JP6198201B1 - 抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤 - Google Patents

Abstract

この発明は、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療する又は腫瘍転移から予防するための抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤であって、該ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を含む高分子ミセルを有効成分として含み、該高分子ミセルが、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーと、該核酸とを含み、該核酸が該カチオン性ポリアミノ酸セグメントのカチオン性基と結合して複合体を形成する、及び／又は、該核酸が該ミセル内部に内包若しくは付着されており、並びに、該高分子ミセルが腫瘍に集積することを特徴とする、ドラッグデリバリー製剤を提供する。

Description

本発明は、ＴＵＧ１遺伝子を高発現する腫瘍に対する抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤に関する。
具体的には、本発明は、腫瘍細胞においてＴＵＧ１の発現を効果的に抑制する、修飾ｓｉＲＮＡ、修飾アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどの核酸を含むドラッグデリバリー製剤に関する。

ＴＵＧ１は、ｔａｕｒｉｎｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ １の略称であり、げっ歯類の網膜の分化に必要なノンコーディングＲＮＡとしてＹｏｕｎｇら（非特許文献１）などによって特定されたスプライシングされたポリアデニル化ＲＮＡであり、網膜や脳など神経系の組織に強い発現を示す。

癌又は腫瘍でのＴＵＧ１の役割について、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ではＴＵＧ１をノックダウンすると細胞増殖を促進することがＺｈａｎｇら（非特許文献２）によって記載されている。これとは逆に、特定の癌又は腫瘍においてＴＵＧ１が過剰発現されており、ＴＵＧ１発現を抑制すると、増殖が抑制されるという報告もある。例えば、Ｘｕら（非特許文献３）は、ＴＵＧ１のサイレンシングによって食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）細胞の増殖が抑制され細胞周期の進行が阻止されると記載している。また、Ｚｈａｎｇら（非特許文献４）は、骨肉腫細胞株でＴＵＧ１が過剰発現されていること、また、ＴＵＧ１発現を抑制すると骨肉腫細胞がアポトーシスを起こすことを記載している。さらにまた、Ｈａｎら（非特許文献５）は、尿路上皮癌でＴＵＧ１が過剰発現され、高ステージと関係があること、また、ＴＵＧ１をサイレンシングすると増殖阻害やアポトーシス誘導が起こることを記載している。

原発性脳腫瘍のなかで最も悪性度の高い膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ＧＢＭ）は、いまだに根治に至ることが極めて困難な腫瘍である。ＧＢＭはゲノム異常に加えて非翻訳ＲＮＡやヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有し、これらエピゲノム異常がＧＢＭの悪性化に寄与することが示唆されている。非翻訳ＲＮＡの１つであるｌｏｎｇ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ （ｌｎｃＲＮＡ）による遺伝子発現制御は細胞の分化や増殖などの様々な生命現象に深く関わっており、癌の悪性化への関与も報告されている。このような知見を基に、ＧＢＭなどの腫瘍の難治性疾患に対する療法の研究開発も行われているが、革新的な技術は見いだされていない。

近年、実用性の面で特に注目される有望な技術が、片岡らによって開発された高分子ミセルドラッグデリバリーシステムであり、この技術は、例えば、親水性ブロックとカチオン性アミノ酸ブロックを含むブロックコポリマーによって形成されるミセル内に薬剤を含むものである（特許文献１〜６など）。この技術を利用できる疾患のなかに腫瘍も含まれているが、いかなる薬剤を含有させるかについては治療効果も含めて今後の研究に依存するところが大きい。

再表２００７／０９９６６０ 再表２００７／０９９６６１ 再表２００９／１１３６４５ ＷＯ２０１３／１６２０４１ 再表２０１０／０９３０３６ 再表２０１２／００５３７６

Ｔ．Ｌ．Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００５；１５（６）：５０１−５１２， Ｅ．Ｂ． Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．Ｍａｙ ２２，２０１４；５：ｅ１２４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１４．２０１ Ｙ．Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｃｔ ３１，２０１４，ｄｏｉ：１０，１００７／ｓ１３２７７．０１４．２７６３．６ Ｑ．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ，２０１３；１４（４）：２３１１−２３１５ Ｙ．Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ，２０１３；１０７：５５５−５５９

本発明の目的は、神経膠芽腫（ＧＢＭ）などの脳腫瘍を含む、ＴＵＧ１を高発現する癌又は腫瘍を予防又は治療することができる核酸医薬を提供することである。

ＧＢＭは、前述のとおり、原発性脳腫瘍のなかで最も悪性度が高く、未だに改善や根治に至ることが極めて困難な腫瘍である。ＧＢＭは、ゲノム異常の他に非翻訳ＲＮＡやヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有し、これらエピゲノム異常がＧＢＭの悪性化に寄与することが示唆されている。

本発明者らは、先に、ＧＢＭを含むいくつかの腫瘍にｌｎｃＲＮＡの一つであるＴＵＧ１が高発現しており、それを標的とした核酸が該腫瘍の有意な退縮に有効であることを見出した（ＷＯ２０１６／１２９６３３Ａ１）が、今回さらに、脳腫瘍をはじめとする腫瘍組織内に特異的に集積する、ＴＵＧ１の発現を抑制して腫瘍を退縮することが可能である抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤を見出し、本発明を完成させた。

したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療する又は腫瘍転移から予防するための抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤であって、該ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を含む高分子ミセルを有効成分として含み、該高分子ミセルが、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーと、該核酸とを含み、該核酸が該カチオン性ポリアミノ酸セグメントのカチオン性基と結合して複合体を形成する、及び／又は、該核酸が該ミセル内部に内包若しくは付着されており、並びに、該高分子ミセルが腫瘍に集積することを特徴とする、ドラッグデリバリー製剤。
（２）上記腫瘍が、脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病又はリンパ腫である、上記（１）に記載のドラッグデリバリー製剤。
（３）上記腫瘍が、脳腫瘍又は膵臓癌である、上記（２）に記載のドラッグデリバリー製剤。
（４）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、若しくはその修飾ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（５）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２又は１０４４〜１０６２の領域、並びに／或いは、それぞれ、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１又は２９４１〜５１２５の領域を標的とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（６）上記核酸が、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ又はその修飾ＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（７）上記修飾ＲＮＡが、１つ又は２つ以上の修飾ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、上記（４）〜（６）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（８）上記修飾ＲＮＡが、配列番号２０〜２７の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列を含む配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、或いは、配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡキメラである、上記（４）〜（７）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（９）上記修飾ＲＮＡが、各末端側に、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされた少なくとも２つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、上記（４）〜（８）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１０）上記修飾ＲＮＡが、配列番号３６〜３８、５１〜５３のいずれかの塩基配列からなるＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、上記（４）〜（５）、及び（７）〜（９）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１１）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡを含むベクターである、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１２）上記親水性ポリマー鎖セグメントが分岐状の複数のポリマー鎖からなる、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１３）上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントがポリリジンを含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１４）上記親水性ポリマー鎖セグメントがポリエチレングリコール又は末端修飾ポリエチレングリコールを含む、上記（１）〜（１３）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１５）上記ブロックコポリマーが上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントと上記親水性ポリマー鎖セグメントとの間に連結基を有する、上記（１）〜（１４）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１６）前記親水性ポリマー鎖セグメントが、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列又はアスパラギン−グリシン−アルギニン配列を含む環状ペプチドを含む、上記（１）〜（１４）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１７）上記ブロックコポリマーが、１を超える［ブロックコポリマー中のカチオン性基の総数（Ｎ）］／［核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）］として定義されるＮ／Ｐ比を有する、上記（１）〜（１６）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤。
（１８）上記Ｎ／Ｐ比が、２以上、３以上、４以上、又は５以上である、上記（１７）に記載のドラッグデリバリー製剤。
（１９）上記（１）〜（１８）のいずれかに記載のドラッグデリバリー製剤を、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体に投与することを含む、該被験体において該腫瘍を治療又は予防する方法。
（２０）上記腫瘍が、脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病又はリンパ腫である、上記（１９）に記載の方法。

本発明のドラッグデリバリー製剤は、脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫などのＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍の強い増殖抑制を可能にする効果を有する。

この図は、種々の腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベルを示す。図中、ＧＳＣはグリオーマ幹細胞株を示し、Ｔ９８、Ｕ２５１、ＳＫ−ＭＧ１及びＡＯ２はグリオーマ細胞株を示し、ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、ＳＫ−ＢＲ３及びＴ４７Ｄは乳癌細胞株を示し、Ｌｏｖｏ、Ｃａｃｏ−２、ＲＫＯ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０及びＳＷ１０８３は大腸癌細胞株を示し、ＰＣ３、ＬＮＣａｐ及びＶｃａｐは前立腺癌細胞株を示し、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７及びＡ５４９は肝臓癌細胞株を示し、Ｈ９２０及びＰＣ９は肺癌細胞株を示し、Ｊｕｒｋａｔは白血病細胞株を示し、Ｒａｊｉはバーキットリンパ腫細胞株を示し、並びに、Ｐｆｅｉｆｆｅｒはリンパ腫細胞株を示す。発現レベルは、内部標準ＧＡＰＤＨに対するＴＵＧ１の相対発現比率で表した。 この図は、ＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡターゲット配列の位置と、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣに対する増殖抑制効果を示す。図中、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４（塩基配列：図３参照）は、作製された修飾ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ；センス鎖及びアンチセンス鎖の３'末端の「ｄＣｄＡ」等はＤＮＡ配列である。）を表し、ＴＵＧ１配列上の標的位置を示す。また、抑制効果は、コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」；Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１ ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３））に対するＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）の相対発現比率で表す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、図２で試験されたｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４の塩基配列（センス鎖配列とアンチセンス鎖配列）を示す。抑制効果の得られたｓｉＲＮＡは、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８であり（図３Ａ）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃９〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４では抑制効果が低いか、又は抑制効果が得られなかったこと（図３Ｂ）を示す。 この図は、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８（「＃１」〜「＃８」と表示した。）によるグリオーマ幹細胞株ＧＳＣにおけるＴＵＧ１の発現抑制効果の評価を示す。各修飾ｓｉＲＮＡ導入３日後におけるＴＵＧ１の発現量（ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準））をコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」；Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１ ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３））に対する相対値で示している。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８（「＃１」〜「＃８」と表示した。）によるグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに対する抗増殖効果の評価を示す。各修飾ｓｉＲＮＡ導入３日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示している。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、すなわち、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）を示す。ＬＮＡ修飾を行った部位を下線で示す。 この図は、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）の３種のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、並びにｓｉ−ＴＵＧ１＃２（センス：配列番号２１及びアンチセンス：配列番号２９）、によるＴＵＧ１発現抑制効果の評価を示す。比較のため、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２及びコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を用いた。各ｓｉＲＮＡ及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに導入し、３、７、１０日後（ｄ３、ｄ７、ｄ１０）におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する相対ＴＵＧ１発現量を示す。発現量は、ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）である。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（初期細胞数１×１０^５）における表示の各ｓｉＲＮＡ及び各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（終濃度３０ｎＭ）による抗腫瘍細胞増殖抑制効果の評価を示す。ｓｉ−ＴＵＧ１＃２（センス：配列番号２１及びアンチセンス：配列番号２９）及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８））の各々をＧＳＣに導入１０日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、配列番号１７の塩基配列に基づいて作製したＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、すなわち、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）を示す。ＬＮＡ修飾を行った部位を下線で示す。 この図は、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）の３種のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、並びにｓｉ−ＴＵＧ１＃６（センス：配列番号２５及びアンチセンス：配列番号３３）、によるＴＵＧ１発現抑制効果の評価を示す。比較のため、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６及びコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を用いた。各ｓｉＲＮＡ及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに導入し、３、７、１０日後（ｄ３、ｄ７、ｄ１０）におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する相対ＴＵＧ１発現量を示す。発現量は、ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）である。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（初期細胞数１×１０^５）における表示の各ｓｉＲＮＡ及び各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（終濃度３０ｎＭ）による抗腫瘍細胞増殖抑制効果の評価を示す。ｓｉ−ＴＵＧ１＃６（センス：配列番号２５及びアンチセンス：配列番号３３）及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３））の各々をＧＳＣに導入１０日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、ＴＵＧ１阻害による前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖抑制効果を示す。図１２Ａは、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２又はコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を作用したときのＰＣ３株におけるＴＵＧ１発現レベルを示し、図１２Ｂは、それぞれのｓｉＲＮＡを作用したときのＰＣ３株の相対細胞増殖率を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣを皮下に移植したヌードマウスにＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（（配列番号３６）又はコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を３日毎に腫瘍に対して直接投与して治療を施したときの腫瘍サイズの経日変化を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、後述の実施例７に記載されるように、脳腫瘍同所移植マウスモデルに、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１））を含有するドラッグデリバリー製剤を静脈内投与したときの、投与３、６、９、１２及び１５時間後、該ドラッグデリバリー製剤が脳腫瘍組織に特異的に集積することを示す。各時間のパネルにおいて、左は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー単体が投与されたマウスであり、右は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤が投与されたマウスにおける結果である。 この図は、図１４の結果に基づき脳腫瘍組織へのドラッグデリバリー製剤の蛍光強度の経時的変化を示すグラフである。●は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤が投与されたマウスの脳腫瘍組織における相対蛍光強度の経時的変化を示し、▲は、Ａｌｅｘａ−６４７標識したＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー単体が投与されたマウスの脳腫瘍組織における相対蛍光強度の経時的変化を示す。相対蛍光強度は、投与前（０時間）における蛍光強度を１としたときの値である。 この図は、脳腫瘍同所移植マウスモデルにＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１））を含有するドラッグデリバリー製剤（２５μｇ／マウス）を３日ごとに１回の頻度で１０回静脈内投与したのちのマウス脳組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す。左は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子（firefly GL3 luciferase）に対するｓｉＲＮＡ（配列番号５４及び５５）を含むドラッグデリバリー製剤（対照）を投与したマウス脳組織であり、一方、右は、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤（本発明）を投与したマウス脳組織である。 この図は、ＴＵＧ１阻害による膵臓癌細胞株（ＭＩＡＰＡＣＡ２、ＰＡＮＣ１、ＢＸＰＣ３）の増殖抑制効果を示す。Ａは、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ修飾アンチセンスＤＮＡ、配列番号５６）又はＦｉｒｅｆｌｙ ＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー（配列番号５７）を作用したときの膵臓癌細胞株におけるＴＵＧ１発現レベルを示し、Ｂは、それぞれのＬＮＡオリゴマーを作用したときの膵臓癌細胞株の相対細胞増殖率を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。 この図は、膵臓癌細胞株（ＢＸＰＣ３）を皮下に移植したヌードマウスに対して、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（配列番号５６）又はＦｉｒｅｆｌｙ ＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー（配列番号５７）を内包するドラッグデリバリー製剤（ミセル型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤（後述の［参考例１］参照））を継続的に静脈内投与しときの腫瘍サイズの経日変化を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１５−２２６８９５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

近年ｌｎｃＲＮＡの発現異常と癌との関係が注目されている。特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、癌の診断分野において多数見出されている。癌又は腫瘍の種類によってｍｉＲＮＡの種類も異なるとともに、正常細胞と比べて過剰発現するｍｉＲＮＡもあれば、逆に減少するｍｉＲＮＡも混在しているため、複雑化している。また、ｌｎｃＲＮＡについてはｍｉＲＮＡと比べて報告数が少ないが、ｌｎｃＲＮＡと癌との関係において過剰発現する場合と発現が減少する場合の両方が知られている。

本発明者らは、腫瘍のなかでも治療が難しい脳腫瘍について治療剤の開発を行ってきた。原発性脳腫瘍のなかでも最も悪性度の高い神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、改善が極めて難しい腫瘍である。ＧＢＭは、ゲノム異常に加えて非翻訳ＲＮＡやヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有し、これらのエピゲノム異常がＧＢＭの悪性化に寄与すると示唆されている。上記の非翻訳ＲＮＡの１つであるｌｎｃＲＮＡの遺伝子発現制御は、細胞の分化や増殖などの様々な生命現象に深く関わり、近年では癌の悪性化への関与も報告されている（Ｒ．Ａ．Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６４：１０７１−１０７６，２０１０；Ｌ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５００：５９８−６０２，２０１３；Ｊ．Ｈ．Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２５：６６６−６８１，２０１４；Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）。

先に、本発明者らは、ヒトＧＢＭから樹立したグリオーマ幹細胞（ｇｌｉｏｍａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＧＳＣ）において、ｌｎｃＲＮＡの１つであるＴＵＧ１が正常組織と比べて高発現しており、ＴＵＧ１の発現抑制がＧＳＣの増殖抑制に寄与することを見出し、ＴＵＧ１を標的とした核酸医薬がＧＢＭ治療に有効であることをさらに見出し、さらに、このような知見を踏まえて、これまで報告のないいくつかの腫瘍についてもＴＵＧ１が高発現していること、そしてこれらの腫瘍においてもＧＳＣと同様に該核酸医薬により抗腫瘍効果が期待できることを見出した（特願２０１５−０２４７１３（出願日２０１５年２月１０日）、ＷＯ２０１６／１２９６３３Ａ１））。

上記の背景技術で記載したように、ＴＵＧ１と腫瘍との関係に関する報告は非常に少ないうえ、腫瘍の治療に関しても、ＴＵＧ１は腫瘍の種類によって発現量が異なることが知られているが、高発現される特定の腫瘍に対してもＴＵＧ１の発現抑制が治療有効であるかについては十分な証明がされていない。

ＴＵＧ１はｐ５３によって誘導され細胞周期に関係する特定の遺伝子を抑制する役割を有しており、ＴＵＧ１を含むｌｎｃＲＮＡがｐ５３転写経路において腫瘍増殖抑制的に機能する可能性も仮説的に指摘されているがよくわかっていない（Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）。

本発明者らは、このような状況のなかで、脳腫瘍などの腫瘍がＴＵＧ１の発現抑制によって増殖抑制されることを見出してきたが、今回、本発明者らはさらに、ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を含むドラッグデリバリー製剤が、脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫などのＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて統計的有意（Ｐ＜０．０１）により高く発現（以下、「高発現」という。）する腫瘍を有する被験体を治療する又は腫瘍の転移から予防するうえで極めて有効であることを見出した。ここで、腫瘍転移からの予防については、ＴＵＧ１遺伝子は癌幹細胞で発現されており、当該遺伝子の発現が抑制されるとき腫瘍増殖が抑制されることから、癌幹細胞による腫瘍転移もまた抑制されると考えられる。

癌幹細胞は、抗癌剤に対し抵抗性を有することが多いため、たとえ癌細胞が見かけ上縮小しても残存して転移や再発の原因となることが知られている。したがって、癌幹細胞を標的とした薬剤を開発することができれば転移を抑制し再発の予防を可能にすると考えられている。ＴＵＧ１遺伝子は癌幹細胞でも発現されるため、本発明のドラッグデリバリー製剤はＴＵＧ１遺伝子を発現する癌若しくは腫瘍に対し効果的な攻撃を可能にする。

本発明のドラッグデリバリー製剤はさらに、ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を含み、該核酸を癌若しくは腫瘍細胞まで特異的に送達することが可能である。上で例示された癌もしくは腫瘍のなかで、とりわけ脳腫瘍と膵臓癌は、最も治療が難しいことが知られており、該製剤は、このような癌若しくは腫瘍に対しても効果的な抗癌効果を発揮することができる。

以下に、本発明についてさらに具体的に説明する。

１．ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸
本発明の組成物の有効成分は、腫瘍においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸である。

本明細書中の「ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する」という用語について、正常組織（又は正常細胞）において正常に発現するＴＵＧ１のレベル（若しくは量）より多い異常な状態を「高発現」と称し、該用語は、ＴＵＧ１遺伝子の高発現を正常レベル又はそれ以下のレベルに抑制すること、並びに、ＴＵＧ１遺伝子の転写体であるｌｎｃＲＮＡの機能を抑制することの意味で使用されている。ここでｌｎｃＲＮＡの機能は、本発明では、癌若しくは腫瘍の増殖、進行又は転移に関係する機能をいう。本発明によれば、例えば脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病及びリンパ腫などのＴＵＧ１を高発現する腫瘍を有する被験体においてＴＵＧ１の発現を抑制し、それによって該腫瘍の増殖を抑制することができる。

被験体は、動物であれば制限はないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、その他の哺乳動物、例えば動物園などで飼育されている哺乳動物であり、好ましい動物はヒトである。このような動物のなかでＴＵＧ１の遺伝子が高発現されている腫瘍をもつ被験体が本発明の対象動物である。

ＴＵＧ１は、上記動物のＴＵＧ１であり、例えば、ヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体（ｌｎｃＲＮＡ）として公知のＮＲ＿１１０４９２（配列番号１）、ＮＲ＿１１０４９３（配列番号２）又はＮＲ＿００２３２３（配列番号３）の塩基配列、或いは、これらの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントであるＴＵＧ１である。

本明細書中で使用される「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜５の整数をいう。また、配列同一性は、塩基配列等の配列アラインメントを得るための公知のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、を使用して決定されうる。

本発明においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ，又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ又はその前駆体ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。上記核酸の他の例は、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、又はその修飾核酸、或いは該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含むベクターである。

本発明における核酸は、ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する、かつ、腫瘍の増殖を抑制するかぎり核酸の種類や核酸の配列を特定のものに限定しないが、上記被験体のＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列内の領域、例えばヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である例えば配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２の領域（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、それぞれ、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５の領域（図２における＃５から＃４までを含む領域）を標的とすることが好ましい。

ＴＵＧ１に対しＲＮＡｉ作用を有するｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡは、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡである。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。突出末端は、ＲＩＳＣと相互作用する可能性が指摘されている（Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒａｐｐｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０ Ａｕｇ；３８（１４）：４７８８−４７９７）。

ＲＮＡｉ作用は、当業界で一般的に使用される意味を有しており、短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がその塩基配列特異的に標的転写体ＲＮＡを分解し、その遺伝子発現を抑制する現象である。

上記前駆体ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのｐｒｉＲＮＡ、ｐｒｅＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのいずれかである。ｐｒｉＲＮＡは、ＴＵＧ１遺伝子に対する転写体ＲＮＡ配列、例えば配列番号１、２又は３の塩基配列を有する。ｐｒｅＲＮＡは、ｐｒｉＲＮＡの酵素的プロセシングにより産生されるｐｒｅｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡの略称であり、ｐｒｅｓｈＲＮＡから酵素的に産生された、ｓｉＲＮＡと同じ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とのステム、ならびにヘアピンループからなる。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、この複合体はｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ転写体ＲＮＡに結合し、それを切断する。

本発明の核酸は、例えば、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである。

或いは、本発明の核酸は、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、上記ｓｉＲＮＡ又はその前駆体ＲＮＡ、或いはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡを含むベクターである。好ましい前駆体ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。

上記ベクターは、細胞内に導入されたとき上記ＤＮＡを発現可能にする調節配列を含む、例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、或いは、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ），酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、又はマウス人工染色体（ＭＡＣ））などの非ウイルスベクターのいずれかである。好ましいベクターは、安全性の面からプラスミド、センダイウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどである。プラスミドは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で使用可能であり、かつ安全性が証明されているプラスミドが好ましい。具体的には、プラスミドベクターとしては、例えば特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるようなベクター、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、ｐＴＤＴ１などの非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されないものとする。

上記調節配列は、プロモーター、転写開始点、ターミネーターなどを含み、必要に応じてエンハンサー、選択マーカー配列などを含むことができる。プロモーターは、特定の宿主細胞内で上記ＤＮＡの転写開始を促進するかぎり任意の内因性若しくは外因性プロモーターを使用できるが、例えばＵ６若しくはＨ１プロモーターであり、これにより、細胞内に導入後にベクターは恒常的に発現されるし、また、娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受け継がれる。

一般にＲＮＡは、生体内で、例えば血中等でリボヌクレアーゼにより分解されやすいためにかなり不安定である。これを解消するため、本発明では、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの修飾が行われる。修飾は、少なくとも１つの、好ましくは複数のヌクレオチドの修飾、例えば、塩基の修飾、糖の修飾、リン酸ジエステル部の修飾、又はそれらの組み合わせ、並びに／或いは、環状構造（二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）、ＤＮＡを含むキメラ構造などを含むことができる。修飾は、非限定的に以下のものが挙げられる。

ＲＮＡもＤＮＡもともに糖、塩基及びホスホジエステル結合からなるヌクレオチドの連鎖によって構成される核酸であり、それらの核酸の構造上の違いは、ヌクレオチド中の糖、すなわち、ＲＮＡの糖はリボースであり、一方ＤＮＡの糖は２'位の水酸基が水素で置換された２'−デオキシリボースであり、またさらなる違いは塩基、すなわち、ＲＮＡの塩基はアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から構成され、一方ＤＮＡの塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から構成されることにある。

バックボーンであるリン酸ジエステル部の修飾には、ホスホジエステル結合に代えて例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、又はホスホロアミデート結合とする修飾による置換が含まれる。

塩基及び糖の修飾には、特表２００７−５２５１９２号公報に例示されるような、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）シチジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ウリジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）グアノシンヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、ロックされた核酸ヌクレオチド（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）；例えば２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２−）修飾ヌクレオチド、２'−Ｏ，４'−Ｃエチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−）修飾ヌクレオチド、等）、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチドなどが挙げられる。また、２'−修飾ヌクレオチドについて、上記例示に加えて、例えば特表２０１０−５０７５７９号公報に記載されるような、糖の２'位を、例えば、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、アセトキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、アシル、カルボニルオキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、アリール、アルケニル、アルキニル、シアノ、ＯＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルキニル、Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキルアリール、アラルキル、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、又はＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）によって置換しうる。ここで、各Ｒ_ｍとＲ_ｎは、独立的に、Ｈ、アミノ保護基、又は置換若しくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキルである。

本発明の核酸のヌクレオチド配列の修飾位置は、腫瘍増殖を抑制する限り特に限定されないが、例えば該配列の５'末端の１〜４個のヌクレオチド及び／又は３'末端の１〜４個のヌクレオチドであり、さらにまた、ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡの場合にはアンチセンス鎖のみ修飾しても腫瘍増殖効果を得ることができる。

ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、今西武（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｉｍａｎｉｓｈｉ）らによって開発された人工核酸（Ｍ．Ａｂｄｕｒ Ｒａｈｍａｎ，Ｓａｙｏｒｉ Ｓｅｋｉ，Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｂｉｋａ，Ｈａｒｕｈｉｓａ Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋａｚｕｙｕｋｉ Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｔａｋｅｓｈｉ Ｉｍａｎｉｓｈｉ：「Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ２'，４'−ＢＮＡ：Ａ ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎａｌｏｇｕｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０．４８８６−４８９６（２００８）；Ｓａｔｏｓｈｉ Ｏｂｉｋａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３８（５０）：８７３５−８７３８（１９９７）；特許４７５５９７２（Ｓａｕｔａｒｉｓ Ｐｈａｒｍａ））であり、本発明のｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどの核酸の塩基配列中の糖部にＬＮＡ（「ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）」とも称する。）を導入したヌクレオチドは、著しくヌクレアーゼ耐性を有するものとなる。このような核酸は、各末端側に少なくとも２つ、好ましくは各末端側に３〜４つ、のＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む。ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ及びＬＮＡ修飾アンチセンスＤＮＡの例は、図３Ａに示すアンチセンス鎖塩基配列（配列番号２８〜３５）の修飾ＲＮＡであり、非限定的に、例えば配列番号３６〜３８、配列番号５１〜５３のようないずれかの塩基配列からなるＬＮＡ修飾ＲＮＡ、配列番号５６の塩基配列からなるＬＮＡ修飾ＤＮＡなどである。

本発明の核酸はまた、ｓｉＲＮＡの塩基配列中の一部にデオキシリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造を有することができる。デオキシリボヌクレオチド配列を含むことによってリボヌクレオチド配列のみと比べてよりヌクレアーゼ耐性とすることが可能になる（例えば特許３８０３３１８号公報）。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの塩基配列のアンチセンス鎖又はセンス鎖の全ヌクレオチド数あたり３０％以下、好ましくは２０％以下の割合で含むことができる。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方に含まれていてもよいし、或いはセンス鎖のみに含まれていてもよい。また、ｓｉＲＮＡの塩基配列中のデオキシリボヌクレオチドは３'側に存在することが好ましく、例えば３'末端に突出末端として２〜４つのデオキシリボヌクレオチドが連続する配列で存在してもよい。具体的には、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラは、センス鎖の塩基配列が配列番号２０〜２７の塩基配列であり、かつ、アンチセンス鎖の塩基配列がそれぞれ配列番号２８〜３５の塩基配列である二本鎖ＲＮＡである。

上記環状構造（すなわち、二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）を有する核酸は、いわゆるダンベル型の一本鎖ＲＮＡである。ステムは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の互いに相補的な配列から構成される。ループは、ステムの各末端部に連結された例えば１ループあたり非相補的な約２〜約１５ヌクレオチドから構成される（例えば米国特許第５，１６８，０５３号明細書、米国特許第５，１９０，９３１号明細書、米国特許第５，１３５，９１７号明細書、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃｌｕｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１、及び米国特許第５，０８７，６１７号明細書）。

上記核酸の他の例として、上記のアンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、又はその修飾核酸などを挙げることができる。

アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡは、ＴＵＧ１遺伝子の転写産物であるｌｎｃＲＮＡを標的とする一本鎖核酸である。該ｌｎｃＲＮＡを標的とする上記ｓｉＲＮＡはｌｎｃＲＮＡを分解するのに対し、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡは上記のｌｎｃＲＮＡ機能を抑制若しくは阻害する。生体内での安定性を高めるために、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造、及び／又は、１若しくは複数の上記の修飾ヌクレオチドを含む修飾誘導体が好ましい。修飾ヌクレオチドの具体例は上に記載したものであり、さらに好ましい例は、ホスホロチオエート修飾と、２’−ＭＯＥヌクレオチド、２’−ＯＭｅヌクレオチド又はＬＮＡ修飾ヌクレオチドとの組み合わせである。アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ又はその修飾誘導体の塩基長は、通常１２〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドである。塩基長として１００ヌクレオチドを超える長さとすることも可能であるが、特に製造コストの面で不利となるので、上記の範囲が適当である。アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡの配列は、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ｌｎｃＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡの塩基配列、例えば配列番号１、２又は３のヒトＴＵＧ１由来の配列、或いは、これらの各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上若しくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントであるＴＵＧ１の塩基配列から、上記サイズの連続する塩基配列を選択し、この配列に相補的な塩基配列又はその修飾塩基配列とすることができる。標的として、上記のとおり、ヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である例えば配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２の領域（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、それぞれ、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５の領域（図２における＃５から＃４までを含む領域）を標的とすることが好ましい。具体的には、各末端側に少なくとも２つ、好ましくは３〜４つ、のＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡの例は、図３Ａに示すアンチセンス鎖塩基配列（配列番号２８〜３５）を有するアンチセンスＲＮＡであり、非限定的に、例えば配列番号３６〜３８、５１〜５３のようないずれかの塩基配列を有するものである。さらに、この具体例において、アンチセンスＤＮＡは、上記アンチセンスＲＮＡの配列においてウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に変換した塩基配列を有するものである。

２．腫瘍の治療又は予防用ドラッグデリバリー製剤
本発明の製剤は、上記のＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する、それによって腫瘍の増殖を抑制する核酸を含むドラッグデリバリー製剤を特徴とする。本発明の製剤は、ブロックコポリマーによって形成されるミセル又はミセル様構造（「高分子ミセル」と称する。）を有する。以下に、ブロックコポリマー及び製剤について説明する。

＜ブロックコポリマー＞
本発明の製剤の構成成分の１つであるブロックコポリマーは、例えばＷＯ２０１３／１６２０４１、ＷＯ２０１２／０９６３９９などに記載される方法によって製造可能である。以下にブロックコポリマー及びその製法について説明する。

高分子ミセルを形成するブロックコポリマーは、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを含む。カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、疎水性を高めるために、好ましくは疎水性アミノ酸セグメント及び／又は疎水性側基を含むことができる。また、親水性ポリマー鎖セグメントとカチオン性ポリアミノ酸セグメントは、連結基を介して結合されていてもよい。ミセルは、親水性ポリマー鎖セグメントが外殻側に配向し、一方、カチオン性ポリアミノ酸セグメントが内殻側に配向する多分子ミセル構造（以下「ミセル型ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）」と称する。）を有するか、或いは、親水性ポリマー鎖セグメントがカチオン性ポリアミノ酸セグメントを包み込む若しくは、覆うような単分子ミセル様構造（以下「ユニット型ＰＩＣ」と称する。）を有する。より具体的には、当該ミセルは、粒子様構造を有して核酸を内包してもよいし、或いは、核酸がカチオン性ポリアミノ酸セグメントに静電的に結合して複合体を形成し、当該親水性ポリマー鎖セグメントが当該ポリアミノ酸セグメントを包み込む又は覆うような構造を有してもよく、いずれもナノ粒径のミセル若しくはミセル様構造を有するのが好ましい。

高分子ミセルでは、好ましくは、核酸がカチオン性ポリアミノ酸セグメントにより静電的に誘引されて該核酸が該ミセル内部に内包若しくは付着されており、ならびに、該ミセルは、腫瘍内の新生血管壁を透過して腫瘍に集積することができる、いわゆるＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を有する。

腫瘍の新生血管の周皮細胞は内皮細胞と弱く結合しており、また平滑筋細胞が極めて少ないか消失し、基底膜が薄いかほとんど欠落している。このため、腫瘍の新生血管内を通過するより大きいサイズの物質さえ漏洩しやすく、かつ透過しやすい血管構造になっていることが知られている。腫瘍の血管壁を透過することができる物質、例えば上記の高分子ミセルを形成するブロックコポリマー、の分子量範囲は、好ましくは約１０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約１５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、あるいは、物質の最大（直径）サイズは、好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２０ｎｍ〜約５０ｎｍである（Ｓ． Ａｚｚｉ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ． ２０１３；３：２１１． ｄｏｉ： １０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１３．００２１１;Ｆ． Ａｌｅｘｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００８； ５（４）：５０５−５１５）。このようなサイズであれば、該物質は腫瘍に集積することができる。また、腫瘍への集積率を高めるために、後述するように、腫瘍の新生血管の内皮細胞に特異的に結合するＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）ペプチド若しくはＮＧＲ（アスパラギン−グリシン−アルギニン）ペプチドを上記のブロックコポリマーに結合することができる（Ｒ．Ｊ． Ｂｏｏｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１２； １９（２２）： ３７９４−３８０４）。

本明細書において「静電的に誘引」とは、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの正電荷と核酸のリン酸イオンの負電荷が静電力によって引き合って核酸分子とポリマー分子が結合若しくは付着することを指す。

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、上記核酸の負電荷を相殺して上記ミセルを全体的に又は部分的に電気的に中性にする正電荷を有し、一方、該親水性ポリマー鎖セグメントは、該核酸を内包するか、又は、包み込む（若しくは、覆う）ことを可能にする鎖長を有する。

上記親水性ポリマー鎖セグメントと上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、分子の構成成分であり、各セグメントの構造的特性や配置については以下でさらに説明する。

親水性ポリマー鎖セグメントは、例えば、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの端部（片端又は両端）に配置され得る。また、該端部に代えて又は加えて、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの中間部分（好ましくは略中央部分）の側鎖にグラフトされてもよく、２つの隣接するカチオン性ポリアミノ酸セグメントの間に配置されてもよい。２つの隣接するカチオン性ポリアミノ酸セグメントの間に配置される場合、親水性ポリマー鎖セグメントは、これらカチオン性ポリアミノ酸セグメントの配列方向と交差する方向に伸びるように配置されてもよい。

上記ブロックコポリマーは、１若しくは複数の親水性ポリマー鎖セグメントを有する。１分子のブロックコポリマーあたり親水性ポリマー鎖セグメントを複数個有する場合、親水性ポリマー鎖セグメントは、分岐状のポリマー鎖からなってもよい。本発明の製剤の構成成分であるブロックコポリマーは、核酸を内包する若しくは覆うことができるので、酵素等による代謝又は分解を好適に回避し得る。その結果、血中滞留性に優れたミセル粒子が得られる。ブロックコポリマー中の親水性ポリマー鎖セグメントの数は、例えば、１〜４、好ましくは１〜２であり得る。

上記親水性ポリマー鎖セグメントは、任意の適切な親水性ポリマーによって構成され得る。該親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（オキサゾリン）、又はこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。ポリエチレングリコールは、例えばＣ１〜Ｃ６アルキル基などの基で末端修飾されたポリエチレングリコールであってもよく、さらにまた、カチオン性ポリアミノ酸セグメント又は連結基（「リンカー」ともいう）との結合のための、例えば、末端に種々の官能基を有するポリエチレングリコールが市販されており、また、ポリエチレングリコールとして種々の分子量のものや分岐型のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられる。

上記親水性ポリマー鎖セグメントの重量平均分子量は、１セグメントあたり、好ましくは１０，０００〜８０，０００、より好ましくは１０，０００〜６０，０００、例えば１０，０００〜４０，０００としうる。

ユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、上記親水性ポリマー鎖セグメントの長さは、高分子ミセルに含まれる核酸の鎖長に応じて、適切な長さに設定され、具体的には、親水性ポリマー鎖セグメントは、該核酸を包み込む若しくは覆うことができる長さに設定される。高分子ミセル中の少なくとも１つの親水性ポリマー鎖セグメントが、該高分子ミセルに含まれる核酸の長さ（もし複数の核酸が含まれる場合には、各核酸の長さの合計）以上の慣性半径（Ｒｇ）を有する場合、該核酸の全体が親水性ポリマー鎖セグメントに包み込まれているか、又は、覆われていると判断される。例えば、重量平均分子量が２１，０００又は４２，０００であるポリエチレングリコールの慣性半径（Ｒｇ）はそれぞれ、約６．５ｎｍ又は約９．７ｎｍであるので、これらは単独でｓｉＲＮＡ（長さ：約５．７ｎｍ）を覆うことができると判断される。また、核酸の一方の末端側に回転中心（例えば、ポリアミノ酸セグメントとの連結部位）を有するように配置された親水性ポリマー鎖セグメントと他方の末端側に回転中心を有するように配置された親水性ポリマー鎖セグメントとを含む高分子ミセルについては、該核酸の両端の親水性ポリマー鎖セグメントの慣性半径（Ｒｇ）の合計が該高分子ミセル粒子に含まれる核酸の長さ以上であれば、該核酸の全体が親水性ポリマー鎖セグメントに包み込まれているか、又は、覆われていると判断できる。このような高分子ミセルにおいては、各親水性ポリマー鎖セグメントが、好ましくは核酸の長さの半分以上の慣性半径（Ｒｇ）を有し、より好ましくは核酸の長さ以上、さらに好ましくは核酸の長さの１．２倍以上、さらにより好ましくは１．３倍以上の慣性半径（Ｒｇ）を有する。親水性ポリマー鎖セグメントの長さの上限は、立体障害等の影響を受け難く、高分子ミセルの形成に有利である限り限定されないが、例えば、その慣性半径（Ｒｇ）が高分子ミセル粒子に含まれる核酸の長さの例えば２．５倍以下、好ましくは１．６倍以下となる長さとしてもよい。

本発明の製剤で使用されうるブロックコポリマーでは、親水性ポリマー鎖セグメントの末端に、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む環状ペプチド（「ｃＲＧＤ」という）、例えばアルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン−リジン配列からなる環状ペプチド（ＷＯ２０１２／０９６３９９）を結合させることができる。ｃＲＧＤは、ミセルを癌細胞に接着若しくは結合させるためのリガンドとなりうる。同様に、後述するように、ＮＧＲペプチドもまた、上記のリガンドとして使用することができる。

上記ブロックコポリマーにおいて、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとは、任意の適切な連結基によって連結されてもよい。該連結基としては、例えば、エステル結合、アミド結合、イミノ基、炭素−炭素結合、エーテル結合、等が挙げられる。また、これらのセグメントは、生体内で開裂可能な連結基（例えば、ジスフィルド結合、ヒドラゾン結合、マレアメート結合、又はアセタール基）によって連結されていてもよい。なお、上記ブロックコポリマーのカチオン性ポリアミノ酸側末端及び／又は親水性ポリマー鎖側末端には、本発明の効果に悪影響を及ぼさない限り、任意の適切な修飾がなさてもよい。

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成するアミノ酸としては、側鎖にカチオン性基（例えば、アミノ基、グアニジル基、イミダゾイル基など）を有する任意の適切なカチオン性アミノ酸が用いられ得る。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸が挙げられる。或いは、カチオン性ポリアミノ酸セグメントの疎水性を高めるために、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、プロリンなど）とカチオン性アミノ酸とを含んでもよい。
カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、例えばポリリジンを含む。

ユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、核酸の負電荷はリン酸基に由来し核酸は負の電荷を１ずつ（電荷量＝−１）略等間隔で有するので、核酸中の各リン酸基と好適に静電結合を形成する観点から、側鎖にカチオン性基を１つ有するアミノ酸、より具体的には血中ｐＨにおいて側鎖に正電荷を１つ有するアミノ酸が好ましく用いられ得る。

上記カチオン性ポリアミノ酸セグメントにおいては、主鎖から側鎖上のカチオン性基までの距離が短いことが好ましい。具体的には、カチオン性基が好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個の原子を介して主鎖に結合していることが好ましい。

ミセル型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、好ましくは高分子ミセルに含まれる核酸の負電荷に対しておよそ等量、およそ半量、およそ１／４量、又はおよそ１／８量の正電荷を有することができる。カチオン性ポリアミノ酸セグメントがこのような電荷量を有することにより、ブロックコポリマーの含有数が異なる（例えば、１個、２個、４個、又は８個）種々の高分子ミセルを得ることができる。また、カチオン性ポリアミノ酸セグメントが含むアミノ酸残基数は、該セグメントに所望される電荷量に応じて適切に設定され得る。カチオン性ポリアミノ酸セグメントは、本発明の効果を損なわない範囲において、非カチオン性アミノ酸残基を含んでいてもよい。非カチオン性アミノ酸残基の数は、カチオン性ポリアミノ酸セグメントが含むアミノ酸残基の総数の、例えば２０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下とすることができる。

ユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの例は、非限定的に、以下の式（１）又は（２）で表され得る。ここで式（１）又は（２）において、親水性ポリマー鎖セグメントであるポリエチレングリコール鎖の数は、２個の例を示しているが、１個でもよい。

各式中、Ｒ^１ａ〜Ｒ^１ｄは、互いに独立して、水素原子、又は未置換若しくは置換された炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル基であり、
Ｒ^２は、水素原子、炭素数１〜１２の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルキル基、或いは炭素数１〜２４の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルキルカルボニル基であり、
Ｒ^３は、ヒドロキシル基、炭素数１〜１２の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルキルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルケニルオキシ基、炭素数２〜１２の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルキニルオキシ基、或いは炭素数１〜１２の未置換若しくは置換された直鎖又は分枝状のアルキル置換イミノ基であり、
Ｒ^４ａ及びＲ^４ｂは、互いに独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ^５ａ及びＲ^５ｂは、互いに独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−[ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｑ１−]_ｒ１ＮＨ_２ （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ２−Ｎ[−（ＣＨ_２）_ｑ２−ＮＨ_２]_２ （ii）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ３−Ｎ｛[−（ＣＨ_２）_ｑ３−ＮＨ_２][−（ＣＨ_２）_ｑ４−ＮＨ−]_ｒ２Ｈ｝ （iii）；及び
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ_２）_ｑ５−Ｎ[−（ＣＨ_２）_ｑ６−ＮＨ_２]_２｝_２ （iv）
よりなる群の同一若しくは異なる基から選ばれるか、或いは、
Ｒ^５ａ及びＲ^５ｂは、互いに独立して、−Ｏ−又はＮＨ−に結合された、水素原子、フェニル基、ベンジル基、−（ＣＨ_２）_４−フェニル基、未置換の又はアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ４〜Ｃ１６アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基であり、
ここで、ｐ１〜ｐ４、ｑ１〜ｑ６、及びｒ１〜ｒ２は、それぞれ互いに独立して、１〜５の整数であり、
Ｑは、−ＮＨ_２、又は−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２であり、
Ｌは、二価の連結基又は原子価結合であり、
ｘ１〜ｘ４は、互いに独立して、例えば１１０〜２，０００の整数であり、
ｙ、ｚ、及びｖは、互いに独立して、例えば０〜６０の整数であり、ただし、５≦ｙ＋ｚ＋ｖ≦６０の関係を満たし、
ｗは、例えば１〜６の整数であり、
ｌ及びｍは、互いに独立して、例えば０〜５の整数であり、
ｎは、例えば０又は１である。

上記式（１）又は（２）において、Ｌは、二価の連結基又は原子価結合である。二価の連結基としては、任意の適切な連結基が採用され得る。例えば、式（１）において、Ｌは、−Ｌ^１−Ｌ^２−Ｌ^３−であり得るし、式（２）において、Ｌは、−Ｌ^４−Ｌ^５−Ｌ^６−であり得る。ここで、Ｌ^１及びＬ^４は、互いに独立して、−（Ｏ−（ＣＨ_２）_ａ）_ｂ−Ｌ^１ａ−であり、ここでａは例えば１〜５の整数であり、ｂは例えば０〜３００の整数であり、ｂが２以上のときａはすべて同一である必要はなく、Ｌ^１ａは原子価結合、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−、−ＯＣＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＯＯ−であり；Ｌ^２及びＬ^５は、互いに独立して、原子価結合又は−Ｌ^２ａ−Ｌ^２ｂ−Ｌ^２ｃ−であり、ここでＬ^２ａ及びＬ^２ｃはスペーサーとなる構造であり、特に限定されないが、例えば置換又は未置換の炭素数１〜１２のアルキル基であり、Ｌ^２ｂは、例えば下記式（３）〜（５）に示す構造のいずれかであり；Ｌ^３は、−（（ＣＨ_２）_ｃ−Ｏ）_ｄ−（ＣＨ_２）_ｅ−Ｌ^３ａ−であり、ここでｃは例えば１〜５、ｄは例えば０〜５００、ｅは例えば０〜５の整数であり、ｄが２以上のときｃはすべて同一である必要はなく、Ｌ^３ａは−ＮＨ−又は−Ｏ−であり；Ｌ^６は、−（（ＣＨ_２）_ｆ−Ｏ）_ｇ−（ＣＨ_２）_ｈ−Ｌ^６ａ−（ＣＨ_２）_ｉ−ＣＯ−であり、ここでｆは例えば１〜５、ｇは例えば０〜３００、ｈは例えば０〜５、ｉは例えば０〜５の整数であり、ｇが２以上のときｆはすべて同一である必要はなく、Ｌ^６ａは−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、又は−ＣＯＯ−である。

上記Ｒ^１ａ〜Ｒ^１ｄ、Ｒ^２、又はＲ^３の基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキルオキシ基、アルキル置換イミノ基、及びアルキル基のアルキル部分としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、及びウンデシル基、等を挙げることができる。炭素数２〜１２の直鎖又は分枝状のアルケニルオキシ基又は炭素数２〜１２の直鎖又は分枝状のアルキニルオキシ基における、アルケニル又はアルキニル部分は、炭素数が２以上の上で例示したアルキル基中に二重結合又は三重結合を含むものを挙げることができる。

このような基又は部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ_１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ_１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ_２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ_１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、又はアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素又はフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。

Ｒ^５ａ及びＲ^５ｂの基について定義する、
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ１−[ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｑ１−]_ｒ１ＮＨ_２ （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ２−Ｎ[−（ＣＨ_２）_ｑ２−ＮＨ_２]_２ （ii）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ３−Ｎ｛[−（ＣＨ_２）_ｑ３−ＮＨ_２][−（ＣＨ_２）_ｑ４−ＮＨ−]_ｒ２Ｈ｝ （iii）；及び
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ_２）_ｑ５−Ｎ[−（ＣＨ_２）_ｑ６−ＮＨ_２]_２｝_２ （iv）
よりなる群から選ばれる基は、同一の基であることが好ましく、式（ｉ）の基であることがさらに好ましい。また、ｐ１〜ｐ４及びｑ１〜ｑ６は、それぞれ互いに独立して例えば２又は３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１及びｒ２は、それぞれ互いに独立して、例えば１〜３の整数であることが好ましい。Ｒ^５ａ及びＲ^５ｂの基は、属する繰り返し単位全てについて同一の基が選択されてもよく、各々の繰り返し単位について異なる基が選択されてもよい。

Ｑは、属する繰り返し単位全てについて同一の基が選択されてもよく、各々の繰り返し単位について異なる基が選択されてもよい。また、ｗは、例えば、１、２、３、又は４である。

エチレングリコールの繰り返し数を表すｘ１〜ｘ４は、所望の高分子ミセルに含まれる核酸の長さに応じて適切に設定され得る値である。例えば、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡを１つ含む高分子ミセル粒子を形成する場合、ｘ１〜ｘ４は、互いに独立して、下限が、非限定的に例えば１００〜２５０であり、上限が、非限定的に例えば９００〜１２００である。

ｙ、ｚ及びｖはそれぞれ、所望の高分子ミセルに含まれる核酸の負の電荷量及びブロックコポリマーの数に応じて適切に設定され得る値である。例えば、２１塩基対の二本鎖ＲＮＡ１つとブロックコポリマー２つを含むユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーを形成する場合、ｙ、ｚ、及びｖは、カチオン性ポリアミノ酸セグメント中のカチオン性基の数が、非限定的に、好ましくは１８〜２２、より好ましくは１９〜２１、さらに好ましくは１９〜２０の整数となるように設定され得る。このように、本発明のドラッグデリバリー製剤は、２つのブロックコポリマーによって構成され、それぞれのブロックコポリマーにおけるカチオン性ポリアミノ酸セグメントが、例えば１８〜２２個のカチオン性アミノ酸残基を含む状態にあってよい。

ｎは、ユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、例えば０又は１であり、好ましくは１である。２本のポリエチレングリコール鎖を有するブロックコポリマーによれば、血中滞留性が顕著に優れた高分子ミセルが得られ得る。

式（１）又は（２）において、カチオン性ポリアミノ酸セグメントを構成する各繰り返し単位の結合順は任意であり、ランダム構造であってもよく、ブロック構造であってもよい。

ミセル型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの例を以下に記載する（式（６）及び式（７））。

各式中、Ｒ^１およびＲ^２は、相互に独立して、水素原子また置換されていてもよい、例えば炭素数１〜１２の直鎖若しくは分岐状のアルキル基であり、Ａは親水性ポリマー鎖、Ｌ^１およびＬ^３は連結基であり、Ｂはカチオン含有基であり、Ｒ^３は任意のアミノ酸の側鎖を表し、ｚは、例えば５〜５００の整数を表し、ｘは、例えばｚの４０％以上の整数を表し、ｙは整数を表し０若しくは１以上であり、ｚ−ｘ−ｙは整数を表し０若しくは１以上であり、ただしｘとｙとｚ−ｘ−ｙの合計がｚとなるようにｘとｙが定まり、ｐは、例えば１〜１０の整数を表し、ｑは、例えば１〜１０の整数を表すが、ｘ、ｙ、ｚ、ｐ及びｑは、上記の範囲に限定されないものとする。

上記親水性ポリマー鎖における親水性ポリマーの繰り返し数は、非限定的ではあるが、好ましくは３０〜２，０００の整数、より好ましくは４０〜１，５００の整数、さらに好ましくは５０〜１，０００の整数であり得る。

ｚは、上記の説明から明らかなように、ポリアミノ酸セグメントの繰り返し数を表す。ｚは、非限定的に、例えば５〜５００の範囲にある整数であり、当該範囲の下限は、非限定的に、例えば１０〜２０であってよく、当該範囲の上限は、非限定的に、例えば１００〜２００であってよい。

Ｂは、カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントのカチオン含有基を表す。該カチオン含有基はカチオンを含む、若しくはカチオン形成可能である、任意の適切な基であり、例えば、アミノ基若しくはアンモニウムカチオンを含有する基が挙げられる。カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントを含むことにより、ブロックコポリマーは、生理的条件下で、薬物として用いられる核酸と複合体（ＰＩＣ）を形成し得る。具体例として、アミジン基と、ジエチレントリアミンに由来する、下記（ｉ）〜（ｉｖ）よりなる群から選ばれる基が挙げられる。
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ３−〔ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｑ３−〕_ｒ１ＮＨ_２ （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ４−Ｎ〔−（ＣＨ_２）_ｑ４−ＮＨ_２〕_２ （ii）；
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ５−Ｎ｛〔−（ＣＨ_２）_ｑ５−ＮＨ_２〕〔−（ＣＨ_２）_ｑ６−ＮＨ−〕_ｒ２Ｈ｝ （iii）；および
−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｐ６−Ｎ｛−（ＣＨ_２）_ｑ７−Ｎ〔−（ＣＨ_２）_ｑ８−ＮＨ_２〕_２｝_２ （iv）
好ましくは（ｉ）で表わされる基を用いることができる。ｐ３〜ｐ６及びｑ３〜ｑ８は、例えば、それぞれ相互に独立して２又は３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１およびｒ２は、例えば、それぞれ相互に独立して、１〜３の整数であることが好ましい。

上記カチオン含有基を有するアミノ酸セグメントは、側鎖の末端、すなわち、上記カチオン含有基の末端にチオール基（−ＳＨ基）を有していてもよい。チオール基は互いに反応することにより、ジスルフィド結合による架橋反応を形成し得る。

具体的には、標的結合部位を有するブロックコポリマーは、例えば、下記式（８）または（９）で表わされる：

式中、Ａ、Ｒ^２、Ｌ^１、Ｌ^３は上記式（６）および（７）と同じであり、Ｚは上記式（６）および（７）のポリアミノ酸セグメントを表し、ｌは、非限定的に、例えば１〜５の整数を表し、Ｄは標的結合部位を表す）。

上記ブロックコポリマーが有する標的結合部位（式（８）及び（９）中のＤ）は、好ましく分子量が、非限定的に、例えば２００〜２０，０００Ｄａのペプチドであり、より好ましくは分子量が３００〜１０，０００Ｄａのペプチドであり、さらに好ましくは分子量が５００〜３，０００Ｄａのペプチドである。

また、Ｄは、非限定的に、例えば２〜２００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることが好ましく、１〜１００個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがより好ましく、３〜３０個のアミノ酸残基を有するペプチドであることがさらに好ましい。

上記ペプチドとしては、例えば、血管新生や内膜肥厚、悪性腫瘍の増殖に関与するインテグリンと特異的に結合することができるペプチドが挙げられ、具体的には、ＲＧＤペプチドおよびＮＧＲペプチドが例示される。ここで、ＲＧＤペプチドとは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含むペプチドをいう、またＮＧＲペプチドとは、アスパラギン−グリシン−アルギニン（ＮＧＲ）配列を含むペプチドをいう。これらのペプチドは、腫瘍の新生血管内皮細胞に結合することができるため、本発明におけるブロックコポリマーは腫瘍細胞に特異的に集積することができる。ＲＧＤペプチドは、好ましくは、環状ＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチドである。上のいずれかの式で表わされるブロックコポリマーに含まれるｃＲＧＤペプチドとしては、具体的には下記式（１０）で表わされるペプチドが挙げられる。

また、ＮＧＲペプチドは、好ましくは、環状ペプチドであり、例えばＮＧＲ配列のＮ末側にＫ、Ｃ末側にＥを含む、又はＮＧＲ配列のＮ末側及びＣ末側にともにＣを含む環状化した配列を含むペプチドである（Ａ．Ｈ． Ｎｅｇｕｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１０； １４３（２）：２６５−２７３； Ｔ．Ｒ． Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ ２０１２； ２４：３８０３−３８２２）。

上記ブロックコポリマーは、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、必要に応じ保護基が導入された所定のアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を、ω末端がアミノ化された親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の末端アミノ基を開始剤として順次重合し、次いで脱保護又は側鎖変換によってポリカチオンセグメントに変換してもよく、まず必要に応じ保護基が導入されたポリアミノ酸を合成し、次いで親水性ポリマーと結合させてから必要に応じ脱保護又は側鎖変換によってポリカチオンセグメントを有するブロックコポリマーを合成するのでもよい。ポリアミノ酸と親水性ポリマーを結合させる方法としては種々の方法が用いられるが、それぞれの末端に反応性の官能基を導入しておきカップリングさせる方法が代表的なものである。例えば、カルボキシル基とアミノ基とを縮合剤を用いて又は活性エステル化して結合させる方法、マレイミドとチオールによる方法、アルキンとアジドによる所謂クリックケミストリーによる方法等が挙げられる。

＜ドラッグデリバリー製剤＞
本発明のドラッグデリバリー製剤は、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療する又は腫瘍転移から予防するための抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤であって、該ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を有する高分子ミセルを有効成分として含み、該高分子ミセル粒子が、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーと、該核酸とを含み、該核酸が該カチオン性ポリアミノ酸セグメントのカチオン性基と結合して複合体を形成する、及び／又は、該核酸が該ミセル内部に内包されるか又は静電的に結合（若しくは付着）されており、ならびに、該高分子ミセルが、腫瘍に集積することを特徴とする。

本発明のドラッグデリバリー製剤は、例えば、必要により緩衝化された水溶液中で上記ブロックコポリマーと上記核酸とを、１を超えるＮ／Ｐ比となるように混合することによって得ることができる。ミセル型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、１以上のＮ／Ｐ比は、非限定的に、例えば、好ましくは１．０〜２．５、より好ましくは１．１〜２．０、さらに好ましくは１．２〜１．６となるように混合することによって得ることができる。このようなＮ／Ｐ比とすることにより、遊離の核酸又はブロックコポリマーが減少し、ブロックコポリマーと核酸を高い含有率で含む製剤を得ることができる。また、ユニット型ＰＩＣ調製用のブロックコポリマーの場合、１を超えるＮ／Ｐ比により、例えば核酸と静電結合していないブロックコポリマー（遊離のブロックコポリマー）を一定量含む製剤などでは、遊離のブロックコポリマーによる遊離核酸の再捕捉作用と、対象の腫瘍細胞に送達された製剤からの円滑な核酸リリースとを高次にバランスさせることができるため、核酸の血中滞留性の向上と抗腫瘍効果をより顕著に両立できる。ここで、Ｎ／Ｐ比とは、［ブロックコポリマー中のカチオン性基の総数（Ｎ）］／［核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）］を意味する。

別の実施形態において、本発明の製剤であるユニット型ＰＩＣは、必要により緩衝化された水溶液中で上記ブロックコポリマーと核酸とを例えば２．５より大きいＮ／Ｐ比となるように、好ましくは３以上、４以上、５以上、さらに好ましくは１０以上のＮ／Ｐ比となるように混合することによっても得ることができる。このようにＮ／Ｐ比を大きくすることにより、製剤に含まれる核酸の血中安定性を大幅に向上することができる。Ｎ／Ｐ比の上限は、非限定的に、例えば２０〜５０である。

上記の緩衝化された水溶液は、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３〜７．４）、トリス緩衝液（ｐＨ７．４）などであり得る。

本発明の製剤は、腫瘍内の新生血管を透過し腫瘍内に集積する。このことは、図１６のグリオーマ（脳腫瘍幹細胞）への核酸薬剤の集積によって実証される。ミセル型ＰＩＣの場合、ミセルの粒径は、非限定的に、例えば約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲内であることが好ましく、また、ユニット型ＰＩＣの場合、非限定的に、例えば約１０ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲内であることが好ましい。

本発明の製剤は、上記ブロックコポリマーと上記核酸（医薬有効成分）を緩衝化された水溶液のなかで混合することによって上記のナノサイズを有する粒子様構造に形成される。

本発明の製剤は、好ましくは血中投与により腫瘍組織に特異的に集積する性質をもつため、副作用が顕著に低い。

上記核酸の用量は、非限定的に、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子又はアンチセンス核酸分子に換算して例えば約０．０００１ｍｇ〜約１，０００ｍｇであるが、一般に用量又は投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるべきである。また、投与は、例えば１週間、２週間、３週間、又は４週間間隔、或いは、必要であれば１か月を超える間隔で行うことができる。

製剤化において、核酸有効成分の他に、担体又は希釈剤、並びに添加剤を混合して医薬組成物の形態としうる。必要に応じて、該医薬組成物と、他の抗癌剤（例えば化学療法剤、抗体医薬、免疫チェックポイント阻害剤、等）及び／又は他の治療関連薬剤とを組み合わせることもできる。

剤型として、注射剤、点滴剤などの非経口投与剤が好ましい。
担体又は希釈剤は、水性溶媒、例えば、蒸留水、滅菌水、リンゲル液、生理食塩水、緩衝液などである。
添加剤は、製薬上許容されうる、例えば、増量剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、などである。
投与経路は、上記のとおり、例えば、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与などである。

本発明のドラッグデリバリー製剤は、腫瘍組織内に移行したのち、凝集体から離散した有効成分である核酸がブロックコポリマーと一緒にエンドサイトーシスを介して細胞質内に取り込まれると考えられる。

本発明はさらに、抗癌剤としての上記製剤を被験体に投与することを含む、脳腫瘍、膵臓癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病（特に、骨髄性白血病）又はリンパ腫などのＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療するための方法を提供する。

後述の実施例によって実証されるように、例えば脳腫瘍での上記核酸の使用により優れた細胞増殖抑制効果が確認されたことから、本発明の製剤は、腫瘍幹細胞を標的とする抗癌剤としても優れたものである。
組成物、被験体、投与量、投与経路、投与回数などは、上で記載したとおりである。

本発明の製剤は、化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の抗癌治療剤の投与と組み合わせて被験体に投与することができる。該製剤の投与は、癌治療用の化学療法剤や医薬抗体の投与の前に、同時に、又は後に行うことができる。また、本発明の製剤中には、上記核酸の他に、癌治療用の化学療法剤及び／又は医薬抗体を含有させることができる。

化学療法剤の例は、非限定的に、特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるような抗癌剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、マイトキサントロン、等）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン、等）、ＤＮＡ鎖切断誘発剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、等）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、等）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、フロックスウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン、等）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポフィロトキシン、テモゾロマイドなどである。

医薬抗体の例は、非限定的に、トラスツズマブ、ベバシズマブ、パニツブマブ、ラムシルマブなどの抗癌作用をもつ市販抗体及び開発（臨床試験）・上市される抗体である。

免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞が免疫細胞からの攻撃を回避することを抑制することによって癌細胞に対する免疫細胞の本来の攻撃力を回復するための薬剤であり、例えば抗ＰＤ−１抗体や抗ＰＤ−Ｌ１抗体、あるいはそれらと同等の機能を有する薬剤が含まれる。

化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の抗癌治療剤の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるか、或いは、臨床現場で実際に使用される範囲の用量である。

＜治療又は予防方法＞
本発明はさらに、上記のドラッグデリバリー製剤を、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体に投与することを含む、該被験体において該腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。

ドラッグデリバリー製剤、用量、投与法、他の抗癌治療剤との併用投与、ヒトを含む被験体、腫瘍若しくは癌などについては、上で記載したとおりである。また治療による効果は、被験体において腫瘍若しくは癌の増殖抑制又は退縮、及び/又は、転移の抑制を達成することあり、一方、予防は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法などの抗癌治療を受けた被験体において腫瘍若しくは癌の転移から予防する、すなわち腫瘍若しくは癌の再発を予防することである。

本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。

[実施例１]
＜各種腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベル＞
種々の腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。使用した腫瘍細胞株は、グリオーマ幹細胞株（ＧＳＣ）、グリオーマ細胞株（Ｔ９８，Ｕ２５１，ＳＫ−ＭＧ１及びＡＯ２）、乳癌細胞株（ＭＣＦ７，ＭＤＡ２３１，ＳＫ−ＢＲ３及びＴ４７Ｄ）、大腸癌細胞株（Ｌｏｖｏ，Ｃａｃｏ−２，ＲＫＯ，ＳＷ４８、ＳＷ４８０及びＳＷ１０８３）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３，ＬＮＣａｐ及びＶｃａｐ）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２，Ｈｕｈ７及びＡ５４９）、肺癌細胞株（Ｈ９２０及びＰＣ９）、白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、バーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）、並びに、リンパ腫細胞株（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）である。

結果を、内部標準ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に対するＴＵＧ１の相対発現比率で表し図１に示した。正常組織におけるＴＵＧ１の発現レベル（ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ＝０．０５３９４（正常脳組織３症例の平均値））と比較すると、ＴＵＧ１遺伝子の発現レベルは、多くの腫瘍細胞株で高いことがわかる。

[実施例２]
＜ｓｉＲＮＡによるＴＵＧ１の標的配列の位置と抑制効果＞
ＴＵＧ１発現を抑制する核酸（ｓｉＲＮＡ）を設計するために、ＴＵＧ１ ｌｎｃＲＮＡの塩基配列（ＮＲ＿１１０４９２（配列番号１）、ＮＲ＿１１０４９３（配列番号２）及びＮＲ＿００２３２３（配列番号３）の全体から標的配列領域の候補を選抜し（Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）、ｓｉＤｉｒｅｃｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／））、その領域に対するｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４（（注）これらの各配列には３'末端に２つのデオキシリボヌクレオチド配列が含まれている。））を北海道システムサイエンス社（札幌、日本）に依頼し作製した（図３）。

各種ｓｉＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（１．０×１０^５細胞）へ終濃度３０ｎＭとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロジーズ社）を用いて添付プロトコールに従いそれぞれ導入した。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）はＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＃１ ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３）を用いた。ｓｉＲＮＡ導入３日後にＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準とし、コントロールｓｉＲＮＡに対するＴＵＧ１の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ社）にて定量した結果、８種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８）に対して有意のＴＵＧ１発現抑制効果を確認した（図２及び図４）。一方、ｓｉ−ＴＵＧ１＃９〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４については、十分なＴＵＧ１発現抑制効果が見られなかった。

さらにまた、上記の結果に基づいて、ＴＵＧ１標的領域として、配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２の領域（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５の領域（図２における＃５から＃４までを含む領域）を標的とすることが好ましいと認められた。

[実施例３]
＜ＧＳＣ腫瘍増殖抑制＞
実施例２で作製されＴＵＧ１発現抑制効果が認められた８種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８）の各々を、実施例２に記載したとおりＧＳＣ腫瘍細胞内にリポフェクション法を用いて導入し、各ｓｉＲＮＡの導入３日後にトリパンブルー染色（ライフテクノロジーズ社）を用いて生存細胞数を測定し、コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する抗増殖効果を解析した結果、解析に用いた８種類のｓｉＲＮＡについて有意な抗増殖効果が認められた（図５）。

[実施例４]
＜ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡによるＧＳＣ腫瘍増殖抑制＞
実施例２及び実施例３でＴＵＧ１の発現を最も効果的に抑制したｓｉ−ＴＵＧ１＃２のアンチセンス鎖配列（（注）ＴＵＧ１のｌｎｃＲＮＡ配列部分と相補的な配列である。）に対してＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２−）核酸ヌクレオチド）修飾を行い３種類のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）；図６）をジーンデザイン社に依頼し作製し、ＴＵＧ１発現抑制効果を調べた。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２、及び上記のＬＮＡ修飾アンチセンスの各々をグリオーマ幹細胞株ＧＳＣへリポフェクション法により導入し、導入後３、７、１０日後にＲＮＡを回収しＴＵＧ１発現量の変化を継時的に定量した。

その結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることにより、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２と比較しＴＵＧ１の発現抑制効果をより長期間保持できることが分かった（図７）。

さらに各ｓｉＲＮＡ、各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡの導入１０日後におけるＧＳＣの相対生存細胞数を測定した結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡについてのみ有意な抗増殖効果が認められた（図８）。

同様に、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６のアンチセンス鎖配列（（注）ＴＵＧ１のｌｎｃＲＮＡ配列部分と相補的な配列である。）に対してＬＮＡ修飾を行い３種類のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）；図９）をジーンデザイン社に依頼し作製し、ＴＵＧ１発現抑制効果を調べた。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６、及び上記のＬＮＡ修飾アンチセンスの各々をグリオーマ幹細胞株ＧＳＣへリポフェクション法により導入し、導入後３、７、１０日後にＲＮＡを回収しＴＵＧ１発現量の変化を継時的に定量した。

その結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることにより、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６と比較しＴＵＧ１の発現抑制効果をより長期間保持できることが分かった（図１０）。

さらに各ｓｉＲＮＡ、各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡの導入１０日後におけるＧＳＣの相対生存細胞数を測定した結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡに対してより有意な抗増殖効果が認められ、とりわけＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）とＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）は優れた抗増殖効果が認められた（図１１）。

[実施例５]
＜前立腺癌増殖抑制＞
実施例２及び実施例３と同様の手順により前立腺癌細胞株ＰＣ３にｓｉ−ＴＵＧ１＃２をリポフェクション法にて導入した。導入３日後の前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＴＵＧ１発現レベルとＰＣ３株の相対細胞増殖率を上記実施例と同様に測定した。陰性対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を使用し、また、発現レベルは、同様に、内部標準ＧＡＰＤＨに対するＴＵＧ１の相対発現比率で表した。
その結果、ＴＵＧ１阻害による前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖抑制効果が認められた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。

[実施例６]
＜ＧＳＣ腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖抑制＞
グリオーマ幹細胞株ＧＳＣを皮下に移植したヌードマウスに、腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３となった時点を０日目とし、この時点から３日毎にＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）を各腫瘍に対して５μｇずつ直接投与し、３５日目まで腫瘍サイズを測定した。対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を同様にマウスに投与した。
その結果、図１３に示すように、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１によるＧＳＣ増殖抑制効果が認められた。

[実施例７]
＜ｉｎ ｖｉｖｏでのユニット型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤による脳腫瘍増殖抑制＞
本実施例では、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤を作製し、脳腫瘍同所移植マウスに静脈内投与することにより、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーの腫瘍組織への特異的な集積及び個体レベルにおける抗腫瘍効果を解析した。

（１）ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有させるためのブロックコポリマーの作製
ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有させるためのブロックコポリマーは、ｔｗｏ−ａｒｍｅｄ α−ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｂｌｏｃｋ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）（（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓ）であり、ＷＯ２０１３／１６２０４１に記載の方法に従い以下のように作製した。

イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、製品名「ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０」）で精製した下記式（１１）：

（式中、ｘ１及びｘ２は、約８００〜１，０００である。）
に示す２本鎖型のポリ（エチレングリコール）誘導体(日油社製、製品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＧＬ２-８００ＰＡ」、平均分子量＝７４，０００Ｄａ（３７，０００Ｄａ×２)２．００ｇと、チオ尿素２．５１ｇとをナスフラスコに量り取り、アルゴン置換の後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌを加えた。該混合物を加熱して溶解させ、さらに２時間撹拌した。Ｎε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リジン・Ｎ−カルボン酸無水物（Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ）０．２０ｇ（２８当量相当）をアルゴン下でナスフラスコに量り取り、ＤＭＦ３ｍｌに溶解した。得られた溶液を上記２本鎖型の（ＰＥＧ）_２が入ったナスフラスコにシリンジで加えた。アルゴン下２５℃の水浴中で撹拌しながら２日間反応させた。ＩＲでＮＣＡ特有の吸収ピークの消失を確認した後、メタノール１７ｍｌを加えた。得られた溶液を５００ｍｌの冷ジエチルエーテル中に撹拌しながら注ぎ、再沈殿させた。上清を取り除き、メタノール５０ｍｌを加え加熱して再溶解させた後、冷ジエチルエーテルを注ぎ込み再沈殿させることをさらに２回繰り返した。沈殿をフィルターでろ過し、真空乾燥して（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）の白色粉末を１．９５ｇ得た。１．００ｇの（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）をメタノール１００ｍｌに溶解した。得られた溶液に１ＮのＮａＯＨ水溶液１０ｍｌを加え３５℃の水浴中で撹拌しながら１７時間反応させた。反応液を透析チューブ（ＭＷＣＯ＝６，０００〜８，０００）に入れ、０．０１Ｎ塩酸を外液として６回、純水を外液として４回透析を行った。チューブ内液を凍結乾燥することにより、（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓ（塩酸塩）の白色粉末を０．８５ｇ得た。

^１Ｈ−ＮＭＲにより、（ＰＥＧ）_２の分子量７４，０００を規準としてＰＬｙｓの重合度は２０と決定された。また、ＧＰＣにより、単峰性でＬｙｓのホモポリマーをほとんど含まないブロックコポリマー：（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓ（重合度はそれぞれ、ＰＥＧについて２１×２、ＰＬｙｓについて２０であった。）が得られたことが確認された。

合成された（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓの構造は、以下のとおりである（式（１２））。

上記と同様の方法によって、ＰＥＧの種類及び／又はポリリジンの重合度が異なる種々のブロックコポリマーを得ることができる。

（２）ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するユニット型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤の作製
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）中で、上記（１）で作製した（ＰＥＧ）_２−ＰＬｙｓとＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１））をＮ／Ｐ比２０となるように室温で緩やかに撹拌・混合することによって、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを内殻に有するドラッグデリバリー製剤を作製した。このとき、該オリゴマーは、ブロックコポリマーのＰＬｙｓに静電的に誘引・付着し、親水性であるＰＥＧが外殻側に配置されたミセル様構造（粒径：約１０〜２５ｎｍ）が形成された。

（３）ユニット型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤による脳腫瘍増殖抑制
脳腫瘍同所移植マウスモデルとして免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄ Ｊｃｌ；クレア株式会社）の脳に脳腫瘍幹細胞（ＧＳＣ−２２２株）を同所移植し、移植３０日後の脳腫瘍が生着したマウスを作製した。

マウス個体レベルで脳へのＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーの集積を確認するため、ドラッグデリバリー製剤に含有させるＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを蛍光物質（Ａｌｅｘａ−６４７）で標識した。なお比較解析としてＡｌｅｘａ−６４７標識したＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー単体（高分子ミセル化していない。）を用いた。ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有する高分子ミセル（ドラッグデリバリー製剤）及びＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー単体を脳腫瘍同所移植マウス（２５μｇ／マウス）に静脈内投与後、蛍光強度をＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した結果、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤が脳腫瘍部に特異的に集積していることを確認した（図１４、図１５）。また、図１５から、投与後９時間までに脳内に集積した該ドラッグデリバリー製剤は、投与前の蛍光強度値を１としたとき最高蛍光強度値２１まで上昇し、その後、減少し、投与後１５時間で蛍光強度値９となった。

次に、上記脳腫瘍同所移植マウス（脳腫瘍幹細胞を移植３０日後のマウス）に対して、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤を継続的に静脈内投与し（３日ごとに一度投与（２５μｇ／マウス））、抗腫瘍効果を評価した。なお比較解析としてＦｉｒｅｆｌｙ ＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号５４（センス鎖）と配列番号５５（アンチセンス鎖））を含有するドラッグデリバリー製剤を投与したマウスを用いた。

投与開始から３０日後（この間に合計１０回の投与を行った。）にマウス脳を摘出し、脳組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色によって観察した結果、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤の投与により腫瘍の著しい縮小が認められ（図１６）、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを含有するドラッグデリバリー製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで脳腫瘍に特異的に集積し、強い抗腫瘍作用を示すことが明らかになった。

[実施例８]
＜膵臓癌細胞株増殖抑制＞
膵臓癌細胞株（ＭＩＡＰＡＣＡ２、ＰＡＮＣ１、ＢＸＰＣ３）にＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ修飾アンチセンスＤＮＡ、配列番号５６）をリポフェクション法にて導入した。導入３日後の膵臓癌細胞株におけるＴＵＧ１発現レベルと膵臓癌細胞株の相対細胞増殖率を測定した。陰性対照としてＦｉｒｅｆｌｙ ＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー（ＬＮＡ修飾ＤＮＡ、配列番号５7）を使用し、また、発現レベルは、内部標準ＧＡＰＤＨに対するＴＵＧ１の相対発現比率で表した。その結果、ＴＵＧ１阻害による膵臓癌細胞株の増殖抑制効果が認められた（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。

[実施例９]
＜膵臓癌細胞株（ＢＸＰＣ３）担持マウスにおける腫瘍増殖抑制＞
膵臓癌細胞株（ＢＸＰＣ３）を皮下に移植したヌードマウスに対して、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー（配列番号５６）を内包するドラッグデリバリー製剤を継続的に静脈内投与し（３日ごとに一度投与（２５μｇ／マウス））、抗腫瘍効果を評価した。なお比較解析としてＦｉｒｅｆｌｙ ＧＬ３ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子に対するＬＮＡオリゴマー（配列番号５７）を内包したドラッグデリバリー製剤を投与したマウスを用いた。腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３となった時点を０日目とし、この時点からそれぞれのＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤（ミセル型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤（後述の［参考例１］参照））を継続的に静脈内投与し、３日毎に３０日目まで腫瘍サイズを測定した。その結果、図１８に示すように、ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを内包するドラッグデリバリー製剤による腫瘍増殖抑制効果が認められた。

[参考例１]
＜ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを内包するミセル型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤の作製＞
（１）アセタール−ポリエチレングリコール−ポリ（Ｌ−リジン）ブロック共重合体（アセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ）の合成
平均分子量１２，０００のアセタール−ＰＥＧ−ＮＨ_２１．２０ｇとチオ尿素２．９０ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１８ｍＬに溶解した。次いで、Ｎε−トリフルオロアセチル−Ｌ−リジンのＮ−カルボン酸無水物（Ｌｙｓ（ＴＦＡ）−ＮＣＡ、アセタール−ＰＥＧ−ＮＨ_２の５０当量）１．３４ｇをＤＭＦ２０．１ｍＬに溶解した溶液を加え、２０℃で２日間反応させた。反応溶液をジエチルエーテル−メタノール（１５／１）の混合溶媒６００ｍＬに滴下し、白色沈殿を得た。さらに沈殿をメタノールに溶解しジエチルエーテル中に滴下することを２回繰り返した。得られた白色沈殿をろ過して真空乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）２．２２ｇを得た。

得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）２．００ｇをメタノール２００ｍＬに溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬを加えて３５℃で１２時間反応させた。反応溶液を透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア、分画分子量６，０００〜８，０００）に入れ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を外液として４回、続いて純水を外液として３回透析を行い、透析膜内液を回収し、凍結乾燥し、アセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ１．６３ｇを白色固体として得た。得られた化合物が目的物であることを^１Ｈ−ＮＭＲにより確認した。得られたアセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのポリリジンセグメントの重合度は４５であった。

（２）ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓの合成
ｃＲＧＤペプチド（式（１０））２６．２ｍｇ（アセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓに対し５倍当量）を１０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬ（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）５ｍｇ（ｃＲＧＤペプチドに対し１当量）を加えて、２５℃で３０分間撹拌し、ｃＲＧＤペプチドを還元した。別の容器に、合成例１で得られたアセタール−ＰＥＧ-ＰＬｙｓ１２５ｍｇ（１当量）を０．０１Ｍの塩酸（ｐＨ２．０）に溶解し、２５℃で２時間攪拌した。その後、還元したｃＲＧＤペプチド溶液をアセタール−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ溶液に滴下し、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を用いたｐＨを５．０に調整した。反応は撹拌しながら、４℃で一晩行った。反応溶液を透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア、分画分子量：６，０００〜８，０００）に移し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で２日間、次いで、蒸留水で２日間透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ^ＴＭ ＧＰ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓの白色粉末を得た（収量：１１２ｍｇ、収率８６％）。ＰＥＧ−ＰＬｙｓに結合したｃＲＧＤペプチドの量は、^１Ｈ−ＮＭＲにより測定したｃＲＧＤペプチドのフェニルＣＨタンパクピークとＰＥＧのＣＨ_２主鎖ピークとの積分比から算出した。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのｃＲＧＤの導入率は８５％であった。

（３）ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）（ブロックコポリマー）の合成
上記（２）で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ５０ｍｇを０．１Ｍのホウ砂緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。別の容器に、３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）３．６ｍｇ（ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのリジンユニットに対して０．１当量）を冷水に溶解した。ＤＴＢＰ溶液をｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ溶液へと滴下し、２５℃で４５分間撹拌した。その後、２−イミノチオラン（２−ＩＭ）３８ｍｇ（ｃＲＧＤ−ＰＥＧＰＬｙｓのリジンユニットに対して２．４当量）を粉末のまま添加し、２５℃で３０分撹拌した。反応液を３５℃に加温し、一晩撹拌した。反応溶液を透析チューブ（フナコシ（株）製、スペクトラ／ポア、分画分子量６，０００〜８，０００）に移し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１５０ｍＭＮａＣｌ溶液で１時間透析した。次いで、ＤＴＴ３５ｍｇ（ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓのリジンユニットに対して２．０当量）を透析チューブの内液に加え、３０分間静置した。その後、１５０ｍＭＮａＣｌ溶液で１時間、蒸留水で１時間透析した。透析後、フィルター（日本ミリポア社、ＳｔｅｒｉｖｅｘＴＭＧＰ０．２２μｍ）で処理した後、凍結乾燥し、ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）の白色粉末を得た（収量：５６ｍｇ）。ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）に結合したＤＴＢＰおよびＩＭの量は、^１Ｈ−ＮＭＲにより測定したＤＴＢＰのＣＨ_２ピーク、ＩＭのＣＨ_２及びＰＥＧのＣＨ_２主鎖ピークとの積分比から算出した。得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）のＤＴＢＰ、ＩＭの導入率はそれぞれ１６％、８０％であった。

ｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）の構造は以下のとおりである（式（１３））。

（４）ミセル型ＰＩＣドラッグデリバリー製剤の作製
上記（３）で得られたｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）を濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、ＤＴＴ濃度３０．５４ｍｇ／ｍＬの１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、Ｎ／Ｐ比が１〜８となるよう濃度を調製し、室温で３０分間静置した。上記のＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマーを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、１５μＭのオリゴマー溶液を調製した。ＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー溶液とｃＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＬｙｓ（ＤＴＢＰ／ＩＭ）溶液とをＮ／Ｐ比が１．３（体積比２：１）となるように混合し、２５℃で２４時間静置した。得られた溶液をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（分画分子量：３．５ｋＤａ）で５ｖ／ｖ％のＤＭＳＯ含有１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）で２日間、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７．４）で２日間透析し、ブロックコポリマーとＴＵＧ１−ＬＮＡオリゴマー溶液の複合体であるオリゴマー内包ミセルを得た。

得られたミセルを、実施例７及び実施例９に記載のように、腫瘍移植マウスに静脈内投与し、抗腫瘍効果の確認のために使用した。

本発明者らは、腫瘍細胞においてＴＵＧ１の発現を効果的に抑制する修飾ｓｉＲＮＡ及び修飾アンチセンスＲＮＡを作製し、それらのなかにＴＵＧ１発現を抑制するとともにグリオーマ等の腫瘍及び腫瘍幹細胞の細胞増殖を抑制する核酸を見いだし、特にＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることによって、より長期的に腫瘍内のＴＵＧ１発現を抑制し、腫瘍増殖抑制を有意に可能とすることを確認した（特願２０１５−０２４７１３（ＷＯ２０１６／１２９６３３Ａ１））。

本願ではさらに、ＴＵＧ１の発現を抑制する上記核酸を含有するドラッグデリバリー製剤を作製し、それを脳腫瘍、膵臓癌などの腫瘍若しくは癌を持つ被験体に投与することにより、該ドラッグデリバリー製剤が腫瘍に特異的に集積し、腫瘍細胞だけでなく腫瘍幹細胞に対しても強い抗腫瘍作用を示すことから、本発明により、ＴＵＧ１を標的とした核酸創薬が脳腫瘍（ＧＢＭなど）、膵臓癌等の癌治療に有効であることが示された。

配列番号４〜１９：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ
配列番号２０〜２１、２８〜２９、４３、４９：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ、この配列中（１）・・（１７）はＲＮＡである。
配列番号２２〜２７、３０〜３５、３９〜４２、４４〜４８、５０：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ、この配列中（１）・・（１９）はＲＮＡである。
配列番号３６：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１６）・・（１９）はロックされた核酸である。
配列番号３７：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（３）及び（１７）・・（１９）はロックされた核酸である。
（１９）はロックされた核酸である。
配列番号３８：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１７）・・（１９）はロックされた核酸である。
配列番号５１：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１８）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５２：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（３）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５３：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５４〜５５：ホタルＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ
配列番号５６：ＬＮＡ修飾アンチセンスＤＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５７：ホタルＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子に対するＬＮＡ修飾ＤＮＡ、この配列中の（１）・・（４）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。

本明細書中で引用された上記の特許、特許出願及び刊行物に記載された開示のすべてについて、参照によりその全体を本明細書中に組み入れるものとする。

Claims (16)

1. ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療する又は腫瘍転移から予防するための抗腫瘍性ドラッグデリバリー製剤であって、該ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を含む高分子ミセルを有効成分として含み、該高分子ミセルが、カチオン性ポリアミノ酸セグメントと親水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロックコポリマーと、該核酸とを含み、該核酸が該カチオン性ポリアミノ酸セグメントのカチオン性基と結合して複合体を形成する、及び／又は、該核酸が該ミセル内部に内包若しくは付着されており、該腫瘍が脳腫瘍、膵臓癌、大腸癌及び前立腺癌からなる群から選択される腫瘍であり、並びに、該高分子ミセルが腫瘍に集積することを特徴とする、ドラッグデリバリー製剤。
2. 前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、若しくはその修飾ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡである、請求項１に記載のドラッグデリバリー製剤。
3. 前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２の領域、並びに／或いは、それぞれ、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５の領域を標的とする、請求項１又は２に記載のドラッグデリバリー製剤。
4. 前記核酸が、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ又はその修飾ＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
5. 前記修飾ＲＮＡが、１つ又は２つ以上の修飾ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
6. 前記修飾ＲＮＡが、配列番号２０〜２７の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列を含む配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、或いは、配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項２〜５のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
7. 前記修飾ＲＮＡが、各末端側に、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされた少なくとも２つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、請求項２〜６のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
8. 前記修飾ＲＮＡが、配列番号３６〜３８、５１〜５３のいずれかの塩基配列からなるＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、請求項２〜３、及び５〜７のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
9. 前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡを含むベクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
10. 前記親水性ポリマー鎖セグメントが分岐状の複数のポリマー鎖からなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
11. 前記カチオン性ポリアミノ酸セグメントがポリリジンを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
12. 前記親水性ポリマー鎖セグメントがポリエチレングリコール又は末端修飾ポリエチレングリコールを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
13. 前記ブロックコポリマーが前記カチオン性ポリアミノ酸セグメントと前記親水性ポリマー鎖セグメントとの間に連結基を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
14. 前記親水性ポリマー鎖セグメントが、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列又はアスパラギン−グリシン−アルギニン配列を含む環状ペプチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
15. 前記ブロックコポリマーが、１を超える［ブロックコポリマー中のカチオン性基の総数（Ｎ）］／［核酸中のリン酸基の総数（Ｐ）］として定義されるＮ／Ｐ比を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のドラッグデリバリー製剤。
16. 前記Ｎ／Ｐ比が、２以上、３以上、４以上、又は５以上である、請求項１５に記載のドラッグデリバリー製剤。

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