JP6664815B2

JP6664815B2 - 抗腫瘍剤

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Publication number: JP6664815B2
Application number: JP2016574831A
Authority: JP
Inventors: 近藤　豊; 豊近藤; 啓佑勝島
Original assignee: Nagoya City University
Current assignee: Nagoya City University
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2016-02-10
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2036-02-10
Also published as: US10563201B2; EP3257515A1; WO2016129633A1; JPWO2016129633A1; EP3257515B1; US20180163208A1; EP3257515A4

Description

本発明は、ＴＵＧ１遺伝子を高発現する腫瘍に対する抗腫瘍剤に関する。

ＴＵＧ１は、ｔａｕｒｉｎｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｇｅｎｅ１の略称であり、げっ歯類の網膜の分化に必要なノンコーディングＲＮＡとしてＹｏｕｎｇら（非特許文献１）などによって特定されたスプラシングされたポリアデニル化ＲＮＡであり、網膜や脳など神経系の組織に強い発現を示す。

癌又は腫瘍でのＴＵＧ１の役割について、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ではＴＵＧ１をノックダウンすると細胞増殖を促進することがＺｈａｎｇら（非特許文献２）によって記載されている。これとは逆に、特定の癌又は腫瘍においてＴＵＧ１が過剰発現されており、ＴＵＧ１発現を抑制すると、増殖が抑制されるという報告もある。例えば、Ｘｕら（非特許文献３）は、ＴＵＧ１のサイレンシングによって食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）細胞の増殖が抑制され細胞周期の進行が阻止されると記載している。また、Ｚｈａｎｇら（非特許文献４）は、骨肉腫細胞株でＴＵＧ１が過剰発現されていること、また、ＴＵＧ１発現を抑制すると骨肉腫細胞がアポトーシスを起こすことを記載している。さらにまた、Ｈａｎら（非特許文献５）は、尿路上皮癌でＴＵＧ１が過剰発現され、高ステージと関係があること、また、ＴＵＧ１をサイレンシングすると増殖阻害やアポトーシス誘導が起こることを記載している。

Ｔ．Ｌ．Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１５（６）：５０１−５１２，２００５Ｅ．Ｂ．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．２０１４Ｍａｙ，２２；５：ｅ１２４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１４．２０１Ｙ．Ｘｕｅｔａｌ．，ＴｕｍｏｒＢｉｏｌｏｇｙＯｃｔ３１，２０１４，ｄｏｉ：１０，１００７／ｓ１３２７７．０１４．２７６３．６Ｑ．Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，ＡｓｉａｎＰａｃｉｆｉｃＪＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ，１４（４）：２３１１−２３１５，２０１３Ｙ．Ｈａｎｅｔａｌ．，ＪＳｕｒｇＯｎｃｏｌ，１０７：５５５−５５９，２０１３

本発明の目的は、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ：ＧＢＭ）などの脳腫瘍を含む、ＴＵＧ１を高発現する癌又は腫瘍を予防又は治療することができる核酸医薬を提供することである。

ＧＢＭは、原発性脳腫瘍のなかで最も悪性度が高く、未だに改善や根治に至ることが極めて困難な腫瘍である。ＧＢＭは、ゲノム異常の他に非翻訳ＲＮＡやヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有し、これらエピゲノム異常がＧＢＭの悪性化に寄与することが示唆されている。

本発明者らは、今回、ＧＢＭを含むいくつかの腫瘍にｌｎｃＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ）の一つであるＴＵＧ１が高発現しており、それを標的とした核酸が該腫瘍の有意な退縮に有効であることを見出し本発明を完成させた。

したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。

（１）腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を有効成分として含む、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療又は予防するための組成物。

（２）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、若しくはその修飾ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡである、（１）に記載の組成物。

（３）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５（図２における＃５−＃４までの領域）の領域を標的とする、（１）又は（２）に記載の組成物。

（４）上記核酸が、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ又はその修飾ＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。

（５）上記修飾ＲＮＡが、１つ又は２つ以上の修飾ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、（２）〜（４）のいずれかに記載の組成物。

（６）上記デオキシリボヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡが、配列番号２０〜２７の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列を含む配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、或いは、配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡキメラである、（５）に記載の組成物。

（７）上記修飾ヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡが、各末端に、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジを有するロックされた少なくとも２つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、（５）に記載の組成物。

（８）上記修飾ＲＮＡが、配列番号３６〜３８、５１〜５３のいずれかの塩基配列からなるＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、（２）〜（３）、（５）〜（７）のいずれかに記載の組成物。

（９）上記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡ、を含むベクターである、（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。

（１０）上記腫瘍が、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病及びリンパ腫からなる群から選択される、（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。

（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の組成物を被験体に投与することを含む、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療するための方法。

（１２）上記腫瘍が、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病及びリンパ腫からなる群から選択される、（１１）に記載の方法。

本発明は、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫などのＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍において、腫瘍幹細胞の増殖抑制を可能にし、それによって腫瘍を退縮させ、かつ腫瘍の転移を抑制する効果を有する。

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-024713号の開示内容を包含する。

この図は、種々の腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベルを示す。図中、ＧＳＣはグリオーマ幹細胞株を示し、Ｔ９８、Ｕ２５１、ＳＫ−ＭＧ１及びＡＯ２はグリオーマ細胞株を示し、ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、ＳＫ−ＢＲ３及びＴ４７Ｄは乳癌細胞株を示し、Ｌｏｖｏ、Ｃａｃｏ−２、ＲＫＯ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０及びＳＷ１０８３は大腸癌細胞株を示し、ＰＣ３、ＬＮＣａｐ及びＶｃａｐは前立腺癌細胞株を示し、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７及びＡ５４９は肝臓癌細胞株を示し、Ｈ９２０及びＰＣ９は肺癌細胞株を示し、Ｊｕｒｋａｔは白血病細胞株を示し、Ｒａｊｉはバーキットリンパ腫細胞株を示し、並びに、Ｐｆｅｉｆｆｅｒはリンパ腫細胞株を示す。発現レベルは、内部標準ＧＡＰＤＨに対するＴＵＧ１の相対発現比率で表した。この図は、ＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡターゲット配列の位置と、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣに対する増殖抑制効果を示す。図中、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４（塩基配列：図３参照）は、作製された修飾ｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ；センス鎖及びアンチセンス鎖の３'末端の「ｄＣｄＡ」等はＤＮＡ配列である。）を表し、ＴＵＧ１配列上の標的位置を示す。また、抑制効果は、コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」；ＳｉｌｅｎｃｅｒＳｅｌｅｃｔＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ＃１ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３））に対するＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）の相対発現比率で表す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、図２で試験されたｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４の塩基配列（センス鎖配列とアンチセンス鎖配列）を示す。抑制効果の得られたｓｉＲＮＡは、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８であり（図３Ａ）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃９〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４では抑制効果が低いか、又は抑制効果が得られなかった（図３Ｂ）。この図は、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８（「＃１」〜「＃８」と表示した。）によるグリオーマ幹細胞株ＧＳＣにおけるＴＵＧ１の発現抑制効果の評価を示す。各修飾ｓｉＲＮＡ導入３日後におけるＴＵＧ１の発現量（ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準））をコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」；ＳｉｌｅｎｃｅｒＳｅｌｅｃｔＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ＃１ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３））に対する相対値で示している。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８（「＃１」〜「＃８」と表示した。）によるグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに対する抗増殖効果の評価を示す。各修飾ｓｉＲＮＡ導入３日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示している。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、配列番号１３の塩基配列に基づいて作製したＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、すなわち、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）を示す。ＬＮＡ修飾を行った部位を下線で示す。この図は、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）の３種のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、並びにｓｉ−ＴＵＧ１＃２（センス：配列番号２１及びアンチセンス：配列番号２９）、によるＴＵＧ１発現抑制効果の評価を示す。比較のため、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２及びコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を用いた。各ｓｉＲＮＡ及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに導入し、３、７、１０日後（ｄ３、ｄ７、ｄ１０）におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する相対ＴＵＧ１発現量を示す。発現量は、ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）である。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（初期細胞数１×１０^５）における表示の各ｓｉＲＮＡ及び各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（終濃度３０ｎＭ）による抗腫瘍細胞増殖抑制効果の評価を示す。ｓｉ−ＴＵＧ１＃２（センス：配列番号２１及びアンチセンス：配列番号２９）及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８））の各々をＧＳＣに導入１０日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、配列番号１７の塩基配列に基づいて作製したＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、すなわち、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）を示す。ＬＮＡ修飾を行った部位を下線で示す。この図は、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）の３種のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、並びにｓｉ−ＴＵＧ１＃６（センス：配列番号２５及びアンチセンス：配列番号３３）、によるＴＵＧ１発現抑制効果の評価を示す。比較のため、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６及びコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を用いた。各ｓｉＲＮＡ及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣに導入し、３、７、１０日後（ｄ３、ｄ７、ｄ１０）におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する相対ＴＵＧ１発現量を示す。発現量は、ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ（内部標準）である。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（初期細胞数１×１０^５）における表示の各ｓｉＲＮＡ及び各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（終濃度３０ｎＭ）による抗腫瘍細胞増殖抑制効果の評価を示す。ｓｉ−ＴＵＧ１−２＃６（センス：配列番号２５及びアンチセンス：配列番号３３）及びＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）及びＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３））の各々をＧＳＣに導入１０日後におけるコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対するＧＳＣの生細胞数の相対値を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、ＴＵＧ１阻害による前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖抑制効果を示す。図１２Ａは、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２又はコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を作用したときのＰＣ３株におけるＴＵＧ１発現レベルを示し、図１２Ｂは、それぞれのｓｉＲＮＡを作用したときのＰＣ３株の相対細胞増殖率を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。この図は、グリオーマ幹細胞株ＧＳＣを皮下に移植したヌードマウスにＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（（配列番号３６）又はコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を３日毎に静脈内投与して治療を施したときの腫瘍サイズの経日変化を示す。＊は、統計的有意（ｐ＜０．０１）を示す。

近年ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡの発現異常と癌との関係が注目されている。特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、癌の診断分野において多数見出されている。癌又は腫瘍の種類によってｍｉＲＮＡの種類も異なるとともに、正常細胞と比べて過剰発現するｍｉＲＮＡもあれば、逆に減少するｍｉＲＮＡも混在しているため、複雑化している。また、ｌｏｎｇｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）についてはｍｉＲＮＡと比べて報告数が少ないが、ｌｎｃＲＮＡと癌との関係において過剰発現する場合と発現が減少する場合の両方が知られている。

本発明者らは、腫瘍のなかでも治療が難しい脳腫瘍について治療剤の開発を行ってきた。原発性脳腫瘍のなかでも最も悪性度の高い神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、改善が極めて難しい腫瘍である。ＧＢＭは、ゲノム異常に加えて非翻訳ＲＮＡやヒストン修飾、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常を有し、これらのエピゲノム異常がＧＢＭの悪性化に寄与すると示唆されている。上記の非翻訳ＲＮＡの１つであるｌｎｃＲＮＡの遺伝子発現制御は、細胞の分化や増殖などの様々な生命現象に深く関わり、近年では癌の悪性化への関与も報告されている（Ｒ．Ａ．Ｇｕｐｔａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６４：１０７１−１０７６，２０１０；Ｌ．Ｙａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５００：５９８−６０２，２０１３；Ｊ．Ｈ．Ｙｕａｎｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ，２５：６６６−６８１，２０１４；Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）。

今回、本発明者らは、ヒトＧＢＭから樹立したグリオーマ幹細胞（ｇｌｉｏｍａｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＧＳＣ）において、ｌｎｃＲＮＡの１つであるＴＵＧ１が正常組織と比べて高発現しており、ＴＵＧ１の発現抑制がＧＳＣの増殖抑制に寄与することを見出し、ＴＵＧ１を標的とした核酸医薬がＧＢＭ治療に有効であることをさらに見出した。さらに今回、本発明者らは、このような知見を踏まえて、これまで報告のないいくつかの腫瘍についてもＴＵＧ１が高発現していること、そしてこれらの腫瘍においてもＧＳＣと同様に腫瘍幹細胞を標的とする該核酸医薬により抗腫瘍効果が期待できることを見出した。

上記の背景技術で記載したように、腫瘍の治療に関して、ＴＵＧ１は腫瘍の種類によって発現量が異なることが知られているが、高発現される特定の腫瘍に対してもＴＵＧ１の発現抑制が治療有効であるかについては十分な証明がされていない。また、ＴＵＧ１と腫瘍幹細胞との関係に関する報告はない。

ＴＵＧ１はｐ５３によって誘導され細胞周期に関係する特定の遺伝子を抑制する役割を有しており、ＴＵＧ１を含むｌｎｃＲＮＡがｐ５３転写経路において腫瘍増殖抑制的に機能する可能性も仮説的に指摘されているがよくわかっていない（Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）。

本発明者らは、今回、このような状況のなかで、脳腫瘍などのいくつかの腫瘍が腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１の発現抑制によって増殖抑制されることを見出した。すなわち、本発明は、腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を有効成分として含む、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫などのＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療又は予防するための組成物を特徴とする。

以下に、本発明についてさらに具体的に説明する。
１．ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸
本発明の組成物の有効成分は、腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸である。

本明細書中の「ＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する」という用語について、正常組織（又は正常細胞）において正常に発現するＴＵＧ１のレベル（もしくは量）より多い異常な状態を「高発現」と称し、該用語は、ＴＵＧ１遺伝子の高発現を正常レベル又はそれ以下のレベルに抑制すること、並びに、ＴＵＧ１遺伝子の転写体であるｌｎｃＲＮＡの機能を抑制することの意味で使用されている。ここでｌｎｃＲＮＡの機能は、本発明では、癌若しくは腫瘍の増殖、進行又は転移に関係する機能をいう。本発明では、腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を被験体に投与することによって、例えば脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病、リンパ腫などの腫瘍を有する被験体においてＴＵＧ１の発現を抑制し、それによって該腫瘍の増殖を抑制する。

被験体は、動物であれば制限はないが、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、その他の哺乳動物、例えば動物園などで飼育されている哺乳動物であり、好ましい動物はヒトである。このような動物のなかでＴＵＧ１の遺伝子が高発現されている腫瘍をもつ被験体が本発明の対象動物である。

ＴＵＧ１は、上記動物のＴＵＧ１であり、例えば、ヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体（ｌｏｎｇｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ）として公知のＮＲ＿１１０４９２（配列番号１）、ＮＲ＿１１０４９３（配列番号２）又はＮＲ＿００２３２３（配列番号３）の塩基配列、或いは、これらの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントであるＴＵＧ１である。

本明細書中で使用される「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜５の整数をいう。また、配列同一性は、塩基配列等の配列アラインメントをとるための公知のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、を使用して決定されうる。

本発明においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ又はその前駆体ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。上記核酸の他の例は、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含むベクター、又はその修飾核酸である。

本発明における核酸は、腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する、かつ、腫瘍の増殖を抑制するかぎり核酸の種類や核酸の配列を特定のものに限定しないが、上記被験体のＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列内の領域、例えばヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である例えば配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５（図２における＃５−＃４までの領域）の領域を標的とすることが好ましい。

ＴＵＧ１に対しＲＮＡｉ作用を有するｓｉＲＮＡもしくはその前駆体ＲＮＡについて、ｓｉＲＮＡは、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは２１〜２３ヌクレオチドからなる、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡである。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端、例えばＵＵ（ＤＮＡの場合、ＴＴ）、を有していてもよい。突出末端は、ＲＩＳＣと相互作用する可能性が指摘されている（Ｗ．Ｒ．Ｓｔｒａｐｐｓｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１０Ａｕｇ；３８（１４）：４７８８−４７９７）。

ＲＮＡｉ作用は、当業界で一般的に使用される意味を有しており、短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がその塩基配列特異的に標的転写体ＲＮＡを分解し、その遺伝子発現を抑制する現象である。

上記前駆体ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのｐｒｉＲＮＡ、ｐｒｅＲＮＡ、ｓｈＲＮＡのいずれかである。ｐｒｉＲＮＡは、ＴＵＧ１遺伝子に対する転写体ＲＮＡ配列、例えば配列番号１、２又は３の塩基配列を有する。ｐｒｅＲＮＡは、ｐｒｉＲＮＡの酵素的プロセシングにより産生されるｐｒｅｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡの略称であり、ｐｒｅｓｈＲＮＡから酵素的に産生された、ｓｉＲＮＡと同じ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とのステム、ならびにヘアピンループからなる。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は細胞機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合し、この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列をもつ転写体ＲＮＡに結合し、それを切断する。

本発明の核酸は、例えば、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである。

或いは、本発明の核酸は、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、上記ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡ、を含むベクターである。好ましい前駆体ＲＮＡはｓｈＲＮＡである。

上記ベクターは、細胞内に導入されたとき上記ＤＮＡを発現可能にする調節配列を含む、例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、或いは、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ），酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、又はマウス人工染色体（ＭＡＣ））などの非ウイルスベクターのいずれかである。好ましいベクターは、安全性の面からプラスミド、センダイウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどである。プラスミドは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で使用可能であり、かつ安全性が証明されているプラスミドが好ましい。具体的には、プラスミドベクターとしては、例えば特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるようなベクター、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、ｐＴＤＴ１などの非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されないものとする。

上記調節配列は、プロモーター、転写開始点、ターミネーターなどを含み、必要に応じてエンハンサー、選択マーカー配列などを含むことができる。プロモーターは、特定の宿主細胞内で上記ＤＮＡの転写開始を促進するかぎり任意の内因性若しくは外因性プロモーターを使用できるが、例えばＵ６もしくはＨ１プロモーターであり、これにより、細胞内に導入後にベクターは恒常的に発現されるし、また、娘細胞に受け継がれ、遺伝子サイレンシングの効果も受け継がれる。

一般にＲＮＡは、生体内で、例えば血中等でリボヌクレアーゼにより分解されやすいためにかなり不安定である。これを解消するため、本発明では、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチドの修飾が行われる。修飾は、少なくとも１つの、好ましくは複数のヌクレオチドの修飾、例えば、塩基の修飾、糖の修飾、リン酸ジエステル部の修飾、又はそれらの組み合わせ、並びに／或いは、環状構造（二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）、ＤＮＡを含むキメラ構造などを含むことができる。修飾は、非限定的に以下のものが挙げられる。

ＲＮＡもＤＮＡもともに糖、塩基及びホスホジエステル結合からなるヌクレオチドの連鎖によって構成される核酸であり、それらの核酸の構造上の違いは、ヌクレオチド中の糖、すなわち、ＲＮＡの糖はリボースであり、一方ＤＮＡの糖は２'位の水酸基が水素で置換された２'−デオキシリボースであり、またさらなる違いは塩基、すなわち、ＲＮＡの塩基はアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から構成され、一方ＤＮＡの塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）から構成されることにある。

バックボーンであるリン酸ジエステル部の修飾には、ホスホジエステル結合に代えて例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、又はホスホロアミデート結合とする修飾による置換が含まれる。

塩基及び糖の修飾には、特表２００７−５２５１９２号公報に例示されるような、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）シチジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）ウリジンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−ハロ（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）グアノシンヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、ロックされた核酸ヌクレオチド（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ）；例えば２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２−）修飾ヌクレオチド、２'−Ｏ，４'−Ｃエチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−）修飾ヌクレオチド、等）、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メトキシ（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチドなどが挙げられる。また、２'−修飾ヌクレオチドについて、上記例示に加えて、例えば特表２０１０−５０７５７９号公報に記載されるような、糖の２'位を、例えば、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、アセトキシ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、アシル、カルボニルオキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、アリール、アルケニル、アルキニル、シアノ、ＯＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ（Ｒ_ｍ）−アルキニル、Ｏ−アルキレニル−Ｏ−アルキル、アルキルアリール、アラルキル、Ｏ−アルキルアリール、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＳＣＨ_３、Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）、又はＯ−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ_ｍ）（Ｒ_ｎ）によって置換しうる。ここで、各Ｒ_ｍとＲ_ｎは、独立的に、Ｈ、アミノ保護基、又は置換若しくは非置換Ｃ_１−Ｃ_１０アルキルである。

ＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、今西武（ＴａｋｅｓｈｉＩｍａｎｉｓｈｉ）らによって開発された人工核酸（Ｍ．ＡｂｄｕｒＲａｈｍａｎ，ＳａｙｏｒｉＳｅｋｉ，ＳａｔｏｓｈｉＯｂｉｋａ，ＨａｒｕｈｉｓａＹｏｓｈｉｋａｗａ，ＫａｚｕｙｕｋｉＭｉｙａｓｈｉｔａ，ＴａｋｅｓｈｉＩｍａｎｉｓｈｉ：「Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ２'，４'−ＢＮＡ：Ａｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎａｌｏｇｕｅ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０．４８８６−４８９６（２００８））であり、本発明のｓｉＲＮＡの塩基配列中の糖部にＬＮＡ（「ＢＮＡ（ＢｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）」とも称する。）を導入したヌクレオチドは、著しくヌクレアーゼ耐性を有するものとなる。各末端に少なくとも２つ、好ましくは各末端に３〜４つ、のＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡの例は、図３Ａに示すセンス鎖塩基配列（配列番号２８〜３５）の修飾ＲＮＡであり、非限定的に、例えば配列番号３６〜３８、配列番号５１〜５３のようないずれかの塩基配列からなる修飾ＲＮＡである。

本発明の核酸はまた、ｓｉＲＮＡの塩基配列中の一部にデオキシリボヌクレオチド配列を含むＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造を有することができる。デオキシリボヌクレオチド配列を含むことによってリボヌクレオチド配列のみと比べてよりヌクレアーゼ耐性とすることが可能になる（例えば特許３８０３３１８号公報）。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの塩基配列のアンチセンス鎖又はセンス鎖の全ヌクレオチド数あたり３０％以下、好ましくは２０％以下の割合で含むことができる。デオキシリボヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方に含まれていてもよいし、或いはセンス鎖のみに含まれていてもよい。また、ｓｉＲＮＡの塩基配列中のデオキシリボヌクレオチドは３'側に存在することが好ましく、例えば３'末端に突出末端として２〜４つのデオキシリボヌクレオチドが連続する配列で存在してもよい。具体的には、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラは、センス鎖の塩基配列が配列番号２０〜２７の塩基配列であり、かつ、アンチセンス鎖の塩基配列がそれぞれ配列番号２８〜３５の塩基配列である二本鎖ＲＮＡである。

上記環状構造（すなわち、二本鎖のステムと２つのループとからなる構造）を有する核酸は、いわゆるダンベル型の一本鎖ＲＮＡである。ステムは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の互いに相補的な配列から構成される。ループは、ステムの各末端部に連結された例えば１ループあたり非相補的な約２〜約１５ヌクレオチドから構成される（例えば米国特許第５，１６８，０５３号明細書、米国特許第５，１９０，９３１号明細書、米国特許第５，１３５，９１７号明細書、ＳｍｉｔｈａｎｄＣｌｕｓｅｌｅｔａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：３４０５−３４１１、及び米国特許第５，０８７，６１７号明細書）。

上記核酸の他の例として、上記のアンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）、又はその修飾核酸などを挙げることができる。

アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）は、ＴＵＧ１遺伝子の転写産物であるｌｎｃＲＮＡを標的とする一本鎖核酸である。該ｌｎｃＲＮＡを標的とする上記ｓｉＲＮＡはｌｎｃＲＮＡを分解するのに対し、アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）は上記のｌｎｃＲＮＡ機能を抑制若しくは阻害する。生体内での安定性を高めるために、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ構造、及び／又は、１若しくは複数の上記の修飾ヌクレオチドを含む修飾誘導体が好ましい。修飾ヌクレオチドの具体例は上に記載したものであり、さらに好ましい例は、ホスホロチオエート修飾と、２’−ＭＯＥヌクレオチド、２’−ＯＭｅヌクレオチド又はＬＮＡ修飾ヌクレオチドとの組み合わせである。アンチセンスＲＮＡ（若しくはアンチセンスＤＮＡ）又はその修飾誘導体の塩基長は、通常１２〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドである。塩基長として１００ヌクレオチドを超える長さとすることも可能であるが、特に製造コストの面で不利となるので、上記の範囲が適当である。アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡの配列は、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ｌｎｃＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡの塩基配列、例えば配列番号１、２又は３のヒトＴＵＧ１由来の配列、或いは、これらの各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる天然バリアントであるＴＵＧ１の塩基配列から、上記サイズの連続する塩基配列を選択し、この配列に相補的な塩基配列又はその修飾塩基配列とすることができる。標的として、上記のとおり、ヒトＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの塩基配列である例えば配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、ヌクレオチド番号２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５（図２における＃５−＃４までの領域）の領域を標的とすることが好ましい。具体的には、各末端に少なくとも２つ、好ましくは３〜４つ、のＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡの例は、図３Ａに示すアンチセンス鎖塩基配列（配列番号２８〜３５）を有するアンチセンスＲＮＡであり、非限定的に、例えば配列番号３６〜３８、５１〜５３のようないずれかの塩基配列を有するものである。さらに、この具体例において、アンチセンスＤＮＡは、上記アンチセンスＲＮＡの配列においてウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に変換した塩基配列を有するものである。

２．腫瘍の治療又は予防用組成物
本発明の組成物は、腫瘍幹細胞において上記のＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する、それによって腫瘍の増殖を抑制する核酸を有効成分として含むことを特徴とする。本発明の組成物は腫瘍幹細胞を標的とするため、腫瘍は退縮するし、並びに、腫瘍の転移も抑制される。

上記核酸は、それ自体を担体等とともに混合して含む組成物の形態に製剤化されてもよいし、或いは、該核酸をデリバリーシステムに組み入れるように製剤化されてもよい。

上記核酸の用量は、非限定的に、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば約０．０１ｍｇ〜約１，０００ｍｇであるが、一般に用量又は投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるべきである。また、投与は、例えば１週間、２週間、３週間、又は４週間間隔、或いは、必要であれば１か月を超える間隔で行うことができる。

製剤化において、核酸有効成分の他に、担体又は希釈剤、並びに添加剤を混合して医薬組成物の形態としうる。必要に応じて、該医薬組成物と、他の抗癌剤（例えば化学療法剤、抗体医薬、等）及び／又は他の治療関連薬剤とを組み合わせた、いわゆる医薬キットとすることもできる。

担体又は希釈剤は、製剤の形態、すなわち通常、固体製剤、半固体製剤又は液体（若しくは、溶液）製剤、或いは剤型（若しくは、投与形態）、に応じて変化しうる。剤型として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ゲル剤等の経口投与製剤、又は、注射剤、点滴剤、経粘膜投与剤（例えば、経鼻投与剤等）、経皮投与剤、リポソーム剤、経直腸投与剤（若しくは坐剤）、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等による非経口投与剤を挙げることができる。

液体製剤用の希釈剤には、水性溶媒の場合には、例えば、蒸留水、滅菌水、リンゲル液、生理食塩水などが含まれる。必要に応じて、エタノールを適量混合することができる。リポソーム製剤、難水性製剤等の場合には、有機溶媒単独で又は有機溶媒／水混合液が担体又は賦形剤として使用されうる。有機溶媒の例には、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトニトリル、アセトン、ケトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、カカオ脂や大豆油などの油脂、並びにこれらの組み合わせが含まれる。

固体製剤用の担体又は賦形剤の例は、マルトース、ラクトース、スクロース、デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、等を含む。

添加剤には、製薬上許容されうる、例えば、賦形剤、増量剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、乳化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、等が挙げられる。

投与経路は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与、直腸内投与、腹腔内投与、脳内投与などを挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましい。

本発明の組成物中の核酸を生体内のヌクレアーゼから保護するために、リポソーム内に該核酸を封入することができる。リポソームは、通常、カチオン性リポソームが使用される（Ｙ．ＴＡＫＡＨＡＳＨＩｅｔａｌ．，ＹＡＫＵＧＡＫＵＺＡＳＳＨＩ１２７（１０）１５２５―１５３１（２００７））。カチオン性リポソームは陽性に荷電しており、陰性に荷電した細胞膜と静電気的に結合しやすく、受動的に細胞膜に結合したリポソーム複合体は、エンドサイトーシスを介して細胞質内に取り込まれ、エンドゾームから抜け出して細胞質内に放出されると考えられている。

本発明はさらに、抗癌剤としての上記組成物を被験体に投与することを含む、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療するための方法を提供する。

本発明によって治療しうる上記腫瘍は、例えば、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病及びリンパ腫などであるが、これらの腫瘍に制限されない。

例えば脳腫瘍の幹細胞での上記核酸の使用により優れた細胞増殖抑制効果が確認されたことから、本発明の核酸を有効成分とする組成物は、腫瘍幹細胞を標的とする抗癌剤としても優れたものであることが判明した。

組成物、被験体、投与量、投与経路、投与回数などは、上で記載したとおりである。

本発明の組成物は、化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤の投与と組み合わせて被験体に投与することができる。該組成物の投与は、化学療法剤、医薬抗体、免疫チェックポイント阻害剤などの他の癌治療剤の投与の前に、同時に、又は後に行うことができる。

化学療法剤の例は、非限定的に、特表２０１４−５０８５１５号公報に記載されるような抗癌剤、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、マイトキサントロン、等）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン、等）、ＤＮＡ鎖切断誘発剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、等）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、等）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキセート、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、フロックスウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン、等）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポフィロトキシン、テモゾロマイドなどである。

医薬抗体の例は、非限定的に、トラスツズマブ、ベバシツズマブを含む種々の市販抗体及び開発・上市される抗体である。

免疫チェックポイント阻害剤は、癌細胞が免疫細胞からの攻撃を回避することを抑制することによって癌細胞に対する免疫細胞の本来の攻撃力を回復するための薬剤であり、例えばPD-1(programmed cell death-1)やPD-L1(programmed death-ligand 1)に対する抗体（例えばニボルマブ、atezolizumab、等）などを包含する。

上記薬剤の投与量は、被験体の性別、年齢、体重、症状、重症度、副作用などを考慮して選択されるか、或いは、臨床現場で実際に使用される範囲の用量である。

本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。

〔実施例１〕
＜各種腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベル＞
種々の腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１の発現レベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。使用した腫瘍細胞株は、グリオーマ幹細胞株（ＧＳＣ）、グリオーマ細胞株（Ｔ９８，Ｕ２５１，ＳＫ−ＭＧ１及びＡＯ２）、乳癌細胞株（ＭＣＦ７，ＭＤＡ２３１，ＳＫ−ＢＲ３及びＴ４７Ｄ）、大腸癌細胞株（Ｌｏｖｏ，Ｃａｃｏ−２，ＲＫＯ，ＳＷ４８、ＳＷ４８０及びＳＷ１０８３）、前立腺癌細胞株（ＰＣ３，ＬＮＣａｐ及びＶｃａｐ）、肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２，Ｈｕｈ７及びＡ５４９）、肺癌細胞株（Ｈ９２０及びＰＣ９）、白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、バーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｊｉ）、並びに、リンパ腫細胞株（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ）である。

結果を、内部標準ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）に対するＴＵＧ１の相対発現比率で表し図１に示した。正常組織におけるＴＵＧ１の発現レベル（ＴＵＧ１／ＧＡＰＤＨ＝０．０５３９４（正常脳組織３症例の平均値））と比較すると、腫瘍細胞株におけるＴＵＧ１遺伝子の発現レベルは、多くの腫瘍細胞で高いことがわかる。

〔実施例２〕
＜ｓｉＲＮＡによるＴＵＧ１の標的配列の位置と抑制効果＞
ＴＵＧ１発現を抑制する核酸（ｓｉＲＮＡ）を設計するために、ＴＵＧ１ｌｎｃＲＮＡの塩基配列（ＮＲ＿１１０４９２（配列番号１）、ＮＲ＿１１０４９３（配列番号２）及びＮＲ＿００２３２３（配列番号３）の全体から標的配列領域の候補を選抜し（Ａ．Ｍ．Ｋｈａｌｉｌｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６：１１６６７−１１６７２，２００９）、ｓｉＤｉｒｅｃｔｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｄｉｒｅｃｔ２．ｒｎａｉ．ｊｐ／））、その領域に対するｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４（（注）これらの各配列には３'末端に２つのデオキシリボヌクレオチド配列が含まれている。））を北海道システムサイエンス社（札幌、日本）に依頼し作製した（図３）。

各種ｓｉＲＮＡをグリオーマ幹細胞株ＧＳＣ（１．０×１０^５細胞）へ終濃度３０ｎＭとなるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ライフテクノロジーズ社）を用いて添付プロトコールに従いそれぞれ導入した。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）はＳｉｌｅｎｃｅｒＳｅｌｅｃｔＮｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ＃１ｓｉＲＮＡ（ライフテクノロジーズ社、カタログ番号４３９０８４３）を用いた。ｓｉＲＮＡ導入３日後にＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準とし、コントロールｓｉＲＮＡに対するＴＵＧ１の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ社）にて定量した結果、８種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８）に対して有意のＴＵＧ１発現抑制効果を確認した（図２及び図４）。一方、ｓｉ−ＴＵＧ１＃９〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃１４については、十分なＴＵＧ１発現抑制効果が見られなかった。

さらにまた、上記の結果に基づいて、ＴＵＧ１標的領域として、配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２（図２における＃１の領域）、並びに／或いは、２９９７〜５１８１、２９４１〜５１１１、又は２９４１〜５１２５（図２における＃５−＃４までの領域）の領域を標的とすることが好ましいと認められた。

〔実施例３〕
＜ＧＳＣ腫瘍増殖抑制＞
実施例２で作製されＴＵＧ１発現抑制効果が認められた８種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉ−ＴＵＧ１＃１〜ｓｉ−ＴＵＧ１＃８）の各々を、実施例２に記載したとおりＧＳＣ腫瘍細胞内にリポフェクション法を用いて導入し、各ｓｉＲＮＡの導入３日後にトリパンブルー染色（ライフテクノロジーズ社）を用いて生存細胞数を測定し、コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）に対する抗増殖効果を解析した結果、解析に用いた８種類のｓｉＲＮＡについて有意な抗増殖効果が認められた（図５）。

〔実施例４〕
＜ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡによるＧＳＣ腫瘍増殖抑制＞
実施例２及び実施例３でＴＵＧ１の発現を最も効果的に抑制したｓｉ−ＴＵＧ１＃２のセンス鎖配列（（注）ＴＵＧ１のｌｎｃＲＮＡ配列部分と相補的な配列である。）に対してＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ；２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ_２−）核酸ヌクレオチド）修飾を行い３種類のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃２（配列番号３７）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃３（配列番号３８）；図６）をジーンデザイン社（大阪、日本）に依頼し作製し、ＴＵＧ１発現抑制効果を調べた。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２、及び上記のＬＮＡ修飾アンチセンスの各々をグリオーマ幹細胞株ＧＳＣへリポフェクション法により導入し、導入後３、７、１０日後にＲＮＡを回収しＴＵＧ１発現量の変化を継時的に定量した。

その結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることにより、ｓｉ−ＴＵＧ１＃２と比較しＴＵＧ１の発現抑制効果をより長期間保持できることが分かった（図７）。

さらに各ｓｉＲＮＡ、各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡの導入１０日後におけるＧＳＣの相対生存細胞数を測定した結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡについてのみ有意な抗増殖効果が認められた（図８）。

同様に、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６のアンチセンス鎖配列（（注）ＴＵＧ１のｌｎｃＲＮＡ配列部分と相補的な配列である。）に対してＬＮＡ修飾を行い３種類のＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ（ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃１（配列番号５１）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）；図９）をジーンデザイン社に依頼し作製し、ＴＵＧ１発現抑制効果を調べた。コントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６、及び上記のＬＮＡ修飾アンチセンスの各々をグリオーマ幹細胞株ＧＳＣへリポフェクション法により導入し、導入後３、７、１０日後にＲＮＡを回収しＴＵＧ１発現量の変化を継時的に定量した。

その結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることにより、ｓｉ−ＴＵＧ１＃６と比較しＴＵＧ１の発現抑制効果をより長期間保持できることが分かった（図１０）。

さらに各ｓｉＲＮＡ、各ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡの導入１０日後におけるＧＳＣの相対生存細胞数を測定した結果、ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡに対してより有意な抗増殖効果が認められ、とりわけＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃２（配列番号５２）とＬＮＡ−ＴＵＧ１−２＃３（配列番号５３）は優れた抗増殖効果が認められた（図１１）。

〔実施例５〕
＜前立腺癌増殖抑制＞
実施例２及び実施例３と同様の手順により前立腺癌細胞株ＰＣ３にｓｉ−ＴＵＧ１＃２をリポフェクション法にて導入した。導入３日後の前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＴＵＧ１発現レベルとＰＣ３株の相対細胞増殖率を上記実施例と同様に測定した。陰性対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を使用し、また、発現レベルは、同様に、内部標準ＧＡＰＤＨに対するＴＵＧ１の相対発現比率で表した。

その結果、ＴＵＧ１阻害による前立腺癌細胞株ＰＣ３の増殖抑制効果が認められた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。

〔実施例６〕
＜ＧＳＣ腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖抑制＞
グリオーマ幹細胞株ＧＳＣを皮下に移植したヌードマウスに、腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３となった時点を０日目とし、この時点から３日毎にＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１（配列番号３６）を各腫瘍に対して５μｇずつ直接投与し、３５日目まで腫瘍サイズを測定した。対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（「ＮＣ」）を同様にマウスに投与した。

その結果、図１３に示すように、ＬＮＡ−ＴＵＧ１−１＃１によるＧＳＣ増殖抑制効果が認められた。

本願では、特定の腫瘍細胞においてＴＵＧ１の発現を効果的に抑制する修飾ｓｉＲＮＡ及び修飾アンチセンスＲＮＡを作製し、それらのなかにＴＵＧ１発現を抑制するとともにグリオーマ等の腫瘍及び／又は腫瘍幹細胞の細胞増殖を抑制する核酸が見いだされた。特にＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡを用いることによって、より長期的に腫瘍内のＴＵＧ１発現を抑制し、腫瘍及び／又は腫瘍幹細胞増殖の抑制を有意に可能とすることを確認した。本発明により、ＴＵＧ１を標的とした核酸創薬がＧＢＭ治療に有効である可能性が示唆された。

配列番号４〜１９：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ
配列番号２０〜２１、２８〜２９、４３、４９：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ、この配列中（１）・・（１７）はＲＮＡである。
配列番号２２〜２７、３０〜３５、３９〜４２、４４〜４８、５０：ヒトＴＵＧ１に対するｓｉＲＮＡ、この配列中（１）・・（１９）はＲＮＡである。
配列番号３６：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１６）・・（１９）はロックされた核酸である。
配列番号３７：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（３）及び（１７）・・（１９）はロックされた核酸である。
（１９）はロックされた核酸である。
配列番号３８：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１７）・・（１９）はロックされた核酸である。
配列番号５１：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１８）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５２：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（３）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。
配列番号５３：ＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡ、この配列中（１）・・（４）及び（１９）・・（２１）はロックされた核酸である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

腫瘍幹細胞においてＴＵＧ１遺伝子の高発現を抑制する核酸を有効成分として含む、ＴＵＧ１遺伝子を正常組織と比べて高発現する腫瘍を有する被験体を治療又は予防するための組成物であって、前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡの配列番号１、２又は３の塩基配列において、それぞれ、ヌクレオチド番号１０４４〜１０６２、１０４４〜１０６２、又は１０４４〜１０６２、ヌクレオチド番号２９９７〜３４５８、２９４１〜３３９８、又は２９４１〜３４１２、並びに／或いは、ヌクレオチド番号３８５５〜５１８１、３７８５〜５１１１、又は３７９９〜５１２５の領域を標的とする核酸であり、かつ前記腫瘍が、脳腫瘍、大腸癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、白血病及びリンパ腫からなる群から選択されることを特徴とする、前記組成物。
前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、若しくはその修飾ＲＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡである、請求項１に記載の組成物。
前記核酸が、配列番号４〜１１の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列番号１２〜１９の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ又はその修飾ＲＮＡのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである、請求項１又は２に記載の組成物。
前記修飾ＲＮＡが、１つ又は２つ以上の修飾ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項２又は３に記載の組成物。
前記デオキシリボヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡが、配列番号２０〜２７の塩基配列からなるセンス鎖と、該センス鎖のそれぞれに相補的な配列を含む配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ、或いは、配列番号２８〜３５の塩基配列からなるアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項４に記載の組成物。
前記修飾ヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡが、各末端に、２'−Ｏ、４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ _２ −）もしくは２'−Ｏ，４'−Ｃエチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ _２ＣＨ _２ −）を有するロックされた少なくとも２つのＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含むＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、請求項４に記載の組成物。
前記修飾ＲＮＡが、配列番号３６〜３８、５１〜５３のいずれかの塩基配列からなるＬＮＡ修飾アンチセンスＲＮＡである、請求項２、４〜６のいずれか１項に記載の組成物。
前記核酸が、ＴＵＧ１遺伝子の転写体ＲＮＡに対する、ｓｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はアンチセンスＤＮＡ、を含むベクターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
前記腫瘍が、脳腫瘍である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
前記核酸が、（ｉ）ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合もしくはホスホロアミデート結合によるホスホジエステル結合の置換、（ｉｉ）２'−Ｏ，４'−Ｃメチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ _２ −）もしくは２'−Ｏ，４'−Ｃエチレンブリッジ（−Ｏ−ＣＨ _２ＣＨ _２ −）、（ｉｉｉ）２’−メトキシエトキシもしくは２’−メトキシ、及び（ｉｖ）２’−ハロゲンからなる群から選択される修飾を含む１つ又は２つ以上の修飾リボヌクレオチド、並びに／或いは、１つ又は２つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
前記ｓｉＲＮＡの前駆体ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡである、請求項２又は３に記載の組成物。