JP6185473B2 - 非アルコール性脂肪性肝炎および非アルコール性脂肪肝疾患を処置するためのガラクト−ラムノガラクツロネート組成物 - Google Patents

Description

発明の背景
非アルコール性の脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、米国において一般的な肝臓疾患である。これらの疾患は、組織病理学的にはアルコール性肝臓疾患に類似するが、アルコールを殆どまたは全く摂取しない人に起こる。その肝臓における病理学的変化は、肝細胞における脂肪蓄積、肝細胞変性の証拠、炎症細胞の浸潤、過剰な繊維組織の沈着、肝細胞結節形成、肝硬変および肝細胞癌を包含するが、それらに限定されない。このような疾患に特異的な治療法は今のところ存在しない。

したがって、関連する肝線維症を伴うかまたは伴わない非アルコール性脂肪性肝炎の処置方法を提供する必要がある。

発明の概要
本発明のいくつかの側面は、許容される医薬担体中にガラクトース含有多糖化合物を含む非経口または経腸投与用処置組成物を用いて、脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、または肝硬変および肝細胞癌を伴う非アルコール性脂肪性肝炎の患者を処置する方法に関する。本発明はいくつかの側面において、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症を伴うＮＡＳＨ、肝硬変を伴うＮＡＳＨ、または肝硬変および肝細胞癌を伴うＮＡＳＨを処置するための、ガラクト−ラムノガラクツロネート化合物を含有する組成物に関する。本発明は他の側面において、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症を伴うＮＡＳＨ、肝硬変を伴うＮＡＳＨ、または肝硬変および肝細胞癌を伴うＮＡＳＨを処置するための医薬組成物を製造するための、ガラクト−ラムノガラクツロネート化合物の使用に関する。いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネートおよび処置剤の混合物を、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症を伴うＮＡＳＨ、肝硬変を伴うＮＡＳＨ、または肝硬変および肝細胞癌を伴うＮＡＳＨの処置のため、あるいは該処置用医薬組成物の製造のために使用しうる。

いくつかの態様において、ガラクトース含有多糖化合物は、ガラクト−ラムノガラクツロネートまたはガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートである。

いくつかの態様において、本発明の方法は、許容される医薬担体中にガラクト−ラムノガラクツロネート化合物を含む非経口または経腸投与用組成物を得るステップ; 該非経口投与用組成物を有効量で、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症を伴うＮＡＳＨ、肝硬変を伴うＮＡＳＨ、または肝硬変および肝細胞癌を伴うＮＡＳＨの１つに罹患した患者に投与するステップを含んでなる。

いくつかの態様において、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ評価システムにおける重篤度の少なくとも１ポイントの低下、ＮＡＳＨ活動性の血清マーカーレベルの低下、ＮＡＳＨ疾患活動性の低下、またはＮＡＳＨの医学的結果の軽減をもたらしうる。

いくつかの態様において、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝組織切片における肝細胞中の微小および大滴性脂肪粒子の評価によるかまたは非侵襲的造影法（超音波または磁気共鳴を包含するが、それらに限定されない）により決定される、肝臓脂肪蓄積（脂肪症）の低減をもたらしうる。いくつかの態様においては、肝脂肪蓄積は、脂肪を含む肝細胞の割合で、およびＮＡＦＬＤ評価システムによる評価において、または造影分析において、少なくとも１０％低減される。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝組織切片において毒性および細胞体積調節不能を示唆する肝細胞膨化の評価により決定される肝細胞風船化の低減をもたらしうる。いくつかの態様においては、肝細胞風船化は、膨化肝細胞の割合として、およびＮＡＦＬＤ評価システムによる評価において、少なくとも１０％低減される。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝組織標本の肝門、中心および小葉域における好中球およびリンパ球の数による評価において、肝組織標本における炎症細胞の浸潤の低減をもたらしうる。いくつかの態様においては、肝組織標本における炎症細胞の浸潤は、ＮＡＦＬＤ評価システムで評価された炎症細胞の割合として、少なくとも１０％低減される。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝組織切片のシリウスレッド染色による定量分析により測定して、肝コラーゲン蓄積の低減をもたらしうる。いくつかの態様においては、肝コラーゲン蓄積は、コラーゲンを示唆するシリウスレッド染色陽性の肝組織の割合として、少なくとも５％低減される。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、ＮＡＳＨ活動性の血清マーカーレベルの低下をもたらしうる。いくつかの態様においては、ＮＡＳＨ活動性の血清マーカーは、トランスアミナーゼの血清レベル、還元型または酸化型コエンザイムＱの血清レベル、または当分野で知られる他のＮＡＳＨ活動性血清マーカーの組み合わせを包含するが、それらに限定されない。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝線維症の生化学的マーカーレベルの低下、肝線維症もしくは肝硬変の非侵襲的検査、または肝線維症もしくは肝硬変の組織学的評価を含む証拠に基づいて、肝線維症または肝硬変の軽減をもたらしうる。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、NASH Clinical Research Network（the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases（NIDDK）により２００２年に設立）により提案される、広く用いられる評価システムであるＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）を包含するがそれらに限定されない、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ評価システムによる重篤度において、少なくとも１ポイントの低下をもたらしうる。

いくつかの態様においては、必要とする患者に投与されるときの組成物の有効用量は、肝線維症または肝硬変を伴うＮＡＳＨの医学的結果、例えば門脈圧亢進、低下した肝タンパク質合成、高ビリルビン血症または脳症の軽減をもたらしうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は多糖であり、ガラクト−ラムノガラクツロネート（ＧＡ−ＲＧ）として化学的に定義しうる。いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネートは、選択的に解重合された分岐ヘテロポリマーで、その主鎖は、主に１，４−結合ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）部分からなり、比較的少ない主鎖組成は交互の１，４−結合ＧａｌＡおよび１，２−結合ラムノース（Ｒｈａ）であり、それに、いくつかの、主に１，４−β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）を包含する側鎖が結合している。いくつかの態様においては、化合物はガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートで、その主鎖は、主に１，４−結合ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）部分からなり、比較的少ない主鎖組成は交互の１，４−結合ＧａｌＡおよび１，２−結合ラムノース（Ｒｈａ）であり、それに、いくつかの、主に１，４−β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）および１，５−α−Ｌ−アラビノース（Ａｒａ）残基を含む側鎖が結合している。他の比較的少ない側鎖構成成分は、キシロース（Ｘｙｌ）、グルコース（Ｇｌｕ）およびフコース（Ｆｕｃ）を包含しうる。

いくつかの態様においては、ガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートは、１，４−β−Ｄ−ガラクトースおよび１，５−α−Ｌ−アラビノース残基を２：１または３：１の比で含む。いくつかの態様においては、ガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートは、１，４−β−Ｄ−ガラクトース残基、１，５−α−Ｌ−アラビノース残基またはそれらの組み合わせを総モル炭水化物の少なくとも１０モル％の量で含む。

いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネートまたはガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートは、５〜５５ｋＤａ、２〜８０ｋＤａ、または２０〜７０ｋＤａの範囲の分子量を有する。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の処置剤と組み合わせて使用しうる。いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネートを混合物として使用しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のシステアミンもしくは薬学的に許容されるその塩またはシスタミンもしくは薬学的に許容されるその塩と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、グリチルリチン、シサンドラ（schisandra）、アスコルビン酸、Ｌ−グルタチオン、シリマリン（silymarin）、リポ酸およびｄ−α−トコフェロールを含む組成物の非経口または経口投与を包含するがそれに限定されないさまざまな処置有効量の抗酸化化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、水溶性ビタミンＥ製剤、カロテノイド混合物またはセレンを含む組成物の非経口または経口投与を包含するがそれに限定されないさまざまな処置有効量の抗酸化化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のレシチンまたはビタミンＢ複合体の非経口または経口投与と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸または他の天然もしくは合成胆汁酸または胆汁酸塩を包含するがそれらに限定されない、処置有効量の胆汁塩製剤と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のカンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体アンタゴニストおよび／またはインバースアゴニストと組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（peroxisome proliferator-activated receptor）)活性調節剤と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物は前記ガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、下記式で示されるチオアミド結合および第四級アンモニウム置換基を有するベンゾチアゼピンまたはベンゾチエピン化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＲＵを阻害するための、処置有効量のＲＮＡアンチセンス構築物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、ヒスタミンＨ_３アンタゴニストとして有用な処置有効量のへテロ原子結合置換ピペリジンおよびその誘導体と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、ステアロイル−コエンザイムαデルタ−９デサチュラーゼを阻害する処置有効量のアザシクロペンタン誘導体と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、アディポネクチンの分泌促進または誘導活性を有する処置有効量のアシルアミド化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の第四級アンモニウム化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のイソフラボン化合物と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のマクロライド抗生物質と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、多発性硬化症の処置に現在用いられている免疫調節剤である処置有効量のグラチラマーアセテート（Glatiramer acetate；Copolymer 1、Cop-1またはCopaxone（Teva Pharmaceuticalsから市販されている）としても知られる）と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、組換えペントラキシン−２を包含するがそれらに限定されない、処置有効量のペントラキシンタンパク質と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のスタチン、例えばアトルバスタチンおよびシンバスタチンのようなＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（それに限定されない）と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のＮ−アセチルシステインと組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、小有機ガレクチン阻害剤、モノクローナル抗体、ＲＮＡ阻害剤、小結合ペプチドまたはタンパク質阻害剤を包含するがそれらに限定されない、単一のガレクチンタンパク質または一連のガレクチンタンパク質を阻害し得る処置有効量のもう１つのガレクチン阻害剤と組み合わせて使用される。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、リシルオキシダーゼ（またはコラーゲンを架橋する他の同様の酵素）を阻害するモノクローナル抗体または結合組織増殖因子に対するモノクローナル抗体と組み合わせて使用される。

いくつかの態様においては、本発明の非経口投与用組成物の有効性を、糖尿病を発症させ高脂肪食を与えたマウスを包含するがそれらに限定されない、ＮＡＳＨ動物モデルへの投与によって決定しうる。いくつかの態様においては、本発明組成物のＮＡＳＨ動物モデルへの投与により、肝細胞脂肪蓄積における少なくとも５％の軽減、肝臓の炎症細胞浸潤における少なくとも５％の軽減、または肝コラーゲン量の少なくとも５％の減少（形態学的定量による測定）がもたらされうる。

添付の図面を参照して本発明をさらに説明する。複数の図面を通じて、同様の構造は同様の数字で示される。示される図面は必ずしも縮尺が一定ではなく、全般に本発明の原理の説明に重点が置かれている。

図１は、脂肪性肝炎のＳＴＡＭマウスモデルの処置実験デザインを示す。 図２Ａは、６〜９週処置群のＳＴＡＭマウスにおける体重変化を示すグラフである。図２Ｂは、９〜１２週処置群のＳＴＡＭマウスにおける体重変化を示すグラフである。 図３Ａは、ＳＴＡＭマウスの全血中グルコースを６〜９週処置群間で比較して示すグラフである。図３Ｂは、ＳＴＡＭマウスの全血中グルコースを９〜１２週処置群間で比較して示すグラフである。 図４は、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびシリウスレッドで染色した、正常およびＮＡＳＨマウスモデルの組織を示す。 図５Ａは、ビヒクル処置ＮＡＳＨマウスモデルおよびＧＲ−ＭＤ−０２処置ＮＡＳＨマウスモデルの組織を示す。図５Ｂは、ＳＴＡＭマウスのＮＦＬＤ活動性スコアを処置群間で比較して示すグラフである。 図６は、６〜９週および９〜１２週試験群のシリウスレッド染色肝組織を示す。 図７Ａは、肝組織のシリウスレッド陽性面積を６〜９週試験群間で比較して示すグラフである。図７Ｂは、肝組織のシリウスレッド陽性面積を９〜１２週試験群間で比較して示すグラフである。図７Ｃは、肝組織のシリウスレッド陽性面積を全動物の試験群間で比較して示すグラフである。 図８Ａは、試験群の肝組織のα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の免疫組織化学的染色を示す。図８Ｂは、試験群の肝組織のα−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）のデジタルモルホメトリーを示す。 図９Ａは、試験群の肝組織のガレクチン−３の免疫組織化学的染色を示す。図９Ｂは、試験群の肝組織のガレクチン−３のデジタルモルホメトリーを示す。

発明の詳細な説明
本発明の詳細な態様を開示するが、開示される態様は本発明の説明に過ぎず、さまざまな形態で実施しうると理解されるべきである。さらに、本発明のさまざまな態様に関連して示される例は、説明を目的としたものであって、制限的なものではない。また、図面は必ずしも縮尺が一定ではなく、特定の構成要素の詳細を示すために、いくつかの特徴に強調が置かれうる。さらに、図面に示される測定結果、仕様等は、説明を目的としたものであって、制限的なものではない。したがって、本書に開示される特定の構造的および機能的詳細は、制限的なものではなく、本発明をさまざまに利用するよう当業者に教示するための典型的な基準に過ぎないと解釈されるべきである。

特記されない限り、本書に示されるパーセンテージはいずれも、重量／重量である。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の主な特徴は、最小限の炎症を伴う、肝細胞における脂肪蓄積である。患者は通例、やや上昇した血清肝トランスアミナーゼレベルの、またはコンピュータ断層撮影もしくは超音波のような非侵襲的試験における脂肪肝の疑いの故に行われる肝生検に基づいて同定される。

一部のＮＡＦＬＤ患者は、小葉、中心静脈および門脈域内の炎症細胞（好中球またはリンパ球を包含するがそれに限定されない）の浸潤が進行し、肝細胞損傷（風船化変性を包含するがそれに限定されない）の証拠が加わった脂肪肝である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を有することが見出される。ＮＡＳＨのこの炎症状態により、線維組織（コラーゲンを包含するがそれに限定されない）の沈着が起こり得、それが肝硬変、結節形成および最終的には肝細胞癌をもたらしうる。

多くのＮＡＳＨ患者は健康であると自覚し、肝臓に問題があることに気付かないので、疾患の進行は潜行性である。無症状であってもＮＡＳＨは重篤であり得、肝臓に線維性物質が蓄積し得、それにより重篤な瘢痕化および／または肝硬変ならびに場合によっては肝細胞癌が起こり得る。したがって、早期にＮＡＳＨを同定し、その進行を追跡することのできる臨床試験が必要である。

ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨは、よく見られる疾患である。米国人の１０〜２０％がＮＡＦＬＤに、３〜５％がＮＡＳＨに罹患していると、米国の国立衛生研究所により報告されている。子供および若年を含め肥満および糖尿病の患者の数が増加しているので、いずれの疾患もより一般的なものとなりつつある。このことは、ＮＡＳＨが肝硬変に進行しうるという事実により、重大な健康問題となっている。

ＮＡＳＨはより一般的になっているが、その根本原因は未だ不明である。ＮＡＳＨは過体重または肥満の中年（その多くはメタボリックシンドローム、インスリン抵抗性または顕性糖尿病を有する）に最もよく見られる。しかしながら、ＮＡＳＨは単に肝臓を冒す肥満ではない。ＮＡＳＨは子供および若年をも冒しうる。

ＮＡＳＨにおける肝臓損傷の近因はわかっていない。いくつもの説が提唱されている。そのいくつかは、インスリンの作用に対する肝細胞抵抗性、肝臓を損傷しさらなる炎症細胞を集める、脂肪細胞および他の炎症細胞による炎症性サイトカインの産生、ならびに肝細胞を損傷し炎症を誘発する反応性酸素ラジカルの生成を伴う肝細胞における酸化ストレスを包含する。

ＮＡＳＨに特異的な治療法は今のところ無く、一般的な健康上の注意が患者に与えられるだけである。それには、減量、バランスの取れた健康的な食事を採ること、身体活動を増やすこと、ならびにアルコールおよび不要の服薬を避けること、が含まれる。減量は、一部のＮＡＳＨ患者において血清肝検査における改善をもたらし得、組織学的肝損傷の証拠における改善をもたらしうるが、重篤な肝疾患を回復しない。しかも、ＮＡＳＨ患者が必ずしも過体重であるわけではない。

抗酸化剤、例えばビタミンＥ、セレン、ベタイン、および糖尿病治療薬、例えばメトフォルミン、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾンの使用を包含するさまざまな試験的アプローチの評価がＮＡＳＨ患者において既になされ、または現在なされている。これまでの臨床結果はいずれも満足できるものではない。

最近、ＮＡＳＨの病因におけるガレクチン−３タンパク質の関与が指摘された。ガレクチン（ガラクチンまたはＳ−レクチンとしても知られる）は、β−ガラクトシドを結合するレクチンのファミリーである。一般名としてのガレクチンは、動物レクチンのファミリーのために１９９４年に提唱された（Barondes, S.H.ら: Galectins: a family of animal b-galactoside-binding lectins. Cell 76、597-598、1994)。このファミリーは、β−ガラクトシドに親和性を有する少なくとも１つの特徴的な糖鎖認識ドメイン（carbohydrate recognition domain; ＣＲＤ）を有し、ある共通の配列要素を有することにより定義される。同一ペプチド鎖中に、一部のガレクチンは、１つのＣＤＲと少数のさらなるアミノ酸とを有し、他のいくつかのガレクチンは、リンクペプチドにより連結された２つのＣＲＤを有し、１つのガレクチン（ガレクチン−３）は、１つのＣＲＤとそれに結合した１つの異なるドメインとを有する。ガレクチン糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）は、約１３５のアミノ酸からなるβサンドイッチ構造を有する。その２枚のシートがやや向き合って、６枚のストランドが凹面を、５枚のストランドが凸面を形成している。その凹面が、糖鎖が結合する凹みを形成する（Leffler H、Carlsson S、Hedlund M、Qian Y、Poirier F (2004). "Introduction to galectins". Glycoconj. J. 19 (7-9): 433-40）。

例えば成長、分化、形態形成、腫瘍転移、アポトーシス、ＲＮＡスプライシングなどの多様な生物学的現象がガレクチンと関連することがわかっている。しかしながら、ガレクチンが、その機能、特に糖鎖認識に関する機能を発揮するメカニズムについてはあまりわかっていない。

一般に、糖鎖ドメインは糖タンパク質のガラクトース残基に結合する。１個またはタンデムに２個の糖鎖ドメインを有する少なくとも１５の哺乳動物ガレクチンタンパク質が同定されている。

各ガレクチンタンパク質は、ガラクトース結合ドメイン、および他のガレクチンタンパク質とのホモまたはヘテロ二量化を可能にする他のドメインを有する。ガレクチンタンパク質は、生理的条件下に広範な細胞および組織において低レベルで発現され、核、細胞質において見られ、独特の分泌経路で細胞外空間に分泌される。

ガレクチンのガラクトース結合ドメインは、細胞表面上または細胞外マトリックスタンパク質上に位置するガラクトース含有糖タンパク質に結合する。ガレクチンの二量化ドメインは、ガレクチンタンパク質の相互作用を促進し、それにより膜またはマトリックスの糖タンパク質間の相互作用を生じる。このような相互作用は、細胞−細胞、細胞−マトリックス、およびマトリックス−マトリックス相互作用、ならびに膜受容体の会合を促進し、それが細胞受容体活性の活性化、不活性化または調節をもたらして細胞内シグナル伝達およびそれに続く事象の調節を導きうる。

一部のガレクチンタンパク質は、病的状況において著しくアップレギュレートされ、多量に細胞から分泌される。組織炎症状態および修復（線維化、瘢痕化）において、マクロファージおよびリンパ球を包含するがそれらに限定されない複数の炎症細胞が、ガレクチン、特にガレクチン−１およびガレクチン−３を発現する。

炎症および線維成長を包含する多くの病態における重要成分としてのガレクチン−３の役割を調べるために、ガレクチン−３遺伝子欠損マウスが用いられている。そのようなガレクチン−３ノックアウトマウスは、毒素投与による肝線維形成、肺線維形成、および腎線維形成に対し抵抗性であることが示された。

ガレクチン−３ノックアウトマウスはまた、ＮＡＳＨにおけるガレクチン−３の重要性を調べるためにも用いられている。そのような研究において、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの発症を誘導するよう、高脂肪食がマウスに与えられた。正常マウスは、脂肪肝、肝臓における炎症性浸潤、および肝線維症を容易に発症した。全く対照的に、ガレクチン−３ノックアウトマウスは、あまり脂肪肝を発症せず、炎症性浸潤および線維症も僅かであった。このようなデータは、ガレクチン−３がＮＡＳＨ治療のための重要なターゲットでありうることを示唆している。

ガレクチン−３抑制が、本発明におけるガラクト−ラムノガラクツロネートの有効性を説明する可能性のある１つのメカニズムである。

用語「有効量」は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨまたは線維症もしくは肝硬変を伴うＮＡＳＨに罹患した動物またはヒトに、非経口用量として、または経口製剤において投与されたとき、ＮＡＳスコアを少なくとも１ポイント改善するかまたはコラーゲン面積％を少なくとも５％低下することのできる、ガラクト−ラムノガラクツロネート、またはガラクト−ラムノガラクツロネートと組み合わせた他の薬剤の量を意味する。

いくつかの側面において本発明は、それを必要とする対象において、ガレクチンが関与する１つまたはそれ以上の疾患、疾病または状態を処置（抑制、緩和、改善、軽減または進行遅延）する方法または予防（発症遅延または発症危険性低下）する方法に関する。そのような方法は、対象に有効量のガラクト−ラムノガラクツロネート化合物を投与すること、またはガラクト−ラムノガラクツロネート化合物含有組成物を、脂肪肝、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症を伴うＮＡＳＨ、肝硬変を伴うＮＡＳＨ、または肝硬変および肝細胞癌を伴うＮＡＳＨの１つを有する対象に投与することを含む。

用語「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の任意の溶媒、分散媒、例えばヒトアルブミンまたは架橋ゼラチンポリペプチド、コーティング、抗細菌および抗真菌化合物、浸透圧調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはグルタミン酸ナトリウム、ならびに吸収遅延化合物等を意味する。薬理活性物質に対してそのような媒体および化合物を使用することは、当分野でよく知られている。好ましくは、担体は、経口、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または硬膜外投与（例えば注射または注入による）のために適当である。投与経路に応じて、活性化合物を、不活性化しうる酸の作用および他の自然条件から保護するために、材料でコーティングしうる。

用語「有効性」は、いくつかの態様において、ＮＡＳＨまたは線維症もしくは肝硬変を伴うＮＡＳＨの肝組織学的知見において、ＮＡＳスコアまたはコラーゲン％により決定される改善が見られることを意味する。

いくつかの態様において、本発明の処置方法は、許容される医薬担体中に化合物を含む非経口または経腸投与用組成物を得るステップを含む。いくつかの態様においては、前記化合物は多糖であり、選択的に解重合された分岐ヘテロポリマーである、ガラクト−ラムノガラクツロネートとして化学的に定義し得、その主鎖は、主に１，４−結合ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）部分からなり、比較的少ない主鎖組成は交互の１，４−結合ＧａｌＡおよび１，２−結合ラムノース（Ｒｈａ）であり、それに、多くの、主に１，４−β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）を含む側鎖が結合している。他の比較的少ない側鎖構成成分は、アラビノース（Ａｒａ）、キシロース（Ｘｙｌ）、グルコース（Ｇｌｕ）およびフコース（Ｆｕｃ）を包含しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は多糖であり、選択的に解重合された分岐ヘテロポリマーである、ガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートと称されるガラクト−ラムノガラクツロネートのサブタイプとして化学的に定義し得、その主鎖は、主に１，４−結合ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）部分からなり、比較的少ない主鎖組成は交互の１，４−結合ＧａｌＡおよび１，２−結合ラムノース（Ｒｈａ）であり、それに、多くの、主に１，４−β−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）および１，５−α−Ｌ−アラビノース（Ａｒａ）残基を含む側鎖が結合している。他の比較的少ない側鎖構成成分は、キシロース（Ｘｙｌ）、グルコース（Ｇｌｕ）およびフコース（Ｆｕｃ）を包含しうる。

いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネート化合物は、米国特許第8,236,780号および国際特許出願番号PCT/US12/55311（"Composition of Novel Carbohydrate Drug for Treatment of Human Diseases"）（それら全体を引用により本書の一部とする）に記載される方法により製造しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、天然の、高度に分岐し、最小限度に加工され、高度にメトキシル化されたＵＳＰペクチン、例えば８〜１２％のペクチンを含有するリンゴ絞りかすから製造されたものから合成されうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、１，４−β−Ｄ−Ｇａｌおよび１，５−α−Ｌ−Ａｒａに富む側鎖を保存しながら、グリコシド結合したメトキシル化α−１，４−結合ＧａｌＡの十分に調節され特定された加水分解により合成されうる。１，４−β−Ｄ−Ｇａｌおよび１，５−α−Ｌ−Ａｒａの量は、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）法およびＡＥＬＣ−ＰＡＤ（陰イオン交換液体クロマトグラフィー−パスルアンペロメトリック検出）法により定量的に測定しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、１〜１００ｍＭのＣｕ^＋＋のようなさらなる還元型遷移金属イオンの存在下または不存在下にアスコルビン酸および／または過酸化物から生じたイオン化ＯＨ⁻によるグリコシド結合の標的化過酸化開裂による分解による解重合を含む方法によって製造しうる。Ｃａ^＋＋またはＦｅ^＋＋のような他の遷移金属も、この目的のために使用しうる。

いくつかの態様においては、解重合された化合物は、最高８７％の初期レベルと比較して４０〜７０％のメトキシル化度を有する解重合化合物を生成するよう、調節され限定された脱メトキシル化を開始するように、２〜６０℃の温度で１０〜３０分間、８〜１０のｐＨに暴露することができ、中程度メトキシル化化合物（middle-methoxylated compound）と称されうる。ガラクツロン酸の完全なメトキシル化は、およそＤＥ８７％であると考えられる。

いくつかの態様においては、解重合組成物は、残留するエンドトキシン、銅および重金属、農業汚染物ならびに他の不純物の除去のために、高温の酸性アルコール（例えば３０〜８０℃の範囲の温度）による複数回の洗浄に付すことができる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、ＳＥＣ−ＲＩ法および／またはＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法により測定される２０００〜８００００ダルトン、２００００〜７００００ダルトンまたは５０００〜５５０００ダルトンの平均分子量分布を有する分岐へテロポリマーである、ガラクト−ラムノガラクツロネートまたはガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートとして化学的に定義される多糖である。

いくつかの態様においては、本発明の化合物における１，５−α−Ｌ−Ａｒａ残基のモル％は０または１％までの微量でありうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、およそ１：１ないし３：１の範囲の比の１，４−β−Ｄ−Ｇａｌおよび１，５−α−Ｌ−Ａｒａ残基を炭水化物の総モルの１０％を超えうるモル％で含むガラクトアラビノ−ラムノガラクツロネートである。

いくつかの態様においては、前記化合物は、静脈内、皮下、関節内、吸入および経口を包含するがそれらに限定されない経路による多元的投与用の処置製剤に適合するように十分に低下された分子量範囲（例えば約２０００〜８００００Ｄ）を有する高度に可溶な修飾多糖でありうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、柑橘類、リンゴまたはビートを包含するがそれらに限定されない任意の植物源に由来しうる、天然の、高度に分岐し、最小限度に加工され、高度にメトキシル化されたＵＳＰペクチンから合成されうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、天然の、高度に分岐し、最小限度に加工され、高度にメトキシル化されたＵＳＰペクチン、例えば８〜１２％のペクチンを含有するリンゴ絞りかすから製造されたものから合成されうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、１，４−β−Ｄ−Ｇａｌおよび１，５−α−Ｌ−Ａｒａに富む側鎖を保存しながら、グリコシド結合したメトキシル化α−１，４−結合ＧａｌＡの十分に調節され特定された加水分解により合成されうる。１，４−β−Ｄ−Ｇａｌおよび１，５−α−Ｌ−Ａｒａの量は、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）法およびＡＥＬＣ−ＰＡＤ（陰イオン交換液体クロマトグラフィー−パスルアンペロメトリック検出）法により定量的に測定しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物は、１〜１００ｍＭのＣｕ^＋＋のようなさらなる還元型遷移金属イオンの存在下または不存在下にアスコルビン酸および／または過酸化物から生じたイオン化ＯＨ⁻によるグリコシド結合の標的化過酸化開裂による分解による解重合を含む方法によって製造しうる。Ｃａ^＋＋またはＦｅ^＋＋のような他の遷移金属も、この目的のために使用しうる。

いくつかの態様においては、解重合された化合物は、最高８７％の初期レベルと比較して４０〜７０％のメトキシル化度を有する解重合化合物を生成するよう、調節され限定された脱メトキシル化を開始するように、２〜３０℃の温度で１０〜３０分間、８〜１０のｐＨに暴露することができ、中程度メトキシル化化合物と称されうる。ガラクツロン酸の完全なメトキシル化は、およそＤＥ８７％であると考えられる。

いくつかの態様においては、解重合組成物は、残留するエンドトキシン、銅および重金属、農業汚染物ならびに他の不純物の除去のために、高温の酸性アルコール（例えば５０〜６５℃の範囲の温度）による複数回の洗浄に付すことができる。

いくつかの態様においては、天然に生成するポリマーを、アルキル化基を還元（脱メトキシル化または脱アセチル化）し、分子量を所望の範囲に低下するように改変することにより、可溶性の化学的に改変されたガラクト−ラムノガラクツロネートを調製する。化学的改変の前には、天然多糖は、複数の糖分岐、例えばグルコース、アラビノース、ガラクトース等の１〜２０の単糖からなる分岐（このような分岐は、例えばラムノースのような天然単糖を介して主鎖に結合しうる）を伴って約４００００〜１００００００Ｄの分子量範囲を有しうる。このような分子はさらに、わずか約２％ないし多くは約７０％までエステル化されうる単一または一連のウロン酸糖主鎖を含みうる。複数の分岐はそれ自体、複数の糖分岐を有し得、複数の分岐は任意に、中性糖および中性糖誘導体（主に疎水性部分を生じる）を含む。

いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネート組成物は、リンゴ、柑橘類またはビートペクチンを包含するがそれらに限定されない任意の植物源由来のペクチン原料（そのいくつかは、ＵＳＰペクチン材料として市販されている）を用いて、熱、高ｐＨ、低ｐＨ、さまざまな形態の分子量排除濾過（またはそのような方法の組み合わせ）を包含するさまざまな処理によって製造しうる。

いくつかの態様においては、本発明の化合物は、実質的に脱メトキシル化された、ペンダント基にラムノース残基を有するポリガラクツロン酸主鎖を含む一般群に含まれる。この種の材料においては、主鎖からのペンダントの末端ガラクトース単位がガレクチンタンパク質に結合すると考えられる。分子の残部は、免疫系反応を調節する化合物の作用を増強しうると考えられる。推測による制約を望むわけではないが、分子の残部は、ガレクチンタンパク質の残部と相互作用し得、および／またはそれに対する糖部分の結合を長く維持しうると考えられる。

いくつかの態様においては、本発明の処置用組成物は、経口的に、静脈内注射によって、皮下注射によって、または注入によって投与しうる。

上記説明は主として、改質ペクチンに基づく処置物質に関するものであるが、本発明はそれにより制限されるものではないと理解すべきである。本発明の一般原則に従い、ガレクチンと相互作用し、それを抑制することのできる広範な化合物のいずれをも使用しうる。そのような物質は一態様において、炭水化物物質を包含するが、それはそのような物質は毒性が低く、ガレクチンと強い相互作用を示すか、または強い抗炎症作用を示すからである。改質ペクチン物質は、ある一群の炭水化物物質を構成する。同様に、その合成および半合成類似体、例えばポリガラクツロン酸物質も同様に使用しうる。

本発明のさらに別の種類の物質は、典型的には炭水化物であってガレクチンに結合することのできる第１の部分と、それに結合した、タンパク質の活性を不活性化または低下する第２の部分を有する分子を含む。この第２の部分は炭水化物である必要はなく、ガレクチンタンパク質の活性部分またはガレクチンと相互作用する別のタンパク質の活性部分を含むタンパク質のセグメントを架橋または変性する物質を含みうる。そのような物質は、例えば硫黄または他のカルコゲン元素のような活性種を、単独で、または例えばチオール、スルフヒドリルなどのような組み合わせとして含む。他の活性種は、シアノ基、チオシアネート、アルキル化剤、アルデヒドなどを含みうる。いくつかの活性種は、モノクローナル抗体を包含するがそれに限定されないタンパク質でありうる。

本発明のいくつかの側面は、ＮＡＳＨまたはＮＡＬＤの処置において適当または向上した効果を有するＮＡＳＨ処置用製剤に関する。いくつかの態様においては、ＮＡＳＨ処置用製剤は、有効量のガラクト−多糖を含む。いくつかの態様においては、ＮＡＳＨ処置用製剤は、単独で、または有効量の処置剤との混合物として、もしくは有効量の処置剤と投薬計画において併用して投与しうる。該製剤はさらに、さらなるＮＡＳＨ処置剤または賦形剤（ここで、製剤は粉末状または液状である）を含んでよい。

他の一態様において、有効量のガラクトース含有多糖は、経口投与処方において投与しうる。該処方は、ガラクトース含有多糖の経口吸収を向上させる、化合物の物理的改変方法またはさまざまな物質の添加を含みうる。

いくつかの態様においては、ガラクト−ラムノガラクツロネートを混合において使用しうる。用語「混合」は、１種を超える成分が混ぜ合わされて組み合わせを形成することを意味する。本発明の目的のためには、「混合」は、投与前、投与後、または投与時の任意の時点における２種またはそれ以上の化合物の混合を意味する。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のシステアミンもしくはその薬学的に許容される塩またはシスタミンもしくはその薬学的に許容される塩と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７９９４２２６号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のさまざまな抗酸化化合物（グリチルリチン、シサンドラ、アスコルビン酸、Ｌ−グルタチオン、シリマリン、リポ酸およびｄ−α−トコフェロールを含む組成物の非経口または経口投与を包含するがそれに限定されない）と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７０７８０６４号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のさまざまな抗酸化化合物（水溶性ビタミンＥ製剤、カロテノイド混合物またはセレンを含む組成物の非経口または経口投与を包含するがそれに限定されない）と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第６５９６７６２号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のレシチンまたはビタミンＢ複合体の非経口または経口投与と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７０１８６５２号、第６１８０１３９号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の胆汁塩製剤（ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸または他の天然もしくは合成胆汁酸または胆汁酸塩を包含するがそれらに限定されない）と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第６２９７２２９号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のカンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体アンタゴニストおよび／またはインバースアゴニストと組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７９９９１０７号、第７９０６６５２号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）活性調節剤と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７９９４３５３号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、下記式で示されるチオアミド結合および第四級アンモニウム置換基を有するベンゾチアゼピンまたはベンゾチエピン化合物と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７９７３０３０号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＲＵを阻害するためのＲＮＡアンチセンス構築物と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７８９７５８３号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、ヒスタミンＨ_３アンタゴニストとして有用なへテロ原子結合置換ピペリジンおよびその誘導体と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７８４６９４６号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、ステアロイル−コエンザイムαデルタ−９デサチュラーゼを阻害するアザシクロペンタン誘導体と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７７５４７４５号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、アディポネクチン分泌促進または誘導活性を有するアシルアミド化合物と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７７３２６３７号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の第四級アンモニウム化合物と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第７３１２２０８号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のイソフラボン化合物と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第６５９２９１０号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のマクロライド抗生物質と組み合わせて使用しうる［引用により本書の一部とする米国特許第５７６００１０号参照］。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、多発性硬化症の処置に現在用いられている免疫調節剤である処置有効量のグラチラマーアセテート（Copolymer 1、Cop-1またはCopaxone（Teva Pharmaceuticalsから市販されている）としても知られる）と組み合わせて使用しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のスタチン、例えばアトルバスタチンおよびシンバスタチンのようなＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（それに限定されない）と組み合わせて使用しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量のＮ−アセチルシステインと組み合わせて使用しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、小有機ガレクチン阻害剤、モノクローナル抗体、ＲＮＡ阻害剤、小結合ペプチドまたはタンパク質阻害剤を包含するがそれらに限定されない、単一のガレクチンタンパク質または一連のガレクチンタンパク質を阻害し得る処置有効量のもう１つのガレクチン阻害剤と組み合わせて使用しうる。

いくつかの態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、処置有効量の、リシルオキシダーゼを阻害するモノクローナル抗体または結合組織増殖因子に結合するモノクローナル抗体と組み合わせて使用しうる。

他の一態様においては、前記化合物はガラクト−ラムノガラクツロネートであり、組換えペントラキシン−２を包含するがそれらに限定されない、処置有効量のペントラキシンタンパク質と組み合わせて使用しうる。

いくつかの態様においては、記載されるガラクト−ラムノガラクツロネートおよび他の化合物は、単独で、または上記の他の化合物との組み合わせとして、肝細胞脂肪蓄積、門脈内および小葉内炎症性浸潤、ならびに線維症（類洞周囲腔におけるコラーゲン沈着を包含するがそれに限定されない）、肝硬変を改善または回復し、肝細胞癌への進行を防止する手段としてヒトＮＡＳＨの処置法として提案される。さらに、肝疾患病変のそのような改善は、肝線維症および肝硬変の合併症（肝細胞癌への進行を含む）を軽減することによって、患者の健康に対し有益な効果をもたらしうると考えられる。

いくつかの態様においては、有効量のガラクトース含有多糖は、反復ボーラス注入または持続注入としての静脈内注入、皮内注射、反復ボーラス注射または持続注入としての皮下投与による非経口経路、または経口投与を含むさまざまな経路で投与しうる。

実験動物に対するガラクトース含有多糖の有効非経口用量（静脈内、腹腔内または皮下投与される）は、２〜１６０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または１０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは３０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは６０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは９０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１２０ｍｇ／ｋｇ体重である。

実験動物に対するガラクトース含有多糖の有効非経口用量（静脈内、腹腔内または皮下投与される）は、週３回、週２回、週１回、２週に１回、月１回、または持続注入として投与しうる。

ヒトに対するガラクトース含有多糖の有効非経口用量（静脈内または皮下投与される）は、０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは２ｍｇ／ｋｇ体重もしくは５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは７．５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１５ｍｇ／ｋｇ体重である。

ヒトに対するガラクトース含有多糖の有効非経口用量（静脈内または皮下投与される）は、週３回、週２回、週１回、２週に１回、月１回、または持続注入として投与しうる。

いくつかの態様においては、ヒアルロン酸および他のコラーゲン分解生成物、サイトケラチン−１８および他の細胞骨格細胞タンパク質、メタロプロテアーゼＩおよびＩＩおよび他の肝臓由来コラーゲンおよびマトリックスプロテアーゼの組織インヒビターを包含するがそれらに限定されないＮＡＳＨ血清バイオマーカーのレベルにおける少なくとも１０％の変化によって、処置有効用量が決定されうる。そのような化合物およびバイオマーカーは、血清または肝組織において免疫測定法によって測定し得、そのレベルは疾患および処置の程度に相関しうる。

いくつかの態様においては、脂質またはタンパク質由来の反応性酸素生成物、還元型または酸化型コエンザイムＱ、および脂質分子またはコンジュゲートを包含するがそれらに限定されないＮＡＳＨ血清バイオマーカーにおける少なくとも１０％の変化によって、処置有効用量が決定されうる。そのようなバイオマーカーは、免疫測定法および電気泳動法を包含するさまざまな手段によって測定し得、そのレベルは疾患および処置の程度に相関しうる。

いくつかの態様においては、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−８を包含するがそれらに限定されない）、オステオポンチンを包含するがそれらに限定されないＮＡＳＨ血清バイオマーカー、またはＮＡＳＨの存在もしくは程度を示唆する血清成分の代謝プロファイル（血清および尿マーカーを包含する）における少なくとも１０％の変化によって、処置有効用量が決定されうる。免疫測定法またはＬＣ質量分析によるプロテオーム解析により測定されるそのようなサイトカイン１種またはそれ以上のプロファイルは、疾患の活動性の評価、および疾患処置において追跡すべきマーカーを提供しうる。

いくつかの態様においては、下記の肝生検における組織病理学的知見を包含するＮＡＳＨの病態生理学的スペクトルにおける少なくとも１０％の変化によって、また、ＮＡＳＨ重篤度を評価するためにさまざまな知見を組み合わせるさまざまな方法によって、処置有効用量が決定されうる：肝細胞内脂肪の証拠、肝細胞毒性（ヒアリン体を包含するがそれに限定されない）、炎症性細胞浸潤（リンパ球ならびにリンパ球および好中球のさまざまなサブセットを包含するがそれらに限定されない）、胆管細胞における変化、内皮細胞における変化、クッパー細胞マクロファージの数、コラーゲン沈着（類洞周囲、門脈および中心のコラーゲン沈着ならびに門脈−中心架橋性コラーゲン沈着を包含するがそれらに限定されない）、正常構造を変形させる肝細胞結節、悪性化と一致する肝細胞異型を包含するがそれらに限定されない。そのような組織学的評価は、ＮＡＳＨ診断の必須条件であり、したがって必然的に、治療の評価に関連付けられる。

いくつかの態様においては、疾患の期および重篤度の臨床的試験、疾患の臨床兆候および症状、ならびに医学的合併症を包含するがそれらに限定されない、ＮＡＳＨの臨床症状における少なくとも１０％の変化によって、処置有効用量が決定されうる。ＮＡＳＨの期および重篤度の臨床的試験は、次のものを包含するがそれらに限定されない：血液学的試験（赤血球数および形態、白血球数および分画ならびに形態、血小板数および形態を包含するがそれらに限定されない）、血清または血漿脂質（トリグリセリド、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質種および脂質過酸化種を包含するがそれらに限定されない）、血清または血漿酵素（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴＰ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびアイソフォームを包含するがそれらに限定されない）、血清または血漿のアルブミンおよび肝合成能を示唆する他のタンパク質、ビリルビンまたは肝臓の代謝副産物排出能を示唆する他の化合物の血清または血漿レベル、血清または血漿電解質（ナトリウム、カリウム、塩素、カルシウム、リンを包含するがそれらに限定されない）、凝固プロファイル（プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、特定の凝固因子のレベル、出血時間および血小板機能を包含するがそれらに限定されない）。臨床的試験はまた、下記の、肝臓の構造、構造的完全性または機能を評価する非侵襲的および侵襲的試験を包含するがそれらに限定されない：コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、超音波（ＵＳ）、超音波エラストグラフィー（FibroScanを包含するがそれに限定されない）または他の肝組織弾性測定法、磁気共鳴スキャニングまたはスペクトロスコピー、経皮もしくは皮膚穿刺または経頸静脈肝生検および組織学的評価（親和性色素または免疫組織化学を用いるさまざまな成分の染色を包含するがそれに限定されない）、肝門脈楔入圧勾配測定、または肝組織におけるＮＡＳＨ重篤度評価のために開発されたものでありうる他の非侵襲的もしくは侵襲的試験を包含するがそれらに限定されない。

いくつかの態様においては、下記の疾患の臨床兆候および症状における少なくとも１０％の変化によって、処置有効用量が決定されうる：疲労、筋肉量低下、クモ状血管腫、腹痛、腹部膨満、腹水、胃腸管出血、他の出血性合併症、アザのでき易さおよび斑状出血、末梢浮腫、肝腫脹、結節性の硬い肝臓、眠気、睡眠障害および昏睡を包含する。ＮＡＳＨの医学的合併症は、肝硬変に関連付けられ、腹水、末梢浮腫、食道および他の消化管の静脈瘤、胃腸管出血、他の出血性合併症、極度の痩せおよび筋肉消耗、肝腎症候群ならびに肝性脳症を包含する。ＮＡＳＨ関連肝硬変のさらなる合併症は、肝臓移植リストに載せるかまたは肝臓移植を受ける必要がある非常に重篤な合併症の発症である。

いくつかの態様においては、処置有効用量は、糖尿病を有する患者の全血中グルコースに対し、または血清脂質が上昇している患者の血清脂質に対し何ら影響を及ぼすことなく、ＮＡＳＨ肝疾患および／または線維症に対して効果的である。

いくつかの態様においては、肝組織または血清におけるガレクチン−３レベルの少なくとも１０％の低下によって、処置有効用量が決定されうる。

いくつかの態様においては、血清におけるガレクチン−３レベルの変化によって、処置有効用量が決定されうる。

ガラクト−ラムノガラクツロネート化合物の製造方法
以下は、処置用多糖の製造を説明する実施例であって、本発明を制限することを意図するものではない。この場合、製造されたガラクト−ラムノガラクツロネートは、本願においてＧＲ−ＭＤ−０２と称されている。

リンゴペクチンＵＳＰ ＨＭ（５０ｋｇ）を水に溶解し、３５〜８５℃に加熱した。溶液のｐＨを５〜７に調節するために１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨを加え、よく混合した。３５〜８５℃の設定温度で２時間、混合を続けた。必要に応じて１Ｍ ＮａＯＨまたはＨＣｌを加えて、ｐＨを５〜７に再調節した。溶液を３０℃に冷却した。３０℃においてｐＨを５〜７に調節した。

ｐＨ調節したペクチン溶液にＣｕＳＯ_４を加えて、１ｍＭ ＣｕＳＯ_４の終濃度とした。この１ｍＭ ＣｕＳＯ_４溶液を、１０〜３０℃の温度で３０分間混合した。

その３０分間の１ｍＭ ＣｕＳＯ_４混合工程の完了時に、アスコルビン酸ナトリウム（５０ｇ）を加え（量は、所望の分子量が達成されるように予め調節した）、５〜２０分間混合した。Ｈ_２Ｏ_２を加え（０．０２モル／ｋｇペクチンから開始し、１．０モル／ｋｇペクチンまで；初期の出発ペクチン分子量に応じて予め調節した）、溶液のｐＨを４〜７に維持しながら、Ｈ_２Ｏ_２濃度を４時間維持した（定量試験（セントルイスのSigma）を用いる）。

溶液のｐＨが８〜１０となるように、溶液に５Ｍ ＮａＯＨを加えた。このｐＨ調節された溶液を１０〜３０分間混合した。このｐＨ調節された溶液に、次いで、濃ＨＣｌを加えて、溶液のｐＨを４〜５に調節した。ｐＨ４〜５に調節したら、溶液を、２〜８℃で２〜２４時間混合し続けることができる。

次いで、溶液を８０℃に３０〜１８０分間加熱し、濾過助剤（セライト）（１〜５ｋｇ）を溶液に加え、セライトが加えられた溶液を３０分間撹拌した後、濾過した。濾過によって生じた固体を取り除いた。

濾液を減圧下に１．５〜３倍に濃縮し、次いでｐＨを３〜５に調節した。高温のエタノールまたはイソプロパノールを、５０重量％加えた。混合物を１〜２時間撹拌して生成物を沈殿させ、次いで濾過した。濾液を取り除き、白色ないし灰白色の沈殿物を残した。

その溶液に冷９６％ＥｔＯＨを加え、得られたスラリーを次いで３０分間撹拌した。その溶液を濾過し、濾液を取り除いた。この９６％ＥｔＯＨスラリー工程を繰り返した後、最終濾過し、白色ないし灰白色の沈殿物を回収した。

脂肪性肝炎のマウスモデルの処置方法
本実施例において使用する実験モデルは、糖尿病を誘発し、高脂肪食を与えたマウスで、ＳＴＡＭマウスと称されているモデルである。図１に示されるように、生後すぐにストレプトゾトシンの単回注射によって糖尿病を誘発し、４週間後にマウスに高脂肪食を与え始める。これは、マウスが確実にＮＡＳＨを発症し、それに伴い肝細胞脂肪蓄積、肝細胞毒性の証拠、門脈および小葉の炎症性浸潤、類洞周囲線維症、結節形成を伴う進行した線維症、肝硬変、および究極的に肝細胞癌（ある割合の動物）を発症することが証明されているモデルである。

疾患の進行は、５週齢までに脂肪肝（ＦＬ）、７週齢までに脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、９週齢までに線維症（Ｆｉｂ）、１３週齢までに結節形成（Ｎ）、そして一部の動物において１６週齢までに肝細胞癌（ＨＣ）が起こるというものである（図１）。

実施例１に記載のように製造したＧＲ−ＭＤ−０２を、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ示される開始時点から４週にわたり週２回、静脈内投与した。早い処置は６〜９週に行い、遅い処置は９〜１２週に行った。

早い処置期間および遅い処置期間の後に殺した動物の体重における変化を、図２Ａ〜２Ｂに示す。ビヒクル（生理食塩液のみ）で処置した動物と、ＧＲ−ＭＤ−０２で処置した動物との比較において、体重に差は無かった。このことは、動物に対して処置による毒性作用は殆どまたは全く無かったこと、および検出される変化は動物の全般的健康状態によるものではなさそうであることを、全体的レベルで示唆する。

処置群間の全血中グルコースの比較を、図３Ａ〜３Ｂに示す。示されるように、ビヒクル対照群およびＧＲ−ＭＤ−０２群のいずれにおいても、血中グルコースレベルは著しく上昇しており、処置スケジュールが早いか遅いかによる統計学的差異は無かった。マウスにおける正常な血中グルコースは約１００ｍｇ／ｄＬであり、ＳＴＡＭ動物における平均は７００〜８００ｍｇ／ｄＬであったので、いずれの動物も明らかな糖尿病を有することが示された。

図４は、正常およびＮＡＳＨマウスの肝組織構造を示す。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した肝臓切片は、正常肝臓とＮＡＳＨ肝臓とでは明らかに異なり、ＮＡＳＨ肝臓においては、脂肪で満たされた大きな肝細胞、肝細胞の風船化変性、および炎症細胞の浸潤が見られた。シリウスレッド染色した肝臓切片は、Ｉ型コラーゲンの存在を示す。図４は、正常肝臓にはコラーゲンが殆ど無いが、ＮＡＳＨ肝臓においては中心静脈の周囲および類洞周囲腔にコラーゲンが増加することを示している。この結果は、本マウスモデルにおいてＮＡＳＨ病変が達成されたことを示している。

肝組織切片における肝病変の重篤度を評価するのに、ＮＦＬＤ活動性スコアを用いたが、これは、脂肪変性（０（＜５％）、１（５〜３３％）、２（３３〜６６％）、または３（＞６６％））、肝細胞風船化（０（なし）、１（少数）、または３（多数））、および小葉炎症（０（病巣なし）、１（＜２病巣／２００倍視野）、２（２〜４病巣／２００倍視野）、または３（＞４病巣／２００倍視野））の３つのＮＡＳＨ病変に点数を付与するものである。合計点数がＮＦＬＤ活動性スコアである。

図５Ｂは、早い処置群のビヒクル処置群およびＧＲ−ＭＤ−０２処置群のＳＴＡＭマウス肝組織におけるＮＦＬＤ活動性スコアの比較を示す。ビヒクル処置マウスのスコアは平均５であり、ＮＡＳＨの存在を確認するものである。ＧＲ−ＭＤ−０２処置ＳＴＡＭマウス群のＮＦＬＤ活動性スコアは、平均３であり、統計学的に非常に有意な低下が見られた（ビヒクル処置動物との比較において、ｐ値が０．０１未満）。このデータは、ＮＡＳＨに伴う肝臓の病変をＧＲ−ＭＤ−０２が軽減することを示している。

図６は、６〜９週および９〜１２週のビヒクル処置群およびＧＲ−ＭＤ−０２処置群のＳＴＡＭマウス肝生検におけるシリウスレッド陽性域の比較を示す。シリウスレッドは、コラーゲン繊維に特異親和性を持つ組織染色で、コラーゲン繊維を赤く染めるので、肝生検において線維症の程度を定量的に評価するための手段となる。早い処置群および遅い処置群のいずれにおいても、ビヒクル対照と比較してＧＲ−ＭＤ−０２処置動物においてはシリウスレッド染色が明らかに少なかった。

３処置群のそれぞれから得た肝病理組織切片におけるシリウスレッド染色面積を、コンピュータを使用した形態学的分析により評価した。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、早い処置群および遅い処置群において、また、両群を合わせて評価した場合に、コラーゲン面積％が顕著に統計学的に有意に減少したことを示す。この結果は、ＧＲ−ＭＤ−０２処置が、ＮＡＳＨマウスにおいて、ＮＡＳＨ活動性低下の結果として肝線維症を軽減することを示している。さらに、遅い処置群は、ＧＲ−ＭＤ−０２処置がＮＡＳＨマウスにおいて線維症を改善しうることを示している（図７Ｂ）。

試験処置化合物が、全血中グルコースに影響を及ぼすことなくＮＡＳＨの肝病変および線維症に対し有効であることもデータにより示される。対照群と比較して処置群において血中グルコースは低下しなかったが、このことは、糖尿病の有効な処置を伴わずに肝疾患が処置されうることを示唆する。

肝臓にコラーゲンを蓄積させる主な細胞は、活性化された星細胞である。ＮＡＳＨにおける炎症性浸潤は静止星細胞を活性化し、該細胞は活性化された状態で、該疾患に伴う繊維組織を形成するコラーゲンを分泌する。活性化星細胞のマーカーであるタンパク質α−平滑筋アクチンの免疫組織化学的染色を、図８Ａに示す。ＧＲ−ＭＤ−０２処置によってα−平滑筋アクチンが顕著に減少したが、これは、活性化星細胞が顕著に減少したことを示唆する（図８Ｂ）。これは、処置によるコラーゲン沈着減少メカニズムの一つである。

ビヒクルおよびＧＲ−ＭＤ−０２処置試験群の肝組織におけるガレクチン−３タンパク質の免疫組織化学的染色を、図９Ａに示す。ビヒクル処置動物においては、主としてマクロファージ内にガレクチン−３の高レベル発現が見られた。ＧＲ−ＭＤ−０２処置により、疾患の病変の改善に関連する、肝臓におけるガレクチン−３の顕著な減少がもたらされた（図９Ｂ）。

本書に記載される実施例および態様は単に説明を目的としたものであって、それに照らしてのさまざまな変形または変更が、本願の精神および範囲ならびに特許請求の範囲に包含されると理解される。本書において引用される刊行物、特許および特許出願はいずれも、引用により本発明の一部とする。

Claims (16)

1. 脂肪肝、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎、または肝硬変および肝細胞癌を伴う非アルコール性脂肪性肝炎を処置するための医薬組成物であって、ガラクト−ラムノガラクツロネートを有効成分として含有し、前記ガラクト−ラムノガラクツロネートは、α−１，２−結合ラムノースおよびα−１，４−結合ＧａｌＡ残基の交互オリゴマーである分岐へテロポリマーを結合する、１，４−結合ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）およびメチルガラクツロネート（ＭｅＧａｌＡ）残基の主鎖を含み、前記ラムノース残基は１，４−β−Ｄ−ガラクトース残基、１，５−α−Ｌ−アラビノース残基またはそれらの組み合わせのオリゴマーである主な分岐を有し、前記ガラクト−ラムノガラクツロネートにおいて、前記１，４−β−Ｄ−ガラクトース残基と１，５−α−Ｌ−アラビノース残基が、炭水化物の総モルの少なくとも１０モル％の量で存在し、前記１，４−β−Ｄ−ガラクトース残基と１，５−α−Ｌ−アラビノース残基が２：１〜３：１の比で存在する、組成物。
2. 薬学的に許容される担体中にガラクト−ラムノガラクツロネートを含有する、請求項１に記載の組成物。
3. 他の処置剤をさらに含有するか、または有効量の他の処置剤と併せて投与される、請求項１または２に記載の組成物。
4. 非経口または経腸投与され、非アルコール性脂肪肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎評点システムの重篤度の少なくとも１ポイントの低下、非アルコール性脂肪性肝炎活動性の血清マーカーレベルの低下、非アルコール性脂肪性肝炎疾患活動性の低下、または非アルコール性脂肪性肝炎の医学的結果の軽減、の少なくとも１つを達成する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
5. 肝臓における脂肪の蓄積の少なくとも１０％の減少；
   肝臓における脂肪を含む肝細胞の割合において評価される、肝臓における脂肪の蓄積の減少；
   肝細胞風船化の少なくとも１０％の軽減；
   肝臓標本の門脈、中心および小葉域における好中球およびリンパ球の浸潤の少なくとも１０％の軽減；
   肝臓におけるコラーゲンの蓄積の少なくとも５％の減少；
   肝組織または血清中のガレクチン−３の少なくとも１０％の減少、
   の１つを達成する、請求項４に記載の組成物。
6. 非アルコール性脂肪性肝炎活動性の血清マーカーが、トランスアミナーゼ、還元型もしくは酸化型コエンザイムＱ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
7. 肝線維症または肝硬変を伴う非アルコール性脂肪性肝炎の医学的結果の軽減が、門脈圧亢進、肝タンパク質合成能低下、高ビリルビン血症、または脳障害の軽減を包含する、請求項４〜６のいずれかに記載の組成物。
8. ガラクト−ラムノガラクツロネートが、２０〜７０ｋＤａの範囲の平均分子量を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
9. 他の処置剤が、システアミンもしくはその薬学的に許容される塩、シスタミンもしくはその薬学的に許容される塩、抗酸化化合物、レシチン、ビタミンＢ複合体、胆汁塩製剤、カンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体アンタゴニスト、カンナビノイド−１（ＣＢ１）受容体インバースアゴニスト、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体活性調節剤、ベンゾチアゼピンもしくはベンゾチエピン化合物、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰＲＵを阻害するＲＮＡアンチセンス構築物、ヘテロ原子結合置換ピペリジンおよびその誘導体、アザシクロペンタン誘導体、アディポネクチン分泌促進または誘導活性を有するアシルアミド化合物、第四級アンモニウム化合物、グラチラマーアセテート、ペントラキシンタンパク質、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、Ｎ−アセチルシステイン、イソフラボン化合物、マクロライド抗生物質、ガレクチン阻害剤、抗体、またはそれらの組み合わせ、の１つである、請求項３に記載の組成物。
10. ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が、アトルバスタチン、シンバスタチンまたはそれらの組み合わせを含み；
    ガレクチン阻害剤が、小有機ガレクチン阻害剤、モノクローナル抗体、ＲＮＡ阻害剤、小結合ペプチド、タンパク質阻害剤、またはそれらの組み合わせを含み；または
    抗体が、抗結合組織増殖因子抗体である、
    請求項９に記載の組成物。
11. ガラクト−ラムノガラクツロネートが、キシロース、グルコース、フコース残基またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
12. 他の処置剤をさらに含有するか、または有効量の他の処置剤と併せて投与され、他の処置剤が抗リシルオキシダーゼ抗体である、請求項１または２に記載の組成物。
13. 他の処置剤をさらに含有するか、または有効量の他の処置剤と併せて投与され、他の処置剤がペントラキシンタンパク質である、請求項１または２に記載の組成物。
14. ペントラキシンタンパク質が組換えペントラキシン−２である、請求項１３に記載の組成物。
15. 他の処置剤をさらに含有するか、または有効量の他の処置剤と併せて投与され、他の処置剤が抗酸化化合物であり、抗酸化化合物が、水溶性ビタミンＥ製剤、カロテノイド混合物、セレン、グリチルリチン、シサンドラ、アスコルビン酸、Ｌ−グルタチオン、シリマリン、リポ酸またはｄ−α−トコフェロール、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。
16. 他の処置剤をさらに含有するか、または有効量の他の処置剤と併せて投与され、他の処置剤が胆汁塩製剤であり、胆汁塩製剤が、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸または他の天然もしくは合成胆汁酸または胆汁酸塩、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の組成物。

Images