JP6093926B2 - パパイヤモザイクウイルス組成物および自然免疫応答刺激のためのその使用 - Google Patents

Description

本発明は、免疫調節の分野に関するものであり、特に、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子を含む組成物の、自然免疫応答を刺激するための使用に関するものである。

パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）およびＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）が有する抗原の免疫原性を高める能力が、下記の特許および特許出願に記載されている。

米国特許第７，６４１，８９６号明細書（特許文献１）、カナダ特許出願第２，４３４，０００号明細書（特許文献２）、および国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５号明細書（国際公開第２００４／００４７６１号パンフレット）（特許文献３）には、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ外被タンパク質由来のＶＬＰを、動物において抗原に対する免疫応答を増強するために使用することが記載されている。前記抗原（１以上）は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは、前記抗原を、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット）（特許文献４）には、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰをベースとする、インフルエンザワクチンが記載されている。前記ワクチンは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰと、１以上のインフルエンザ抗原とを含有している。前記インフルエンザ抗原は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット）（特許文献５）には、ＰａｐＭＶをベースとする、免疫原性を有する親和性により複合体化された抗原系が記載されている。この出願には、外被タンパク質と、対象とする抗原に結合可能な複数の親和性ペプチドとの融合物が記載されている。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット）（特許文献６）には、チフス菌（Ｓ．Ｔｙｐｈｉ）および他の腸内細菌性病原体に対するＰａｐＭＶベースのワクチンが記載されている。前記ワクチンは、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰと、１以上の腸内細菌性抗原とを含有している。前記腸内細菌性抗原は、前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰに付着させてもよいし、あるいは前記ＰａｐＭＶまたはＶＬＰと共に投与してもよい。

国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット）（特許文献７）には、ＰａｐＭＶ成分と１以上の抗原とを含有する多価ワクチン、ならびに、ある病原体の複数の株または１を超える病原体に対する防御を提供するための前記ワクチンの使用が記載されている。前記ワクチンは、サルモネラ菌種のポリン成分を任意に含むことができる。

その他の出版物において、抗原に対する体液性および細胞性免疫応答を誘導するＰａｐＭＶ ＶＬＰの能力が記載されている（Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８（非特許文献１）；Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：３３９５−４０３（非特許文献２）；Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８１：１３１９−２６（非特許文献３）；Ｌａｃａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８２：７８５−９４（非特許文献４））。植物から単離したＰａｐＭＶウイルス粒子は、自然免疫応答を活性化すること、ならびに免疫系により病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と認識されることがわかっており、このことから、ＰａｐＭＶの免疫原性、ならびにＰａｐＭＶに内在するアジュバント特性により、ＰａｐＭＶを抗原と同時投与した際に観察される、特異的な持続性抗体応答が得られると提唱されるに至った（Ａｃｏｓｔａ−Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２４：１８６−９７（非特許文献５））。

自然免疫は、感染に対する抗体に依存しない防護の最前線であり、多くの場合に、感染性の作用物質を駆除できる。自然免疫の構成要素は、微生物病原体に特徴的で、且つ、哺乳類の細胞には存在しない構造を認識する。自然免疫の主要なエフェクター細胞は、好中球、単核食細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。好中球およびマクロファージは、血液および組織中の微生物を認識する表面受容体を発現し、食作用を刺激するか（例えば、マンノースまたはオプソニン受容体）、または貪食に関与していない食細胞を活性化する（例えば、トール様受容体、ＴＬＲ）。自然免疫のエフェクター機構は、獲得免疫応答においても、しばしば微生物の駆除に使用される。このように、自然免疫応答は、抗原に呼応して抗原特異的な（適応性の）ＴおよびＢリンパ球の増殖および分化を刺激するよう機能するシグナルを提供することができる。

自然免疫応答の刺激因子が、これまでに記載されている。米国特許出願第１１／８３０，６２２号明細書（米国特許出願公開第２００８／０１７０９６６号明細書）（特許文献８）には、自然免疫を刺激する微生物ライセートを吸入することにより、呼吸器感染症を弱める方法が記載されている。米国特許出願第１０／９７２，０６２号明細書（米国特許出願公開第２００９／０３１８３３７号明細書）（特許文献９）には、プロテアソームをベースとする免疫活性組成物を対象に投与することにより、自然免疫を活性化する方法が記載されている。米国特許出願第１２／５５６，７５９号明細書（米国特許出願公開第２０１１／０１０５３８３号明細書）（特許文献１０）には、組換え細菌タンパク質を対象に投与することにより、病原体に対する自然免疫抵抗性を刺激する方法が記載されている。

この背景情報は、出願人が本発明に関連する可能性があると考える情報を明らかにするために提供するものである。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術であることを必ずしも認めるものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

米国特許第７，６４１，８９６号明細書 カナダ特許出願第２，４３４，０００号明細書 国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５号明細書（国際公開第２００４／００４７６１号パンフレット） 国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書（国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレット） 国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４号明細書（国際公開第２００８／０５８３６９号パンフレット） 国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書（国際公開第２００８／０８９５６９号パンフレット） 国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書（国際公開第２０１０／０１２０６９号パンフレット） 米国特許出願第１１／８３０，６２２号明細書（米国特許出願公開第２００８／０１７０９６６号明細書） 米国特許出願第１０／９７２，０６２号明細書（米国特許出願公開第２００９／０３１８３３７号明細書） 米国特許出願第１２／５５６，７５９号明細書（米国特許出願公開第２０１１／０１０５３８３号明細書）

Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８ Ｄｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ ２６：３３９５−４０３ Ｌｅｃｌｅｒｃ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８１：１３１９−２６ Ｌａｃａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，８２：７８５−９４ Ａｃｏｓｔａ−Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２４：１８６−９７

本発明は、自然免疫応答を刺激するための、パパイヤモザイクウイルス組成物の使用を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するための、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における自然免疫応答を刺激し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減するための医薬品の製造における、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、病原体による感染から対象を防御するための、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用であり、前記組成物が、前記対象における自然免疫応答を刺激することを特徴とする使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、病原体による感染から対象を防御するための医薬品の製造における、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用であり、前記組成物が、前記対象における自然免疫応答を刺激することを特徴とする使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における慢性または反復性の微生物感染を治療するための、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における慢性または反復性の微生物感染を治療するための医薬品の製造における、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物の使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象における自然免疫応答を刺激する方法であり、前記対象にパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物を有効量投与し、これにより、前記対象における微生物感染を予防するか、またはその重症度を軽減することを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、微生物感染から対象を防御するための方法であり、前記対象にパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物を有効量投与することを含み、前記組成物が、前記対象における自然免疫応答を刺激することを特徴とする方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、慢性または反復性の感染の治療方法であり、慢性の微生物感染を有する対象にパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物を投与することを含む方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）またはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む医薬組成物を収容した容器を備えたキットであり、前記容器が、前記医薬組成物を鼻腔内、肺内、または膣内経路で送達するよう構成されたキットが提供される。

本発明のこれらおよびその他の特徴は、添付図面を参照した以下の詳細な説明により、より明らかとなる。

図１において、（Ａ）は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示し、（Ｂ）は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。

図２において、（Ａ）は、改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸配列（配列番号３）を示し、（Ｂ）は、改変ＰａｐＭＶ外被タンパク質ＰａｐＭＶ ＣＰｓｍのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。

図３は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰがインフルエンザ感染を制御する抗ウイルス応答を誘導することを実証する結果を示している。（Ａ）は、３０μｇもしくは７５μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはコントロール緩衝液（ＰＢＳ）を鼻腔内投与し、１００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジしたＢａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）の体重低下を示す。（Ｂ）は、感染中にマウスに生じた症状を示す（症状０：症状なし、１：軽い毛の逆立ち、若干の背の湾曲。２：毛の逆立ち、背の湾曲。３：毛の逆立ち、背の湾曲、動作困難、および軽い脱水症状。４：毛の逆立ち、背の湾曲、動作困難、重篤な脱水症状、閉眼、および眼から分泌物）。（Ｃ）は、感染したマウスの生存率を示す。

図４は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰがインフルエンザ感染を制御する抗ウイルス応答を誘導することを実証する結果を示している。（Ａ）は、６０μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはコントロール緩衝液（ＰＢＳ）を鼻腔内投与し、２００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジしたＢａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）の体重低下を示す。（Ｂ）は、感染中にマウスに生じた症状を示す（症状：図３と同じ）。（Ｃ）は、感染したマウスの生存率を示す。

図５は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰがインフルエンザ感染を制御する抗ウイルス応答を誘導することを実証する結果を示している。（Ａ）は、ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、６０μｇのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、３μｇのｓｓＲＮＡ、３μｇのｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、６０μｇのＰａｐＭＶ ＣＰモノマー、またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）を鼻腔内投与し、２００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジしたＢａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）の体重低下を示す。（Ｂ）は、感染中にマウスに生じた症状の概要を示す（症状：図３と同じ）。

図６は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ（６０μｇ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（１５μｇ）、またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）を鼻腔内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中におけるＩＰ−１０（Ａ）およびＩＬ−９（Ｂ）の存在を示すグラフである。各点は、各マウスで検出されたサイトカインのレベルに対応する。同マウスから採取した鼻咽頭洗浄液（「ＬＮＰ」）に存在するＩＰ−１０またはＩＬ−９の量も、あわせて示している。

図７ａ−ｃは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ（６０μｇ）またはコントロール緩衝液（トリスＨＣｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）を１回または２回鼻腔内投与したＢａｌｂ／Ｃマウスの気管支肺胞洗浄液中における、（Ａ）ＭＩＰ−１α、（Ｂ）ＭＩＰ−１β、（Ｃ）ＭＩＰ−２、（Ｄ）ＫＣ、（Ｅ）ＴＮＦ−α、（Ｆ）ＲＡＮＴＥＳ、（Ｇ）ＶＥＧＦ、（Ｈ）ＭＣＰ−１、（Ｉ）ＩＰ−１０、（Ｊ）ＩＬ−１７、（Ｋ）ＩＬ−１３、（Ｌ）ＩＬ−１２（ｐ７０）、（Ｍ）ＩＬ−９、（Ｎ）ＩＬ−６、（Ｏ）ＩＬ−１α、（Ｐ）ＩＬ−１β、（Ｑ）ＧＭ−ＣＳＦ、および（Ｒ）Ｇ−ＣＳＦの存在を示すグラフである。各点は、各マウスで検出されたサイトカインのレベルに対応する。

図８は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ（１００μｇ）またはＰＢＳによる免疫の２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウス、ＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス、ＭＹＤ８８ ＫＯマウス、およびＩＲＦ５／７ ＫＯマウスのＤＣ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＢ細胞における、（Ａ）ＣＤ８６および（Ｂ）ＣＤ６９の発現を集計したグラフである。結果はＦＡＣＳにより分析し、ＰＢＳサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比率として示す。

図９は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、抗ＢＳＴ２抗体による処理あり、なしのいずれかの条件下、ＰａｐＭＶ ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡで免疫した２４時間後における、（Ａ）ＣＤ６９、（Ｂ）ＭＨＣ−Ｉ、および（Ｃ）ＣＤ８６の発現についてのフローサイトメトリー分析の結果を集計したグラフである。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意ではない。

図１０は、１００μｇＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）血清中および（Ｂ）脾臓中のＩＦＮ−α産生動態をＥＬＩＳＡにって評価した結果を示すグラフである。（Ｃ）は、１００μｇＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたはＰＢＳによる免疫の６時間後におけるＣ５７ＢＬ／６および異なるノックアウトマウスの血清ＩＦＮ−αを、ＥＬＩＳＡにより定量した結果を示すグラフである。

図１１は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたはＰＢＳによる免疫の２４時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲ ＫＯマウスの脾臓から採取した、（Ａ）Ｂリンパ球および（Ｂ）樹状細胞内におけるＣＤ８６、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ６９の発現を集計したグラフである。（Ｃ）は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる免疫後の異なる時点におけるＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲＫＯマウスの血清中のＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡに対する抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量したグラフである。

図１２は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３（力価は血液１ミリリットル当たりのＰＦＵとして表示、ＬＯＤ：検出限界）感染の６時間前において、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ（黒四角）またはＰＢＳ（白丸）により処理したＣ５７ＢＬ／６マウスの血液中のＬＣＭＶクローン１３のウイルス動態をを示すグラフである。

図１３は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３感染の１５日後におけるＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウスの、（Ａ）脾臓、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）肝臓、および（Ｄ）脳におけるウイルス力価を示すグラフである。前記マウスは、感染の６時間前に、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７、またはＰＢＳで処理した（力価は臓器当たりのＰＦＵとして表示）。ＬＯＤ：検出限界。

図１４は、２×ｌ０^６ｐｆｕのＬＣＭＶクローン１３感染の６時間前に１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７、またはＰＢＳで免疫し、感染１５日後に屠殺したマウスから単離した脾細胞をＧＰ３３で再刺激した後における、（Ａ）ＩＦＮ−γ、（Ｂ）ＴＮＦ−α、および（Ｃ）両サイトカインを産生するＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。（Ｄ）は、ＧＰ３３による再刺激後にＣＤ８^＋Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ−γ量、（Ｅ）は、同ＴＮＦ−α量であり、（Ｆ）は、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球におけるＰＤ−１発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）であり、（Ｇ）は、脾細胞におけるＤｂＧＰ３３^＋ＣＤ８^＋ＣＤ４４^＋のパーセンテージである。

図１５は、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３感染の４５日後の、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの（Ａ）脾臓、（Ｂ）腎臓、（Ｃ）脳、および（Ｄ）肝臓におけるウイルス力価を示すグラフである。前記マウスは感染の６時間前に、１００μｇＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたはＰＢＳで処理した（力価は臓器当たりのＰＦＵとして表示）。ＬＯＤ：検出限界。

図１６は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる刺激の１８時間後のヒトＰＢＭＣ（ＣＤ１４^＋ＣＤｌｌｂ^＋細胞集団）におけるＣＤ８６発現のフローサイトメトリー分析を示したチャートである（ＭＦＩ：平均蛍光強度）。

図１７は、致死未満量の肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によるチャレンジに先立ち、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡを２週間間隔で２回処理したマウスの生存率を示すグラフである。

図１８は、ＬＣＭＶに慢性感染させ、１日１回の１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡを静脈内投与したマウスにおけるウイルス量を示すグラフである。（Ａ）は、感染後１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に処理を行った場合のデータであり、（Ｂ）は、感染後６日目および７日目にのみ処理を行った場合のデータである（力価はＰＦＵ／ｍＬで表示）。

図１９は、図１８に関して述べた方法で処理を行ったマウスの異なる臓器における１５日目（実験終了時）のウイルス力価を示すグラフである。

図２０は、１週間間隔でＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理を１回（１×）、２回（２×）、５回（５×）、および１０回（１０×）行い、最後の処理の３日後にインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジしたマウスの体重低下を示すグラフである。

図２１は、マウスから採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中で発見された細胞を示す電子顕微鏡写真である（好中球を丸で囲んでいる）。（Ａ）は、マウスを緩衝液で処理した場合であり、（Ｂ）はＰａｐＭＶ ＶＬＰで処理した場合であり、（Ｃ）は、前記ＢＡＬ中の好中球数を示すグラフである。

図２２は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰと３価不活性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の組み合わせの鼻腔内投与により免疫したマウスの血液中で測定したＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ力価を示すグラフである。（Ａ）は、１回の免疫後の総ＩｇＧ力価であり、（Ｂ）は、１４日間隔で行った２回の免疫後の総ＩｇＧ力価であり、（Ｃ）は、２回の免疫後に測定したＩｇＧ２ａ力価である。

図２３は、図２２に関して述べた方法で免疫したマウスにおいて、２回の免疫後に測定した抗体力価を示すグラフである。（Ａ）は、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＩｇＡ力価であり、（Ｂ）は、前記ＢＡＬ中の総ＩｇＧ力価であり、（Ｃ）は、糞中のＩｇＡである。

図２４は、図２２に関して述べた方法で免疫し、１５日目に１ＬＤ_５０のインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジしたマウスにおける体重低下を示すグラフである。体重低下は、１４日間追跡調査した。

図２５において、（Ａ）は、ｓｓＲＮＡと共に自己集合させたＰａｐＭＶ ＶＬＰの電子顕微鏡写真であり、（Ｂ）は、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（ｄｓＲＮＡ）と共に自己集合させたＰａｐＭＶ ＶＬＰの電子顕微鏡写真である。

図２６は、ヒト単球系細胞株（ＴＨＰ−１）においてＰａｐＭＶ ＶＬＰが、ＴＬＲ−２およびＣＤ１４と相互作用すること、ならびに、この相互作用は、ＴＬＲ−２およびＣＤ１４に対する抗体（Ａｃ）によりブロックされることを実証するグラフである。

図２７は、本発明の一実施形態によるインビトロ集合ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰの調製工程を概説したフローチャートである（ｒＣＰ＝組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質；ＳＲＴ＝合成ＲＮＡ鋳型；ｒＶＬＰ＝組換えＶＬＰ；Ｅｃ．ｐｒＣＰ＝ｒＣＰをコードするプラスミドを含む大腸菌；Ｅｃ．ｐＳＲＴ＝ＳＲＴをコードするプラスミドを含む大腸菌）。

図２８は、図２７で概説したプロセスの一実施形態で使用される合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）の配列［配列番号５］を示す。ＡＴＧコドンは全て、ＴＡＡ終止コドン（太字）へと変異させている。最初の１６個のヌクレオチド（下線）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ発現ベクター内に位置するＴ７転写開始部位から開始している。ｒＶＬＰの集合のためのＰａｐＭＶ核形成部位を四角で囲んでいる。

図２９は、図２７で概説したプロセスの一実施形態で使用される合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）の配列［配列番号６］を示す。一番目のＧは、転写物の一番目のヌクレオチドである。ＡＴＧコドンは全て、ＴＡＡ終止コドン（太字）へと変異させている。この配列における最初の１５００個のヌクレオチドは、配列番号５と同一である。

本発明は、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）部分を含む組成物（以下、「ＰａｐＭＶ組成物」という）、ならびに自然免疫応答を刺激するためのその使用を提供する。ＰａｐＭＶ組成物に含まれるＰａｐＭＶ部分は、パパイヤモザイクウイルスまたはＰａｐＭＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）であればよい。ＰａｐＭＶの自然免疫応答活性化能がＰａｐＭＶのアジュバント効果に貢献していることがこれまでに指摘されているが（Ａｃｏｓｔａ−Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ、２００８、同上。）、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰは、単独で投与した場合にも、予期しなかったことに、防御効果および／または治療効果をもたらすのに十分な程度の自然免疫応答を刺激できることを本明細書中において実証している。さらに、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜表面で免疫応答を刺激することができる。

それゆえ、ある実施形態では、本発明は、動物において非特異的な防御免疫応答を刺激し、これにより、その後に起こる病原体の攻撃に対する防御を提供するための、ＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。本明細書に示すように、ＰａｐＭＶ組成物は、迅速な自然免疫応答を刺激することが可能であり、病原体感染に対する防御を数日間にわたって提供できる。ある実施形態では、本発明は、粘模を介して身体に到達する病原体による感染の可能性から対象を防御するための、ＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。例えば、ＰａｐＭＶ組成物は、自然免疫応答を刺激するために単独で投与してもよいし、あるいは、１以上の抗原と組み合わせて投与し、効果的な粘膜免疫応答を生じさせるための粘膜アジュバントとして作用させてもよい。それゆえ、本発明のある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜経路を介して投与され、粘膜および／または呼吸器系内で防御効果を誘導する。本発明のある実施形態では、前記病原体は、ウイルス病原体、細菌性病原体、または真菌性病原体の１以上である。

本発明のある実施形態は、確立された感染、例えば、ウイルス病原体、細菌性病原体、または真菌性病原体による感染を治療するための、ＰａｐＭＶ組成物の使用を規定する。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、例えば、肺、腸、または泌尿生殖器系の粘膜表面における感染を治療するために使用してもよい。

本発明のいくつかの実施形態は、対象における慢性のウイルス感染によるウイルス量を低減し、これにより、前記感染の管理および／またはクリアランスを助けるための、ＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。ＰａｐＭＶ組成物と慢性感染に対する従来の療法とを用いた併用療法も、いくつかの実施形態で提供されている。いくつかの実施形態では、このような併用療法は、例えば、従来の療法の有効性の向上、所定のエンドポイントに到達するために従来の療法が要する用量の低減、治療継続期間の短縮、従来の療法に伴う副作用の軽減等の１以上をもたらし得る。本発明のある実施形態は、対象における慢性感染による免疫疲弊を治療するための、単独または従来の療法と組み合わせたＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。

通常、前記組成物は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰと、好適な担体または希釈剤とを含有するが、対象への投与に適した形態のＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰのみからなる組成物（例えば、フリーズドライまたは凍結乾燥したもの）もまた、いくつかの実施形態では、代替の選択肢である。ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰの混合物を含む組成物も、ある実施形態では企図されている。

＜定義＞
特に定義しない限り、本明細書中で使用するあらゆる技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書中で使用される「約」という用語は、所与の数値から±１０％前後の変動を指す。そのような変動は、本明細書中に記載のあらゆる数値に常に含まれるものと解釈すべきである。

本明細書中で「ａ」または「ａｎ」という単語を「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と共に使用した場合、それは「１（ｏｎｅ）」を意味する場合もあるが、「１以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１または１を超える（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」という意味も有しうる。

本明細書中で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等、その文法的変化形）、「を有する（ｈａｖｉｎｇ）」（および「ｈａｖｅ」や「ｈａｓ」等、その文法的変化形）、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」や「ｉｎｃｌｕｄｅ」等、その文法的変化形）、または「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｉｎｇ）」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」や「ｃｏｎｔａｉｎ」等、その文法的変化形）という単語は、包括的または非限定的な表現であり、記載されていない追加の構成要素や方法工程を除外するものではない。

本明細書中で使用される「天然由来の」は、物体について述べる場合、物体が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、生物、または生物内に存在するポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列で、自然界のソースから単離可能で、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないものは、天然由来である。

本明細書中で使用される「弱める」、「阻害する」、「予防する」という用語およびその文法的変化形は、所与のパラメータまたは事象の測定可能な減少を指す。

本明細書中で使用される「ワクチン」という用語は、対象に投与された際、有益な免疫応答を生じさせることができる組成物を指す。

本明細書中で使用される「病原体」という用語は、宿主に疾患または障害を生じさせることが可能な生物を指し、細菌、ウイルス、原虫、真菌、および寄生虫を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、治療を必要とする動物を指す。

本明細書で使用される「動物」という用語は、哺乳動物、鳥類、および魚類を含むが、これらに限定されない、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指し、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、または他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、アヒル、非ヒト霊長動物、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスター、およびマウス等の飼育動物、家畜、動物園の動物、実験動物、ならびに野生動物を包含する。

１以上のさらに別の治療薬と「組み合わせた」ＰａｐＭＶ組成物の投与とは、同時（並行）投与および連続投与を含むことを意図している。連続投与とは、（１以上の）治療薬および本発明の組成物の、種々の順序での対象への投与を包含することを意図するものであり、前記治療薬および前記組成物の投与の間隔が、短く設定させてもよいし（例えば、数分程度）、長く設定されていてもよい（例えば、数日または数週間程度）。

核酸またはアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、ある核酸またはアミノ酸配列が、例えば以下で述べる方法を用いて最適に整列されたとき、規定の第２の核酸またはアミノ酸配列（または「参照配列」）に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有することを指す。「実質的な同一性」は、完全長配列、機能性ドメイン、コードおよび／または調節配列、プロモーター、およびゲノム配列等、様々なタイプおよび長さの配列を指すために使用され得る。２つのアミノ酸または核酸配列の間の同一性パーセントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ． ａｎｄ Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ（商標）に組み込まれている「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１）），Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ ｐｐ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０）、およびＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ、およびＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含むそれらのバリエーション等、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内である様々な方法で決定され得る。加えて、当業者は、比較する配列の全長にわたり最大の一致を達成するために必要なアルゴリズムを含む、アラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。一般に、アミノ酸配列に関しては、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸である。当業者であれば、実際の長さは比較する配列の全長によって左右され、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、または少なくとも２００アミノ酸となるか、あるいは、当該アミノ酸配列の全長となる場合もあることを理解するであろう。核酸に関しては、比較配列の長さは一般的に少なくとも２５ヌクレオチドであるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、または少なくとも６００ヌクレオチドとなるか、あるいは当該核酸配列の全長となる場合もある。

「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏまたはｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ）」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部または一部と同一であることを指す。対照的に、「相補的」という用語は、本明細書中では、核酸配列が参照核酸配列の相補鎖の全部または一部と同一であることを指すために使用される。例を挙げると、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。「に対応する」という用語を、本明細書中において、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の相互参照に用いた場合には、ＤＮＡ配列が、参照ＲＮＡ配列の全部または一部と同一であることを指す（逆もまた同様である）。ただし、ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）残基に対応する位置にはチミン（Ｔ）残基を含有する。それゆえ、例を挙げると、ＤＮＡ配列「ＴＡＴＡＣ」は、ＲＮＡ参照配列「ＵＡＵＡＣ」に対応する。

本発明のあらゆる方法または組成物について、本明細書中に記載のあらゆる実施形態が実施可能であり、逆もまた同様と企図するものである。さらに、本発明の組成物およびキットを使用して本発明の方法を達成することができる。

＜ＰａｐＭＶ部分＞
本発明のＰａｐＭＶ部分は、ＰａｐＭＶまたはＰａｐＭＶ ＶＬＰのいずれであってもよい。本発明のある実施形態では、前記ＶＬＰを含む組成物は、ディスク形態の多量体化ＰａｐＭＶ外被タンパク質を、少量含有してもよい。

ＰａｐＭＶは、当該技術分野で公知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＶ−２０４（商標）として入手可能である。

ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、多量体化し、自己集合してＶＬＰを形成した組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質から形成される。集合すると、各ＶＬＰは、外被タンパク質サブユニットの長いらせん配列を含む。野生型ウイルスは、１２００超の外被タンパク質サブユニットを含み、約５００ｎｍの長さである。しかしながら、野生型ウイルスより短いまたは長いＰａｐＭＶ ＶＬＰも、やはり有効である。本発明のある実施形態では、ＶＬＰは、少なくとも４０個の外被タンパク質サブユニットを含んでいればよい。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、約４０〜約１６００個の外被タンパク質サブユニットを含んでもよい。これよりも多くの個数の外被タンパク質を含むＶＬＰも企図されている。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは少なくとも４０ｎｍの長さであればよい。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは約４０ｎｍ〜約６００ｎｍの長さでもよい。本発明のある実施形態では、６００ｎｍ超の長さのＶＬＰが企図されている。

本発明のＶＬＰは、同一のアミノ酸配列を有する複数の組換え外被タンパク質から、集合によって得られる最終的なＶＬＰが同一の外被タンパク質サブユニットを含むように調製できる。あるいは、前記ＶＬＰは、異なるアミノ酸配列を有する複数の組換え外被タンパク質から、集合によって得られる最終的なＶＬＰがその外被タンパク質サブユニット内に変異を含むように調製することもできる。

ＶＬＰの調製に使用されるＰａｐＭＶ外被タンパク質は、ＰａｐＭＶ外被タンパク質全体とすることもできるし、またはその一部とすることもできる。あるいは、例えば、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換等を含む野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変体を使用することもできるが、この場合は、当該外被タンパク質が、自己集合によりＶＬＰとなる能力を保持していることが条件である。野生型ＰａｐＭＶ外被（またはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり（Ｓｉｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３２５−２３３１、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０４４３３４．１参照）、本明細書中においては、配列番号１として示す（図１Ａ参照）。この配列の変異体が公知であり、例えば、Ｎｏａ−Ｃａｒｒａｚａｎａ氏およびＳｉｌｖａ−Ｒｏｓａｌｅｓ氏によって記載された、ＰａｐＭＶのメキシコ分離株の外被タンパク質（２００１、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、８５：５５８）は、配列番号１に対し、８８％の配列同一性を有している。ＰａｐＭＶ外被タンパク質のヌクレオチド配列も、当該技術分野で公知であり（Ｓｉｔ，ｅｔ ａｌ．、同上、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００１７４８（ヌクレオチド５８８９−６５３６）参照）、本明細書中においては、配列番号２として示す（図１Ｂ参照）。

上述したように、ＰａｐＭＶ外被タンパク質（以下、ＰａｐＭＶ ＣＰともいう）のアミノ酸配列は、親（野生型）配列に厳密に対応する必要はない。すなわち、「変異体配列」であってもよい。例えば、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、１以上のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失により変異誘発し、その部位の残基が親（参照）配列に対応しないよう構成してもよい。しかしながら、このような変異は広範なものではなく、当該組換えＰａｐＭＶ ＣＰが集合してＶＬＰを形成する能力に劇的な影響を及ぼさない程度のものであることを、当業者であれば理解するであろう。ＰａｐＭＶ外被タンパク質変異体が集合してＶＬＰを形成する能力については、例えば、米国特許出願第１１／５５６，６７８号明細書に記載の例示的方法等、標準的な技術にしたがい、電子顕微鏡検査によって評価できる。

したがって、多量体化し、集合してＶＬＰを形成する能力を保持する野生型外被タンパク質のフラグメント（すなわち、「機能的」フラグメントである）を用いて調製される組換えＰａｐＭＶ ＣＰもまた、本発明において企図されている。例えば、フラグメントは、当該タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部、またはこれらの組合せからのアミノ酸の欠失を１以上含んでもよい。一般的に、機能的フラグメントは、少なくとも１００アミノ酸長である。本発明の一実施形態では、機能的フラグメントは、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも１６０アミノ酸長、少なくとも１７０アミノ酸長、少なくとも１８０アミノ酸長、および少なくとも１９０アミノ酸長である。野生型タンパク質のＮ末端でなされる欠失は、当該タンパク質の自己集合能を保持するため、一般的に、１３未満のアミノ酸の欠失とすべきである。

本発明のある実施形態では、組換え外被タンパク質が変異体配列を含む場合、前記変異体配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態では、前記変異体配列は、参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の実施形態では、前記変異体配列は、参照配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、および少なくとも約９８％同一である。ある実施形態では、参照アミノ酸配列は、配列番号１（図１Ａ）である。

本発明のある実施形態では、組換えＰａｐＭＶ ＣＰの調製に使用するＰａｐＭＶ ＣＰは、ＰａｐＭＶ外被タンパク質の遺伝子改変体（すなわち変異体）である。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端から複数のアミノ酸を欠失させるように、および／または、アミノ酸置換を１以上含むように遺伝子改変されている。また、いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端またはＣ末端から約１〜約１０個のアミノ酸を欠失させるように遺伝子改変されている。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、野生型タンパク質のＮ末端の近位（すなわち、配列番号１の１位と６位）で生じ、翻訳を開始させることができる２個のメチオニンコドンのうちの１個を除去するよう、遺伝子改変されている。前記翻訳開始コドンの１個を除去することで、均質なタンパク質集団の産生が可能となる。選択したメチオニンコドンの除去は、例えば、前記コドンを構成するヌクレオチドの１以上を、前記コドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするように置換するか、またはナンセンスコドンとなるように置換することによって行える。あるいは、前記コドンの全部または一部、または前記選択コドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域を欠失させることもできる。本発明のいくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質のＮ末端から１〜５個のアミノ酸を欠失させるよう遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＰａｐＭＶ外被タンパク質は、配列番号３（図２Ａ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、６個までのヒスチジン残基からなるヒスチジン標識を任意に含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列に特異的制限酵素部位を１以上組込みんだことにより生じる追加のアミノ酸（例えば、約１〜約８個のアミノ酸）をＣ末端に含むよう遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ外被タンパク質は、配列番号４（図２Ｂ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、前記ヒスチジン標識を含んでも含まなくてもよい。

１以上のアミノ酸置換を含む変異ＰａｐＭＶ ＣＰ配列を用いて組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質を調製する場合、これらの置換は、「保存的」置換であっても、「非保存的」置換であってもよい。保存的置換は、１個のアミノ酸残基の、類似の側鎖特性を有する他の残基による置き換えを含む。当該技術分野で公知のように、２０個の天然由来のアミノ酸は、それらの側鎖の物理化学的特性に応じて分類できる。好適な分類は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファン（疎水性側鎖）；グリジン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミン（極性・無電荷側鎖）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖）；およびリジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖）を含む。アミノ酸のもう１つの分類は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、あるアミノ酸の、同一群に属する他のアミノ酸による置換を含む。非保存的置換は、あるアミノ酸残基の、異なる側鎖特性を有する他の残基による置き換え、例えば、中性または塩基性残基による酸性残基の置き換え、酸性または塩基性残基による中性残基の置き換え、親水性残基による疎水性残基の置き換え等を含む。

本発明のある実施形態では、変異体配列は、１以上の非保存的置換を含む。１個のアミノ酸を、異なる特性を有する他のアミノ酸で置き換えることにより、外被タンパク質の特性が改善され得る。例えば、先に記載したように、外被タンパク質の残基１２８の変異により、当該タンパク質のＶＬＰへの集合が向上される（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．２００６、ＦＥＢＳＪ．、２７３：１４−２５）。よって、本発明のいくつかの実施形態では、外被タンパク質は、当該外被タンパク質の残基１２８に変異を含み、この位置のグルタミン酸残基が中性残基で置換されている。いくつかの実施形態では、１２８位のグルタミン酸残基がアラニン残基で置換されている。

野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質のＦ１３位のフェニルアラニン残基を他の疎水性残基で置換すると、野生型タンパク質配列を使用した場合と比べて、当該組換えタンパク質を発現させた場合のほうが、形成されるＶＬＰの割合が高くなることがわかっている。（Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ−Ｇａｇｎｅ，ｅｔ ａｌ，２００８，ＦＥＢＳＪ．，２７５：１４７４−１４８４）。本発明との関係においては、以下に挙げるアミノ酸残基が、Ｆ１３位の置換に好適な疎水性残基と考えられる：Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、およびＴｙｒ。本発明のいくつかの実施形態では、外被タンパク質は、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒによる１３位のＰｈｅの置換を含む。いくつかの実施形態では、外被タンパク質は、ＬｅｕまたはＴｙｒによる１３位のＰｈｅの置換を含む。

ある実施形態では、前記ＣＰのＦ１３位の変異を、Ｅ１２８位の変異、Ｎ末端の欠失、またはこれらの組み合わせと併用している。

同様に、組換えＰａｐＭＶ ＣＰの調製に使用するＰａｐＭＶ外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照親配列に厳密に対応する必要はなく、遺伝暗号の縮重により、および／または、上述の変異アミノ酸配列をコードするように、異なっていてもよい。それゆえ、本発明のある実施形態では、変異外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。いくつかの実施形態では、変異外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７５％同一である。他の実施形態では、変異外被タンパク質をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％同一である。ある実施形態では、参照核酸配列は、配列番号２（図１Ｂ）である。

＜ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ ＶＬＰの調製＞
（ＰａｙＭＶ）
ＰａｐＭＶは、当該技術分野で公知であり、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）よりＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＶ−２０４（商標）として入手可能である。前記ウイルスは、標準プロトコールにしたがって（例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．＆Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｊ．Ｂ．，１９７８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９０：３６−４６参照）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）およびキンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）のような宿主植物で維持し、前記宿主植物から精製することができる。

（ＰａｐＭＶ ＶＬＰ）
ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、当該技術分野で公知の標準的な技術（例えば、Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２００６、同上、および国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９号明細書、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００１５４号明細書、および国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６号明細書参照）、ならびに、本明細書に記載のインビトロ集合技術により、調製可能である。

ＰａｐＭＶ ＶＬＰを調製するための組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質は、野生型タンパク質の配列が提供されれば、当業者により、標準的な遺伝子工学技術で容易に調製可能である。タンパク質を遺伝子操作する方法は、野生型ＰａｐＭＶ外被タンパク質の配列（例えば、配列番号１および２参照）同様、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４＆ｕｐｄａｔｅｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ参照）。

例えば、野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離とクローニングは、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、同上参照）を用いて達成できる。例えば、標準的な技術によりＲＮＡを抽出し、次に、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成することにより（例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより）、ＰａｐＭＶから核酸配列を直接得ることができる。ＰａｐＭＶは、モザイク症状を示す感染植物葉から標準的な技術により精製することができる。

次に、前記外被タンパク質をコードする核酸配列を、直接、または１以上のサブクローニング工程後に、好適な発現ベクターへと挿入する。使用するベクターそのものが本発明にとって決定的に重要ではないことを、当業者であれば理解するであろう。好適なベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、またはＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。外被タンパク質は、次いで、上述および後述のように、発現および精製することができる。

あるいは、前記外被タンパク質をコードする核酸配列を、当該技術分野において周知の標準的なインビトロ部位特異的変異誘発技術によって、上述のような１以上の変異を導入するようにさらに操作することができる。変異は、前記コード配列を構成する適切なヌクレオチドの１以上に欠失、挿入、置換、逆位、またはこれらの組合せを生じさせることで導入できる。これは、例えば、１以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入、または欠失を組み込むように設計したプライマーを用いたＰＣＲに基づく技術によって行える。変異の存在の確認は、例えば、制限分析またはＤＮＡ塩基配列決定等、多数の標準的な技術により可能である。

前記外被タンパク質をコードするＤＮＡを、コードされるタンパク質の活性に影響を及ぼさない範囲で、種々の方法で改変してもよいことを、当業者であれば理解するであろう。例えば、前記タンパク質の発現に使用する宿主細胞におけるコドン選択の最適化のためにＤＮＡ配列の改変を用いてもよいし、あるいは、発現を促進する他の配列変化を含むように改変してもよい。

発現ベクターは、外被タンパク質または融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写に必要な、転写エレメント等の調節エレメントをさらに含んでもよいことを、当業者であれば理解するであろう。ベクターに組み込むことができる調節エレメントの例として、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。それゆえ、本発明のある実施形態では、遺伝子操作された外被タンパク質をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節エレメントを含むベクターが提供される。好適な調節エレメントの選択は、前記遺伝子操作された外被タンパク質の発現用に選択される宿主細胞に依存すること、ならびに、そのような調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物、または昆虫遺伝子を含む様々なソースに由来してもよいことを、当業者であれば理解するであろう。

本発明との関係においては、前記発現ベクターは、発現されたタンパク質の精製を容易にする異種核酸配列をさらに含有してもよい。このような異種核酸配列の例として、金属親和性標識、ヒスチジン標識、アビジン／ストレプトアビジンをコードする配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列、およびビオチンをコードする配列等の親和性標識が挙げられるが、これらに限定されない。異種核酸配列によってコードされたアミノ酸は、当該技術分野で公知の方法により、発現された外被タンパク質から使用前に除去することができる。あるいは、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸がその後のＶＬＰへの集合に干渉しない場合には、これらを外被タンパク質上に保持しておくこともできる。

本発明の一実施形態では、外被タンパク質は、ヒスチジン標識されたタンパク質として発現される。ヒスチジン標識は、外被タンパク質のカルボキシル末端またはアミノ末端に配置することができる。

発現ベクターは、当該技術分野で公知の様々な方法の１つによって、好適な宿主細胞または組織に導入することができる。このような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（同上）に概説されており、例えば、安定導入または一過性導入、リポフェクション、電気穿孔、および組換えウイルスベクターによる感染が挙げられる。外被タンパク質の発現に好適な宿主細胞の選択は、選択したベクターに依存することを、当業者であれば理解するであろう。宿主細胞の例としては、細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用する宿主細胞そのものは、本発明にとって決定的に重要ではない。外被タンパク質は、原核生物の宿主（例えば、大腸菌、エロモナス・サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））または真核生物の宿主（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）；哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、またはＨｅＬａ細胞；昆虫細胞または植物細胞）内で産生できる。

所望の場合、外被タンパク質は、当該技術分野で公知の標準的な技術（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照）により宿主細胞から精製することができ、インタクトなタンパク質またはそのタンパク質分解フラグメントのいずれかを用いた標準的なペプチド配列決定技術によって配列決定ができ、それにより、当該タンパク質の同一性を確認する。

本発明の組換え外被タンパク質は、自己集合してＶＬＰを形成することができる。ＶＬＰへの集合は、例えば、外被タンパク質を発現する宿主細胞内で行うこともできるし（例えば、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７３：１４−２５参照）、あるいは、以下により詳しく述べるように、インビトロで行ってもよい（２０１２年５月１日出願の国際出願第＿号明細書、“Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｓａｍｅ”も参照。その開示全体を、本明細書に援用する）。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ｓｓＲＮＡを含む。例えば、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質を大腸菌内で発現させ、前記外被タンパク質を細菌内で自己集合させて調製されるＶＬＰは、バクテリアｓｓＲＮＡを含んでもよい。あるいは、インビトロでの集合で形成されるＶＬＰについては、外被タンパク質調製物に対し、自己集合前にｓｓＲＮＡを添加してもよい。前記ｓｓＲＮＡは、例えば、合成ｓｓＲＮＡ、天然由来のｓｓＲＮＡ、天然由来の修飾ｓｓＲＮＡ、天然由来または合成ｓｓＲＮＡのフラグメント等であってもよい。

インビトロ集合の場合のｓｓＲＮＡは、通常、少なくとも約１００ヌクレオチドかつ約５０００ヌクレオチドまでの長さであり、例えば、少なくとも約２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ヌクレオチドかつ約５０００、４５００、４０００、または３５００ヌクレオチドまでの長さである。ある実施形態では、インビトロ集合の場合のｓｓＲＮＡは、約５００から約３０００ヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、インビトロ集合の場合のｓｓＲＮＡは、配列のインビボ転写の機会を最小限に抑えるため、ＡＴＧ開始コドンを含まないように設計されている。しかしながら、前記ｓｓＲＮＡがキャッピングされていないため、インビボ転写が起こる可能性は低く、よって、ＡＴＧ開始コドンの含有を除外するものではない。ある実施形態では、インビトロ集合の場合のｓｓＲＮＡは、未変性ＰａｐＭＶ ＲＮＡの５’末端から約１００ヌクレオチドを含むが、これは、推定パッケージングシグナルに対応する。推定パッケージングシグナルを含まないｓｓＲＮＡもまた、問題なく集合できる。この観点から使用できるＰａｐＭＶゲノムに基づくｓｓＲＮＡの非限定的な例を、図２８および２９に示す［配列番号５および６］。

ＶＬＰは、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ ａｌ．（２００６，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７３：１４−２５）および実施例に記載のような標準的な技術により、宿主細胞から単離することができる。また、夾雑宿主細胞タンパク質、またはＬＰＳ等、その他の化合物の除去が所望される場合には、ＶＬＰを、クロマトグラフィー等の標準的な技術により、さらに精製することができる。

必要な場合、ＶＬＰを、例えば、超遠心分離またはゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ−２００を使用）により他の外被タンパク質成分から分離し、実質的に純粋なＶＬＰ製剤を提供することができる。この文脈において、「実質的に純粋」とは、前記製剤が、７０％以上のＶＬＰ、例えば、８０％または９０％以上のＶＬＰを含有することを意味する。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ ＶＬＰはｓｓＲＮＡを含み、ｓｓＲＮＡ鋳型を用いたインビトロでの集合により調製される。ｓｓＲＮＡ鋳型を図２８および２９［配列番号５および６］に例示しているが、前述のように、種々の他のｓｓＲＮＡもまたこの目的に好適であることを、当業者であれば理解するであろう。インビトロでの集合の方法の一例を、図２８に示すと共に、実施例１８に記載している。種々の変更をこの方法に加えてもよく、変更を加えてもＶＬＰが得られることは認識されるであろう。例えば、組換え外被タンパク質およびｓｓＲＮＡ鋳型の発現を、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の他の宿主細胞内で行うことができ、また、集合反応は、２℃〜３７℃の温度範囲で、種々のタンパク質対ｓｓＲＮＡ比率で行ってもよい。一般的に、重量比率で約１：１〜約５０：１のタンパク質対ｓｓＲＮＡ比率が使用でき、例えば、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約４０：１、または約１０：１〜約４０：１の重量比率としてもよい。

（組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質の特徴）
組換え外被タンパク質のＶＬＰへの自己集合能は、標準的な技術、例えば、精製した前記タンパク質を電子顕微鏡によって視覚化することにより（例えば、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ ａｌ，２００６，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７３：１４−２５参照）、分析が可能である。また、超遠心分離を用いてＶＬＰをペレットとして単離し、より小さい凝集体（２０ｍｅｒ以下）を上清に残しておき、円偏光二色性（ＣＤ）分光測光法により、前記組換えまたは改変タンパク質の二次構造を、野生型ウイルスと比較してもよい（例えば、Ｔｒｅｍｂｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，同上参照）。

ＶＬＰおよびＰａｐＭＶの安定性は、所望の場合、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプロテイナーゼＫ分解分析等、当該技術分野で公知の技術によって測定できる。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、高温で安定であり、室温で容易に保存できる。

＜有効性の評価＞
自然免疫応答刺激および防御または治療効果の生成におけるＰａｐＭＶ組成物の有効性は、当該技術分野で公知の標準的な技術によって評価することができる。例えば、防御効果に関しては、チャレンジ感染による検証を行うことができる。このような検証は、実験動物群（マウス等）への、標準的な技術によるＰａｐＭＶ組成物の接種を含む。非接種動物および／または公知の自然免疫応答刺激因子を接種した動物を含むコントロール群、あるいはその他のポジティブコントロールを、並行して設定する。ワクチン接種から適切な期間をおいた後、前記動物を、試験対象の病原体でチャレンジする。前記動物を、例えば体温、体重等を含む、感染に関連する他の状態の発生に関して観測する。例えば、抗原が、死亡リスクを伴うインフルエンザの特定の株または他の病原体から選択された抗原である場合のような特定の例では、生存率もまた、好適なマーカーである。感染の程度についても、所望される場合には、前記動物を屠殺した後、標準的な技術を使用してウイルス力価を測定することで評価できる。

治療効果の検証に関しても、標準的な感染動物モデルを使用し、感染後の適切な時点で前記動物をＰａｐＭＶ組成物で処理する同様の方法を採用できる。

さらに、前記動物から、例えば、接種前、接種後、および／またはチャレンジ後等の種々の時間間隔で採取した血液試料について、所望の場合、当該技術分野で公知の標準的な試験により、サイトカインおよび／またはケモカイン誘導を分析することができる。

その他の標準的な技術を用いて前記組成物の評価を行ってもよく、例えば、従来の予防薬もしくは治療薬またはワクチンと併用した場合の有効性の評価を、当該技術分野で公知の種々の感染および疾患の動物モデルにおいて行ってもよい。

＜医薬組成物および投与＞
本発明は、ＰａｐＭＶ部分、ならびに１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。所望される場合、例えば、追加の免疫刺激化合物、標準的な治療薬、ワクチン等の他の有効成分を、前記組成物に含有させてもよい。

前記医薬組成物は、様々な経路による投与用に製剤可能である。例えば、前記組成物は、経口、局所、直腸、鼻腔内、もしくは非経口投与用、または、吸入もしくは噴霧による投与用に製剤できる。本明細書中で使用される非経口という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内、胸骨内注射または注入技術を含む。対象への鼻腔内投与は、前記組成物を対象の鼻道または鼻腔の粘膜に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、粘膜投与用に製剤される。粘膜投与は、例えば、経口、鼻腔内、エアロゾル、直腸、または膣内投与を含む。前記粘膜投与用製剤としては、粘膜の部位に応じ、経皮デバイス、エアロゾル、クリーム、ローション、またはパウダーが挙げられる。ある実施形態では、前記医薬組成物は、鼻腔内または肺内投与用に製剤される。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、直腸または膣内投与用に製剤される。

前記医薬組成物は、ＰａｐＭＶ部分を有効量含有する。所与の適応症に対する有効量は、まずは、例えば、通常げっ歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類である動物モデルにおいて推定できる。動物モデルは、適切な濃度範囲および投与経路を決定する目的にも使用できる。そして、このような情報を使用し、ヒトを含む治療対象の動物において有用な用量および投与経路を決定できる。本発明のある実施形態では、単位用量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇのタンパク質、例えば、約１０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質または約４０μｇ〜約２ｍｇのタンパク質を含む。１回以上の投与で対象を免疫してもよく、これらの投与は同日に行ってもよいし、あるいは数日または数週にわたって行ってもよい。

水性懸濁液として製剤される組成物は、ＰａｐＭＶ部分を、１以上の好適な賦形剤との混合物として含有してもよい。前記賦形剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような懸濁化剤；天然由来のホスファチド、例えば、レシチン、または脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、または長鎖脂肪アルコールとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸とヘキシトールとから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン等の分散剤または湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液はまた、１以上の保存料、例えば、エチルもしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１以上の着色剤、１以上の香味料、またはスクロースもしくはサッカリン等の１以上の甘味料を含有してもよい。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ部分を、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油等の植物油、または流動パラフィンのような鉱物油に懸濁することにより、前記医薬組成物を油性懸濁液として製剤してもよい。前記油性懸濁液は、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコールのような増粘剤を含有してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存可能である。

ある実施形態では、前記医薬組成物を分散性粉末または顆粒として製剤してもよい。前記分散性粉末または顆粒は、その後、水の添加によって水性懸濁液を調製するために使用できる。このような分散性粉末または顆粒は、ＰａｐＭＶ部分を、１以上の分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および／または保存料との混合物として提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤の例としては、上述のものが挙げられる。例えば着色剤のような追加の賦形剤を、これらの組成物に含有させることもできる。

本発明の医薬組成物は、いくつかの実施形態では、水中油型エマルションとして製剤してもよい。油相は、例えば、オリーブ油もしくは落花生油のような植物油、または、例えば、流動パラフィンのような鉱物油とすることができる。あるいは、これらの油の混合物を油相としてもよい。これらの組成物に含有させる好適な乳化剤としては、天然由来のゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム；天然由来のホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン；または脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルもしくは部分エステル、無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびエチレンオキシドと前記部分エステルとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが挙げられる。

ある実施形態では、前記医薬組成物は、前述のような好適な１以上の分散剤もしくは湿潤剤および／または懸濁化剤を使用して、当該技術分野で公知の方法により、滅菌注射用水性または油性懸濁液として製剤してもよい。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液とすることができ、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液とすることができる。使用可能なビヒクルおよび溶媒として、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、および等張食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。その他の例として、溶媒または懸濁媒として従来使用されている滅菌された不揮発性油、および、例えば、合成のモノまたはジグリセリドを含む種々の無刺激性不揮発性油が挙げられる。オレイン酸等の脂肪酸もまた、注射剤の製造に使用可能である。

前記医薬組成物は、抗菌薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等の保存料、および／または炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、またはデキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）もしくはタンパク質含有物質（例えば、ウシ血清または脱脂乳）等の安定剤を、好適な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）と共に任意に含有してもよい。前記組成物の各種成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータにしたがって調整すればよい。

滅菌組成物は、例えば、必要量のＰａｐＭＶ部分を、先に列挙した種々のその他の成分と共に適切な溶媒に混合し、次いで、必要に応じて、ろ過滅菌を行うことにより調製できる。一般的に、分散液は、ベースとなる分散媒および先に列挙したような他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、種々の滅菌済みの有効成分を加えることにより調製される。滅菌組成物の調製に滅菌粉末を使用する場合、いくつかの例示的な製剤方法として、真空乾燥技術および凍結乾燥技術が挙げられる。これらの技術によれば、予め滅菌ろ過した前記活性成分および追加の所望の成分の溶液より、これら成分の粉末が得られる。

本発明のある実施形態では、治療用製品の肺内または鼻腔内送達のために設計された種々の機械的デバイスの使用が企図されている。このようなデバイスとしては、ネブライザー、定量吸入器、粉末吸入器、および経鼻スプレーデバイスが挙げられるが、これらには限定されず、またこれらは全て当業者にはよく知られている。

定量吸入器は、通常、噴射ガスを使用しており、吸気の際に作動させる必要がある。乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼吸作動を採用している。ネブライザーが溶液からエアロゾルを生じさせるのに対し、定量吸入器、乾燥粉末吸入器等は、小粒子のエアロゾルを生成する。

本発明の実施に好適な市販のデバイスのいくつかの具体例としては、ＵＬＴＲＡＶＥＮＴ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、ＡＣＯＲＮ ＩＩ（登録商標）ネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．）、ＭＩＳＴＹ−ＮＥＢ（登録商標）ネブライザー（Ａｌｌｅｇｉａｎｃｅ，ＭｃＧｒａｗ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）、ＡＥＲＯＥＣＬＩＰＳＥ（登録商標）ネブライザー（Ｔｒｕｄｅｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｎａｄａ）、Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）経鼻スプレーデバイス（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＡＤ３００）（Ｗｏｌｆｅ Ｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ）、ＯｐｔｉＮｏｓｅデバイス（ＯｐｔｉＮｏｓｅ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｎｅｋｔａｒ ＤＰＩシステム（Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＡＥＲｘ肺内薬物送達システム（Ａｒａｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｐｉｒｏｓ（登録商標）デバイス（Ｄｕｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＲｅｓｐｉｍａｔ（登録商標）デバイス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）が挙げられる。

このようなデバイスは全て、ＰａｐＭＶ部分の供給に好適な製剤の使用を必要とする。また、当業者であれば理解可能と思われるが、通常、各製剤は、採用するデバイスのタイプに固有のものであり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、および／または担体に加えて、適切な噴霧材料の使用を伴ってもよい。さらに、リポソーム、マイクロカプセルもしくはマイクロスフェア、包接錯体、またはその他の種類の担体の使用も企図されている。

よって、いくつかの実施形態では、本発明は、鼻腔内または肺内経路を介した送達用に製剤された医薬組成物であり、例えば、凍結乾燥粉末の形態、エアロゾル化された液体の形態、またはゲル形態にある医薬組成物を規定する。これらの投与経路によれば、万一、大量分布の必要が生じたとしても、簡単に投与を行うことができる。

ジェット式または超音波式のネブライザーでの使用に好適な製剤は、通常、ＰａｐＭＶ部分を水系媒体中に好適な濃度、例えば、溶液１ｍＬ当たり約０．０１ｍｇ〜２５ｍｇまたは約０．１ｍｇ〜１０ｍｇのタンパク質という濃度で含む。前記製剤は、緩衝液および単糖（例えば、タンパク質の安定化および浸透圧の調節用）、および／または約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のヒト血清アルブミンをさらに含んでもよい。使用できる緩衝剤の例として、酢酸ナトリウム、クエン酸塩、およびグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。通常、前記緩衝液は、前記溶液のｐＨを３〜９の範囲に調整するのに好適な組成およびモル濃度を有する。一般的に、１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度の緩衝液が、この目的に好適である。前記製剤中に通常約１重量％〜約９０重量％の範囲の量（例えば、約１％〜約５０重量％、または約５％〜約３０重量％）で存在する賦形剤の例として、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖類；マンニトール、キシリトール、キシロース、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ソルビトース、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等のアルジトール；およびグリジン、ＣａＣｌ_２、ヒドロキシエクトイン、エクトイン、ゼラチン、ジ−ミオ−イノシトールリン酸（ＤＩＰ）、環状２，３ジホスホグリセレート（ｃＤＰＧ）、１，１−ジ−グリセロールリン酸（ＤＧＰ）、β−マンノシルグリセレート（フィロイン（ｆｉｒｏｉｎ））、β−マンノシルグリセルアミド（フィロインＡ）、プロリンベタイン、および／またはこれらの誘導体、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

ネブライザー製剤は、エアロゾルを形成する際の溶液の噴霧化によって引き起こされる組成成分の表面誘発凝集を低減または防止するため、界面活性剤をさらに含有してもよい。種々の従来の界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等が採用できる。界面活性剤の量は、一般的に、製剤の約０．００１重量％〜約４重量％の範囲である。この目的で使用される界面活性剤の非限定的な例として、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。

ある実施形態では、前記医薬組成物を、例えば、定量吸入装置を使用して、粉末形態で送達することができる。この粉末は、凍結乾燥により製造してもよく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の安定剤をさらに含有してもよい。さらに、必要であれば、１以上の特徴を強化するため（例えば、装置からの粉末の散布を容易にするため、前記組成物の貯蔵寿命を延長するため、または、凍結乾燥の際の前記組成物の安定性を改善するため）、前記組成物に下記の１以上を賦形剤として添加してもよい：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖類；マンニトール、キシリトール、キシロース、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ソルビトース、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等のアルジトール；およびグリシン、ＣａＣｌ_２、ヒドロキシエクトイン、エクトイン、ゼラチン、ジ−ミオ−イノシトールリン酸（ＤＩＰ）、環状２，３ジホスホグリセレート（ｃＤＰＧ）、１，１−ジ−グリセロールリン酸（ＤＧＰ）、β−マンノシルグリセレート（フィロイン）、β−マンノシルグリセルアミド（フィロインＡ）、プロリン、ベタイン、および／またはこれらの誘導体、ならびにこれらの組み合わせ。前記組成物への添加量は、存在するタンパク質の約０．０１％〜２００％（ｗ／ｗ）の範囲内とすることができ、例えば、約１％〜５０％（ｗ／ｗ）、または約５％〜３０％（ｗ／ｗ）とすることができる。次いで、このような製剤を凍結乾燥し、所望の粒子サイズに粉砕する。通常、前記粉末の粒子は、５０μｍ未満、例えば、１．５μｍ〜１０μｍの中央径を有する。平均粒径は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｉｍｐａｃｔｏｒ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｇａ．）等の従来の機器を使用して計測することができる。

前記粉末は、界面活性剤を用いることにより、噴霧剤中に懸濁されてもよい。噴霧剤は、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせを含む）等、この目的に用いられる種々の従来の材料の１つであってよい。好適な界面活性剤としては、ソルビタントリオレアートおよび大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、界面活性剤として有用である。

本発明のある実施形態では、前記医薬組成物は鼻腔内に投与され、よって、前記組成物は、鼻粘膜表面とのより持続的な接触を提供する経鼻ゲル、クリーム、ペースト、または軟膏として製剤される。これらの製剤は、通常、約１０〜約２５０，０００センチポイズ（ｃｐｓ）、例えば、約２５００〜約１００，０００ｃｐｓまたは約５，０００〜５０，０００ｃｐｓの粘度を有する。このような製剤は、例えば、アルキルセルロースおよび／または当該技術分野で周知の他の高粘度生体適合性担体をベースとしてもよい。アルキルセルロースの非限定的な例として、メチルセルロースが挙げられる。メチルセルロースは、好適な濃度、例えば、担体１００ｍｌ当たり約５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または担体１００ｍｌ当たり約２５ｍｇ〜約ｍｇの濃度で含有させることができる。ある実施形態では、ＰａｐＭＶ部分を含有する担体を、鼻粘膜表面に貼り付けが可能な好適な基材、例えば、ガーゼ等の布材に吸収させ、前記ＰａｐＭＶ部分を前記粘膜へ浸透させるようにしてもよい。

ある実施形態では、ゲル製剤は、透過促進剤（浸透促進剤）をさらに含んでもよい。透過促進剤としては、ジメチルスルホキシドおよびデシルメチルスルホキシド等のスルホキシド；ラウリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ポロキサマー（２３１、１８２、１８４）、Ｔｗｅｅｎ（２０、４０、６０、８０）、およびレシチン等の界面活性剤；１−置換アザシクロヘプタン−２−オン、特に、１−ｎ−ドデシルシクラザシクロヘプタン−２−オン；ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール等の脂肪アルコール；ラウリン酸、オレイン酸、および吉草酸等の脂肪酸；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、メチルプロピオネート、およびオレイン酸エチル等の脂肪酸エステル；ポリオールおよびそのエステル（プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、ブタンジオール、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールモノラウレート等）、アミドおよび他の窒素化合物（尿素、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−ピロリドン、１−メチル−２−ピロリドン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン等）、テルペン；アルカノン、および有機酸、特に、サリチル酸およびサリチル酸塩、クエン酸およびコハク酸が挙げられるが、これらに限定されない。透過促進剤は、約０．１〜約３０％（ｗ／ｗ）の範囲で存在すればよい。ゲル組成物は、緩衝剤、例えば、炭酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、塩酸、乳酸、酒石酸、無機および有機塩基をさらに含有してもよい。緩衝剤は、当業者に公知のように、使用する緩衝剤（１以上）の種類に応じて、約１〜約１０重量パーセント、例えば、約２〜約５重量パーセントの濃度で存在してもよい。しかしながら、緩衝剤の濃度は変更可能であり、いくつかの実施形態では、緩衝剤は、組成物中で、最大１００％の量の水に置き換えられてもよい。

本発明のある実施形態では、前記医薬組成物を経直腸または膣内投与用に製剤する。前記医薬組成物は坐薬として提供してもよく、前記坐薬は、有効成分（１以上）を１以上の好適な非刺激性の賦形剤または担体と混合することによって調製してもよい。賦形剤または担体の非限定的な例としては、カカオ脂、ポリエチレングリコール、坐薬用ワックス、またはサリチル酸塩が挙げられる。これらは室温では固体であるが、体温では液体であり、よって、直腸または膣腔内で溶融して前記有効成分を放出する。膣内投与に好適な本発明の製剤として、当該技術分野で適切なものとして知られている担体を含有する腟坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレー式製剤が挙げられる。

ＰａｐＭＶ部分を、市販のワクチン、例えば、鼻腔内または肺内投与用に製剤された組成物と共に含む医薬組成物もまた、本発明に包含される。

他の医薬組成物および医薬組成物の調製方法が当該技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前の「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。

＜方法および用途＞
本発明は、対象における自然免疫応答を刺激するためのＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。前記対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。前記組成物は、例えば、慢性感染を含む感染の治療または予防に有用である。

ある実施形態は、病原体による感染の可能性から対象を防御するための、前記対象に対するＰａｐＭＶ組成物の投与を提供する。本発明のある実施形態によれば、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜および／または呼吸器系において防御効果を誘導するために投与される。鼻腔内または肺内経路を介した投与は、例えば、呼吸器系の病原体に対する防御を提供するために使用できる。膣内経路を介した投与は、例えば、膣病原体に対する防御を提供するために使用できる。鼻腔内投与もまた、膣病原体に対する防御を提供する上で効果的である（例えば、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ＆Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１１（４）：Ｓ４５−Ｓ５３参照）。他の投与経路もまた、企図されている。

ＰａｐＭＶ組成物の投与によって刺激される自然免疫応答は非特異的であり、それゆえ、広範囲にわたる病原体に対して防御または治療効果を提供するものと期待される。これらの効果は迅速であり、よって、従来のワクチンよりもさらに即効性の防御が求められる状況下で有用性を見い出せると考えられる。さらに、前記効果が非特異的であることから、病原体を同定し、適切なワクチンや他の治療法を特定しようとする間に、ＰａｐＭＶ組成物の投与により即効性の防御を提供することが可能と思われる。

本発明のある実施形態は、病原体による感染から防御するための予防的または先制措置としての、ＰａｐＭＶ組成物の対象への投与を提供する。このようなアプローチは、例えば、免疫無防備状態の患者（ＡＩＤＳ患者、化学療法中の患者、または免疫抑制剤を服用している患者等）；世界的流行または流行時に、適切なワクチンの開発／普及に先立ち、集団に対して初期防御を提供するため；感染の可能性のある地域に赴く救助隊、医師、および看護師等の作業従事者を守るため；およびバイオテロ攻撃の脅威または発生がある状況下において有用である。

本明細書中で実証しているように、ＰａｐＭＶ組成物の投与は、投与後約６時間以内にサイトカインおよびケモカインの産生を増加させ、さらに、チャレンジに対する防御は数日間持続した。したがって、ある実施形態では、本発明は、疑わしい病原体への接触が予測される約４時間〜約１週間前、例えば、少なくとも４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間前〜約７日、６日、５日、または４日前に行われる対象への予防的なＰａｐＭＶ組成物の投与を企図している。ある実施形態では、これらの上限および下限のそれぞれによって規定される様々な範囲が企図されている。例えば、約４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間〜約７日前の範囲；約４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間〜約６日前の範囲；４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間〜約５日前の範囲；約４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間〜約４日前の範囲が挙げられる。

ある実施形態では、防御期間を延長するため、ＰａｐＭＶ組成物の複数回の投与を提供している。前記複数回の投与は、特定の時間間隔をあけて行われ、例えば、各回の投与を約１２時間から約１０日間の間隔をあけて行うことができる。ある実施形態は、初回の投与に続き、少なくとも１回から約１０回までの後続の投与を、少なくとも約１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間〜約１０日間、９日間、８日間、または７日間の間隔、例えば、約２４時間から約７日間の間隔をあけて行う投与を提供する。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、細菌性病原体による感染の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい。細菌性病原体としては、例えば、バチルス属、エルシニア属、フランシセラ属（Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、シュードモナス属、マイコバクテリウム属、およびバークホルデリア属に属する各種細菌が挙げられる。ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、細菌性病原体による呼吸器感染症の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい。関連する病原細菌種の非限定的な例としては、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コクシエラ菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クロストリジウム菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｓｐｐ．）、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、細菌性肺炎に関与する細菌、例えば、以下の細菌１以上による感染の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい：肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎杆菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、コクシエラ菌（Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、レジオネラ菌（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）。本発明のある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、膣内または腸内細菌性病原体、例えば、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、サルモネラ属細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）による感染に対する防御を提供するために投与してもよい。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、ウイルス病原体による感染の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい。ウイルス病原体としては、例えば、以下の科のウイルスが挙げられる：アデノウイルス科；アレナウイルス科（例えば、イッピーウイルス（Ｉｐｐｙ ｖｉｒｕｓ）およびラッサ熱ウイルス）；ビルナウイルス科；ブニヤウイルス科；カリシウイルス科；コロナウイルス科；フィロウイルス科；フラビウイルス科（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えば、ヒト単純ヘルペスウイルス１）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣ）；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および呼吸器合胞体ウイルス）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスおよびＡ型肝炎ウイルス）；ポックスウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ウシ免疫不全ウイルス、およびネコ免疫不全ウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルス）、ならびにトガウイルス科（例えば、風疹ウイルス）。関連する病原ウイルスの非限定的な例としては、インフルエンザウイルスの各種株、サイトメガロウイルス、呼吸器合胞体ウイルスの各種株（ヒト呼吸器合胞体ウイルスおよび特定の動物株を含む）、パラインフルエンザウイルスの各種株（ヒトパラインフルエンザウイルスおよび特定の動物株を含む）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルスを含む）、ライノウイルス（ヒトライノウイルスを含む）、エンテロウイルス（ヒトエンテロウイルスを含む）、アデノウイルス（ヒトアデノウイルスを含む）、ボカウイルス（ヒトボカウイルスを含む）、メタニューモウイルス（ヒトメタニューモウイルスを含む）、デングウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウエストナイルウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、およびポリオーマウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、インフルエンザウイルス、フラビウイルス（デング熱ウイルスまたは黄熱病ウイルス等）、パラインフルエンザウイルス、ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス等）、ライノウイルス、またはアデノウイルスによる感染の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、真菌性病原体による感染の可能性に対する防御を提供するために投与してもよい。真菌性病原体としては、例えば、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、およびニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）が挙げられる。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、生物兵器／バイオテロ物質に対する防御を提供するために投与してもよい。バイオテロ物質の例としては、以下が挙げられる：炭疽病（バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、ボツリヌス症（ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素）、ペスト（ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、天然痘（大痘瘡）、野兎病（野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））およびウイルス性出血熱（エボラおよびマールブルグ等のフィロウイルス、ならびにラッサおよびマチュポ等のアレナウイルス）等のカテゴリＡのバイオテロ物質；ブルセラ症（ブルセラ種）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のイプシロン毒素、鼻疽（鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ））、類鼻疽（類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、オウム病（オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、Ｑ熱（コクシエラ菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ））、リシナス・コミュニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）由来のリシン毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ））およびウイルス性脳炎（ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、および西部ウマ脳炎等のアルファウイルス）等のカテゴリＢのバイオテロ物質；およびニパーウイルスおよびハンタウイルス等の新興感染症を含む、カテゴリＣのバイオテロ物質。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、例えば、競馬、犬の品評会、猫の品評会等、競争する環境にある動物に対し、感染から防御するための先制措置として投与してもよい。流行／世界的流行下での家畜へのＰａｐＭＶ組成物の投与もまた、ある実施形態で企図されている。一般的な動物病原体の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｌｉｃａ、最も一般的な「ケンネルコフ」の原因物質）、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス（１型または２型）、イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ）、イヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）、イヌレオウイルス（１型、２型、または３型）、イヌヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ［Ｃｈｌａｍｙｄｉａ］ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤ）ウイルス、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）ウイルス、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモリチカ菌（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ） ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、小反芻獣疫ウイルス（ＰＰＲＶ）、ナイロビ羊病ウイルス（ＮＳＤＶ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｎｏｍｉａｅ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルスの各種株、ウマ動脈炎ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウマインフルエンザウイルスの各種株、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）およびストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）（例えば、エクイ亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｅｑｕｉ）およびズーエピデミカス（ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ））。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を鼻腔内ワクチンと併用し、これらのワクチンの効果の増強や延長を図ってもよい。例えば、ある種のインフルエンザワクチンが、鼻腔内投与用に開発されている。肺炎球菌およびペスト菌に対するワクチン。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜免疫応答全般を刺激し、これにより、腸、泌尿生殖路、ならびに、肺を含む他の粘膜表面における疾患または感染に対する防御を向上させるために投与される。ＰａｐＭＶ組成物は、例えば、鼻腔内または肺内経路経由で、または膣内に投与できる。ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、１以上の抗原と組み合わせて投与され、粘膜免疫応答を刺激する。ここでは、ＰａｐＭＶ組成物は、効果的な粘膜免疫応答を起こすため、前記抗原の効果を増強する粘膜アジュバントとして作用する。それゆえ、本発明のある実施形態は、粘模を介して身体に到達する微生物による感染に対する防御を提供するための、単独または１以上の抗原と組み合わせたＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。このような微生物の例としては、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ロタウイルス、カリシウイルス、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、呼吸器合胞体ウイルス、ＨＩＶ、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、感染、例えば、上述のようなウイルス病原体、細菌性病原体、または真菌性病原体による感染を治療するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物は、粘膜表面、例えば、肺、腸、または泌尿生殖器系での感染を治療するために使用してもよい。

本発明のいくつかの実施形態では、対象における慢性、持続性、または反復性の感染によるウイルス量を低減し、これにより、前記感染の管理および／または排除を助けるための、ＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。慢性感染の例としては、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染が挙げられる。持続性および／または反復性の感染の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染、結核（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染による）、およびライム病（ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）感染による）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＰａｐＭＶ組成物と慢性感染に対する従来の療法とを用いた併用療法も、いくつかの実施形態で提供されている。例えば、ある実施形態では、ＰａｐＭＶ組成物を、ＨＣＶのためのＰＥＧインターフェロン、リバビリン、もしくはＰＥＧインターフェロン／リバビリン療法と併用してもよいし、または、ＨＩＶおよびＡＩＤＳのためのヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）、融合阻害剤、もしくは非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）と併用してもよい。いくつかの実施形態では、このような併用療法は、例えば、従来の療法の有効性の向上、所定のエンドポイントに到達するために従来の療法が要する用量の低減、治療継続期間の短縮、従来の療法に伴う副作用の軽減等の１以上をもたらし得る。

本発明のある実施形態では、対象における慢性、持続性、または反復性の感染による免疫疲弊を治療するための、単独または従来の療法と組み合わせたＰａｐＭＶ組成物の使用を提供する。

ある実施形態では、肺における自然免疫応答の抗腫瘍活性を刺激するため、肺内経路を介してＰａｐＭＶ組成物を肺ガン患者に投与することができる。

＜キット＞
本発明は、ＰａｐＭＶ組成物を含むキットをさらに提供する。ある実施形態では、前記キットは持ち運び可能であり、人が携帯することができる。前記キットはさらに、病原体検出器を任意に備えていてもよい。また、前記キットはさらに、ＰａｐＭＶ組成物のガス噴霧剤または機械的な噴霧機構を任意に備えていてもよい。

前記キットの個々の成分は、別個の容器内に包装すればよく、そして、このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関が規定する形態の表示が付随する場合がある。このような表示は、製造、使用、または販売に関する当該機関の認可を反映している。前記キットはまた、前記ＰａｐＭＶ組成物の使用方法または投与レジメンを概説した指示書または説明書を、任意に備えていてもよい。

前記キットの成分は、溶液、腟坐薬、または粉末化もしくは凍結乾燥した形態で包装してもよい。前記キットの成分を乾燥または凍結乾燥させた形態で提供する場合、前記キットは、前記乾燥または凍結乾燥させた成分の再構成に好適な溶媒をさらに含むことができる。容器の個数または種類にかかわらず、本発明のキットは、患者への組成物の投与を助ける器具をさらに含んでもよい。このような器具としては、吸入器、ネブライザー、経鼻スプレーデバイス、注射器、ピペット、腟坐薬ディスペンサー、または同様の医学的に認可されている送達媒体が挙げられる。ある実施形態では、組成物を収容した容器そのものを、このような器具としてもよい。

本明細書に記載した発明のさらなる理解のため、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態について説明することを意図したものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと理解すべきである。

実施例１：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ＃１の投与による、マウスにおける抗ウイルス応答の誘導
配列番号４（図２Ｂ）に示す配列を有するＰａｐＭＶ外被タンパク質を使用し、これまでに記載の方法（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．、２００６、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７３：１４−２５）により、前記ＰａｐＭＶ外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて、ＰａｐＭＶ ＶＬＰを調製した。３０または７５μｇ（容積５０μＬ）のＰａｐＭＶ ＶＬＰを７日間隔で鼻腔内投与することによりＢａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を２回処理し、２回目の処理の３日後に、１００ｐｆｕ（プラーク形成単位）のインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３による鼻腔内チャレンジを行った。感染の発達を、１４日間追跡調査した。これらの１４日間、前記動物の体重を、１日１回測定した。２０％超の体重低下を示した動物を屠殺した。コントロール群は、ＰＢＳ（生理食塩緩衝液）で処理した。

結果を図３Ａ〜３Ｃに示す。ＰａｐＭＶ ＶＬＰで処理した両群は、感染の兆候を示さず、正常に体重が増加し続けた（図３ＡおよびＢ）。これに対し、ＰＢＳで処理した群は、感染の兆候を示し、チャレンジ後８日目の時点で、１２％超の体重低下を示した（図３ＡおよびＢ）。ＰａｐＭＶ ＶＬＰにより、前記動物のインフルエンザ感染と戦う能力が向上した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰで処理したマウスは全て、実験終了時まで生き残ったのに対し、コントロール群の３０％が、チャレンジから８日目以降は生存できなかった（図３Ｃ）。

実施例２：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによって誘導されるウイルスチャレンジに対する防御の持続
実施例１に記載のものと同様の実験を行った。ＰａｐＭＶ ＶＬＰを同じ方法で調製し、同じ処理スケジュールを採用したが、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの用量を変更した（６０μｇ）。インフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３（２００ｐｆｕ）によるチャレンジを、１０日目、１２日目、１４日目、および１７日目（すなわち、ＰａｐＭＶ処理の３日後、５日後、７日後、および１０日後）に行い、チャレンジ後１４日間、症状を観測した。

その結果を、図４Ａ〜４Ｃに示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、最後の処理から最大５日間持続する防御を提供できたことを示している。防御の裏付けは、コントロール群の動物と比べて体重低下が減っていること（図４Ａ）、症状が軽いこと（図４Ｂ）、ならびに、最後のＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理の３日後または５日後にチャレンジを行った動物は、１００％生存した（図４Ｃ）ことである。しかしながら、誘導された防御は７日目までに消失し、最後のＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理の７日後または１０日後にチャレンジを行ったマウスで観察された生存率は５０％未満であり、ＰＢＳで処理したコントロール群の生存率と同程度であった。

したがって、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理により誘導される防御は、約５日間持続するものと考えられ、この日数は、非特異的かつ非持続的な自然免疫応答の誘導に一致する期間である。

実施例３：合成ｓｓＲＮＡを含有するＰａｐＭＶ ＶＬＰの投与による、マウスにおける抗ウイルス応答の誘導
周知のトール様受容体３（ＴＬＲ−３）リガンドであるポリイノシン・ポリシチジン酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ；ｄｓＲＮＡ）は、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０、ＪＥ、ＫＣ、ｍＧＣＳＦ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、およびＴＮＦ等の炎症性サイトカインの分泌を誘導することにより、肺における自然免疫応答を誘導する誘導因子であることがわかっている（Ｓｔｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、２００９、Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．、１０：４３）。また、ＴＬＲ−７が、ｓｓＲＮＡおよびＲ８３７（グアノシン類似体）等のリガンドの結合により、自然免疫応答を活性化することも知られている。

自然免疫応答および抗ウイルス応答の発達を誘導するＰａｐＭＶ ＶＬＰの能力を高める目的で、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡのいずれかを含有するＰａｐＭＶ ＶＬＰを、実施例１７に記載の方法により調製した。ＰａｐＭＶ外被タンパク質を、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（ｄｓＲＮＡ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｓｓＲＮＡと共にインビトロで集合させ、各ＲＮＡを含むＶＬＰを製造した。ｓｓＲＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔ７ Ｒｉｂｏｍａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、インビトロで調製した。

集合により得られたＶＬＰを電子顕微鏡観察したところ、Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．に記載の方法（２００６、ＦＥＢＳ Ｊ．、２７３：１４−２５）により調製したＶＬＰと似ていることがわかった（図２５Ａに示すｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、図２５Ｂに示すｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ参照）。

前記２種類のＶＬＰについて、インフルエンザウイルスのチャレンジに対する防御誘導の有効性を評価した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ（「ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ」）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ（「ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ」）、または同量のＲＮＡ（すなわち、３μｇのｐｏｌｙ Ｉ：ＣまたはｓｓＲＮＡ）で処理した。コントロール群のマウスを、６０μｇのＰａｐＭＶ外被タンパク質（ＣＰ）モノマー（ＲＮＡを含まない）またはコントロールである緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）で処理した。マウスは、実施例２に記載の方法で処理し（すなわち、７日間隔で２回の鼻腔内投与）、最後の処理の３日後に、２００ｐｆｕのインフルエンザウイルス株ＷＳＮ／３３でチャレンジした。その後の１４日間、前記動物の体重、症状、および生存率を、１日１回測定した。２０％超の体重低下を示した動物を屠殺した。

結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡで処理したマウスは、前記処理群の中でも最良の実験成績を示した。具体的には、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡで処理したマウスにおいては、著しい体重低下は見られず（図５Ａ）、さらに、症状は、あったとしてもごくわずかであった（図５Ｂ）。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃまたはｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ単独で処理した群は、チャレンジに対して部分的な防御を示し、コントロール群と比べて、体重低下の減少（図５Ａ）、症状の軽減（図５Ｂ）が見られた。ＰａｐＭＶ ＣＰモノマーによる処理では防御は得られず、前記モノマーで処理したマウスで観察された体重低下（図５Ａ）および症状（図５Ｂ）は、ＰＢＳコントロールで処理したマウスで観察されたものと同程度であった。次に、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ分析を行った結果、これらのＶＬＰは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ程は安定ではないことが示唆され、これにより、性能面で劣る結果となったものと考えられる。

実施例４：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ＃１の投与による、マウスにおけるサイトカインの誘導
ＰａｐＭＶ ＶＬＰにより肺内で誘導されるメカニズムを解明するため、前述の実施例１〜３に記載のものと同じプロトコールにしたがい（すなわち、７日間隔で２回の鼻腔内投与）、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰ、１５μｇのＰａｍＣＳＫ４（ＴＬＲ−２リガンドであり、１型ＩＦＮの非誘導因子）（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）またはコントロールである緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣ１、ｐＨ８）でマウス（５匹／群）を処理した。２回目の処理の２４時間後に気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行い、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｅｍｉｘｅｄ ３２−ｐｌｅｘ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、サイトカインの存在をスクリーニングした。

２つの主要なサイトカイン、すなわち、インターロイキン９（ＩＬ−９）およびインターフェロン−γ−誘導タンパク質１０ｋＤａ（ＩＰ−１０）が、ＰａｐＭＶ ＶＬＰまたはＰａｍＣＳＫ４処理により誘導された（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｔ細胞の増殖を促進し、アポトーシスを抑制するＩＬ−９は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球によって分泌されるサイトカインである。ＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γの分泌の結果、出現し、刺激部位におけるＴリンパ球、樹状細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージの動員に重要な役割を果たす。ＰａｍＣＳＫ４（公知のＴＬＲ−２リガンドであり、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）分子）およびＰａｐＭＶ ＶＬＰによる両サイトカインの誘導は、前記ＶＬＰもまたＰＡＭＰである可能性を示唆するものである。

実施例５：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ＃２の投与による、マウスにおけるサイトカインの誘導
処理の６時間後にＢＡＬを行い、前述の処理を１回または７日の間隔をあけて２回とした以外は、実施例４と同様の方法で実験を行った。この実験においても、前述同様、６０μｇのｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰを使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ（３２サイトカイン検出キット）を使用し、処理後早期にサイトカイン産生をスクリーニングした。

結果を図７Ａ〜７Ｒに示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理を２回行うと、１回の処理の場合と比べ、マウスにおいてサイトカインおよびケモカインがより効率的に誘導されたことを示している。さらに、処理の６時間後においては、処理の２４時間後と比べ、より多くの種類のサイトカインおよびケモカインが検出された（図６および図７を比較）。

ＭＩＰ−ｌα、ΜＩΡ−Ιβ、ＭＩＰ−２、ｍＫＣ、ＴＮＦ−α、およびＭＣＰ−１が、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理マウスから採取したＢＡＬ中に多量に存在することがわかった（図７Ａ〜ΕおよびＨ）。これらのサイトカインおよびケモカインは、ヒト顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）を活性化し、これにより、急性好中球性炎症を誘導する場合がある。また、これらサイトカインおよびケモカインは、線維芽細胞およびマクロファージからのＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＩＬ−ｌα／β等の他の炎症性サイトカインの合成および放出を誘導するが（Ｍａｕｒｅｒ ａｎｄ ｖｏｎ Ｓｔｅｂｕｔ，２００４，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３６：１８８２−１８８６）、これらは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰによっても誘導されることがわかった（図７Ｅ、Ｎ、Ｏ、およびＰの各図参照）。さらに、ＭＩＰ−１タンパク質は、インフルエンザウイルスをはじめとするウイルス（Ｍｅｎｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３：４５５−４８１）および寄生虫（Ａｌｉｂｅｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１：８３−８７）等の感染性病原体に対する炎症反応を誘導することにより、健康を促進することができ、このことは、先の実施例に示した結果と一致している。

また、ＩＬ−６は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの投与に反応して分泌されることが観察された（図７Ｎ）。興味深いことに、細菌である肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の感染に対する耐性に、ＩＬ−６分泌が必要であることがわかっている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．，１７６（２）：４３９−４４）。

ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理により、ＩＰ−１０が強力に誘導された（図７Ｉ）。ＩＰ−１０は、炎症部位におけるＴ細胞の動員、さらにナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の増殖と活性化を助ける走化性ケモカインである。

インターロイキン１７もまた、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理によって誘導された（図７Ｊ）。ＩＬ−１７は、インターフェロンガンマと同様、種々の組織においてケモカイン産生を増加させることにより、単球および好中球を炎症部位に動員するよう作用するサイトカインである。ＩＬ−１７はヘルパーＴ細胞によって産生されるものであり、細胞外病原体の免疫系への侵入に反応する炎症性サイトカインでもある。ＩＬ−１７は、ＩＬ−６、顆粒球コロニー刺激因子、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＫＣ、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−２等の炎症性サイトカインおよびケモカインの発現上昇により、局所組織の炎症に対処するが（Ｚｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ａｐｒ １２．［印刷物に先駆けたオンライン出版］）、これらもまた、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理によって誘導されることがわかった。

ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理（図７Ｑおよび７Ｒ）は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦも誘導したが、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球）および単球を産生させることが知られている。単球は、血液循環を離脱して組織へと移動し、ここでマクロファージへと成熟する。よって、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、感染と闘う上で不可欠なプロセスである、少数のマクロファージを活性化してマクロファージ数を急速に増加させるという炎症性カスケードの一部をなしている（Ｍｅｔｃａｌｆ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０：４２５−４３４）。

実施例４および５に記載の結果は、マウスをＰａｐＭＶ ＶＬＰで処理することにより、免疫系細胞によって分泌されるサイトカインおよびケモカインのプロファイルが示すように、強力かつ全般的な炎症反応が誘導されることを実証している。サイトカインおよびケモカインのレベルは、処理の６時間後に最大となり、処理の２４時間後に有意に低下した。炎症性サイトカインおよびケモカインが、免疫系細胞および顆粒球の移動を誘導し、これにより、前記動物の５日間を超える抗ウイルス状態をもたらす可能性が高い。誘導されたサイトカインは、１型ＩＦＮを分泌させることもでき、そして、この１型ＩＦＮが抗インフルエンザ活性を提供することが知られている。

実施例６：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによるＴＬＲ−７の活性化
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス、ＭＹＤ８８ ＫＯマウス、およびＩＲＦ５／７ ＫＯマウス（３〜５匹／群）を、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。免疫の２４時間後に脾細胞を単離し、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびＢ細胞におけるＣＤ８６およびＣＤ６９の発現を分析した。ＦＡＣＳにより細胞をソーティングし、ＣＤ８６およびＣＤ６９の発現量を、ＣＤ６９またはＣＤ８６特異抗体の結合による蛍光強度により評価した。得られた結果を、ＰＢＳサンプルに対する分析対象サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比率として、図８に示す。

簡潔には、これらの結果は、ＤＣ、Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞等の抗原提示細胞は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子によって活性化されることを示している。ＩＲＦ５／７、Ｍｙｄ８８、またはＴＬＲ７を欠損させたマウスでは活性化は起こらないため、活性化は、ＩＲＦ５／７、Ｍｙｄ８８、およびＴＬＲ−７に依存している。ＴＬＲ−７は、ＶＬＰに含まれるｓｓＲＮＡによって誘導されると考えられる。ＰａｐＭＶの外被タンパク質（単量体または他の低分子量の形態）を使用して行った実験では、ＴＬＲ−７は活性化されなかった。

ＩＲＦ５／７は、ＴＬＲ−７の刺激によって誘導されるインターフェロン応答因子であり、インターフェロンアルファの産生を引き起こす。Ｍｙｄ８８分子は、ＴＬＲ−７によって誘導されるシグナルの伝達を担うアダプター分子である。前記反応のカスケードは、以下の通りであると考えられる：１）ＶＬＰ中のｓｓＲＮＡによるＴＬＲ−７の誘導、２）Ｍｙｄ８８の関与に続き、ＩＲＦ５／７が誘導され、これにより、インターフェロンアルファ産生の増加が起こる。最後に、インターフェロンアルファが、ＰａｐＭＶ ＶＬＰナノ粒子の免疫調節効果に貢献する。

実施例７：形質細胞様樹状細胞のＰａｐＭＶ ＶＬＰ免疫原性への関与
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５匹／群）を、ＢＳＴ２＋細胞を除去する前処理あり、なしのいずれかの条件下、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡの静脈内投与により免疫した。除去のため、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる免疫の４８時間前と２４時間前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに抗ＢＳＴ２抗体（ｍＡｂ ９２７）を５００μｇ腹腔内注射した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる免疫から２４時間後に、単離した脾細胞におけるＣＤ６９、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ８６の発現を、ＦＡＣＳによって分析した。

結果を図９に示す。これらの結果は、マウスにおけるＰａｐＭＶ ＶＬＰｓｓＰｖＮＡナノ粒子の免疫原性には、ＢＳＴ２^＋細胞（主に形質細胞様樹状細胞）が重要であることを示している。具体的には、ＢＳＴ２＋細胞を除去したマウスにおいては、Ｂ細胞、ＣＤ８＋細胞、およびＤＣの活性化が起こらないという事実が観察され、これにより、活性化は形質細胞様樹状細胞を介して起こることが示唆された。

実施例８：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ＃１による、インターフェロンα産生の刺激
２群のＣ５７ＢＬ／６マウスと、ＴＬＲ−７ＫＯマウスおよびＭＹＤ８８ＫＯマウス（４匹／群）とを、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群の一方を、実施例７に記載の方法により、まず、抗ＢＳＴ２抗体によって処理した。血清および脾臓におけるＩＦＮ−α産生を、免疫の６時間後、１２時間後、２４時間後、および４８時間後、（図１０Ａ）、または免疫の６時間後（図１０Ｂ）に、ＥＬＩＳＡ（ＶｅｒｉＫｉｎｅ（商標） Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）によって観測した。

その結果を、図１０に示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子によって刺激されるＩＦＮ−αの産生は、ＭＹＤ８８、ＴＬＲ７、およびＢＳＴ２^＋細胞に依存することを示している。

実施例９：ＰａｐＭＶ ＶＬＰ＃２による、インターフェロンα産生の刺激
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲ ＫＯマウス（３匹／群）を、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与により免疫した。前記マウスの脾臓から単離したＢリンパ球および樹状細胞におけるＣＤ８６、ＭＨＣ−Ｉ、およびＣＤ６９の発現を、免疫の２４時間後に、フローサイトメトリーにより評価した。

結果を図１１ＡおよびＢに示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子によるマウス免疫系細胞の活性化には、Ｉ型ＩＦＮ受容体が必要であることを示している。Ｉ型ＩＦＮ受容体を欠損させたマウス（ＩＦＮＡＲ ＫＯ）においては、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子による免疫系細胞の活性化は見られなかった。

１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡによる免疫後、４日目、８日目、１２日目、２０日目、および３０日目における、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＩＦＮＡＲ ＫＯマウス（９匹／群）の血清中のＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡに対する抗体レベルを、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ被覆プレートに結合する総ＩｇＧを測定する間接ＥＬＩＳＡによって分析した。

結果を図１１Ｃに示す。これらの結果は、Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達の不在下では、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子に対する抗体応答に有意な遅れが生じることを示している。

実施例１０：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによる前処理は、慢性感染の制御を助ける
ＬＣＭＶは、慢性感染（ＨＣＶ感染等）の関連動物モデルである。ＬＣＭＶのクローン１３変異体により、マウスに持続感染が確立される。ＬＣＭＶ感染は、ＨＣＶ感染同様、主としてＣＴＬによって制御されており、ＣＴＬ応答の疲弊は、ＰＤ−１の発現と関連付けられる。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウス（３〜６匹／群）を、２×１０^６ＰＦＵのＬＣＭＶクローン１３に感染させる６時間前に（静脈内投与）、１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡ、１００μｇのＲ８３７（市販のＴＬＲ−７リガンド）、または１００μＬのＰＢＳを静脈内に投与することにより処理した。５日目、１１日目、１５日目、２５日目、および４５日目に血液サンプルを採取し、ＬＣＭＶフォーカス形成アッセイにより、ウイルス力価を評価した。感染の１５日後または４５日後にマウスを屠殺し、脾臓における免疫応答をＦＡＣＳにより分析すると共に、脾臓、肝臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、ラット抗ＬＣＭＶ−ＮＰモノクローナルＡｂ（ＶＬ−４）を使用したＭＣ５７線維芽細胞に対するＬＣＭＶフォーカス形成アッセイという、これまでに記載された方法（Ｌａｃａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８２：７８５−７９４）によって分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血液におけるＬＣＭＶクローン１３のウイルス動態を、図１２に示す。これにより、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、ＬＣＭＶによって誘発される慢性感染を制御できることを示している。

感染後１５日目のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＴＬＲ７ＫＯマウスの脾臓、腎臓、肝臓、および脳におけるウイルス力価を、図１３に示す。この結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、市販のＴＬＲ７リガンド（Ｒ８３７）よりも優れた効率で、ＴＬＲ７依存的に異なる臓器におけるウイルス量を低減できることを実証している。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子中のＴＬＲ−７リガンドは、分子中のおよそ５％を占めるｓｓＲＮＡ成分であると考えられる。それゆえ、マウスにそれぞれを１００μｇ投与したが、前記マウスにおけるＬＣＭＶウイルス量の低減におけるＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子の効果は、Ｒ８３７の２０倍を上回る。

図１４は、ＬＣＭＶクローン１３による感染前にＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子を投与することにより、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能性が向上することを示している。ＮＰ３９６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に関しても、同様の結果が得られた。特に、図１４Ｆは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理により、ＧＰ３３特異的ＣＤ８^＋Ｔリンパ球におけるＰＤ−１の発現量が有意に減少することを示している。ＰＤ−１は免疫疲弊の指標であり、その発現は、ＬＣＭＶクローン１３感染の特徴の一つである。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子によるマウスの前処理により、ＰＤ−１発現量が未感染マウスと同等の低レベルに維持された。このことは、これらのマウスにおいて免疫系が疲弊しておらず、このため、これらのマウスが感染に対して抵抗できることを示唆している。

図１５は、感染後４５日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓、腎臓、肝臓、および脳におけるウイルス力価を示している。この結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子を用いた前処理によるウイルス量の低減が、処理後数週間にわたって見てとれることを示している。

実施例１１：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによるインビトロでのヒト単球の活性化
ヒトＰＢＭＣを、フィコール勾配により単離し、１００μｇ／ｍＬのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたはＰＢＳで処理した。処理の１８時間後、ＣＤ１４^＋ＣＤ１１ｂ^＋細胞集団（単球）について、フローサイトメトリーにより、ＣＤ８６発現を分析した。

結果を図１６に示す。これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子により、ヒト単球も活性化されることを示している。これらの結果は、３回の独立した実験の結果を示すものである。

実施例１２：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによる抗菌応答の誘導
一群当たり１０匹のマウスを、緩衝液のみ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８）または６０μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡを７日間隔で２回、鼻腔内経路を介して投与することにより処理した。処理後３日目に、前記マウスを肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の毒性株２２０ＣＦＵ（コロニー形成単位）に感染させた。

４日間にわたり、生存を１２時間毎に綿密に観測した。結果を図１７に示す。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子で処理した群のマウスは全て、前記感染を生き残った。緩衝液で処理した群では、生存率は７０％であった。

この実施例で使用した肺炎球菌の投与量は致死未満量であったが、得られたデータは、ＰａｐＭＶナノ粒子による前処理は、肺における自然免疫応答の誘導し、細菌感染に対する防御を提供することを強く示唆している。本実施例および前述の実施例は、ＰａｐＭＶナノ粒子によって付与される防御は、ウイルス感染および細菌感染のいずれにもに有効であることから、非特異的であることを実証している。

実施例１３：ＰａｐＭＶ ＶＬＰを使用したＬＣＭＶ慢性感染の治療
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（３匹／群）を、０日目に２×１０^６のＰＦＵＬＣＭＶクローン１３に静脈内投与により感染させ、一日一回の１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡまたは１００μＬのＰＢＳの静脈内投与を、１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目に行う（Ａ群）か、または６日目および７日目のみに行う（Ｂ群）ことにより処理した。血液サンプルを５日目、１０日目、および１５日目に採取し、感染から１５日目にマウスを屠殺し、血液、脾臓、腎臓、および脳におけるウイルス力価を、ＬＣＭＶフォーカス形成アッセイにより分析した。

前記動物の血液中で計測されたウイルス力価を、図１８に示す。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子で処理したマウスは、１５日目には、コントロール群と同じ力価を示したが、１０日目には、両群でウイルス力価の有意な低下が観察された（Ａ群の動物では１０に近い対数減少値）。この結果は、治療レジメンを調整することで、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡナノ粒子で処理したマウスにおいて、ウイルス量のさらなる低減が達成可能であることをことを強く示唆している。例えば、処理回数を増やすことが考えられる。１日目から５日目まで、または６日目および７日目に行われた処理によりＬＣＭＶ力価の低減が見られたが、６日目および７日目以降に処理の回数を増やせば、ウイルス量がさらに低減する可能性がある。処理回数の増加に代えて、または処理回数の増加に加えて、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの投与量を、例えば、用量当たり２００μｇまで増加することが考えられる。

前記動物の各種臓器で計測されたウイルス力価を、図１９に示す。６日目および７日目に処理を行った動物（Ｂ群）の脳におけるウイルス量は有意に低減していたが、当該処理マウスの他の臓器におけるウイルス量には、有意な低減は見られなかった。この理由としては、力価の測定を１５日目に行ったため、処理後に感染が「勢いを取り戻す（ｋｉｃｋ ｂａｃｋ）」のに十分な時間があった可能性が最も高いと考えらえる。６日目および７日目以降に行う処理により、より著しいウイルス量の低減が起こると期待される

実施例１４：複数回のＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理で防御期間が延長される
実施例２は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理により誘導される防御は、約５日間持続するものと思われることを示している。ＰａｐＭＶ ＶＬＰの複数回投与による処理によれば、より長い防御期間を提供できるのかどうかを調べるため、実施例１に記載のレジメンの概略にしたがい、ｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰを１回（１×）、２回（２×）、５回（５×）、または１０回（１０×）１週間間隔で投与することにより、マウスを処理した。最後の処理の３日後に、実施例２に記載の方法で、マウスをインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジした。

マウスの体重低下を図２０に示す。前記動物は、前記複数回処理の影響を受けることなく、処理期間中も、コントロール群の動物と同様の、正常な体重増加を示したことも見てとれる。

これらの結果は、複数回処理により、ＰａｐＭＶ ＶＬＰナノ粒子によって誘導される防御期間を１０週間超まで延長できることを示している。これらの結果はまた、複数回のＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理を行っても、動物の自然免疫は疲弊しないことを示している。最後に、ＰａｐＭＶ ＶＬＰに対する抗体は初回処理の７日後に出現し、追加免疫処理によって増加することが知られているように、これらの結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの自然免疫応答誘導能は、抗体産生の影響を受けないことを実証している。

実施例１５：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによる好中球動員の誘導
実施例１のプロトコールにしたがい、マウスに対してｓｓＲＮＡ含有ＰａｐＭＶ ＶＬＰの滴下投与（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ）を２回行い、２回目の処理から６時間後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。結果を図２１に示す。ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理マウスのＢＡＬで発見された好中球を、図２１Ｂにおいて丸で囲んでいる。処理マウスにおいては、コントロール群と比べて、３倍の好中球が観察された。

好中球は、防御機構の最前線である。この実施例は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ処理マウスにおいて、好中球が、処理後わずか６時間で、迅速に動員されることを示している。肺における細菌感染およびウイルス感染の制御において、好中球が重要な役割を果たすことが知られており、よって、好中球は、ＰａｐＭＶ処理マウスにおいて観察される防御においても、おそらくその役割を果たしているものと思われる。

実施例１６：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによる粘膜免疫応答の誘導
２μｇの３価不活性インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）と組み合わせた２０μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ ｓｓＲＮＡを、１４日間隔で２回滴下投与することにより、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）を処理した。０日目、１４日目、および２８日目に出血を起こさせた。別の一群のマウスは、比較のため、同一のプロトコールにより、皮下経路で免疫した動物である。マウスを、１５日目に、１ＬＤ_５０のインフルエンザＷＳＮ／３３ウイルスでチャレンジし、体重低下を１４日間追跡調査した。

前記免疫動物の血液中のＩｇＧ力価を、ＴＩＶに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２２に示す。使用した免疫経路が同一である場合、ＴＩＶにＰａｐＭＶ ＶＬＰを添加することにより、総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ応答が、ＴＩＶのみで免疫した群と比べて著しく増加した。興味深いことに、動物の血液中における総ＩｇＧおよび総ＩｇＧ２ａ産生に関しては、鼻腔内経路よりも皮下経路での投与のほうが効率的であった。

前記免疫動物の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中および糞中の抗体力価を、ＴＩＶに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２３に示す。これらの結果から、鼻腔内投与による処理のみが、ＢＡＬ中のＩｇＡ産生を引き起こすことは明らかである。ＴＩＶにＰａｐＭＶ ＶＬＰを添加することにより、肺におけるＩｇＡ量が、ＴＩＶのみの滴下投与を行った場合と比べて有意に増加した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰとＴＩＶを組み合わせて処理した動物においても、ＴＩＶ単独で処理した群と比べて、ＢＡＬ中の総ＩｇＧの有意な増加が観察された。ＰａｐＭＶ ＶＬＰの鼻腔内投与とＴＩＶの鼻腔内投与を組み合わせて処理したマウスから得たＢＡＬ中の総ＩｇＧ量は、前記組み合わせを皮下投与して処理したマウスのものと比べて、有意な差はなかった。最後に、興味深いことに、前記組み合わせを鼻腔内投与して処理したマウスの腸においても、ＴＩＶに対するＩｇＡがこの臓器に存在することからわかるように（図２３Ｃ）、粘膜免疫応答が観察された。

インフルエンザウイルスによるチャレンジ後のマウスの体重低下を、図２４に示す。前記チャレンジの結果、鼻腔内経路で免疫した場合、皮下経路で免疫した場合と比べて、より頑強かつ効率的にヘテロサブタイプ株からマウスを防御できることが判明した。ＰａｐＭＶ ＶＬＰとＴＩＶの組み合わせの鼻腔内投与により免疫した群では、マウスは体重増加を示し、症状も見られなかった。前記組み合わせを皮下投与した場合には、部分的な防御しか得られなかった。しかしながら、３μｇのＴＩＶを３０μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰと共に皮下投与すれば、完全な防御を得ることができる。ＴＩＶ単独（いずれかの経路で）、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ単独、またはコントロール緩衝液で免疫した他の群は全て、防御が得られず、疾患の症状を示し、有意な体重低下が見られた。

この実験の結果は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰが粘膜アジュバントとして作用し得ることを実証している。粘膜免疫応答を引き起こすアジュバントの能力は、粘模を介して身体に到達する微生物による感染および疾患（インフルエンザ、結核、およびピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感染を含む）の効果的な予防または治療に重要である。免疫動物の糞中のＩｇＧの存在は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰをアジュバントとして用いた鼻腔内ワクチン投与を、腸における細菌またはウイルス感染からの防御のために使用できることを示唆している。さらに、ＰａｐＭＶ ＶＬＰが引き起こす粘膜免疫応答は全般的であるため、ＰａｐＭＶ ＶＬＰをアジュバントとして用いた鼻腔内ワクチン投与は、膣粘膜における細菌またはウイルス感染（ＨＩＶ−１等）からの防御目的でも使用できる可能性がある。

この実験では、ＰａｐＭＶ ＶＬＰ単独の鼻腔内投与で処理したマウスでは防御は見られなかったが、これは、ＰａｐＭＶ ＶＬＰによって誘導される非特異的防御は約５日間しか持続しないことを示す先の実施例における結果と一致している。この実験では、チャレンジは、ＶＬＰの２回目の滴下投与の１４日後に行った。

実施例１７：ＰａｐＭＶ ＶＬＰによるＴＬＲ−２およびＣＤ１４の活性化
先の実施例で実証したように、細菌宿主細胞内で調製したＰａｐＭＶ ＶＬＰおよびｓｓＲＮＡと共にインビトロで自己集合させて調製したＰａｐＭＶ ＶＬＰは、いずれも自然免疫応答を刺激することが可能である。しかしながら、前記２つの異なる方法で調製したＶＬＰは、異なるＴＬＲを活性化する。先に示したように、ｓｓＲＮＡと共にインビトロで自己集合させて調製したＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ＴＬＲ−７を活性化する。これに対し、これまでに記載の方法（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．、２００６、同上）により、ＰａｐＭＶ外被タンパク質を大腸菌の菌体内で発現させ自己集合させて調製したＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ＴＬＲ−２およびＣＤ１４を活性化する。

簡潔には、ＴＨＰｌ−ＸＢｌｕｅ（商標）−ＣＤ１４細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、以下を用いて処理した：１００μｇのＰａｐＭＶ ＶＬＰ（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．記載の方法で調製）または公知のＴＬＲリガンド（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＬＴＡ）由来のリポテイコ酸１００μｇ：ＴＬＲ２およびＣＤ１４リガンド；１μｇのＰａｍ３ＳＣＫ４：ＴＬＲ２リガンド；または１０μｇのフラゲリン：ＴＬＲ５リガンド）、および抗ＣＤ１４、抗ＴＬＲ２、抗ＴＬＲ５抗体のいずれか。ＴＨＰｌ−ＸＢｌｕｅ（商標）−ＣＤ１４細胞は、複数のＴＬＲ（ＴＬＲ２、４、５を含む）を内部に有し、ＴＬＲがリガンドに結合すると、青色を発色するように改変されている。結合すると、前記細胞は青色に変色し、分光光度計を用いて結合の強度を容易に評価できる。測定は、前記細胞を３７℃で２４時間インキュベートした後に行った。

結果を図２６に示す。ＣＤ１４、ＴＬＲ２、またはＴＬＲ５に対する抗体（Ａｃ）は、各ＴＬＲまたはＣＤ１４の結合をブロックし、これにより、各テスト分子によりどのような相互作用が起こっているのかが判明した。抗ＴＬＲ２抗体をＰａｐＭＶ ＶＬＰと併用した場合には、光学密度の有意な低下が観察され、抗ＣＤ１４抗体を使用した場合には、大幅な低下が観察された。この実験では、Ｐａｍ３ＣＳＫ４（公知のＴＬＲ２リガンド）使用時にはより大きな低下が観察されるはずであったのに、ＴＬＲ２に対する抗体は、予期した通りの働きを見せなかった。おそらく、本実験で使用したＰａｍ３ＣＳＫ４量が多すぎたものと考えられる。

細菌内での集合により得られたＰａｐＭＶ ＶＬＰに関して見られるＴＬＲ活性化における差は、菌体からの単離後に前記ＶＬＰに対して行った洗浄剤処理に起因する可能性がある。この処理は、ＰａｐＭＶ ＶＬＰの表面に対し、例えば、疎水性残基を露出させるという影響を与えることがあり、この結果、前記ＶＬＰがＴＬＲ２のリガンドとなる場合がある。エンドソームに存在するＴＬＲ７とは対照的に、ＴＬＲ２またはＣＤ１４は、いずれも免疫系細胞上にその表面が露出している。

実施例１８：ｓｓＲＮＡを含むＰａｐＭＶ ＶＬＰの調製方法
この実施例では、組換えＰａｐＭＶ外被タンパク質（ｒＣＰ）を合成ＲＮＡ鋳型（ＳＲＴ）上に集合させて組換えＶＬＰ（ｒＶＬＰ）を製造することにより、ＰａｐＭＶ ＶＬＰをインビトロで調製するプロセスについて述べる。ｒＶＬＰは、幅１５ｎｍ、長さ５０〜数千ｎｍの桿状のナノ粒子である。このプロセスを、図２７に示すフローチャートに概略的に示している。

（ｒＣＰの製造）
６×Ｈｉｓ標識を内部に有するｒＣＰを、前記ｒＣＰ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡで形質転換させた大腸菌内において、誘導性プロモーターの制御下で製造した。簡潔には、ＰａｐＭＶ ＣＰを、制限酵素ＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩに挟まれたｐＱＥ８０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）にクローニングし、当該タンパク質をＴ５プロモーターの制御下で発現させた。発現には大腸菌ＢＤ−７９２を使用した。形質転換した細菌を、標準的な培地で培養した。前記培地（０．７〜１ｍＭ ＩＰＴＧに２２℃〜２５℃で６〜９時間）に生化学的誘導因子を添加することにより、タンパク質の発現を誘導した。誘導期間の終了時に、細胞を採取し、溶解用緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、フレンチプレス、ホモジナイザー、またはソニケーターを使用して、機械的に破砕した。標準的なＤＮａｓｅ処理によるゲノムＤＮＡの除去、遠心分離またはタンジェント流ろ過（３００ｋＤａ〜０．４５μｍのＭＷＣＯ膜）による大型の細胞フラグメントおよび膜の除去により、細胞溶解物を清澄化した。ｒＣＰを、イオンマトリックス親和性樹脂上に捕捉し、標準的な手順を用いて、ｐＨ勾配またはイミダゾールにより溶出した。次いで、ｒＣＰを、陰イオン交換クロマトグラフィー／ろ過によりエンドトキシンから精製し、タンジェント流ろ過（０〜３０ｋＤａのＭＷＣＯ膜）により小型低分子から精製した。ｒＣＰ溶液中に存在する夾雑イミダゾールを、透析またはタンジェント流ろ過（５〜３０ｋＤａのＭＷＣＯ膜）により除去した。最終的に得られたｒＣＰタンパク質溶液を、ろ過により滅菌した。得られた滅菌製品は、２〜８℃で保存でき、しかも数年間安定である。

（ＳＲＴの製造）
ＳＲＴの配列を、図２８に示す［配列番号５］。ＳＲＴは、ＰａｐＭＶのゲノムに基づき、ＰａｐＭＶ外被タンパク質核形成シグナルを５’末端に有している（図２８において、四角で囲んでいる）。残りのヌクレオチド配列は、全ＡＴＧコドンをＴＡＡ終止コドンへと変異させるように、多重変異（ｐｏｌｙ−ｍｕｔａｔｅｄ）されている。前記配列の最初の１６個のヌクレオチド（図２８の下線部）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ発現ベクター内に位置するＴ７転写開始部位を含み、ＲＮＡ転写物内に存在している。五量体の繰り返し単位を、図２８において下線部で示している。転写物全体としては、１５２２ヌクレオチドの長さである。

前記ＳＲＴに対応するＤＮＡを、標準的な手順を用いて、原核ＲＮＡポリメラーを含むＤＮＡプラスミドに挿入した。前記組換えプラスミドを使用して大腸菌の菌体を形質転換し、続いて、前記形質転換した細菌を、標準的な培地で培養した。細胞培養物からの前記プラスミドＤＮＡの回収と精製を標準的な技術によって行い、次に、前記プラスミドＤＮＡを、そのＤＮＡ配列を、ＳＲＴ内に存在させるべき最終のヌクレオチドの直後の部位で制限酵素（ＭｌｕＩ）によって切断することにより直線化した。

製造元が推奨するプロトコールにしたがってＲｉｂｏＭＡＸ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、ＳＲＴの転写を行った。発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから生じる転写物が、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ切断点から遊離されるように設計した。ＳＲＴの精製を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いたタンジェント流ろ過により、ＤＮＡ、タンパク質および遊離ヌクレオチドを除去することによって行った。最終的に得られたＲＮＡ溶液を、ろ過により滅菌した。得られた滅菌製品は、−６０℃よりも低い温度で保存でき、しかも数年間安定である。

（ｒＶＬＰの製造）
ｒＣＰおよびＳＲＴを組み合わせることにより、ｒＶＴＰへの集合をインビトロで行った。集合反応は、中性の緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）中で行った。集合反応は、１ｍｇのＲＮＡに対し、１５〜３０ｍｇのタンパク質というタンパク質対ＲＮＡ比率を用いて行った。集合により新たに生じたｒＶＬＰを、少量のＲＮａｓｅ（ＲＮＡ１μｇ当たりＲＮＡｓｅ０．０００１μｇ）でインキュベートし、ｒＶＬＰから突出しているＲＮＡを除去した。この工程により、ｒＶＬＰの溶解性が向上する。次いで、１０〜１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いたダイアフィルトレーションにより、夾雑物および遊離ｒＣＰ（集合しなかった単量体のｒＣＰ）から、平滑化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）ＶＬＰを精製した。最終的に得られたｒＶＬＰ懸濁液を、ろ過により滅菌した。得られた滅菌生成物は、２〜８℃で保存でき、しかも数年間安定である。

本明細書中に引用した全ての特許、公開された特許出願を含む刊行物、およびデータベースエントリによる開示内容は、その全体が、このような別個の特許、刊行物、およびデータベースエントリのそれぞれを明示的かつ個々に援用した場合と同程度に、本明細書に援用されるものとする。

本発明をある特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の趣旨および範囲内における種々の変更例が、当業者には明白であると考えられる。当業者に明白なこのような全ての変更例が、以下に記載の特許請求の範囲内に含まれるものと意図している。

Claims (20)

1. パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、且つ抗原を含まず、
   前記ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ｓｓＲＮＡを含む、対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することによる前記対象における微生物感染の予防用、またはその重症度の軽減用医薬品。
2. 前記微生物感染が、粘模を介して前記対象の身体に到達する微生物による感染である、請求項１記載の医薬品。
3. 前記微生物感染が、ウイルス感染または細菌感染である、請求項１記載の医薬品。
4. 前記免疫応答が、粘膜表面で刺激される、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬品。
5. パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、且つ抗原を含まず、
   前記ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ｓｓＲＮＡを含む、病原体による感染からの対象の防御用医薬品であり、前記医薬品が、前記対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することを特徴とする、医薬品。
6. 前記病原体が、粘模を介して前記対象の身体に到達する微生物である、請求項５記載の医薬品。
7. 前記病原体が、ウイルスまたは細菌である、請求項５記載の医薬品。
8. 前記病原体が、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、またはライノウイルスである、請求項５記載の医薬品。
9. 前記病原体が、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、またはコクシエラ菌（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）である、請求項５記載の医薬品。
10. 前記医薬品が、前記対象が前記病原体と接触すると予測される４時間前から６日前の間の投与用である、請求項５から９のいずれか一項に記載の医薬品。
11. 前記医薬品が、複数回投与用の医薬品である、請求項５から９のいずれか一項に記載の医薬品。
12. 前記対象が、免疫無防備状態、化学療法中、または免疫抑制剤使用中である、請求項５から９のいずれか一項に記載の医薬品。
13. 前記医薬品が、前記対象における免疫疲弊を予防する、請求項５から９のいずれか一項に記載の医薬品。
14. パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み、且つ抗原を含まず、
    前記ＰａｐＭＶ ＶＬＰは、ｓｓＲＮＡを含む、対象における慢性または反復性の微生物感染の治療用医薬品であり、
    前記医薬品が、前記対象における非特異的な自然免疫応答を刺激することを特徴とする、医薬品。
15. 前記医薬品の投与を、１以上の従来の療法と組み合わせて行う、請求項１４記載の医薬品。
16. 前記微生物感染が、ウイルス感染または細菌感染である、請求項１４または１５記載の医薬品。
17. 前記微生物感染が、Ｃ型肝炎ウイルス感染またはヒト免疫不全ウイルス感染である、請求項１４または１５記載の医薬品。
18. 前記医薬品が、前記対象におけるウイルス量を低減する、請求項１６記載の医薬品。
19. 前記医薬品が、鼻腔内投与用である、請求項１４または１５記載の医薬品。
20. 前記医薬品が、１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および／または賦形剤と組合せて投与される医薬品である、請求項１、５、および１４のいずれか一項に記載の医薬品。