胞内において、製造した。形質転換した宿主細胞を、標準的な培地で培養した。前記培地に生化学的誘導因子を添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘導期間の終了時に、細胞を採取し、溶解用緩衝液に懸濁し、破砕した。細胞溶解物を、ゲノムDNAおよび膜の除去により清澄化した。rCPを、イオンマトリックス親和性樹脂上に捕捉し、エンドトキシンおよび低分子量分子から精製した。最終的に得られた中間生成物1は、ろ過により滅菌したタンパク質溶液であった。2℃〜8℃で保存した滅菌生成物は、数年間安定である。
宿主:大腸菌菌株であるDH5−α、BL21、およびBD792、ならびに、酵母のピキア・パストリスGS115菌株を使用した。
原核生物バイオマスを、フラスコおよびバイオリアクター内の両方で製造した。
組換え遺伝子発現の誘導を、種々のIPTG量(0.3〜2mM)および種々のインキュベーション時間(3〜24時間)を用いて、20℃、22℃、25℃、32℃、または37℃で行った。最適な誘導は、IPTG量0.7〜1mM、6〜9時間、22℃〜25℃の条件下で起こった。
細胞は、遠心分離により濃縮できる。湿潤バイオマスは、−60℃よりも低い温度で凍結させて、数ヶ月間保存することができる。細胞破砕の前に、細胞を、中性の高張溶解用緩衝液(例えば、10mMトリス、pH8.0、500mM NaCl)に懸濁させた。
細胞を、フレンチプレス、ホモジナイザー、またはソニケーターを使用して、機械的に破砕した。
DNase処理を使用して、細菌ゲノムDNAを断片化した。Benzonase(商標)を含む、種々のDNaseを使用した。
前記rCPは、6×His標識を内部に有し、イオンマトリックスアフィニティクロマトグラフィにより捕捉および精製した。前記清澄化した細胞抽出液をIMAC充填する際のバックグラウンドを、低濃度のイミダゾールを使用して低減した。rCPは、pH勾配またはイミダゾールを用いてIMACカラムから溶出できる。
rCP溶液中に存在する夾雑エンドトキシンは、陰イオン交換クロマトグラフィー/ろ過により除去できる。
rCP溶液中に存在する夾雑イミダゾールは、透析またはタンジェント流ろ過(5〜30kDaのMWCOの膜)により除去できる。
PapMVの多重変異(poly−mutated)ゲノムを、プラスミドDNAに挿入した。前記組換えプラスミドを使用し、細菌を形質転換した。形質転換した細菌を培地で培養し、分子生物学的手法により、細胞培養物からの前記プラスミドDNAの捕捉と精製を行った。
プラスミドDNAの複製を可能にする種々の細菌宿主を、選択した細菌宿主内で複製可能な種々の標準的な発現ベクターと共に使用してもよい。前記発現ベクターは、SRTの転写のための原核RNAポリメラーゼを内部に有しているべきである。
前記プラスミドDNAの調製および浄化には、当該技術分野で公知の種々のプラスミドDNAの抽出方法および精製方法を使用することができる。
前記プラスミドDNAの直線化に用いる前記制限エンドヌクレアーゼは、以下の条件を満たすように選択した:(i)前記制限酵素は、前記DNA配列を、前記RNAポリメラーゼプロモーターとSRT内に存在させるべき最終のヌクレオチドとの間で切断してはならない。(ii)前記制限酵素は、前記DNA配列を、SRT内に存在させるべき最終のヌクレオチドの直後で切断しなければならない。
SRTの5’末端は、PapMV外被タンパク質核形成シグナルを有しているが、一方、他のヌクレオチド配列は、前記PapMV5’末端ゲノムの多重変異体(polymutated version)由来である。例示的なST配列コードするDNA配列を、図7に示している[配列番号5および6]。
全長SRTは、SRTの大きさとの関連で決定したMWCOの膜を用いたタンジェント流ろ過により、遊離リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから精製することができる。例えば、1500nt長のSRTを、100kDaのMWCOの膜を使用して遊離ヌクレオチドから精製した。
中間生成物1および2を組み合わせることにより、rVLPの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液中で行った。集合により新たに生じたrVLPを、少量のRNaseと共にインキュベートし、rVLPから突出しているRNAを除去した。この操作により、rVLPの溶解性が向上する。次いで、平滑化したrVLPを、夾雑物および遊離rCP(集合しなかった単量体)から精製した。最終生成物は、ろ過により滅菌したrVLP懸濁液であった。2℃〜8℃で保存した滅菌生成物は、数年間安定である。
前記集合反応過程は、中性の水系緩衝液中で行われ、他の特定のイオンを必要としない。集合反応は、ssRNA上で集合するrCPの天然の特性に基づいている。
突出したRNAは、種々のヌクレアーゼを使用し、標準的な条件下で前記rVLPから除去すればよい。
rVLP濃縮は、100kDaのMWCOの膜を使用したダイアフィルトレーションにより行ってもよい。
(rCPの製造)
誘導性プロモーターの制御下にあるrCP遺伝子を含むDNA。簡潔には、6×His標識を内部に有するPapMV CPを、制限酵素NcolおよびBarnHIに挟まれたpQE80ベクター(QIAGEN)にクローニングし、当該タンパク質をT5プロモーターの制御下で発現させた。大腸菌BD−792を前記プラスミドで形質転換し、標準的な培地で培養した。前記培地にIPTGを添加することにより(0.7〜1mM IPTGを22℃〜25℃で6〜9時間)、タンパク質の発現を誘導した。
SRTをコードするDNAの配列を、図7Aに示す[配列番号5]。SRTは、PapMVのゲノムに基づき、PapMV外被タンパク質核形成シグナルを5’末端に有している(図7Aにおいて、四角で囲んでいる)。残りのヌクレオチド配列は、全ATGコドンをTAA終止コドンへと変異させるように、多重変異(poly−mutated)されている。前記配列の最初の16個のヌクレオチド(図7Aの下線部)は、pBluescript発現ベクター内に位置するT7転写開始部位を含み、RNA転写物内に存在している。五量体の繰り返し単位を、図7Aにおいて下線部で示している。転写物全体としては、1522ヌクレオチドの長さである。図7Bに示すより長いSRT[配列番号6]もまた、問題なくインビトロ集合に使用できた。
rCPおよびSRTを組み合わせることにより、rVTPへの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液(10mMトリス−HCl、pH8)中で行った。集合反応は、1mgのRNAに対し、15〜30mgのタンパク質というタンパク質対RNA比率を用いて行った。集合により新たに生じたrVLPを、少量のRNase(RNA1μg当たりRNAse0.0001μg)でインキュベートし、rVLPから突出しているRNAを除去した。次いで、10〜100kDaのMWCOの膜を用いたダイアフィルトレーションにより、夾雑物および遊離rCP(集合しなかった単量体のrCP)から、平滑化した(blunted)VLPを精製した。最終的に得られたrVLP懸濁液を、ろ過により滅菌した。
周知のトール様受容体3(TLR−3)リガンドであるポリイノシン・ポリシチジン酸(polyI:C;dsRNA)は、IL−6、CXCL10、JE、KC、mGCSF、CCL3、CCL5、およびTNF等の炎症性サイトカインの分泌を誘導することにより、肺における自然免疫応答を誘導する誘導因子であることがわかっている(Stowell et al.、2009、Respir.Res.、10:43)。また、TLR−7が、ssRNAおよびR837(グアノシン類似体)等のリガンドの結合により、自然免疫応答を活性化することも知られている。
PapMV VLPにより肺内で誘導されるメカニズムを解明するため、60μgのssRNA含有PapMV VLP、15μgのPamCSK4(TLR−2リガンドであり、1型IFNの非誘導因子)(Cedarlane、Burlington、ON)、またはコントロールである緩衝液(10mMトリスHC1、pH8)を7日間隔で2回、マウス(5匹/群)の鼻腔内に接種した。2回目の処理の24時間後に気管支肺胞洗浄(BAL)を行い、Luminex technology(Milliplex Mouse cytokine premixed 32−plex immunoassay kit;Millipore)を使用して、サイトカインの存在をスクリーニングした。
処理の6時間後にBALを行い、前述の処理を1回または7日の間隔をあけて2回の接種とした以外は、実施例4と同様の方法で実験を行った。この実験においても、前述同様、60μgのssRNA含有PapMV VLPを使用した。Luminex(32サイトカイン検出キット)を使用し、処理後早期にサイトカイン産生をスクリーニングした。
C57BL/6マウス、TLR7ノックアウト(KO)マウス、MYD88 KOマウス、およびIRF5/7 KOマウス(3〜5匹/群)を、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。免疫の24時間後に脾細胞を単離し、樹状細胞(DC)、CD8+T細胞、およびB細胞におけるCD86およびCD69の発現を分析した。FACSにより細胞をソーティングし、CD86およびCD69の発現量を、CD69またはCD86特異抗体の結合による蛍光強度により評価した。得られた結果を、PBSサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度(MFI)の比率として、図12に示す。
C57BL/6マウス(5匹/群)を、BST2+細胞を除去する前処理あり、なしのいずれかの条件下、100μgのPapMV VLP ssRNAの静脈内投与により免疫した。除去のため、PapMV VLP ssRNAによる免疫の48時間前と24時間前に、C57BL/6マウスに抗BST2抗体(mAb 927)を500μg腹腔内注射した。PapMV VLP ssRNAによる免疫から24時間後に、単離した脾細胞におけるCD69、MHC−I、およびCD86の発現を、FACSによって分析した。
2群のC57BL/6マウスと、TLR−7KOマウスおよびMYD88KOマウス(4匹/群)とを、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。C57BL/6マウス群の一方を、実施例7に記載の方法により、まず、抗BST2抗体によって処理した。血清および脾臓におけるIFN−α産生を、免疫の6時間後、12時間後、24時間後、および48時間後、(図14A)、または免疫の6時間後(図14B)に、ELISA(VeriKine(商標) Mouse Interferon Alpha ELISA Kit;PBL InterferonSource)によって観測した。
C57BL/6マウスおよびIFNAR KOマウス(3匹/群)を、100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与により免疫した。前記マウスの脾臓から単離したBリンパ球および樹状細胞におけるCD86、MHC−I、およびCD69の発現を、免疫の24時間後に、フローサイトメトリーにより評価した。
LCMVは、慢性感染(HCV感染等)の関連動物モデルである。LCMVのクローン13変異体により、マウスに持続感染が確立される。LCMV感染は、HCV感染同様、主としてCTLによって制御されており、CTL応答の疲弊は、PD−1の発現と関連付けられる。
ヒトPBMCを、フィコール勾配により単離し、100μg/mLのPapMV VLP ssRNAまたはPBSで処理した。処理の18時間後、CD14+CD11b+細胞集団(単球)について、フローサイトメトリーにより、CD86発現を分析した。
一群当たり10匹のマウスを、緩衝液のみ(10mMトリス、pH8)または60μgのPapMV VLP ssRNAを7日間隔で2回、鼻腔内経路を介して投与することにより処理した。処理後3日目に、前記マウスを肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の毒性株220CFU(コロニー形成単位)に感染させた。
C57BL/6マウス(3匹/群)を、0日目に2×106のPFULCMVクローン13に静脈内投与により感染させ、一日一回の100μgのPapMV VLP ssRNAまたは100μLのPBSの静脈内投与を、1日目、2日目、3日目、4日目、および5日目に行う(A群)か、または6日目および7日目のみに行う(B群)ことにより処理した。血液サンプルを5日目、10日目、および15日目に採取し、感染から15日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、LCMVフォーカス形成アッセイにより分析した。
PapMV VLP処理により誘導される防御は、約5日間持続することが示された。PapMV VLPの複数回投与による処理によれば、より長い防御期間を提供できるのかどうかを調べるため、60μgのssRNA含有PapMV VLPを、1週間間隔で1回(1×)、2回(2×)、5回(5×)、または10回(10×)マウスに鼻腔内接種した。最後の処理の3日後に、マウスをインフルエンザWSN/33ウイルス(およそ1LD50)でチャレンジした。
実施例3のプロトコールにしたがい、マウスに対してssRNA含有PapMV VLPの滴下投与(instillations)を2回行い、2回目の処理から6時間後に、気管支肺胞洗浄(BAL)を行った。結果を図25に示す。PapMV VLP処理マウスのBALで発見された好中球を、図25Bにおいて丸で囲んでいる。処理マウスにおいては、コントロール群と比べて、3倍の好中球が観察された。
2μgの3価不活性インフルエンザワクチン(TIV)と組み合わせた20μgのPapMV VLP ssRNAを、14日間隔で2回滴下投与することにより、Balb/Cマウス(10匹/群)を処理した。0日目、14日目、および28日目に出血を起こさせた。別の一群のマウスは、比較のため、同一のプロトコールにより、皮下経路で免疫した動物である。マウスを、15日目に、1LD50のインフルエンザWSN/33ウイルスでチャレンジし、体重低下を14日間追跡調査した。
先の実施例で実証したように、細菌宿主細胞内で調製したPapMV VLPおよびssRNAと共にインビトロで自己集合させて調製したPapMV VLPは、いずれも自然免疫応答を刺激することが可能である。しかしながら、前記2つの異なる方法で調製したVLPは、異なるTLRを活性化する。先に示したように、ssRNAと共にインビトロで自己集合させて調製したPapMV VLPは、TLR−7を活性化する。これに対し、これまでに記載の方法(Tremblay et al.、2006、同上)により、PapMV外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて調製したPapMV VLPは、TLR−2およびCD14を活性化する。
H1N1世界的流行インフルエンザウイルス株A/カリフォルニア/7/2009の核タンパク質(NP)を、His標識タンパク質として大腸菌内に発現させ、ニッケルアフィニティーカラム上で精製した。NP抗原(10μg)を、実施例2に記載の方法で調製したPapMV VLP10、30、60、または90μgと混合し、Balb/Cマウス(10匹/群)に接種した。接種の21日後に、血液サンプルを採取し、体液性応答評価のため、GST−NP抗原を使用したELISAによって分析した。
本実施例では、本発明のプロセスによって調製されたPapMV VLPおよびTremblay et al.(2006、同上)に記載の方法で調製されたPapMV VLP(PapMV sm)のアジュバント活性を比較する。電子顕微鏡観察によれば、両VLPは、同一の外観を有している。
Claims (29)
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)を調製するためのインビトロでの製造方法であり、
a)組換えPapMV外被タンパク質とssRNAとを組み合わせる処理を、重量比で5:1〜50:1のタンパク質対RNA比率(タンパク質:RNA)で、6.0から9.0のpH、2℃から37℃の温度で、VLPへの集合に十分な時間行う工程と、
b)前記VLPをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているRNAを除去する工程と、
c)前記VLPを、他のプロセス成分から分離する工程を含み、
前記a)工程において、
少なくとも70%の前記組換えPapMV外被タンパク質が、20量体未満の低分子量種の形態にあり、
前記ssRNAは、
250から5000ヌクレオチドの長さであり、
5’末端にPapMV外被タンパク質核形成シグナルを有し、かつ
PapMVゲノムのDNA配列と同一の配列を有し、
前記DNA配列が、全ATGコドンをTAA終止コドンへと変異させるように、多重変異され、
前記DNA配列における全チミン(T)残基が、ウラシル(U)残基に置換されている、インビトロでの製造方法。 - 前記組換えPapMV外被タンパク質が、遺伝子改変外被タンパク質である、請求項1記載の製造方法。
- 前記組換えPapMV外被タンパク質が、1以上の抗原ペプチドに融合されている、請求項1または2記載の製造方法。
- 前記1以上の抗原ペプチドが、前記組換えPapMV外被タンパク質のC末端またはN末端に融合されている、請求項3記載の製造方法。
- 前記タンパク質対RNA比率が、重量比で5:1〜50:1である、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記タンパク質対RNA比率が、重量比で10:1〜50:1である、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記pHが、pH6.5からpH8.5である、請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記pHが、pH7.0からpH8.5である、請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記温度が、5℃から37℃である、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記温度が、10℃から37℃である、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記温度が、20℃から37℃である、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記組換えPapMV外被タンパク質が、大腸菌内で産生される、請求項1から11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ssRNAが、500から3000ヌクレオチドの長さである、請求項1から12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記ssRNAが、1000から3000ヌクレオチドの長さである、請求項1から12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記DNA配列が、
a)配列番号5における第17番目から第54番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
b)配列番号5に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
c)配列番号6に示す核酸配列と同じ配列を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の製造方法。 - 組換えパパイヤモザイクウイルス(PapMV)外被タンパク質とssRNAとを含み、
前記ssRNAは、
250から5000ヌクレオチドの長さであり、
5’末端にPapMV外被タンパク質核形成シグナルを有し、かつ
PapMVゲノムのDNA配列と同一の配列を有し、
前記DNA配列が、全ATGコドンをTAA終止コドンへと変異させるように、多重変異され、
前記DNA配列における全チミン(T)残基が、ウラシル(U)残基に置換されている、PapMVウイルス様粒子(VLP)。 - 組換えPapMV外被タンパク質およびssRNAを含むパパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)であり、前記ssRNAが、250から5000ヌクレオチドの長さであり、かつ、
a)配列番号5における第17番目から第54番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
b)配列番号5に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
c)配列番号6に示す核酸配列と同じ配列
を含み、
前記配列における全チミン(T)残基が、ウラシル(U)残基に置換されている、パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)。 - 前記組換えPapMV外被タンパク質が、前記PapMV外被タンパク質のC末端またはN末端で、1以上の抗原ペプチドに融合されている、請求項16または17記載のPapMV VLP。
- 前記ssRNAが、500から3000ヌクレオチドの長さまたは1000から3000ヌクレオチドの長さである、請求項16から18のいずれか一項に記載のPapMV VLP。
- 請求項16から19のいずれか一項に記載のPapMV VLPと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物。
- 1以上の抗原をさらに含む、請求項20記載の医薬組成物。
- 前記1以上の抗原が、1以上のインフルエンザウイルス抗原、1以上の腫瘍関連抗原、または1以上のアレルゲンである、請求項21記載の医薬組成物。
- 請求項16から19のいずれか一項に記載のVLPを含む、医薬品。
- 前記医薬品が、対象における抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントである、請求項23記載の医薬品。
- 前記免疫応答が、体液性免疫応答、CTL免疫応答、または粘膜免疫応答である、請求項24記載の医薬品。
- 前記医薬品が、対象における自然免疫応答を刺激することにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するためのものである、請求項23記載の医薬品。
- 前記医薬品が、1以上の抗原と組み合わせてワクチンとして使用するためのものである、請求項23記載の医薬品。
- 前記1以上の抗原が、1以上のインフルエンザウイルス抗原、1以上の腫瘍関連抗原、または1以上のアレルゲンである、請求項27記載の医薬品。
- パパイヤモザイクウイルス(PapMV)ウイルス様粒子(VLP)を調製するためのインビトロでの製造方法であり、
a)組換えPapMV外被タンパク質とssRNAとを組み合わせる処理を、重量比で5:1から40:1のタンパク質対RNA比率(タンパク質:RNA)で、6.5から8.5のpH、22℃から37℃の温度の緩衝液中で、VLPへの集合に十分な時間行う工程であり、前記組換えPapMVが、少なくとも70%が20量体未満の低分子量種の形態にある工程と、
b)前記VLPをヌクレアーゼで処理し、当該粒子から突出しているRNAを除去する工程と、
c)前記VLPを、他のプロセス成分から分離する工程を含み、
前記a)工程において、
前記ssRNAは、
250から5000ヌクレオチドの長さであり、かつ
(i)配列番号5における第17番目から第54番目までのヌクレオチドと同じ配列、または
(ii)配列番号5に示す核酸配列と同じ配列、もしくは
(iii)配列番号6に示す核酸配列と同じ配列を含み、
前記配列における全チミン(T)残基が、ウラシル(U)残基に置換されている、インビトロでの製造方法。
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