CN103648528A - 番木瓜花叶病毒组合物及其用于刺激先天免疫应答的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)部分的组合物在刺激先天免疫应答中的用途。所述PapMV部分可以是番木瓜花叶病毒或PapMV病毒样颗粒(VLP)。所述PapMV组合物刺激足够强的先天免疫应答以针对后续病原体攻击提供保护或者治疗已发生的感染。本发明还提供了PapMV组合物在保护对象免受病原体(例如病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体)的潜在感染中的用途，以及PapMV组合物在治疗已发生的感染中的用途。所述PapMV组合物可以例如通过鼻内或肺途径施用以在黏膜内和/或呼吸系统中引起作用。

Description

番木瓜花叶病毒组合物及其用于刺激先天免疫应答的用途

技术领域

本发明涉及免疫调节领域，具体地涉及包含番木瓜花叶病毒(papayamosaic virus，PapMV)或PapMV病毒样颗粒的组合物在刺激先天免疫应答中的用途。

背景技术

番木瓜花叶病毒(PapMV)和PapMV病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)增强抗原免疫原性的能力在下述专利和专利申请中已有描述。

美国专利No.7,641,896、加拿大专利申请No.2,434,000和国际专利申请No.PCT/CA03/00985(WO2004/004761)描述了PapMV或来自PapMV外壳蛋白的VLP在动物中加强对抗原的免疫应答的用途。所述抗原可以附接至所述PapMV或VLP，或者它们可以与所述PapMV或VLP组合施用。

国际专利申请No.PCT/CA2007/002069(WO2008/058396)描述了基于PapMV和PapMV VLP的流感疫苗。该疫苗包含PapMV或PapMVVLP以及一种或更多种流感抗原，所述一种或更多种流感抗原可以附接至所述PapMV或VLP，或者可以与所述PapMV或VLP组合施用。

国际专利申请No.PCT/CA2007/001904(WO2008/058369)描述了基于PapMV的缀合免疫原性亲和力的抗原系统。该申请描述了PapMV外壳蛋白与多种能够结合目的抗原的亲和肽的融合。

国际专利申请No.PCT/CA2008/000154(WO2008/089569)描述了基于PapMV的对抗伤寒沙门菌(S.typhi)以及其他肠细菌病原体的疫苗。该疫苗包含PapMV或PapMV VLP及一种或更多种肠细菌抗原，所述一种或更多种肠细菌抗原可以附接至所述PapMV或VLP或者可以与所述PapMV或VLP组合施用。

国际专利申请No.PCT/CA2009/00636(WO2010/012069)描述了包含PapMV组分和一种或更多种抗原的多价疫苗，及其在对多种病原体株或针对多于一种病原体提供保护中的用途。该疫苗可任选地包含沙门菌属(Salmonella spp.)孔蛋白(porin)组分。

另一些出版物描述了PapMV VLP引起对抗原的体液免疫应答及细胞免疫应答的能力(Denis等，2007，Virology，363：59-68；Denis等，2008，Vaccine26：3395-403；Leclerc等，2007，J Virol，81：1319-26；Lacasse等，2008，J.Virol，82：785-94)。从植物分离的PapMV病毒颗粒已示出活化先天免疫应答，并且被免疫系统识别为病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular pattern，PAMP)，导致这样的提议：PapMV的免疫原性和内在佐剂属性转化为当PapMV与抗原共同施用时观察到的特异性持久抗体应答(Acosta-Ramírez等，2008，Immunology，124：186-97)。

先天免疫是对抗感染的第一道抗体非依赖性防线，并且在许多情况下，可以消除感染原(infectious agent)。先天免疫的组分识别微生物病原体特征性的以及哺乳动物细胞上不存在的结构。先天免疫的主要效应细胞是嗜中性粒细胞、单核吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。嗜中性粒细胞和吞噬细胞表达识别血液和组织中的微生物并且刺激吞噬作用(例如，甘露糖受体或调理素(opsonin)受体)或活化未参与摄取之吞噬细胞的表面受体(例如，Toll样受体，TLR)。先天免疫的效应机制常常用于清除微生物，即使在适应性免疫应答中也是如此。因此，先天免疫应答可以提供与抗原配合起作用的信号以刺激抗原特异性(适应性)T和B淋巴细胞的增殖和分化。

先天免疫应答的刺激因子已有描述。美国专利申请No.11/830,622(公布号：2008/0170966)描述了通过吸入刺激先天免疫的微生物裂解液来减弱呼吸感染的方法。美国专利申请No.10/972,062(公开号：2009/0318337)描述了通过向对象施用基于蛋白体(proteosome)的免疫活性组合物来活化先天免疫的方法。美国专利申请No.12/556,759(公开号：2011/0105383)描述了通过向对象施用重组细菌蛋白质来刺激抵抗病原体的先天免疫的方法。

提供这些背景信息的目的是揭示本申请人认为可能与本发明相关的信息。不必然旨在承认也不应被解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。

发明概述

本发明的一个目的是提供番木瓜花叶病毒组合物在刺激先天免疫应答中的用途。根据本发明的一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在对象中刺激先天免疫应答从而在对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染之严重程度的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于在对象中刺激先天免疫应答从而在对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染之严重程度的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在保护对象免受病原体感染中的用途，其中所述组合物在所述对象中刺激先天免疫应答。

根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于保护对象免受病原体感染的药物中的用途，其中所述组合物在对象中刺激先天免疫应答。

根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在对象中治疗慢性或复发性微生物感染中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于在对象中治疗慢性或复发性微生物感染的药物中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供了在对象中刺激先天免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，从而在对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染的严重程度。

根据本发明的另一个方面，提供了保护对象对抗微生物感染的方法，其包括向所述对象施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中所述组合物在所述对象中刺激先天免疫应答。

根据本发明的另一个方面，提供了治疗慢性或复发性感染的方法，其包括向患有慢性微生物感染的对象施用包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了药盒(kit)，所述药盒包含其中含有药物组合物的容器，所述药物组合物包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)，所述容器适用于通过鼻内、肺或阴道途径递送所述药物组合物。

附图简述

本发明的这些和其他特征将通过以下参照附图的详细描述而变得更明显。

图1示出(A)野生型PapMV外壳蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和(B)野生型PapMV外壳蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

图2示出(A)经修饰PapMV外壳蛋白CPΔN5的氨基酸序列(SEQID NO：3)；和(B)经修饰PapMV外壳蛋白PapMV CPsm的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图3示出证明PapMV VLP诱导控制流感感染之抗病毒应答的结果，(A)用30μg或75μg的PapMV VLP或对照缓冲剂(PBS)鼻内处理并且用100pfu的流感病毒株WSN/33攻击的Balb/C小鼠(每组10只)的体重减轻；(B)在感染期间，小鼠产生的症状(症状：0，无症状。1，轻微竖毛(spiked fur)，轻微弯背(curved back)。2，树毛，弯背。3，树毛，弯背，难以移动和轻度脱水。4，树毛，弯背，难以移动，严重脱水，闭眼以及眼部分泌物)；以及(C)被感染小鼠的存活率。

图4示出证明PapMV VLP诱导控制流感感染的抗病毒应答的结果，(A)用60μg的PapMV VLP或对照缓冲剂(PBS)鼻内处理并且用200pfu的流感病毒株WSN/33攻击的Balb/C小鼠(每组10只)的体重减轻；(B)在感染期间小鼠所发生的症状(症状：如图3)；以及(C)被感染小鼠的存活率。

图5示出证明PapMV VLP诱导控制流感感染的抗病毒应答的结果，(A)描绘用含ssRNA的PapMV VLP、60μg含聚I：C、3μgssRNA、3μg聚I：C的PapMV、60μg的PapMV CP单体或对照缓冲剂(Tris HCl10mM pH8)鼻内处理并用200pfu的流感病毒株WSN/33攻击的Balb/C小鼠(每组10只)的体重减轻；(B)示出在感染期间小鼠所发生症状的总结(症状：如图3)。

图6示出表明以下内容的图：用PapMV VLP(60μg)、Pam3CSK4(15μg)或对照缓冲剂(Tris HCl10mM pH8)鼻内处理的Balb/C小鼠的支气管肺泡灌洗液(bronchoaleolar lavage)中存在IP-10(A)和IL-9(B)。每个点对应于每只小鼠中检测到的细胞因子的水平。还示出存在于小鼠鼻咽灌洗液(nasopharyngeal lavage，LNP)中存在的IP-10或IL-9的量。

图7示出表明以下内容的图：用PapMV VLP(60μg)鼻内处理一次或两次或用对照缓冲剂(Tris HCl10mM pH8)处理的Balb/C小鼠的支气管肺泡灌洗液中存在(A)MIP-1α、(B)MIP-1β、(C)MIP-2、(D)KC、(E)TNF-α、(F)RANTES、(G)VEGF、(H)MCP-1、(I)IP-10、(J)IL-17、(K)IL-13、(L)IL-12(p70)、(M)IL-9、(N)IL-6、(O)IL-1α、(P)IL-1β、(Q)GM-CSF和(R)G-CSF。每个点对应于在每只小鼠中检测到的细胞因子的水平。

图8示出描绘以下内容的汇编图：PapMV VLP ssRNA(100μg)或PBS免疫接种24小时后C57BL/6、TLR7敲除(knockout，KO)、MYD88KO和IRF5/7KO小鼠的DC、CD8⁺T细胞和B细胞中的(A)CD86和(B)CD69表达。通过FACS分析结果，并且表示为所分析样品与PBS样品的平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity，MFI)的比值。

图9示出描绘以下内容的汇编图：用PapMV PapMV VLP ssRNA(用抗-BST2抗体处理或不用抗-BST2处理)免疫接种C57BL/6小鼠24小时后(A)CD69、(B)MHC-I和(C)CD86表达的流式细胞术分析。^＊＊＊p<0.001，^＊＊p<0.01，^＊p<0.05，NS：差异不显著。

图10示出描绘以下内容的图：用100μgPapMV VLP ssRNA免疫接种之后C57BL/6小鼠的(A)血清和(B)脾中IFN-α产生动力学的ELISA评价，以及(C)用100μgPapMV VLP ssRNA或PBS免疫接种6小时后C57BL/6和不同敲除小鼠中血清IFN-α的ELISA量化。

图11示出描绘以下内容的汇编图：用PapMV VLP ssRNA或PBS免疫接种24小时后来自C57BL/6和IFNAR KO小鼠的脾的(A)B淋巴细胞和(B)树突细胞中CD86、MHC-I和CD69的表达，以及(C)通过ELISA量化PapMV VLP ssRNA免疫接种后不同时间点时C57BL/6和IFNAR KO小鼠血清中对抗PapMV VLP ssRNA的抗体。

图12示出描绘以下内容的图：用100μgPapMV VLP ssRNA(实心正方形)或PBS(空心圆)处理6小时之后用2×10⁶PFU LCMV克隆13感染的C57BL/6小鼠之血液中LCMV克隆13的病毒动力学(滴度表示为PFU/毫升血液；LOD：检出限)。

图13示出描绘以下内容的图：用2×10⁶PFU LCMV克隆13感染15天之后C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠的(A)脾、(B)肾、(C)肝和(D)脑中的病毒滴度；小鼠用100μgPapMV VLP ssRNA、100μgR837或PBS处理6小时之后进行感染(滴度表示为PFU/器官)。LOD：检出限。

图14示出描绘以下内容的图：对从用100μgPapMV VLP ssRNA、100μgR837或PBS免疫接种6小时后用2×10⁶pfu LCMV克隆13感染并在感染15天后处死的小鼠分离的脾细胞进行GP33再刺激之后，产生(A)IFN-γ、(B)TNF-α和(C)这两种细胞因子的CD8⁺T细胞的比例；在GP33再刺激后由CD8⁺T细胞产生的(D)IFN-γ量和(E)TNF-α量，(F)GP33特异性CD8⁺T淋巴细胞中PD-1表达的平均荧光强度(MFI)，以及(G)脾细胞中DbGP33⁺CD8⁺CD44⁺的百分比。

图15示出描绘用2×10⁶PFU LCMV克隆13感染45天后C57BL/6小鼠的(A)脾、(B)肾、(C)肝和(D)脑中的病毒滴度的图；小鼠用100μgPapMV VLP ssRNA或PBS处理6小时之后进行感染(滴度以PFU/器官表示)。LOD：检出限。

图16示出描绘用PapMV VLP ssRNA刺激18小时之后人PBMC(CD14⁺CD11b⁺细胞群)中CD86表达的流式细胞术分析的示图(MFI：平均荧光强度)。

图17示出描绘在2周间隔中用2剂量PapMV VLP ssRNA处理之后用亚致死剂量肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)攻击的小鼠存活的图。

图18示出描绘慢性感染LCMV并且(A)在感染后第1、2、3、4和5天，以及(B)仅在感染后第6天和第7天用100μgPapMV VLP ssRNA静脉内处理(一次/天)的小鼠的病毒负荷的图(滴度以PFU/mL表示)。

图19示出描绘在如图18所述处理第15天(实验结束)的小鼠不同器官中的病毒滴度的图。

图20示出说明在1周间隔中用PapMV VLP处理1次(1×)、2次(2×)、5次(5×)和10次(10×)并在最后一次处理3天后用流感WSN/33病毒攻击的小鼠体重减轻的图。

图21示出显示出来自用(A)缓冲液和(B)PapMV VLP处理的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中发现的细胞(中性粒细胞标有圆圈)的电子显微图，以及(C)描述BAL中发现的中性粒细胞的数目的图。

图22示出描绘在用与三价灭活流感疫苗(trivalent inactivated fluviccine，TIV)组合之PapMV VLP鼻内免疫接种的小鼠血液中测量的IgG和IgG2a滴度的图，(A)一次免疫接种后的总IgG滴度，(B)14天间隔的两次免疫接种后的总IgG滴度，以及(C)两次免疫接种后测量的IgG2a滴度。

图23示出描述在如图22所述进行免疫接种的小鼠在两次免疫接种之后测量的抗体滴度的图，(A)支气管肺泡灌洗液(BAL)中的IgG滴度，(B)BAL中的总IgG滴度，以及(C)粪便中的IgA。

图24示出显示出如图22所述进行免疫接种并在第15天用1LD₅₀流感WSN/33病毒攻击的小鼠体重减轻的图；追踪体重减轻14天时间。

图25示出(A)与ssRNA自装配的PapMV VLP和(B)与聚I：C(dsRNA)自装配的PapMV VLP的电子显微图。

图26示出说明PapMV VLP与人单核细胞系(THP-1)中的TLR-2和CD14相互作用并且该相互作用被对抗TLR-2和CD14之抗体(Ac)所阻断的图。

图27示出给出根据本发明一个实施方案用于制备含ssRNA之体外装配PapMV VLP的步骤的流程图(rCP=重组PapMV外壳蛋白；SRT=合成的RNA模板；rVLP=重组VLP；Ec.prCP=包含编码rCP之质粒的大肠杆菌；Ec.pSRT=包含编码SRT之质粒的大肠杆菌)。

图28示出用于图27给出之方法的一个实施方案中的合成的RNA模板(synthetic RNA template，SRT)的序列[SEQ ID NO：5]；所有ATG密码子都已突变为TAA终止密码子(粗体)，前16个核苷酸(用下划线标出)来自位于pBluescript表达载体中的T7转录起始位点，并且用于rVLP装配的PapMV成核位置(nucleation site)用框标出。

图29示出用于图27给出之方法的一个实施方案的合成的RNA模板(SRT)的序列[SEQ ID NO：6]；第一个G是转录物的第一个核苷酸；所有ATG密码子都已突变为TAA终止密码子(粗体)；该序列的前1500个核苷酸与SEQ ID NO：5相同。

发明详述

本发明提供包含番木瓜花叶病毒(PapMV)部分的组合物(在本文称为“PapMV组合物”)及其在刺激先天免疫应答中的用途。PapMV组合物所包含的PapMV部分可以是番木瓜花叶病毒或PapMV病毒样颗粒(VLP)。虽然之前已指出PapMV活化先天免疫应答的能力促成PapMV的佐剂作用(Acosta-Ramírez等，2008，出处同上)，但是本文证明，PapMV和PapMV VLP在单独施用时出乎意料地也能够刺激先天免疫应答，该应答的强度足以导致保护性和/或治疗性作用。此外，PapMV组合物能够刺激黏膜表面的免疫应答。

因此，在某些实施方案中，本发明提供PapMV组合物在刺激动物中的保护性非特异性免疫应答并因此针对后续病原体攻击提供保护中的用途。如本文所证明的，PapMV组合物还能够刺激迅速的先天免疫应答，并且可以在几天之内针对病原体感染提供保护。在某些实施方案中，本发明提供PapMV组合物在保护对象免受病原体通过黏膜进入身体的潜在感染中的用途。例如，PapMV组合物可以单独施用于刺激先天免疫应答或者可以与一种或更多种病原体组合施用，并且充当允许产生有效黏膜免疫应答的黏膜佐剂。因此，根据本发明的某些实施方案，PapMV组合物通过黏膜途径施用并且在黏膜和/或呼吸系统中引起保护作用。在本发明的某些实施方案中，病原体是病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体中的一种或更多种。

本发明的某些实施方案提供PapMV组合物在治疗已发生的感染(例如，被病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体感染)中的用途。在一些实施方案中，PapMV组合物可用于治疗黏膜表面(例如，肺、肠或泌尿生殖系统中)的感染。

本发明的一些实施方案提供PapMV组合物在患有慢性病毒感染的对象中降低病毒负荷并且因此有助于控制和/或清除感染中的用途。在一些实施方案中还提供了使用PapMV组合物和用于慢性感染的常规治疗的联合治疗。在一些实施方案中，这样的联合治疗可以例如导致常规治疗效力的提高、达到预定终点所需常规治疗剂量的降低、治疗持续时间的降低、与常规治疗相关的副作用的降低等中的一种或更多种。本发明的某些实施方案提供PapMV组合物(单独或与常规治疗联合)在患有慢性感染之对象中治疗免疫衰竭(immune exhaustion)中的用途。

通常来说，所述组合物包含PapMV或PapMV VLP以及合适的载体或稀释剂，但在一些实施方案中，用于向对象施用的适合形式(例如，冷冻干燥的或冻干的)的仅由PapMV或PapMV VLP组成的组合物仍然是一个替代选择。在某些实施方案中还考虑包含PapMV与PapMV VLP之混合物的组合物。

定义

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。

本文中使用的术语“约”是指相对于给定值改变约+/-10％。应理解，这样的改变常常包括在本文所提供的任何给定值的范围内。

当在本文中单数指称与术语“包括/包含”一起使用时可以表示“一”，但其也符合“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的含义。

本文中使用的措辞“包括/包含”(及其语法变化形式)、“具有”(及其语法变化形式)、“包括”(及其语法变化形式)或“含有”(及其语法变化形式)是包括性的或开放性的并且不排除额外的、未记载的要素或方法步骤。

本文中使用的“天然的”(如用于指对象)是指对象可见于自然中的事实。例如，可以分离自天然来源并且未在实验室中被人有意地修饰的生物或存在于生物中的多肽或多核苷酸序列是天然的。

本文中使用的术语“减弱”、“抑制”、“预防”及其语法变化形式是指给定参数或事件的可测量降低。

本文中使用的术语“疫苗”是指在向对象施用时能够产生有益免疫应答的组合物。

本文中使用的术语“病原体”是指能够在宿主中引起疾病或病症的生物，包括但不限于细菌、病毒、原生动物、真菌和寄生虫。

本文中使用的术语“对象”或“患者”是指需要治疗的动物。

本文中使用的术语“动物”是指人和非人动物二者，包括但不限于哺乳动物、鸟和鱼，并且涵盖家畜、农场动物、动物园动物、实验动物和野生动物，例如牛、猪、马、山羊、绵羊或其他有蹄类动物(hoofed animal)、狗、猫、鸡、鸭、非人灵长类、豚鼠、兔、雪貂、大鼠、仓鼠和小鼠。

PapMV组合物与一种或更多种其他治疗剂“组合”施用旨在包括同时(同步)施用和连续施用。连续施用旨在涵盖治疗剂和本发明组合物以多种顺序向对象施用，其中治疗剂和组合物的施用分开限定的一段时间段，其可以短(例如，约几分钟)或长(例如，约几天或几周)。

本文中使用的关于核酸或氨基酸序列的术语“基本相同”是指，当进行最佳比对(例如，使用下述方法)时，核酸或氨基酸序列与限定的第二核酸或氨基酸序列(或“参考序列”)共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性(identity)。“基本同一性”可用于指序列(例如全长序列、功能性结构域、编码序列和/或调节序列、启动子、和基因组序列)的多种类型和长度。两条氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比可以以本领域技术人员所知晓的技术中的多种方式来确定，例如，使用公开可得的计算机软件，例如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)JMol Biol147：195-7)；合并到GeneMatcherPlus^TM，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence和Structure，Davhof， M.O.编，第353-358页中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics，482-489(1981))；BLAST程序(基本局域线性搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul，S.F.，W.Gish等(1990)J Mol Biol215：403-10)及其变化形式，包括BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL和Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在待比较序列长度上实现最大比对所需的算法。一般来说，对于氨基酸序列，比较序列的长度为至少10个氨基酸。本领域技术人员将理解，实际长度取决于待比较序列的总长度，并且可以是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个或至少200个氨基酸，或者其可以是氨基酸序列的全长。对于核酸，比较序列的长度一般是至少25个核苷酸，但可以是至少50个、至少100个、至少125个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个或至少600个核苷酸，或者其可以是核苷酸序列的全长。

术语“对应于”或“相当于”是指核酸序列与参考核酸序列的全部或一部分相同。相比之下，本文中使用的术语“与......互补”指核酸序列与参考核酸序列的互补链的全部或一部分相同。为了说明，核酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”并且与参考序列“GTATA”互补。在本文中术语“对应于”和“相当于”当用于使DNA和RNA序列互相参考时指DNA序列与参考RNA序列的全部或一部分相同(或者反之亦然)，但是，DNA序列在对应于RNA序列中尿嘧啶(U)残基的位置处包含胸腺嘧啶(T)残基。因此，举例说明，DNA序列“TATAC”对应于RNA参考序列“UAUAC”。

考虑可针对本发明的任何方法或组合物来实施本文所讨论的任何实施方案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和药盒可用于实现本发明的方法。

PAPMV部分

根据本发明的PapMV部分可以是PapMV或PapMV VLP。在本发明的某些实施方案中，包含VLP的组合物还可以包含少量的盘(disc)形式的多聚化PapMV外壳蛋白。

PapMV是本领域中已知的并且可以例如作为ATCC No.PV-204^TM从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。

PapMV VLP由重组PapMV外壳蛋白形成，重组PapMV外壳蛋白多聚化并且自装配从而形成VLP。在装配时，每个VLP包含长螺旋阵列的外壳蛋白亚单位。野生型病毒包含超过1200个外壳蛋白亚单位，并且长度为约500nm。但是，与野生型病毒相比较短或较长的PapMV VLP可以仍然有效。在本发明的某些实施方案中，VLP可以包含至少40个外壳蛋白亚单位。在一些实施方案中，VLP可以包含约40至约1600个外壳蛋白亚单位。也考虑包含更多数目的外壳蛋白的VLP。在一些实施方案中，VLP的长度可以是至少40nm。在一些实施方案中，VLP的长度可以是约40nm至约600nm。本发明的某些实施方案考虑长度大于600nm的VLP。

根据本发明的VLP可以由多个具有相同氨基酸序列的重组外壳蛋白来制备，使得最终VLP装配时包含相同的外壳蛋白亚单位，或者VLP可以由多个具有不同氨基酸序列的重组外壳蛋白来制备，使得最终VLP装配时在其外壳蛋白亚单位中包含变化。

用于制备VLP的PapMV外壳蛋白可以是完整的PapMV外壳蛋白或其一部分，或者其可以是野生型PaPMV外壳蛋白的经遗传修饰形式，例如，包含一个或更多个氨基酸缺失、插入、替换等，前提是所述外壳蛋白保留自装配成VLP的能力。野生型PapMV外壳(或衣壳)蛋白的氨基酸序列是本领域中已知的(参见Sit等，1989，J.Gen.Virol.，70：2325-2331，和GenBank登记号NP_044334.1)，并且在本文中提供为SEQ ID NO：1(参见图1A)。已知该序列的变体，例如，Noa-Carrazana&Silva-Rosales(2001，Plant Science，85：558)所述的PapMV的Mexican分离物的外壳蛋白与SEQ ID NO：1具有88％的序列同一性。PapMV外壳蛋白的核苷酸序列也是本领域中已知的(参见，Sit等，出处同上，和GenBank登记号NC_001748(第5889至6536位核苷酸))并且在本文中提供为SEQ IDNO：2(参见图1B)。

如上所述，PapMV外壳蛋白的氨基酸序列不需要精确对应于母本(野生型)序列，即，其可以是“变体序列”。例如，PapMV外壳蛋白可以通过一个或更多个氨基酸残基的替换、插入或缺失来突变，使得该位点的残基不对应于母本(参考)序列。但是，本领域技术人员将理解，这样的突变将是广泛的，并且不会大大影响重组PapMV CP装配成VLP的能力。例如可以按照标准技术(例如美国专利申请No.11/556,678中所述的示例性方法)用电子显微镜来评价PapMV外壳蛋白的变体形式装配成VLP的能力。

因此，本发明还涵盖使用保留多聚化和装配成VLP之能力的野生型外壳蛋白的片段(即，“功能性”片段)制备的重组PapMV CP。例如，片段可以包含一个或更多个氨基酸从蛋白质的N-末端、C-末端或内部或其组合中的缺失。一般来说，功能性片段的长度为至少100个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，功能性片段的长度为至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸以及至少190个氨基酸。在野生型蛋白的N-末端处进行的缺失应一般缺失少于13个氨基酸以保留蛋白质自装配的能力。

在本发明的某些实施方案中，当重组外壳蛋白包含变体序列时，该变体序列与参考序列具有至少约70％的同一性。在一些实施方案中，该变体序列与参考序列具有至少约75％的同一性。在另一些实施方案中，该变体序列与参考序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％的同一性以、及至少约98％的同一性。在某些实施方案中，参考氨基酸序列是SEQ ID NO：1(图1A)。

在本发明的某些实施方案中，用于制备重组PapMV CP的PapMVCP是PapMV外壳蛋白的经遗传修饰的(即变体)形式。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以从蛋白质的N-末端或C-末端缺失氨基酸和/或包括一个或更多个氨基酸替换。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行了遗传修饰以从蛋白质的N-末端或C-末端缺失约1至约10个氨基酸，例如约1至约5个氨基酸。

在某些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以去除最接近野生型蛋白质N-末端存在的(即，在SEQ ID NO：1的1位和6位)两个甲硫氨酸密码子中的一个，并且可以起始翻译。翻译起始密码子中的一个的去除使得产生同源蛋白质群体。可以例如通过替换构成该密码子的一个或更多个核苷酸使得该密码子编码除甲硫氨酸以外的氨基酸或者变为无义密码子来去除所选甲硫氨酸密码子。作为替代，可以缺失密码子的全部或一部分，或编码包含所选密码子的蛋白质之核酸的5’区。在本发明的一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以从蛋白质的N-末端缺失1至5个氨基酸。在一些实施方案中，经遗传修饰的PapMV外壳蛋白具有与SEQ ID NO：3(图2A)基本相同的氨基酸序列，并且可以任选地包含多至6个组氨酸残基的组氨酸标签。在一些实施方案中，对PapMV外壳蛋白进行遗传修饰以在C-末端包含额外的氨基酸(例如，约1至约8个氨基酸)，这是由于在编码核苷酸序列中包含进一个或更多个特异性限制酶位点。在一些实施方案中，PapMV外壳蛋白具有与SEQ ID NO：4(图2B)基本相同的氨基酸序列(有或没有组氨酸标签)。

当使用包含一个或更多个氨基酸替换的变体PapMV CP序列制备重组PapMV外壳蛋白时，这些可以是“保守”替换或“非保守”替换。保守替换涉及用具有相似侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基。如本领域中已知的，可以根据其侧链的物理化学性质将二十种天然氨基酸分组。合适的组包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸(疏水侧链)；甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺(极性，不带电侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(酸性侧链)以及赖氨酸、精氨酸和组氨酸(碱性侧链)。另一组氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳族侧链)。保守替换涉及用来自同组的其他氨基酸替换该氨基酸。非保守替换涉及用具有不同侧链性质的另一个残基替换一个氨基酸残基，例如用中性或碱性残基替换酸性残基，用酸性或碱性残基替换中性残基，用亲水性残基替换疏水性残基等。

在本发明的某些实施方案中，所述变体序列包含一个或更多个非保守替换。用具有不同性质的另一个氨基酸替换一个氨基酸可以改进所述外壳蛋白的性质。例如，如前所述，外壳蛋白128位残基的突变改进蛋白质装配成VLP(Tremblay等.2006，FEBS J.，273：14-25)。因此，在本发明的一些实施方案中，所述外壳蛋白包含外壳蛋白128位残基处的突变，其中该位置的谷氨酸残基被中性残基所替换。在一些实施方案中，128位处的谷氨酸残基被丙氨酸残基所替换。

已表明用另一个疏水性残基替换野生型PapMV外壳蛋白的F13位处的苯丙氨酸残基导致与使用野生型蛋白质序列相比，表达重组蛋白质时形成更高比例的VLP(Laliberté-Gagné等，2008，FEBS J.，275：1474-1484)。在本发明的上下文中，认为下述氨基酸残基是适于在F13位替换的疏水性残基：Ile、Trp、Leu、Val、Met和Tyr。在本发明的一些实施方案中，所述外壳蛋白包含在13位用Ile、Trp、Leu、Val、Met或Tyr替换Phe。在一些实施方案中，所述外壳蛋白包含在13位用Leu或Tyr替换Phe。

在某些实施方案中，CP的F13位的突变可以与E128位的突变、N-末端的缺失或其组合相组合。

同样，编码用于制备重组PapMV CP之PapMV外壳蛋白的核酸序列不需要精确对应于母体参考序列，而在遗传密码的简并性方面可不同，和/或使得其编码如上所述的变体氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，编码变体外壳蛋白的核酸序列与参考序列具有至少约70％的同一性。在一些实施方案中，编码变体外壳蛋白的核酸序列与参考序列具有至少约75％的同一性。在另一些实施方案中，编码变体外壳蛋白的核酸序列与参考序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性。在某些实施方案中，参考核酸序列是SEQ ID NO：2(图1B)。

PapMV和PapMV VLP的制备

PapMV

PapMV是本领域中已知的并且可以例如作为ATCC No.PV-204^TM从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。可以按照标准方案将病毒在宿主植物(例如番木瓜(papaya，Carica papaya)和金鱼草(snapdragon，Antirrhinum mαjus))中维持并从其中纯化(参见，例如Erickson，J.W.&Bancroft，J.B.，1978，Virology90：36-46)。

PapMV VLP

PapMV VLP可以通过本领域中已知的标准技术(参见例如，Tremblay等，2006，出处同上以及国际专利申请No.PCT/CA2007/002069、PCT/CA2008/000154和PCT/CA2009/00636)以及通过本文所述的体外装配技术来制备。

用于制备PapMV VLP的重组PapMV外壳蛋白可容易地由本领域技术人员通过标准遗传工程技术(具有野生型蛋白质的序列)来制备。遗传改造蛋白质的方法是本领域中公知的(参见，例如Ausubel等(1994及更新的版本)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)，如野生型PapMV外壳蛋白的序列(参见，例如，SEQ ID NO：1和2)。

例如，编码野生型蛋白质的核酸序列的分离和克隆可使用标准技术实现(参见，例如，Ausubel等，出处同上)。例如，核酸序列可通过用标准技术提取RNA，然后由RNA模板合成cDNA(例如，通过RT-PCR)而从PapMV中直接得到。PapMV可通过标准技术从显示出花叶症状的被感染植物叶片中纯化。

然后将编码外壳蛋白的核酸序列直接或在一步或更多步亚克隆步骤之后插入到合适的表达载体中。本领域技术人员应理解，所使用的精确载体对于本发明不是关键的。合适载体的实例包括但不限于，质粒、噬菌粒、黏粒、噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒或DNA病毒。然后可如之前和以下所述来表达和纯化所述外壳蛋白。

或者，编码外壳蛋白的核酸序列可通过本领域公知的标准体外定点诱变技术进一步改造以引入一个或更多个突变，如下文所述的那些。突变可通过构成编码序列的适当核苷酸的一个或更多个的缺失、插入、替换、倒置或其组合引入。这可以例如通过基于PCR的技术实现，就所述基于PCR的技术而言，设计包含有一个或更多个核苷酸错配、插入或缺失的引物。突变的存在可通过多种标准技术来验证，例如，通过限制分析或通过DNA测序来验证。

本领域技术人员应理解，编码外壳蛋白的DNA可以以多种方式变化而不影响所编码蛋白质的活性。例如，DNA序列中的变化可用于优化用于表达蛋白质的宿主细胞中的密码子偏好，或者可包括有助于表达的其他序列改变。

本领域技术人员应理解，表达载体还可包含调节元件，例如高效转录编码衣壳蛋白或融合蛋白的DNA序列所需的转录元件。可合并到载体中的调节元件的实例包括但不限于启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号。因此，本发明的某些实施方案提供了包含与编码经遗传改造之外壳蛋白的核酸序列可操作地相连接的调节元件。本领域技术人员应理解，合适调节元件的选择取决于为表达经遗传改造之外壳蛋白所选的宿主细胞，并且这样的调节序列可来源于多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。

在本发明的上下文中，表达载体可另外地包含有助于纯化所表达蛋白质的异源核酸序列。这样的异源核酸序列的实例包括但不限于亲和标签(例如，金属亲和标签)、组氨酸标签、编码亲和素/链霉亲和素的序列、编码谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的序列和编码生物素的序列。由异源核酸序列编码的氨基酸可在根据本领域中已知的方法使用之前从所表达的外壳蛋白中移除。或者，如果对应于异源核酸序列表达的氨基酸不干扰其向VLP的后续装配，则其可保留在外壳蛋白上。

在本发明的一个实施方案中，外壳蛋白表达为组氨酸标记的蛋白质。组氨酸标签可位于外壳蛋白的羧基端或氨基端。

可以通过本领域已知的多种方法之一将表达载体引入到合适的宿主细胞或组织中。这样的方法可以在Ausubel等(出处同上)中找到一般性描述，并且包括例如稳定转染或瞬时转染、脂质体转染(lipofection)、电穿孔和用重组病毒载体感染。本领域技术人员应理解，用于表达外壳蛋白的适当宿主细胞的选择将取决于所选择的载体。宿主细胞的实例包括但不限于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞。所使用的精确宿主细胞对于本发明不是决定性的。外壳蛋白可在原核宿主(例如，大肠杆菌、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)或枯草杆菌(B.subtilis))中或在真核宿主(例如，酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)；哺乳动物细胞，例如，COS、NIH3T3、CHO、BHK、293或HeLa细胞；昆虫细胞或植物细胞)中产生。

如果期望，则可以通过本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化外壳蛋白(参见，例如，Current Protocols in Protein Science，Coligan，J.E.等编著，Wiley&Sons，New York，NY)并且通过标准肽测序技术使用完整蛋白质或其蛋白水解片段进行测序以确定蛋白质的同一性。

本发明的重组外壳蛋白能够自装配成VLP。VLP的装配可以例如发生在表达外壳蛋白的宿主细胞中(参见例如，Tremblay等，2006，FEBSJ.，273：14-25)，或者其可以发生在体外，如在下文中更详细的描述(另参见，2012年5月1日提交的国际专利申请No._“Virus-Like Particles andProcess for Preparing Same,”其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，所述VLP包含ssRNA。例如，通过在大肠杆菌中表达重组PapMV外壳蛋白和细菌中外壳蛋白的自装配制备的VLP可以包含细菌ssRNA。或者，就在体外装配的VLP而言，ssRNA可以在自装配之前添加至外壳蛋白制备物。所述ssRNA可以是例如合成ssRNA、天然ssRNA、经修饰天然ssRNA、天然ssRNA或合成ssRNA的片段等。

通常来说，用于在体外装配的ssRNA的长度为至少约100个核苷酸，并且长度为多至约5000个核苷酸，例如，长度为至少约250、300、350、400、450或500个核苷酸，以及长度为多至约5000、4500、4000或3500个核苷酸。在某些实施方案中，用于在体外装配的ssRNA的长度为约500至约3000个核苷酸。在某些实施方案中，用于在体外装配的ssRNA设计为使得其不包含任何ATG起始密码子以使序列在体内转录的机会尽可能小，但是不排除包含ATG起始密码子，因为体内转录因ssRNA未加帽而仍然不大可能。在某些实施方案中，用于在体外装配的ssRNA从推定的PapMV RNA的5’端包括约100个核苷酸，其对应于推定的包装信号。不包含推定的包装信号的ssRNA也不能成功装配。鉴于此，可使用的基于PapMV基因组的ssRNA之非限制性实例提供于图28和29中[SEQ IDNO：5和6]。

VLP可以通过标准技术从宿主细胞分离，例如描述于Tremblay等(2006，FEBS J.，273：14-25)和实施例中的那些。如果期望除去污染性宿主细胞蛋白质或其他化合物(例如LPS)的话，可以通过标准技术(例如色谱)进一步纯化VLP。

当需要时，可以通过例如超速离心或凝胶过滤色谱(例如，使用Superdex G-200)来将VLP与其他外壳蛋白组分分离，以提供基本上纯的VLP制备物。在上下文中，“基本上纯”意为制备物包含70％或更多(例如，80％或90％或更多)的VLP。

在某些实施方案中，PapMV VLP包含ssRNA，并且通过在体外用ssRNA模板装配来制备。示例性ssRNA模板示于图28和29[SEQ ID NO：5和6]中，但本领域技术人员将理解如上所述，多种其他ssRNA将适合用于该目的。用于体外装配的一种示例性方法示于图28中并且描述于实施例18中。应理解，可以对该方法进行多种改变并且仍然提供VLP。例如，可以在其他宿主细胞(例如毕赤酵母，Pichia pastoris)中进行重组外壳蛋白和ssRNA模板的表达，并且装配反应可以在2℃至37℃的温度下以多种蛋白质：ssRNA比例进行。一般来说，可以使用按重量计约1：1至约50：1的蛋白质：ssRNA比例，例如按重量计约5：1至50：1、约5：1至约40：1、或约10：1至约40：1。

重组PapMV外壳蛋白的特征

可以通过标准技术分析重组外壳蛋白自装配成VLP的能力。例如，通过电子显微镜可视化经纯化蛋白质(参见，例如Tremblay等，2006，FEBS J.，273：14-25)。此外，可以采用超速离心来分离作为沉淀的VLP，同时在上清液中留下较小的聚集体(20-mer以及更小)，以及可以使用元二色谱(CD)分光光度法来将重组蛋白质或经修饰蛋白质的二级结构与WT病毒进行比较(参见例如Tremblay等，出处同上)。

如果期望的话，可以通过本领域中已知的技术来确定VLP和PapMV的稳定性，例如通过SDS-PAGE和蛋白酶K降解分析。根据本发明的一些实施方案，PapMV VLP在升高的温度下稳定并且可以容易地在室温下储存。

效力的评价

可以通过本领域中已知的标准技术来评价PapMV组合物在刺激先天免疫应答和产生保护作用或治疗作用中的效力。例如，就保护作用而言，可以进行攻击研究。这样的研究涉及通过标准技术对受试动物(例如小鼠)组接种PapMV组合物。平行设置了包含未经接种动物和/或接种有已知天然免疫应答刺激剂的动物或其他阳性对照的对照组。在免疫接种后一段合适的时间，用目的病原体攻击这些动物。监测这些动物与感染相关的其他状况的发展，包括例如体温、体重等。在某些情况下，例如当抗原来自与死亡相关的某些流感毒株或其他病原体时，存活也是一个合适的标志。如果期望的话，可以通过在处死动物之后使用标准技术测量病毒滴度来评定感染的程度。

就治疗研究而言，可以采用类似的方法，使用标准的动物感染模型和在感染后一段合适的时间用PapMV组合物处理的动物。

此外，如果期望的话，可以使用本领域中已知的标准测试分析在不同时间间隔(例如接种前、接种后和/或攻击后)从动物收集的血液样品的细胞因子和/或趋化因子诱导。

还可以采用其他标准技术来评定组合物(包括例如与常规预防或治疗药物或疫苗的组合的效力评价)在本领域中已知的多种动物感染和疾病模型中的效力。

药物组合物及施用

本发明提供了包含PapMV部分和一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。如果期望的话，所述组合物中还可包含其他活性成分，例如，另外的免疫刺激化合物、标准治疗剂、疫苗等。

所述药物组合物可配制成用于通过多种途径施用。例如，所述组合物可配制成用于经口、局部(topcal)、经直肠、经鼻或胃肠外施用或者用于通过吸入或喷雾施用。本文中使用的术语胃肠外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、鞘内、胸骨内注射或输注技术。向对象鼻内施用包括向对象的鼻道(nasal passage)或鼻腔的黏膜施用所述组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物配制成用于经黏膜施用。经黏膜施用可包括例如经口、鼻内、气溶胶、经直肠或经阴道施用。用于经黏膜施用的制剂包括保留在黏膜部位的透皮装置、气溶胶、乳膏、洗剂或粉末。在某些实施方案中，所述药物组合物配制成用于鼻内或肺施用。在一些实施方案中，所述药物组合物配制成用于经直肠或经阴道施用。

所述药物组合物包含有效量的PapMV部分，给定指示物的有效量可在例如动物模型中初始估计，通常在啮齿动物、兔、狗、猪或灵长类中初始估计。动物模型还可用于确定合适的浓度范围和施用途径。然后可用这些信息确定用于在待治疗动物(包括人)中施用的可用剂量和施用途径。在本发明的某些实施方案中，单位剂量包含约10μg至约10mg蛋白质，例如，约10μg至约5mg蛋白质、或约40μg至约2mg蛋白质。可使用一个或更多个剂量来对对象进行免疫接种，并且这些剂量可在同一天施用或经过数天或数周施用。

配制成水性混悬剂的组合物可包含与一种或更多种合适的赋形剂混合的PapMV部分，例如，与助悬剂、分散剂或润湿剂混合，所述助悬剂例如：羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基-β-环糊精、西黄蓍胶和阿拉伯胶，所述分散剂或润湿剂例如：天然磷脂，如卵磷脂；或环氧烷(alkvlene oxide)与脂肪酸的缩合产物，如硬脂酸聚氧乙烯；或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)；或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物，如聚乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。所述水性混悬剂还可包含一种或更多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或更多种着色剂、一种或更多种矫味剂或者一种或更多种甜味剂(例如，蔗糖或糖精)。

在某些实施方案中，可通过将PapMV部分混悬于植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液体石蜡)中而将药物组合物配制成油性混悬剂。油性混悬剂可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡(hard paraffin)或鲸蜡醇。这些组合物可通过添加抗氧化剂(例如抗坏血酸)来保存。

在某些实施方案中，药物组合物可配制成可分散粉末或颗粒，其随后可通过添加水而配制成水性混悬剂。这样的可分散粉末或颗粒提供与一种或更多种分散剂或润湿剂、助悬剂和/或防腐剂混合的PapMV部分。合适的分散剂或润湿剂以及助悬剂已经通过上文提到的那些进行了示例。这些组合物中还可包含另外的赋形剂，例如着色剂。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物还可配制成水包油型乳剂。油相可以是植物油如橄榄油或花生油或者矿物油如液体石蜡，或者油相可以是这些油的混合物。这些组合物中包含的合适的乳化剂包括：天然树胶，例如阿拉伯胶或西黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆、卵磷脂；或由脂肪酸和己糖醇、酸酐衍生的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

在某些实施方案中，所述药物组合物可根据本领域中已知的方法并使用合适的一种或更多种分散剂或润湿剂和/或助悬剂(例如上文提到的那些)配制成无菌可注射水性或油性混悬剂。所述无菌可注射制剂可以是非毒性、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(例如，1,3-丁二醇)中的无菌可注射溶液剂或混悬剂。可使用的可接受载剂和溶剂包括但不限于水、林格液(Ringer's solution)、乳酸林格液(lactated Ringer's solution)和等张氯化钠溶液。其他实例包括无菌固定油(fixed oil)(其通常用作溶剂或助悬介质)和多种温和的固定油，包括例如合成甘油一酯或甘油二酯。在注射剂的制备中还可使用脂肪酸，例如油酸。

任选地，药物组合物可包含防腐剂(例如抗微生物剂)、抗氧化剂、螯合剂和隋性气体和/或稳定剂，例如与合适缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲剂)在一起的碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白或酪蛋白)或含蛋白质的物质(例如，牛血清或脱脂乳)。可根据公知的参数调整所述组合物的pH和各种组分的准确浓度。

可通过例如将所需量的PapMV部分引入到具有上文列举的多种其他成分的合适溶剂中然后无菌过滤来制备无菌组合物。通常，通过将多种无菌活性成分引入到包含基础分散介质和所需的其他成分(来自上文列举的那些)的无菌载剂中来制备分散体。对于制备无菌组合物的无菌粉末，一些示例的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这些技术产生活性成分的粉末和来自来自之前的无菌滤过溶液的任何其他期望成分。

考虑在本发明的某些实施方案中使用被设计用于肺或鼻内递送治疗性产品的多种机械装置，包括但不限于雾化器(nebulizer)、定量吸入器、粉末吸入器和鼻喷雾装置，其全部都是本领域技术人员所熟悉的。

定量吸入器通常使用抛射剂气体并且在吸入的过程中需要驱动。干粉吸入器使用呼吸驱动混合的粉末。雾化器从溶液产生气溶胶，而定量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气溶胶。

适合实施本发明的市售装置的一些具体实例是

雾化器(Mallinckrodt，Inc.，St.Louis，Mo.)、

雾化器(MarquestMedical Products，Englewood，Colo.)、

雾化器(Allegiance，McGraw Park，Ill.)、

雾化器(Trudell MedicalInternational，Canada)、Accuspray^TM鼻喷雾装置(Becton Dickinson)、Mucosal Atomization Device(MAD300)(Wolfe Tory Medical)、OptiNose装置(OptiNose，Oslo，Norway)、Nektar DPI系统(Nektar Therapeutics，Inc.，San Carlos，Calif.)、AERx肺部药物递送系统(Aradigm Corporation，Hayward，Calif.)、

装置(Dura Pharmaceuticals)和

装置(Boehringer Ingelheim)。

所有这些装置需要使用适于分散PapMV部分的制剂。如本领域技术人员将理解的，每一种制剂通常是所使用装置类型特异性的，并且除了可用于治疗的常用稀释剂、辅料和/或载体之外还可包括使用合适的抛射剂材料。另外，考虑使用脂质体、微胶囊或微球、包合络合物(inclusioncomplex)或其他类型的载体。

因此，在一些实施方案中，本发明提供配制成用于通过鼻内或肺途径递送的例如冻干粉末形式、雾化液体形式或凝胶形式的药物组合物。这些施用途径还可允许在需要大批量配送的情况下容易地施用。

适于喷射式雾化器或超声雾化器使用的制剂通常包括以合适的浓度在水性介质中的PapMV部分，例如，约0.01mg至25mg、或约0.1mg至10mg蛋白质/mL溶液。所述制剂还可包含缓冲剂和单糖(例如，用于稳定蛋白质和调节渗透压)和/或浓度为约0.1至约10mg/ml的人血清白蛋白。可使用的缓冲剂的实例包括但不限于乙酸钠、柠檬酸钠和甘氨酸钠。通常，缓冲剂将具有适合在3至9的范围内调节溶液pH的组成和摩尔浓度。通常，摩尔浓度为1mM至50mM的缓冲剂适合用于该目的。通常，量按重量计为制剂的约1％至约90％(例如，按重量计为约1％至约50％，或按重量计为约5％至约30％)的赋形剂的实例包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖(sorbose)等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)、纤维二糖(cellobiose)等；多糖，例如棉子糖(raffinose)、松三糖(melezitose)、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；糖醇(alditol)，例如甘露糖醇、木糖醇、木糖、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、山梨糖、吡喃糖基山梨糖醇(pyranosyl sorbitol)、肌醇等；以及甘氨酸、CaCl₂、羟基四氢嘧啶(hydroxyectoine)、四氢嘧啶(ectoine)、明胶、二-肌醇磷酸酯(DIP)、环2,3-二磷酸甘油酸(cDPG)、1,1-二甘油磷酸(DGP)、β-甘露糖甘油酸酯(firoin)、β-甘露糖甘油酰胺(firoin A)、脯氨酸甜菜碱和/或衍生物、及其组合。

雾化器制剂还可包含表面活性剂以降低或防止由在形成气溶胶之溶液的喷雾引起的表面诱导的组合物组分的聚集，。可使用多种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯及醇，以及聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。量一般为制剂重量的约0.001％至约4％。对于该目的的表面活性剂的非限制性实例是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

在某些实施方案中，所述药物组合物可以用例如定量吸入器装置以粉末形式递送。这种粉末可通过冻干产生并且还可包含稳定剂如人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)。另外，若需要，可添加以下物质中的一种或更多种作为组合物的赋形剂以提高一个或更多个特征(例如，促进粉末从装置的分散、延长组合物的货架期(shelf-life)、或提高冻干过程中组合物的稳定性)：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉等；糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、木糖、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨醇(葡糖糖醇)、山梨糖、吡喃糖基山梨醇、肌醇等；以及甘氨酸、CaCl₂、羟基四氢嘧啶、四氢嘧啶、明胶、二-肌醇磷酸酯(DIP)、环2,3-二磷酸甘油酸(cDPG)、1,1-二甘油磷酸(DPG)、β-甘露糖甘油酸酯(firoin)、β-甘露糖甘油酰胺(firoinA)、脯氨酸、甜菜碱和/或衍生物及其组合。向组合物中添加的量可以是存在的蛋白质的约0.01％至约200％(w/w)，例如约1％至50％(w/w)、或约5％至30％(w/w)。然后可将这样的制剂冻干并研磨成期望的粒径。通常，粉末的颗粒的中值直径小于约50μm，例如，为约1.5pm至10μm。可使用常规设备例如级联冲击取样器(Cascade Impactor，Andersen，Ga.)测量平均粒径。

粉末可在表面活性剂的作用下混悬在抛射剂中。所述抛射剂可以是为了该目的使用的多种常规材料中的一种，例如，氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、或其组合。合适的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。

在本发明的某些实施方案中，鼻内施用所述药物组合物，因此所述组合物配制成鼻用凝胶、乳膏剂、糊剂或软膏剂，其提供与鼻黏膜表面更持久的接触。这些制剂的黏度通常为约10至约250,000厘泊(cp)，例如约2500至约100,000cp、或约5,000至50,000cp。这样的制剂可基于例如烷基纤维素和/或本领域中公知的其他高黏度的生物相容性载体。烷基纤维素的非限制性实例是甲基纤维素，其可以以合适的浓度被包含，例如每100ml载体约5mg至约1000mg，或每100ml载体约25mg至约100mg。在某些实施方案中，包含PapMV部分的载体可以渗透到可施加到鼻黏膜表面的合适的基底(例如织物材料，如纱布)中以允许PapMV部分渗透进入黏膜。

在某些实施方案中，凝胶制剂还可包含渗透促进剂(穿透促进剂)。渗透促进剂包括但不限于：亚砜，例如二甲基亚砜和癸基甲基亚砜；表面活性剂，例如月桂酸钠、月桂基硫酸钠、十六烷基三甲溴化铵、苯扎氯铵、泊洛沙姆(231、182、184)、吐温(20、40、60、80)和卵磷脂；1-取代的氮杂环庚-2-酮，特别是1-正十二烷基氮杂环庚-2-酮；脂肪醇，例如月桂醇、肉豆蔻醇、油醇等；脂肪酸，例如月桂酸、油酸和戊酸；脂肪酸酯，例如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、丙酸甲酯和油酸乙酯；多元醇及其酯，例如丙二醇、乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙二醇和聚乙二醇单月桂醇酯；酰胺及其他含氮化合物，例如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯烷酮、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺、萜烯；烷酮(alkanone)和有机酸，特别是水杨酸和水杨酸盐/酯、柠檬酸和琥珀酸。渗透促进剂的存在量可以是约0.1％至约30％w/w。所述凝胶组合物还可包含缓冲剂，例如，碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、盐酸、乳酸、酒石酸、无机碱和有机碱。如本领域技术人员已知的，根据所使用的缓冲剂的类型，缓冲剂的存在浓度可以为约1至约10重量百分比，例如，约2至约5重量百分比。但是，缓冲剂的浓度可以不同，在一些实施方案中，缓冲剂可以代替组合物中最多100％的水量。

在本发明的某些实施方案中，药物组合物配制成用于经直肠或经阴道施用，并且可作为栓剂存在，其可通过将活性成分与一种或更多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合来制备。所述赋形剂或载体的非限制性实例包括可可豆脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐/酯，它们在室温下是固体，但是在体温下是液体，因此在直肠或阴道腔内融化并且释放活性成分。适合经阴道施用的本发明制剂还包括包含本领域中已知的合适载体的子宫托(pessary)、塞子(tampon)、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。

本发明还包括包含与市售疫苗组合的PapMV部分的药物组合物，例如配制成用于鼻内或肺施用的组合物。

其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域中已知的，并且描述在例如“Remington：The Science and Practice of Pharmacy”(原名“Remingtons Pharmaceutical Sciences”)；Gennaro，A.，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA(2000)中。

方法和用途

本发明提供了PapMV组合物用于在对象中刺激先天免疫应答的用途。所述对象可以是人或非人动物。所述组合物可用于例如治疗或预防感染，包括慢性感染。

某些实施方案提供了向对象施用PapMV组合物以保护所述对象免受病原体的潜在感染。根据本发明的某些实施方案，施用PapMV组合物以在黏膜内和/或呼吸系统中引起保护作用。例如通过鼻内或肺途径施用可用于针对呼吸道病原体提供保护。例如通过阴道途径施用可用于针对阴道病原体提供保护。鼻内施用也可有效地针对阴道病原体提供保护(参见，例如，Holmgren&Czerkinsky,2005，Nature Medicine，11(4)：S45-S53)。还考虑其他施用途径。

通过施用PapMV组合物刺激的先天免疫应答是非特异性的，因此，预期针对范围广泛的病原体提供保护或治疗。作用迅速，因此可用于需要提供比传统疫苗更即时的保护的情况。另外，由于作用是非特异性的，所以施用PapMV组合物可在提供即时保护的同时确定病原体的种类并且确定合适的疫苗或其他治疗。

本发明的某些实施方案提供向对象施用PapMV组合物作为防护病原体感染的预防性或预先措施。这样的方法可用于例如免疫功能低下患者(例如，具有AIDS的患者、经受化学治疗的患者或接受免疫抑制药物的患者)，在瘟疫或疫情的情况下在合适的疫苗开发/配送之前向人群提供初始保护，以保护进入潜在感染区域的工作者如救援人员、医生和护士，以及在发生生物恐怖袭击或其威胁的情况下。

如本文证明的，施用PapMV组合物在施用的约6小时或更短时间内使细胞因子和趋化因子的产生提高，并且针对攻击的保护持续数天。因此，在某些实施方案中，本发明考虑在预计暴露于怀疑的病原体约4小时至约1周之前(例如，暴露前至少4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，以及暴露前最多约7、6、5或4天)向对象预防性施用PapMV组合物。在某些实施方案中还考虑这些上限和下限之间的多种范围。例如，约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时至约7天，约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时至约6天，约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时至约5天，约4、5、6、7、8、9、10、11或12小时至约4天。

某些实施方案提供施用多剂量的PapMV组合物以延长保护期。按剂量施用可以以特定时间间隔进行，例如，剂量可间隔约12小时至约10天。某些实施方案提供了施用第一剂量，然后至少一个随后剂量和至多约10个随后剂量，其时间间隔至少约12、24、36、48或72小时，至多约10、9、8或7天，例如，约24小时至约7天。

在某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对细菌病原体潜在感染提供保护。细菌病原体包括例如芽孢杆菌属(Bacillus)、耶尔森菌属(Yersinia)、弗朗西斯菌属(Franscisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分支杆菌属(Mycobacterium)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的多个物种。在某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对细菌病原体潜在呼吸道感染提供保护。相关致病细菌物种的非限制性实例包括但不限于：炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkh olderia cepacia)、白喉棒状杆菌(Coryn ebacterium diph theriae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetii)、梭状芽孢杆菌属(Clostridia spp.)和志贺菌属(Shigella spp.)。在本发明的某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对与细菌性肺炎相关细菌的潜在感染提供保护，所述细菌例如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、卡他莫拉菌、伯内特科克斯立克次体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、肺炎衣原体和鼠疫耶尔森菌中的一种或更多种。在本发明的某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对阴道或肠道细菌病原体感染提供保护，所述细菌病原体例如志贺菌属、沙门菌属、大肠杆菌或沙眼衣原体(Chlamydia trach omatis)。

在某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对病毒病原体的潜在感染提供保护。病毒病原体包括例如以下科的病毒：腺病毒科(Adenoviradae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如Ippy病毒和拉沙病毒(Lassa virus))、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、本雅病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，黄热病病毒、登革热病毒和丙型肝炎病毒)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae)(例如，乙型肝炎病毒)、疱疹病毒科(Herpesviradae)(例如，人单纯疱疹病毒1型)、正黏病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒A、B和C型)、副黏病毒科(例如，腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒)、小核糖核酸病毒(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒和甲型肝炎病毒)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviradae)(例如，BLV-HTLV逆转录病毒、HIV-1、HIV-2、牛免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒)、弹状病毒科(Rhabodoviridae)(例如，狂犬病病毒)和披膜病毒科(Togaviridae)(例如风疹病毒)。相关致病病毒的非限制性实例包括但不限于：流感病毒的各种毒株、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒的各种毒株(包括人呼吸道合胞病毒和特定动物毒株)、副流感病毒的各种毒株(包括人副流感病毒和特定动物毒株)、冠状病毒(包括人冠状病毒和SARS冠状病毒)、鼻病毒(包括人鼻病毒)、肠道病毒(包括人肠道病毒)、腺病毒(包括人腺病毒)、博卡病毒(bocavirus)(包括人博卡病毒)、偏肺病毒(metapneumovirus)(包括人偏肺病毒)、登革热病毒、各种肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、西尼罗河病毒(West Nile virus)、狂犬病病毒、人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、EB病毒(Epstein Barr，EBV)和多瘤病毒(polyoma virus)。在本发明的某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对以下病毒的潜在感染提供保护：流感病毒、黄病毒(例如登革热病毒或黄热病病毒)、副流感病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒(例如，SARS冠状病毒)、鼻病毒或腺病毒。

在某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对真菌病原体的潜在感染提供保护。真菌病原体包括例如：荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、白色念珠菌(Candida albicans)和卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii)。

在某些实施方案中，可施用PapMV组合物以针对生物武器/生物恐怖剂(bioterrorism agent)提供保护。生物恐怖剂的实例包括：A类生物恐怖剂，例如炭疽(炭疽芽孢杆菌)、肉毒毒素(botulism)(肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)毒素)、鼠疫(鼠疫耶尔森菌)、天花(大天花(variola major))、兔热病(tularemia)(土拉弗朗西斯菌）和病毒性出血热(丝状病毒如埃博拉(Ebola)病毒和马尔堡(Marburg)病毒，以及沙粒病毒如拉沙(Lassa)病毒和马秋波(Machupo)病毒)；B类生物恐怖剂，例如布鲁菌病(布鲁菌(Brucella)属)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的ε毒素、鼻疽(glanders)(鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei))、类鼻疽(melioidosis)(类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei))、鹦鹉热(psittacosis)(鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci))、Q热(伯内特科克斯立克次体)、来自蓖麻(Ricinuscommunis)(蓖麻籽)的蓖麻毒素、葡萄球菌B型肠毒素、斑疹伤寒(普氏立克次体(Rickettsia prowazekii))和病毒性脑炎(甲病毒属，例如委内瑞拉马脑炎、东部马脑炎和西部马脑炎)；以及C类生物恐怖剂，包括新发现的传染病，例如尼帕病毒(Nipah virus)和汉坦病毒(hantavirus)。

在某些实施方案中，可向竞赛环境中的动物施用PapMV组合物作为防御感染的预防措施，例如，赛马、狗展、猫展等。在某些实施方案中还考虑在疫情/瘟疫的状况下向家畜施用PapMV组合物。常见动物病原体的实例包括但不限于支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)(“犬舍咳(kennel cough)”最常见的病原体)、犬瘟热病毒(canine distempervirus)、犬腺病毒(1型或2型)、犬副流感病毒(canine parainfluenzavirus，CPI)、犬流感病毒(canine influenza virus，CIV)、犬呼肠孤病毒(1、2或3型)、犬疱疹病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒(feline calicivirus，FCV)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila ［Chlamydia］psittaci)、牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛病毒性腹泻(Bovine ViralDiarrhea，BVD)病毒、3型副流感(P13)病毒、睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)、溶血曼海姆菌(溶血巴斯德菌)(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、经典猪瘟病毒(classical swine fevervirus，CSFV)、小反刍兽疫病毒(peste de petits ruminants virus，PPRV)、内罗毕绵羊病病毒(Nairobi sheep disease virus，NSDV)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuronomiae)、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、猪流感病毒、禽流感病毒的各种毒株、马动脉炎病毒(equine arteritis virus)、马孢疹病毒、马流感病毒的各种毒株、马红球菌(Rhodococcus equi)和马链球菌(Streptococcus equi)(例如，马(equi)亚种和受瘟(zooepidemicus)亚种)。

在某些实施方案中，PapMV组合物可与鼻内疫苗联合使用以增强和延长这些疫苗的作用。例如，已经开发出了某些用于鼻内施用的流感疫苗。对抗肺炎球菌和鼠疫耶尔森菌的疫苗。

在某些实施方案中，一般施用PapMV组合物以刺激黏膜免疫应答，从而提高针对肠、泌尿生殖道和其他黏膜表面(包括肺)之疾病或感染的保护。PapMV组合物可例如通过鼻内或肺途径或阴道内施用。在某些实施方案中，PapMV组合物与一种或更多种抗原联合施用于刺激黏膜免疫应答。在这种情况下，PapMV组合物作为黏膜佐剂，其增强抗体的效果以产生有效的黏膜免疫应答。因此，本发明某些实施方案提供PapMV组合物单独或联合一种或更多种抗原以针对通过黏膜进入身体的微生物感染提供保护的用途。这样的微生物的实例包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌、志贺菌属、艰难梭菌(Clostridium difficile)、轮状病毒、杯状病毒、肺炎支原体、流感病毒、结核分支杆菌、呼吸道合胞病毒、HIV、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和单纯疱疹病毒。

在某些实施方案中，PapMV组合物可用于治疗感染，例如病毒病原体、细菌病原体或真菌病原体(例如，上文描述的那些)的感染。在一些实施方案中，PapMV组合物可用于治疗例如肺、肠或泌尿生殖系统中黏膜表面的感染。

本发明的一些实施方案提供PapMV组合物用于在患有慢性、持续性或复发性感染的对象中降低病毒负荷的用途，因此有助于控制和/或清除感染。慢性感染的实例包括但不限于HIV、AIDS和丙型肝病毒(HCV)感染。持续性和/或复发性感染的实例包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)感染、单纯孢疹病毒(HSV)感染、结核病(结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起)和莱姆病(lyme disease)(伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)感染引起)。

在一些实施方案中还提供了使用PapMV组合物与用于慢性感染的常规治疗剂的联合治疗。例如，在某些实施方案中，PapMV组合物可与PEG-干扰素、利巴韦林或PEG-干扰素/利巴韦林联合使用以治疗HCV，或与核苷逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NRTI)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，PI)、高活性抗逆转录病毒治疗剂(highly active anti-retroviral therapy，HAART)、融合抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂(fusion hinibitors0r non-nucleoside reverse transcriptaseinhibitors，NNRTI)联合使用以治疗HIV和AIDS。在一些实施方案中，这样的联合治疗可导致例如常规治疗效力的提高，达到预定终点所需常规治疗剂量的降低、治疗持续时间的降低、与常规治疗相关的副作用的降低等中的一种或更多种。

本发明的某些实施方案提供给了PapMV组合物单独或与常规治疗联合用于在患有慢性、持续性或复发性感染的对象中治疗免疫衰竭的用途。

在某些实施方案中，可通过肺途径向肺癌患者施用PapMV组合物以刺激肺中先天免疫应答的抗肿瘤活性。

药盒

本发明还提供了包含PapMV组合物的药盒。在某些实施方案中，所述药盒是便携式的并且可由人携带。所述药盒还可任选地包含病原体检测器。所述药盒还可任选地包含用于PapMV组合物的气体或机械抛射剂。

所述药盒的独立组分可包装在单独的容器中，并且与容器的联系可以是由政府机关规定的对药物或生物制品的制造、使用或销售的说明，该说明反映所述机关批准制造、使用或销售。所述药盒可任选地包含概括PapMV组合物的使用方法或施用方案的说明书或指导。

药盒的组分可作为溶液、子宫托或以粉末或冻干形式包装。当提供干燥或冻干形式的药盒组分时，药盒可额外包含用于重构干燥或冻干组分的合适溶剂。不论容器的数量或种类，本发明的药盒还可包含用于辅助向患者施用所述组合物的工具。这样的工具可以是吸入器、雾化器、鼻喷雾装置、注射器、移液管、子宫托分配器或类似医学上批准的递送载体。在某些实施方案中，包含组合物的容器自身可以是这样的工具。

为了更好的理解本文描述的本发明，给出了以下实施例。将理解的是这些实施例旨在描述本发明的示例实施方案，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：通过施用PAPMV VLP#1在小鼠中诱导抗病毒应答

使用具有SEQ ID NO：4(图2B)所述序列的PapMV外壳蛋白，通过如前文描述(Tremblay等，2006，FEBS J.，273：14-25)在大肠杆菌细胞中表达PapMV外壳蛋白并且自装配而制备PapMV VLP。通过鼻内途径施用30或75μg(50uL体积)PapMV VLP以7天间隔处理Balb/C小鼠(每组10只)两次，然后在第二次处理后第三天后用100pfu(噬斑形成单位)的流感病毒毒株WSN/33进行鼻内攻击。对感染的发展追踪14天。在这14天中每天测量一次动物的体重。处死体重减轻超过20％的动物。对照组用PBS(盐水缓冲液)处理。

结果示于图3A～C中。用PapMV VLP处理的两组未表示出感染迹象并且体重持续地正常增长(图3A和B)。相比之下，用PBS处理的组表现了感染迹象并且在攻击后第8天体重减轻超过12％(图3A和B)。PapMV VLP提高动物对抗流感感染的能力。所有用PapMV VLP处理的小鼠存活到了试验结束，而对照组的30％未存活超过攻击后第8天(图3C)。

实施例2：PapMV VLP诱导的针对病毒攻击之保护的持续时间

进行与实施例1所述类似的实验。通过相同的方法制备PapMV VLP，并且使用相同的处理时间表，但是使用不同剂量的PapMV VLP(60μg)。在第10、12、14和17天(即，PapMV处理后第3、5、7和10天)用流感病毒毒株WSN/33(200pfu)进行攻击，并且在攻击之后监测症状14天。

结果示于图4A～C中，并且表明PapMV VLP提供在最后一次处理后最多5天的保护。通过与对照动物相比降低的体重减轻(图4A)和较轻的症状(图4B)以及100％的存活(图4C)证明在最后一次用PapMV VLP处理后第3天或第5天攻击的动物中的保护。但是，诱导的保护在第7天时已经消退，与用PBS处理的对照组的存活率相比，在用PapMV VLP最后一次处理后第7或第10天攻击的小鼠中观察到低于50％的存活率。

因此，用PapMV VLP处理诱导的保护看来持续约5天时间，该时间与先天免疫应答的非特异性、非持续性诱导相一致。

实施例3：通过施用包含合成的ssRNA的PAPMV VLP对小鼠中抗病毒应答的诱导

通过诱导促炎性细胞因子如IL-6、CXCL10、JE、KC、mGCSF、CCL3、CCL5和TNF的分泌，已表明聚肌酸-聚胞苷酸(聚I：C，dsRNA，一种公知的Toll样受体3(TLR-3)配体)是肺中先天免疫应答的诱导剂(Stowell等，2009，Respir.Res.，10：43)。还已知TLR-7通过与配体如ssRNA和R837(鸟苷类似物)结合来活化先天免疫应答。

在尝试提高PapMV VLP引起先天免疫应答和发生抗病毒应答的能力时，通过实施例17所述的方法制备包含聚I：C dsRNA或ssRNA的PapMV VLP。PapMV外壳蛋白在体外与聚I：C(dsRNA；InvivoGen，SanDiego，CA)或ssRNA装配以产生包含各自RNA的VLP。ssRNA用Promega T7Ribomax Express大规模RNA生产系统(Promega，Madison，WI)在体外制备。

用电子显微镜检查装配的VLP并且观察到其与通过Tremblay等(2006，FEBS J.，273：14-25)所述方法制备的VLP类似(见图25A：包含ssRNA的PapMV VLP和图25B：包含聚I：C的PapMV VLP)。

评价两种VLP在诱导针对流感病毒攻击的保护中的效力。将Balb/C小鼠(每组10只)用60μg包含ssRNA的PapMV VLP(“PapMV VLPssRNA”)、包含聚I：C的PapMV VLP(“PapMV VLP聚I：C”)或等量RNA(即，3μg聚I：C或ssRNA)处理。对照组小鼠用60μgPapMV外壳蛋白(CP)单体(不含RNA)或用对照缓冲剂(10mM Tris-HCl pH8)处理。将小鼠如实施例2所述进行处理(即，以7天间隔鼻内处理两次)并且在最后一次处理后第3天用200pfu流感病毒毒株WSN/33攻击。在接下来的14天中每天一次测量动物的体重、症状和存活。处死表现为体重减轻超过20％的动物。

结果示于图5A～B中。用PapMV VLP ssRNA处理的小鼠表现出经处理组中最好的表现。具体地，用PapMV VLP ssRNA处理的小鼠未减轻任何显著量的体重(图5A)并且表现出非常少(若有的话)的症状(图5B)。用PapMV VLP聚I：C或单独用聚I：C处理的组表现出对攻击的部分保护，与对照组相比降低了体重减轻(图5A)和症状(图5B)。用PapMVCP单体处理未提供任何保护，在用单体处理的小鼠中观察的体重减轻的量(图5A)和症状(图5B)与在用PBS对照处理的小鼠中所观察到的类似。随后对PapMV VLP聚I：C的分析表明这些VLP不如PapMV VLPssRNA稳定，这可能是其较差表现的原因。

实施例4：施用PAPMV VLP#1对小鼠中细胞因子的诱导

为了说明肺中PAPMV VLP诱导的机理，按照与上文实施例1至3中的描述相同的方案(即，以7天间隔在鼻内处理2次)用60μg包含ssRNA的PapMV VLP、15μgPamCSK4(TLR-2配体并且非1型IFN的诱导剂)(Cedarlane，Burlington，ON)或对照缓冲剂(10mM Tris HClpH8)处理小鼠(每组5只)。在第二次处理后第24小时进行支气管肺泡灌洗(BAL)，并且用Luminex技术(Milliplex Mouse cytokine premixed32-plex immunoassay kit；Millipore)筛选细胞因子的存在。

通过用PapMV VLP或PamCSK4处理，诱导了两种主要的细胞因子白介素-9(IL-9)和干扰素-γ诱导蛋白10kDa(IP-10)(图6A和B)。IL-9是由CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子，其促进T增殖并抑制细胞凋亡。IP-10作为IFN-γ分泌的结果出现并且在刺激部位募集T淋巴细胞、树突细胞、NK细胞和巨噬细胞中发挥重要作用。PamCSK4(已知的TLR-2配体和病原体相关分子模式(PAMP)分子)和PapMV VLP对这两种细胞因子的诱导表明VLP也可能是PAMP。

实施例5：通过施用PAPMV VLP#2对小鼠中细胞因子的诱导

进行与实施例4所述类似的实验，不同之处在于在处理6小时后进行BAL，并且所述处理是施用1次或以7天间隔施用2次。与之前一样，在实验中使用60μg包含ssRNA的PapMV VLP。在处理之后用Luminex(32种细胞因子的检测试剂盒)筛选处理后早期产生细胞因子。

结果示于图7A～R中，并且表明用PapMV VLP处理2次与处理一次相比在诱导小鼠中的细胞因子和趋化因子上更高效。此外，在处理后第6比处理后第24小时检测到更多种类的细胞因子和趋化因子(比较图6和图7)。

在来自用PapMV VLP处理的小鼠的BAL中发现MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、mKC、TNF-α和MCP-1非常丰富(图7A～E和H)。这些细胞因子和趋化因子活化人粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，其可导致急性中性粒细胞炎症。它们还诱导成纤维细胞和巨噬细胞合成和释放其他促炎性细胞因子，例如来TNF-α、IL-6和IL-1α/β(Maurer和von Stebut，2004，The International Journal of Biochemistry&CellBiology，36：1882-1886)，这也表现为由PapMV VLP诱导(分别见图7E、N、O和P)。MIP-1蛋白还可通过诱导针对传染性病原体如病毒(包括流感病毒)(Menten等，2002，Cytokine Growth Factor Reviews，13：455-481)和寄生虫(Aliberti等，2000，Nature Immunology，1：83-87)的炎性应答来促进健康，这与之前实施例中所示结果相一致。

响应于PapMV VLP的施用，还观察到IL-6的分泌(图7N)。有趣的是，在抵抗细菌肺炎球菌(Pneumococcus pneumoniae)的感染中表现为需要IL6的分泌(van der Poll等，1997，JInfect Dis.，176(2)：439-44)。

用PapMV VLP处理强烈诱导IP-10(图71)。IP-10是趋化性趋化因子，其有利于炎症部位募集T细胞，并且其还有利于自然杀伤细胞(NK细胞)的增殖和活化。

用PapMV VLP处理还诱导白介素17(图7J)。与干扰素γ类似，IL-17是通过提高多种组织中趋化因子的产生从而向炎症部位募集单核细胞和中性粒细胞而发挥作用的细胞因子。IL-17由辅助T细胞产生，并且也是响应于细胞外病原体侵入免疫系统的促炎性细胞因子。IL-17通过上调促炎性细胞因子和趋化因子如IL-6、粒细胞集落刺激因子、TNFa、IL-1、KC、MCP-1和MIP-2来协调局部组织炎症(Zepp等，2011，TrendsImmunol.Apr12.[印刷版之前的电子版])，而这也表现为由PapMV VLP处理所诱导。

PapMV VLP处理(图7Q和R)还诱导G-CSF和GM-CSF，已知G-CSF和GM-CSF刺激干细胞以产生粒细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)和单核细胞。单核细胞离开循环系统并且迁移进入组织，它们在此处成熟为巨噬细胞。因此，G-CSF和GM-CSF是炎症级联反应的一部分，通过它们，活化少量巨噬细胞可迅速导致巨噬细胞数量提高，这是对抗感染的重要过程(Metcalf，2010，Nature Reviews Cancer,20：425-434)。

如通过免疫细胞分泌的细胞因子和趋化因子谱所表现的，实施例4和5所述结果表明用PapMV VLP处理小鼠诱导强烈且普遍的炎性应答。细胞因子和趋化因子的水平在处理后6小时最大，在处理后24小时显著降低。这很可能是炎性细胞因子和趋化因子诱导免疫细胞和粒细胞的迁移，因此是动物的抗病毒状态超过5天的原因。诱导的细胞因子还可导致1型IFN的分泌，已知后者继而提供抗流感活性。

实施例6：PAPMV VLP ssRNA对TLR-7的活化

用100μgPapMV VLP ssRNA或100μlPBS对C57BL/6、TLR7敲除(KO)、MYD88KO和IRF5/7KO小鼠(每组3～5只小鼠)通过静脉注射(i.v.)进行免疫接种，在免疫接种后24小时的时候分离脾细胞并分析在树突细胞(DC)、CD8⁺T细胞和B细胞中CD86和CD69的表达。用FACS分选细胞并且通过CD69或CD86特异性抗体的结合借助荧光强度评价CD86和CD69的水平。结果在图8中作为所分析样品相对于PBS样品的平均荧光强度(MFI)的比率表示。

简单地说，这些结果表明抗原递呈细胞如DC和B细胞以及CD8+T细胞被PapMV VLP ssRNA纳米颗粒活化。活化依赖于IRF5/7、Mvd88和TLR-7，因为在敲除IRF5/7、Myd88或TLR7的小鼠中未活化。认为TLR-7通过VLP中包含的ssRNA来触发。用外壳蛋白PapMV(单体或其他低分子量形式)进行的实验无法活化TLR-7。

IRF5/7是干扰素应答因子，其通过TLR-7的刺激诱导并且导致产生干扰素α。Myd88分子是衔接分子，其是由TLR-7触发的信号转移的原因。提议的反应级联是：1)由VLP中的ssRNA触发TLR-7；和2)动员(engagement)Myd88，然后诱导IRF5/7，其将导致干扰素α的产生增多。最后，干扰素α有助于PapMV VLP纳米颗粒的免疫调节作用。

实施例7：浆细胞样树突细胞参与PAPMv vLP的免疫原性

用100μgPapMV VLP ssRNA对C57BL/6小鼠(每组5只)通过i.V.进行免疫接种，免疫接种之前进行或不进行耗尽BST2+细胞的处理。为了耗尽，在用PapMV VLP ssRNA免疫接种之前48小时和24小时用500μg抗-BST2抗体(mAb927)通过i.p.注射C57BL/6小鼠。在用PapMVvLP ssRNA进行免疫接种后第24小时通过FACS分析分离的脾细胞中CD69、MHC-I和CD86的表达。

结果示于图9中，并且表明BST2⁺细胞(主要的浆细胞样树突细胞)对于小鼠中PapMV VLP ssRNA纳米颗粒的免疫原性很重要。具体地，在BST2+细胞耗尽的小鼠中观察到B细胞、CD8+细胞和DC无法活化，表明活化通过浆细胞样树突细胞进行。

实施例8：PAPMV VLP#1对干扰素-α之产生的刺激

用100μgPapMV VLP ssRNA或100μlPBS对两组C57BL/6小鼠以及TLR-7KO和MYD88KO小鼠(每组4只小鼠)通过i.V.进行免疫接种。一组C57BL/6小鼠首先如实施例7中所述用抗-BST2抗体进行处理。在免疫接种后6、12、24和48小时(图10A)或免疫接种后6小时(图10B)通过ELISA(VeriKine^TM Mouse Interferon Alpha ELISA Kit；PBLInterferonSource)监测血清和脾细胞中IFN-α的产生。

结果示于图10中，并且表明PapMV VLP ssRNA纳米颗粒对IFN-α之产生的刺激依赖于MYD88、TLR7和BST2⁺细胞。

实施例9：PAPMV VLP#2对干扰素-α之产生的刺激

用100μgPapMV VLP ssRNA或100μlPBS对C57BL/6和IFNARKO小鼠(每组3只小鼠)通过i.V.进行免疫接种。在免疫接种后24小时通过流式细胞术评价从小鼠的脾分离的B淋巴细胞和树突细胞中CD86、MHC-I和CD69的表达。

结果示于图11A和11B中，并且表明I型IFN受体是PapMV VLPssRNA纳米颗粒活化小鼠免疫细胞所必需的。敲除了I型IFN受体(IFNAR KO)的小鼠未表现出PapMV VLP ssRNA纳米颗粒对免疫细胞的活化。

通过间接ELISA测量与PapMV VLP ssRNA包被平板结合的总IgG，分析在用100μgPapMV VLP ssRNA进行免疫接种后第4、8、12、20和30天的C57BL/6和IFNAR KO小鼠(每组9只小鼠)血清中针对PapMVVLP ssRNA的抗体的水平。

结果示于图11C中，并且表明I型IFN信号传导的缺失导致针对PapMV VLP ssRNA纳米颗粒的抗体应答显著延迟。

实施例10：用PAPMV VLP预处理有助于控制慢性感染

LCMV是慢性感染(例如HCV感染)的相关动物模型。LCMV的克隆13变体建立了小鼠中的持续性感染。与HCV感染类似，LCMV感染主要受CTL控制，并且CTL应答衰竭与PD-1表达相关。

用100μgPapMV VLP ssRNA、100μgR837(市售TLR-7配体)或100μlPBS通过i.V.处理C57BL/6和TLR7敲除(KO)小鼠(每组3～6只小鼠)，6小时之后用2×10⁶PFU LCMV克隆13感染(i.V.)。在第5、11、15、25和45天采集血样以通过LCMV焦点形成测定(focus-forming assay)评价病毒滴度。在感染后第15天或45天处死小鼠以通过FACS分析脾中的免疫应答，并且如先前所述(Lacasse等，2008，J.Virology，82：785-794)使用大鼠抗LCMV-NP单克隆Ab(VL-4)在MC57成纤维细胞上通过LCMV焦点形成测定分析脾、肝、肾和脑中的病毒滴度。C57BL/6小鼠的血液中LCMV克隆13的病毒动力学在图12中描述，并且表明用PapMV VLPssRNA纳米颗粒预处理控制LCMV诱导的慢性感染。

感染后第15天C57BL/6和TLR7KO小鼠脾、肾、肝和脑中的病毒滴度示于图13中，表明用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理比市售TLR7配体(R837)以更大效力并且以TLR7依赖的方式降低了不同器官中的病毒负荷。认为PapMV VLP ssRNA纳米颗粒中的TLR-7配体是ssRNA组分，其占分子的约5％。同样地，尽管向小鼠施用了100μg的每一种物质，PapMV VLP ssRNA纳米颗粒在降低小鼠中的LCMV病毒负荷中比R837更有效超过20倍。

图14示出在用LCMV克隆13感染之前施用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒使GP33特异性CD8⁺T细胞的功能提高。对于NP396特异性CD8⁺T细胞得到了类似结果。具体地，图14F表明通过用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理，GP33特异性CD8⁺T细胞中表达的PD-1的量显著降低。PD-1是免疫衰竭的指示剂，其表达是LCMV克隆13感染的特征。用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理小鼠导致PD-1水平保持在如未感染小鼠中的一样低，表明在这些小鼠中免疫系统未衰竭，这是这些小鼠能够抗感染的原因。

图15示出感染后第45天C57BL/6小鼠的脾、肾、肝和脑中的病毒滴度。该结果表明因用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒预处理造成的病毒负荷的降低在处理后数周依然明显。

实施例11：PAPMV VLP在体外对人单核细胞的活化

通过Ficoll梯度分离人PBMC并且用100μg/ml PapMV VLP ssRNA或PBS处理。在处理后第18小时，通过流式细胞术分析CD14⁺CD11b⁺细胞群(单核细胞)的CD86表达。

结果示于图16中，并且表明人单核细胞也被PapMV VLP ssRNA纳米颗粒活化。这些结果代表三个独立实验。

实施例12：PAPMV VLP对抗菌应答的诱导

通过鼻内途径用单独缓冲剂(10mM Tris pH8)或用60μgPapMVVLP ssRNA以7天间隔处理小鼠(每组10只小鼠)两次。在处理后第3天，用220CFU(菌落形成单位)的有毒力的肺炎链球菌菌株感染小鼠。

在4天中每12小时密切监测存活率。结果示于图17中。用PapMVVLP ssRNA处理的组中的全部小鼠在感染中存活。用缓冲剂处理的组表现出70％存活。

尽管在本实施例中使用的肺炎链球菌的剂量是亚致死剂量，但是数据强烈表明用PapMV纳米颗粒预处理将通过诱导肺内的先天免疫应答来对细菌感染提供保护。本实施例和之前的实施例表明由PapMV纳米颗粒赋予的保护是非特异性的，因为其有效地针对病毒和细菌的感染。

实施例13：使用PAPMV VLP处理LCMV慢性感染

将C57BL/6小鼠(每组3只小鼠)在第0天用2×10⁶PFU LCMV克隆13通过i.v.进行感染，并且在第1、2、3、4和5天(A组)或仅在第6和第7天(B组)用100μgPapMV VLP ssRNA或100μlPBS每天一次通过i.v.进行处理。在感染后第5、10和15采集血样并且在第15天处死小鼠以通过LCMV焦点形成测定来分析血液、脾、肾和脑中的病毒滴度。

在动物血液中发现的病毒滴度示于图18中。尽管在第15天，用PapMV VLP ssRNA纳米颗粒处理的小鼠表现出与对照相同的滴度，但是观察到在第10天在这两组小鼠中病毒滴度显著降低(A组动物中降低接近于log10)。该结果强烈表明通过调整处理方案，在用PapMV VLPssRNA纳米颗粒处理的小鼠中将可实现病毒负荷的进一步降低。例如，可提高处理次数。如在第1至5或6和7天提供处理表现为LCMV滴度降低，这很可能的是提高第6和7天后的处理次数将提供病毒负荷的进一步降低。作为替代或补充，可提高PapMV VLP的施用量，例如提高至每剂量200μg。

在动物的多种器官中发现的病毒滴度示于图19中。尽管在第6天和第7天(B组)处理的动物脑中的病毒负荷表现出显著降低，但是经处理小鼠其他器官中的病毒负荷未表现出显著降低。这最可能是由于在第15天测量的滴度，其允许感染足够时间以在处理后“反弹”。预期随后第6天和第7天的处理将导致病毒负荷更显著的降低。

实施例14：用PAPMV VLP多次处理延长保护期

实施例2表明通过PapMV VLP处理诱导的保护看来持续约5天时间。为了研究如果用多剂量PapMV VLP进行处理是否可提供更长的保护期，根据实施例1所述一般方案用包含ssRNA的PapMV VLP以一周间隔处理小鼠1次(1×)、2次(2×)、5次(5×)或10次(10×)。最后一次处理后第3天，如实施例2所述用流感WSN/33病毒对小鼠进行攻击。

小鼠的体重减轻示于图20中。还注意到动物未受到多次处理的影响，并且与对照动物一样在处理期间体重正常增加。

这些结果表明多次处理可使由PapMV VLP纳米颗粒诱导的保护期延长至超过10周。结果还表明用PapMV VLP多次处理不使动物的先天免疫衰竭。最后，众所周知，PapMV VLP的抗体在第一次处理后7天出现并随着将强处理而提高，这些结果表明PapMV VLP触发先天免疫应答的能力不受抗体之产生的影响。

实施例15：PAPMV VLP对中性粒细胞募集的诱导

根据实施例1的方案对小鼠2次滴注包含ssRNA的PapMV VLP，并且在第二次处理后第6小时进行支气管肺泡灌洗(BAL)。结果示于图21中。图21B中圆圈内的是发现进入用PapMV VLP处理的小鼠的BAL中的中性粒细胞。与对照组相比，经处理的小鼠中观察到了3倍更多的中性粒细胞。

中性粒细胞代表第一道防线。该实施例表明在用PapMV VLP处理的小鼠中中性粒细胞迅速募集，仅在处理后6小时。已知中性粒细胞在控制肺中细菌和病毒的感染中发挥关键作用，因此很可能在PapMV处理小鼠中观察到的保护中发挥作用。

实施例16：PAPMV VLP对黏膜免疫应答的诱导

通过以14天间隔两次滴注20μg PapMV VLP ssRNA和2μg三价灭活流感疫苗(TIV)处理Balb/C小鼠(每组10只)。在第0、14和28天抽血。根据同一方案，另一组小鼠是作为对比通过s.c.途径进行免疫接种的动物。在第15天用1LD₅₀的流感WSN/33病毒攻击小鼠，在接下来的14天时间体重减轻。

使用TIV的抗体通过ELISA测量经免疫接种的动物血液中的IgG滴度，结果示于图22中。在使用相同途径进行免疫接种时，与单独用TIV进行免疫接种的组相比，向TIV中添加PapMV VLP使总IgG和IgG2a应答显著提高。有趣的是，对于动物血液中总IgG和IgG2a的产生，s.c.途径比i.n.途径更高效。

使用TIV的抗体通过ELISA在经免疫接种的动物的支气管肺泡灌洗(BLA)和粪便中测量抗体滴度，结果示于图23中。根据这些结果，很显然仅i.n.处理触发BAL中IgA的产生。与单独滴注TIV相比，向TIV中添加PapMV VLP使肺中IgA的量显著提高。与单独用TIV的组相比，在用PapMV VLP和TIV处理的动物中还观察到BAL中显著提高的总IgG。从得自在鼻内用PapMV VLP处理并且通过i.n.施用TIV的小鼠的BAL中总IgG的量与得自用所述组合皮下处理的小鼠无显著差异。最后，有趣的是注意到在用所述组合鼻内处理的小鼠的肠中也观察到了黏膜免疫应答，如在该器官中存在针对TIV的IgA所表明的(图23C)。

用流感病毒攻击之后小鼠的体重减轻示于图24中。所述攻击表明通过鼻内途径进行免疫接种在保护小鼠对抗异型毒株中比通过s.c.途径更稳健且高效。在用PapMV VLP和TIV的组合通过i.n.途径进行免疫接种的组中，小鼠体重增加并且不表现出任何症状。通过s.c.施用所述组合仅提供部分保护。但是，通过使用s.c.施用3μgTIV和30μg PapMV VLP可取得完全的保护。用单独TIV(通过任何途径)、单独PapMV VLP或对照缓冲剂进行免疫接种的全部其他组不被保护，表现出疾病症状并且体重显著量地减轻。

该实验的结果表明PapMV VLP可充当黏膜佐剂。佐剂触发黏膜免疫应答的能力对于有效预防或治疗通过黏膜进入身体的微生物引起的感染和疾病(包括流感、结核病和幽门螺杆菌感染)很重要。经免疫接种的动物的粪便中IgG的存在表明使用PapMV VLP作为佐剂通过i.n.接种疫苗可用于抵御肠中细菌或病毒的感染。另外，由于通过PapMV VLP触发的黏膜免疫应答是全身性的，所以使用PapMV VLP作为佐剂通过i.n.接种疫苗还可潜在地用于抵御阴道黏膜中细菌或病毒的感染(例如，HIV-1)。

尽管在这个实验中未在单独用PapMV VLP处理的小鼠中观察到保护，但是这与之前实施例中的结果相一致，其表明通过PapMV VLP诱导的非特异性保护仅持续约5天时间。在该实验中，在第二次滴注VLP后第14天进行攻击。

实施例17：PAPMV VLP对TLR-2和CD14的活化

如在之前实施例中证明的，在细菌宿主细胞中制备的PapMV VLP和用ssRNA通过体外自装配制备的PapMV VLP二者都能够刺激先天免疫应答。但是，通过两种不同方法制备的VLP活化不同的TLR。如上文所示，用ssRNA通过体外自装配制备的PapMV VLP活化TLR-7。相比之下，如先前描述(Tremblay等，2006,出处同上)通过在大肠杆菌细胞中表达PapMV外壳蛋白和自装配而制备的PapMV VLP活化TLR-2和CD14。

简言之，用100μg PapMV VLP(根据Tremblay等制备)或已知的TLR配体(获自金黄色葡萄球菌(LTA)的100μg脂磷壁酸：TLR2和CD14配体；1μg Pam3SCK4：TLR2配体；或10μg鞭毛蛋白：TLR5配体)和抗CD14、抗TLR2或抗TLR5抗体处理THP1-XBlue^TM-CD14细胞(InvivoGen，San Diego，CA)。THP1-XBlue^TM-CD14细胞包含多个TLR(包括TLR2、4、5)，并且已被修饰成在TLR被配体占据时产生蓝色。占据之后，细胞变为蓝色并且可用分光光度计迅速评价占据的强度。在将细胞在37℃下孵育24小时后进行测量。

结果示于图26中。针对CD14，TLR2或TLR5的抗体(Ac)阻止各自TLR或CD14的占据，并且揭示了每一种受试分子产生的相互作用。在使用抗TLR2抗体与PapMV VLP一起时观察到光密度显著降低，在使用抗CD14抗体时观察到强烈降低。在该实验中，当使用Pam3CSK4(已知的TLR2配体)时，TLR2的抗体不能像预期的那样较高地降低光密度。这很可能是在实验中Pam3CSK4的使用量过高。

用在细菌中装配的PAPMV VLP观察到的TLR活化的差异可能是由于在从细菌中分离之后对VLP进行的清洁剂处理的结果。该处理可能影响PAPMV VLP的表面，例如暴露出疏水残基并导致VLP成为TLR2的配体。与存在于核内体中的TLR7不同，TLR2和TLR14二者表面暴露于免疫细胞

实施例18：包含ssRNA的PAPMV VLP的制备方法

本实施例描述了用于通过在体外将重组PapMV外壳蛋白(rCP)装配在合成的RNA模板(SRT)上从而产生重组VLP(rVLP)来制备PapMVVLP的方法。rVLP是宽15nm、长50至数千nm的杆状纳米颗粒。所述方法总结在图27中的流程图中。

rCP的产生

在诱导型启动子的控制下在转化有包含rCP基因的质粒DNA的大肠杆菌中产生具有6×His标签的rCP。简言之，将PapMV CP克隆到两侧是限制酶NcoI和BamHI的pQE80载体(QIAGEN)中，并且在T5启动子的控制下表达蛋白质。用大肠杆菌BD-792进行表达。将转化的细菌培养在标准培养基中。通过向培养基中添加生化诱导剂(0.7～1mM IPTG于22-25℃下6-9小时)触发蛋白质的表达。在孵育期结束时，收集细胞，混悬在裂解缓冲液(10mM Tris pH8.0，500mM NaCl)中并且用弗氏压碎器(French press)、均化器或超声发生器机械破裂。通过用标准DNA酶处理除去基因组DNA并通过离心或切向流过滤(300kDa至0.45μmMWCO膜)除去大的细胞碎片使细胞裂解物澄清。将rCP捕获在离子基质亲和树脂上并使用标准流程用pH梯度或咪唑洗脱。之后通过阴离子交换色谱/过滤从内毒素中并且通过切向流过滤(0至30kDa MWCO膜)从小的低MW分子中纯化rCP。通过透析或切向流过滤(5至30kDaMWCO膜)除去rCP溶液中存在的任何咪唑污染。通过过滤对最终的rCP蛋白溶液除菌。可将无菌产品在2～8℃下储藏并且稳定数年。

SRT的产生

SRT的序列提供在图28[SEQ ID NO：5]中。SRT基于PapMV的基因组并且在5′-端包含PapMV外壳蛋白成核信号(在图28中框出)。其余核苷酸序列是多突变的(poly-mutated)，其中全部ATG密码子突变为TAA终止密码子。序列的前16个核苷酸(图28中的下划线)包含位于pBluescript表达载体中并且存在于RNA转录物中的T7转录起始位点。图28中的五聚物重复用下划线标出。整个转录物的长度为1522个核苷酸。

使用标准流程将与SRT对应的DNA插入到包含原核RNA聚合酶启动子的DNA质粒中。使用重组质粒转化大肠杆菌细胞，随后将经转化的细菌培养在标准培养基上。回收质粒DNA并且通过标准技术从细胞培养物中纯化，然后通过用限制酶(Mlul)在DNA序列中紧接将存在于SRT中的最后一个核苷酸的位点切割来线性化。

根据制造商的推荐方案使用RiboMAX^TM试剂盒(Promega，USA)通过T7RNA聚合酶进行SRT的转录。表达载体设计为从RNA聚合酶启动子开始的转录物在DNA切割位点从DNA模板释放。用100kDa MWCO膜通过切向流过滤纯化SRT以除去DNA、蛋白质和游离核苷酸。无菌产物在低于-60℃下储藏并且稳定数年。

rVLP的产生

通过合并rCP和SRT在体外装配rVLP。在中性缓冲溶液(10mMTris-HCl pH8)中进行装配反应。用15～30mg蛋白质/1mg RNA的蛋白质：RNA比例进行装配反应。将新装配的rVLP与少量RNA酶(0.0001μgRNA酶/μgRNA)一起孵育以除去从rVLP中突出的任何RNA。该步骤提高了rVLP的溶解度。然后通过用10～100kDa MWCO膜的渗滤(diafiltration)从污染物和游离rCP(未装配的单体rCP)中纯化平端rVLP。通过过滤将最终的rVLP液体悬液除菌。无菌产物可在2～8℃下储藏并且稳定数年。

本说明书中引用的全部专利、出版物(包括公开的专利申请)和数据库条目的公开内容明确地通过引用整体并入本文，其程度如同各自清楚且单独地指明这些单独的专利、出版物和数据库条目通过引用并入本文。

尽管参照某些具体实施方案描述了本发明，但是不脱离本发明的精神和范围而对本发明进行的多种修改对于本领域技术人员将来说是显而易见的。对于本领域技术人员将是显而易见的所有这些修改旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (69)

1.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在对象中刺激先天免疫应答从而在所述对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染之严重程度中的用途。

2.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于在对象中刺激先天免疫应答从而在所述对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染之严重程度的药物中的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述微生物感染是通过黏膜进入所述对象身体的微生物的感染。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述微生物感染是病毒感染。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述微生物感染是细菌感染。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其用于在所述对象中预防微生物感染。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其用于在所述对象中降低微生物感染的严重程度。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中在黏膜表面刺激所述免疫应答。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述组合物用于与一种或更多种抗原一起施用。

10.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在保护对象免受病原体感染中的用途，其中所述组合物在所述对象中刺激所述先天免疫应答。

11.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于保护对象免受病原体感染的药物中的用途，其中所述组合物在所述对象中刺激先天免疫应答。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述病原体是通过黏膜进入所述对象身体的微生物。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述病原体是病毒。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述病毒是流感病毒、黄病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒或鼻病毒。

15.根据权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述病原体是细菌。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述细菌是炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)或伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetii)。

17.根据权利要求10至16中任一项所述的用途，其中所述组合物用于在所述对象预期暴露于所述病原体之前的4小时至6天之间施用。

18.根据权利要求10至16中任一项所述的用途，其中所述组合物用于以多剂量施用。

19.根据权利要求10至18中任一项所述的用途，其中所述对象免疫功能受损、经受化学治疗或接受免疫抑制药物。

20.根据权利要求10至19中任一项所述的用途，其中所述组合物在所述对象中预防免疫衰竭。

21.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在对象中治疗慢性或复发性微生物感染的用途。

22.包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物在制备用于在对象中治疗慢性或复发性微生物感染的药物中的用途。

23.根据权利要求21或22所述的用途，其中所述组合物用于与一种或更多种常规治疗组合施用。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的用途，其中所述微生物感染是细菌感染。

25.根据权利要求21至23中任一项所述的用途，其中所述微生物感染是病毒感染。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述病毒感染是丙型肝炎病毒感染或人类免疫缺陷病毒感染。

27.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述组合物在所述对象中降低病毒负荷。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的用途，其中所述组合物用于鼻内施用。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的用途，其中所述组合物包含PapMV。

30.根据权利要求1至28中任一项所述的用途，其中所述组合物包含PapMV VLP。

31.根据权利要求30所述的用途，其中所述PapMV VLP包含ssRNA。

32.在对象中刺激先天免疫应答的方法，其包括向所述对象施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，从而在所述对象中预防微生物感染或降低所述微生物感染的严重程度。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物感染是通过黏膜进入所述对象身体的微生物的感染。

34.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物感染是病毒感染。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。

36.根据权利要求32所述的方法，其用于在所述对象中预防微生物感染。

37.根据权利要求32所述的方法，其用于在所述对象中降低微生物感染的严重程度。

38.根据权利要求32所述的方法，其中在黏膜表面刺激所述免疫应答。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述组合物与一种或更多种抗原一起施用。

40.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物通过鼻内途径施用。

41.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物包含PapMV。

42.根据权利要求32所述的方法，其中所述组合物包含PapMVVLP。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述PapMV VLP包含ssRNA。

44.保护对象免受微生物感染的方法，其包括向所述对象施用有效量的包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中所述组合物在所述对象中刺激先天免疫应答。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物感染是通过黏膜进入所述对象身体的微生物的感染。

46.根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物感染是病毒感染。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述病毒感染是流感病毒、黄病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒或鼻病毒感染。

48.根据权利要求44所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述细菌感染是炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、白喉棒状杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌、卡他莫拉菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌或伯内特科克斯立克次体感染。

50.根据权利要求44所述的方法，其中在所述对象预期暴露于所述病原体之前的4小时至6天之间向所述对象施用所述组合物。

51.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物以多剂量向所述对象施用。

52.根据权利要求44所述的方法，其中所述对象免疫功能受损、经受化学治疗或接受免疫抑制药物。

53.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物在所述对象中预防免疫衰竭。

54.根据权利要求44所述的方法，其中通过鼻内途径施用所述组合物。

55.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物包含PapMV。

56.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物包含PapMVVLP。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述PapMV VLP包含ssRNA。

58.治疗慢性或复发性感染的方法，其包括向患有慢性微生物感染的对象施用包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)的组合物。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述组合物与一种或更多种常规治疗组合施用。

60.根据权利要求58所述的方法，其中所述微生物感染是细菌感染。

61.根据权利要求58所述的方法，其中所述微生物感染是病毒感染。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述病毒感染是丙型肝炎病毒感染或人类免疫缺陷病毒感染。

63.根据权利要求58所述的方法，其中所述组合物在所述对象中降低病毒负荷。

64.根据权利要求58所述的方法，其中通过鼻内途径施用所述组合物。

65.根据权利要求58所述的方法，其中所述组合物包含PapMV。

66.根据权利要求58所述的方法，其中所述组合物包含PapMVVLP。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述PapMV VLP包含ssRNA。

68.药盒，所述药盒包含其中含有药物组合物的容器，所述药物组合物包含番木瓜花叶病毒(PapMV)或PapMV病毒样颗粒(VLP)，所述容器适用于通过鼻内、肺或阴道途径递送所述药物组合物。

69.根据权利要求68所述的药盒，其中所述容器是吸入器、雾化器或鼻喷雾装置。

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