ES2621838T3

ES2621838T3 - Método in vitro no invasivo para la cuantificación de lesiones hepáticas

Info

Publication number: ES2621838T3
Application number: ES09796060.3T
Authority: ES
Inventors: Paul Cales; Christophe Aube
Original assignee: Universite dAngers; Centre Hospitalier Universitaire dAngers
Current assignee: Universite dAngers; Centre Hospitalier Universitaire dAngers
Priority date: 2008-11-18
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2017-07-05
Anticipated expiration: 2029-11-18
Also published as: US20110313276A1; EP2359285B1; EP2359285A2; WO2010058295A2; WO2010058295A3

Abstract

Un método no invasivo in vitro para cuantificar las lesiones del hígado de un paciente que comprende: medir los siguientes biomarcadores en una muestra del paciente: plaquetas, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), ferritina y glucemia y medir los siguientes marcadores clínicos: edad y peso, y combinar dichas medidas en una función logística.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Metodo in vitro no invasivo para la cuantificacion de lesiones hepaticas

Esta invencion se refiere al campo del diagnostico hepatico y mas precisamente a un metodo no invasivo in vitro para cuantificar lesiones hepaticas, especialmente debidas o relacionadas con insuficiencia hepatica, esteatosis hepatica, enfermedad por hlgado graso no alcoholico (NAFLD), o esteatohepatitis no alcoholica (NASH). En el sentido de esta invencion se entiende por cuantificacion la determination de la cantidad y/o la arquitectura de las lesiones hepaticas.

La FLD (enfermedad del hlgado graso) describe una amplia gama de afecciones potencialmente reversibles que implican el hlgado, en donde se acumulan grandes vacuolas de grasa de trigliceridos en hepatocitos a traves del proceso de esteatosis (esto es, la retention anormal de llpidos dentro de una celula).

La FLD se asocia comunmente con alcohol o slndromes metabolicos (diabetes, hipertension, dislipidemia, betalipoproteinemia, enfermedades de almacenamiento de glucogeno, enfermedad de Weber-Christian, enfermedad de Wolman, hlgado graso agudo del embarazo, lipodistrofia). Sin embargo, tambien puede deberse a causas nutricionales (desnutricion, nutrition parenteral total, perdida severa de peso, slndrome de realimentacion, bypass yeyuno ileal, bypass gastrico, diverticulosis yeyunal con sobrecrecimiento bacteriano), as! como diversos farmacos y toxinas (amiodarona, metotrexato, diltiazem, terapia antirretroviral altamente activa, glucocorticoides, tamoxifeno, hepatotoxinas ambientales) y otras enfermedades tales como la enfermedad inflamatoria intestinal o HIV.

Ya sea AFLD (enfermedad por hlgado graso alcoholico) o NAFLD (enfermedad por hlgado graso no alcoholico), la FLD abarca un espectro morfologico que consiste del tipo mas leve de esteatosis hepatica (hlgado graso), denominado NAFLD, al tipo potencialmente mas grave "esteatohepatitis", denominado NASH, que se asocia con la inflamacion danina del hlgado y, a veces, la formation de tejido fibroso. De hecho, la esteatohepatitis tiene la propension inherente a progresar hacia el desarrollo de la fibrosis luego cirrosis que puede producir cicatrices hepaticas progresivas e irreversibles o hacia el carcinoma hepatocelular (cancer de hlgado).

Debido a que estas enfermedades pueden ser potencialmente invertidas si se diagnostican con tiempo suficiente, o al menos sus consecuencias limitadas, es crucial poder proporcionar al campo medico herramientas que permitan un diagnostico precoz, rapido y preciso.

Durante mucho tiempo, el diagnostico de esteatosis hepatica se ha llevado a cabo habitualmente midiendo marcadores tales como g-glutamiltranspeptidasa (GGT) y alanina aminotransferasa (ALT) mientras que al mismo tiempo realiza una biopsia de hlgado con el fin de confirmar FLD y determinar la clasificacion y estadificacion de la enfermedad. Aunque las biopsias pueden proporcionar information importante sobre el grado de dano hepatico, en particular la gravedad de la actividad necroinflamatoria, la fibrosis y la esteatosis, el procedimiento tambien presenta varias limitaciones, tales como el error de muestreo, la invasividad, el costo, el dolor para los pacientes, lo que a su vez provoca cierta renuencia a someterse a dicho procedimiento; y finalmente las complicaciones pueden surgir de tal procedimiento, que en algunos casos puede incluso conducir a la mortalidad. La ecografla tambien se utiliza para diagnosticar esteatosis hepatica. Sin embargo, este metodo es subjetivo ya que se basa en la intensidad del eco (ecogenicidad) y patrones especiales de ecos (textura). Como resultado, no es lo suficientemente sensible y a menudo inexacta en pacientes con fibrosis avanzada. Por ultimo, se admite generalmente que alrededor de la mitad de todos los casos de FLD son detectados por las pruebas de sangre habituales y alrededor de la mitad por ecografla, lo que resulta en alrededor de una cuarta parte del diagnostico erroneo cuando ambos se utilizan.

En los ultimos anos, el uso de biomarcadores no invasivos ha ganado importancia en el campo del diagnostico hepatico. De hecho, varias pruebas utilizando biomarcadores no invasivos ya se han desarrollado y propuesto para el diagnostico de fibrosis (vease, por ejemplo, WO 2005/116901). El ensayo se refiere a un metodo para diagnosticar la presencia y/o gravedad de una patologla hepatica y/o para controlar la efectividad de un tratamiento curativo contra una patologla hepatica en un individuo, estableciendo al menos una puntuacion diagnostica no invasiva, en particular una puntuacion diagnostica para la fibrosis portal y septal y/o una estimation de la cantidad de fibrosis (el area de fibrosis) y/o una estimation de la arquitectura de la fibrosis (dimension fractal).

Recientemente, Poynard et al. (WO 2006/082522) han demostrado que un unico o un panel de biomarcadores puede ser utilizado como una alternativa a la biopsia de hlgado para el diagnostico de esteatosis, ya sea inducida por alcohol, hepatitis viral o NAFLD, las causas mas comunes de esteatosis. En particular, este documento proporciona un nuevo panel de biomarcadores conocidos como SteatoTest (ST) con valores predictivos para el diagnostico de esteatosis debido al alcohol, NAFLD y hepatitis C y B. Suero GGT y ALT fueron considerados como los marcadores bioqulmicos estandar. De acuerdo con the French National Agency for Health (HAS), actualizada en diciembre de 2008, y la opinion internacional actual, la realization de este tipo de prueba puede ser insuficiente, especialmente debido a la referencia basada en una clasificacion subjetiva de esteatosis hepatica con una reproducibilidad pobre del inter-observador. Ademas, esta clasificacion es una variable semicuantitativa que implica una reflexion imprecisa y limitada del patron original.

Watkins et al. (WO 2008/021192) ha proporcionado metodos para evaluar el nivel de trigliceridos en el hlgado de un sujeto. Tales metodos comprenden determinar la cantidad de metabolitos lipldicos en una muestra recogida de un fluido corporal del sujeto y compararlo con un valor de referencia que representa el nivel normal de los metabolitos lipldicos, o correlacionar la cantidad con la presencia de un trastorno hepatico. Se dice que los metodos se usan, por ejemplo, para 5 el diagnostico y control de trastornos hepaticos tales como esteatosis, NAFLD y NASH (Esteatohepatitis no alcoholica). De este modo, con el fin de predecir la esteatosis, Watkins solo utiliza un tipo de biomarcadores (esto es, llpidos metabolicos) en un llquido corporal al azar. Sin embargo, el uso de este tipo de biomarcadores tiene varias limitaciones. En primer lugar, se ha demostrado que el nivel serico de trigliceridos no siempre fue un marcador independiente de esteatosis hepatica. En segundo lugar, los procesos patologicos son procesos de multiples etapas y una estrategia 10 dirigida a biomarcadores puede perder una o varias etapas que son relevantes para un diagnostico preciso. Finalmente, un fluido corporal es el resultado de mezclar fuentes de todo el metabolismo que puede introducir algunos sesgos resultantes de cambios debidos a otros organos que el organo diana para el diagnostico. Por ultimo, el contenido de trigliceridos (medicion bioqulmica) es un objetivo de diagnostico diferente en comparacion con la esteatosis hepatica (lesion histologica, esto es, imagen anormal)

15 El objetivo de la presente invencion es proporcionar nuevos metodos no invasivos utilizando biomarcadores mixtos de diferentes fuentes, que evitan las limitaciones antes mencionadas y son mas precisos y fiables que los metodos citados en la tecnica anterior, como se muestra por su alto rendimiento de diagnostico. Los metodos de la invencion reducen considerablemente la necesidad de biopsias, ya que capturan mas informacion que en la tecnica anterior sobre las lesiones evaluadas, garantizan la reproducibilidad y el rendimiento, mientras que atenuan las causas de falsos 20 resultados (en general, las fuentes de resultados falsos se antagonizan en una puntuacion incluyendo varios marcadores siempre que se incluyan algunas precauciones).

El solicitante ha observado ahora que, en el hlgado, las tres lesiones, fibrosis, esteatosis e inflamacion (NASH) estan profundamente interconectadas. Por ejemplo, el grado de esteatosis hepatica es un factor predictivo de la NASH en pacientes con NAFLD; tambien, fibrosis significativa se asocia con el desarrollo de esteatosis y NASH en NAFLD.

25 El solicitante tambien observo que, como una enfermedad hepatica se debe a la causa, dando lugar a lesiones, dichas lesiones induciendo slntomas y terminando en complicaciones, la informacion mas fiable para el paciente fue el grado de sus lesiones hepaticas.

El solicitante demuestra en este documento que las lesiones estan relacionadas: existe una relacion entre lesiones.

La fibrosis se puede cuantificar mediante la determinacion de una puntuacion (fase reflectante), area de fibrosis 30 (cantidad reflectante) o dimension fractal (arquitectura reflectante).

La esteatosis se puede cuantificar por determinacion de una puntuacion, area de fibrosis o dimension fractal.

La NASH se puede evaluar mediante la determinacion de la(s) puntuacion(es).

La presente invencion se define de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. Esta invencion se refiere de este modo a un metodo in vitro para cuantificar las lesiones de un paciente, preferiblemente con NAFLD, que comprende dirigir un 35 objetivo de diagnostico, esto es, cuantificar fibrosis, esteatosis y/o NASH por

- realizar una puntuacion, un area o una dimension fractal de fibrosis en dicho paciente y/o

- realizar una puntuacion, un area o una dimension fractal de esteatosis en dicho paciente y/o

- realizar una puntuacion de esteatohepatitis (NASH) en dicho paciente mediante

40 - medicion de al menos un marcador, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 marcadores seleccionados del grupo que

consiste en biomarcadores y posiblemente marcadores cllnicos y posiblemente puntuaciones, seleccionandose los biomarcadores del grupo que consiste en glucemia, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), AST/ALT, AST.ALT, ferritina, plaquetas, Indice de protrombina, acido hialuronico, hemoglobina, trigliceridos, seleccionandose el biomarcador cllnico del grupo que consiste en peso, Indice de masa corporal, sexo y edad, y 45 seleccionandose las puntuaciones del grupo que consiste de puntuacion de fibrosis, area de fibrosis, dimension fractal de fibrosis, puntuacion de esteatosis, area de esteatosis, dimension fractal de esteatosis;

- y combinacion de dichas medidas en una funcion matematica que incluye dichos marcadores con el fin de obtener un valor final.

En la ultima etapa, la combinacion se obtiene implementando el metodo estadlstico que implica una funcion matematica 50 denominada regresion loglstica binaria (u ordinal) o regresion lineal multiple con el siguiente procedimiento:

5

10

15

20

25

30

35

40

- en primer lugar, las variables independientes se prueban mediante analisis univariado;

- en segundo lugar, las variables independientes que fueron significativas en el analisis univariado se prueban en analisis multivariable mediante regresion loglstica binaria (u ordinal) o regresion lineal multiple con la etapa ascendente o descendente mediante la seleccion en etapas; la seleccion de variables se puede realizar de dos maneras

o La convencional donde se utiliza la muestra completa de la poblacion de pacientes. Este procedimiento de seleccion tambien podrla incluir puntuacion(es) de otras lesiones que el objetivo de diagnostico.

o El metodo bootstrap donde la funcion matematica se aplica a diferentes muestras con menos pacientes clasificados por casualidad, usualmente 1000 muestras. Las variables independientes seleccionadas son aquellas con una ocurrencia de mayorla absoluta, esto es, al menos 500 veces entre 1000 muestras. Este metodo tambien incluyo solo variables sin colinealidad significativa (esto significa que las variables estan fuertemente vinculadas). Este procedimiento no incluyo puntuacion(es) de otras lesiones que el objetivo de diagnostico. De este modo, esta etapa proporciona un numero mlnimo de variables predictivas en comparacion con la etapa anterior.

- la regresion loglstica produce la formula para cada puntuacion en la forma:

puntuacion = aO + al xl + a2 x2 +

en donde los coeficientes ai son constantes y las variables xi son las variables independientes; esta puntuacion corresponde al logit de p donde p es la probabilidad de existencia del objetivo de diagnostico. Esta probabilidad p se calcula con la siguiente formula:

imagen1

o

p = l/(i+exp( - ri; - aixi - a2x2 - ...) )

en donde los coeficientes ai y las variables xi corresponden a los de la formula para la puntuacion.

Se da abajo el valor de los coeficientes asociados ai (denominado [beta] en el texto a continuacion y con frecuencia en la literatura y B en las tablas siguientes), y las dos ultimas columnas dan el intervalo de confianza ai, esto es, el intervalo de confianza (denominado Cl en las tablas a continuacion) de los coeficientes beta o la relacion odds correspondiente (denominada exp ([beta]) en las tablas).

Cuando el objetivo de diagnostico es cuantitativo (variable matematica discreta) tal como la medida del area de esteatosis, la funcion utilizada es una regresion lineal multiple con area de esteatosis =

puntuacion = a0 + al xl + a2 x2 + ...

En una realizacion, el objetivo es la fibrosis, y se realiza una puntuacion, area y/o dimension fractal de fibrosis, y se miden al menos 5, preferiblemente 5, 6, 7, 8, marcadores que se seleccionan del grupo que consiste en glucemia, AST, ALT, ferritina, plaquetas, Indice de protrombina, acido hialuronico, hemoglobina, trigliceridos, peso, Indice de masa corporal, sexo y edad, preferiblemente glucemia, AST, ALT, ferritina, plaquetas, peso y edad o glucemia, AST, ALT, Indice de protrombina, peso.

En otra realizacion, el objetivo es esteatosis y se realiza una puntuacion, area y/o dimension fractal de esteatosis, y se miden al menos 5 marcadores, siendo dichos marcadores seleccionados del grupo que consiste en glucemia, AST, ALT, AST/ALT, AST.ALT ferritina, plaquetas, Indice de protrombina, acido hialuronico, hemoglobina, trigliceridos, peso, Indice de masa corporal, sexo y edad, y preferiblemente pero no obligatoria, una puntuacion, area o dimension fractal de fibrosis.

En una realizacion adicional, el objetivo es la esteatohepatitis, y se realiza una puntuacion de NASH.

En otra realizacion, el objetivo de diagnostico es la fibrosis, y

- se lleva a cabo una puntuacion en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferritina y plaquetas o del grupo que consiste en peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferritina e indice de protrombina; o

- se lleva a cabo un area en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en acido hialuronico, 5 glucemia, AST, ALT, plaquetas e indice de protrombina; o

- se lleva a cabo una dimension fractal en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en peso, acido hialuronico, glucemia, AST, edad e indice de protrombina.

En otra realizacion, el objetivo de diagnostico es esteatosis y

- se lleva a cabo una puntuacion en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en glucemia, 10 AST/ALT, trigliceridos, hemoglobina, edad y sexo y opcionalmente al menos una puntuacion de fibrosis; o del grupo que

consiste en glucemia, AST, trigliceridos, AST/ALT, hemoglobina, BMI y peso y opcionalmente puntuaciones de fibrosis y/o dimension fractal de la puntuacion de fibrosis; o del grupo que consiste en bMi, glucemia y trigliceridos, o del grupo que consiste en BMI, glucemia, trigliceridos y ferritina; o

- se lleva a cabo un area en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en glucemia, AST,

15 trigliceridos, BMI, peso y opcionalmente al menos una puntuacion de fibrosis; o del grupo que consiste en BMI,

glucemia, trigliceridos y ferritina; o

- se lleva a cabo una dimension fractal en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en glucemia, AST, ALT, trigliceridos, BMI, peso y opcionalmente al menos una puntuacion de fibrosis; o del grupo que consiste en BMI, glucemia, trigliceridos y ferritina.

20 En otra realizacion, el objetivo de diagnostico es NASH, y los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en AST, ferritina y AST.ALAt y opcionalmente puntuacion de fibrosis y/o puntuacion de esteatosis y/o puntuacion de NASH; o del grupo que consiste en BMI, AST y ferritina; o ferritina sola.

Puntuacion # 1

De acuerdo con una primera realizacion, el objetivo de diagnostico es una fibrosis significativa determinada por el 25 sistema de puntuacion de Metavir implementado por Bedossa et al., y el metodo de la invencion se realiza midiendo el

nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3 ,4, 5, 6, 7, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del

grupo que consiste en glucemia, AST, ALT, AST/ALT, ferritina, plaquetas y la medicion del peso y edad de los marcadores clinicos, la combinacion de dichas medidas mediante una funcion matematica como se describe anteriormente con el metodo convencional.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Fibrosis significativa: Metavir F> 2 Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferretina, plaquetas # 1A

30

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos. Cuando se selecciona con el metodo bootstrap, las variables no cambian para esta puntuacion.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Fibrosis significativa: Metavir F> 2 Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferritina, plaquetas # 1B

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos.

35 Puntuacion # 2

De acuerdo con una segunda realizacion, el objetivo de diagnostico es fibrosis significativa determinada por el sistema NASH-CRN implementado por Kleiner et al., y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en glucemia, AST, ALT, ferritina, indice de protrombina y midiendo los marcadores clinicos edad, peso y combinando dichas medidas 40 mediante una funcion matematica como se describe anteriormente con el metodo convencional.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Fibrosis significativa

NASH-CRN F>2: Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferretina, Indice de protrombina # 2A

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos. Cuando se selecciona con el metodo bootstrap, las variables son menos numerosas para esta puntuacion.

Fibrosis significativa

NASH-CRN F>2: Peso, glucemia, AST, ALT, Indice de protrombina # 2B

5 Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos.

Puntuacion # 3

De acuerdo con una tercera realizacion, el objetivo de diagnostico es el area de fibrosis, y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en acido hialuronico, glucemia, AST, ALT, plaquetas, Indice de protrombina y 10 combinando dichas medidas mediante una funcion matematica como la descrita anteriormente.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Area de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST, ALT, plaquetas, Indice de protrombina # 3A

Area de fibrosis

Acido hialuronico, glucemia, AST, ALT, plaquetas, Indice de protrombina

# 3B

15 Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos.

Puntuacion # 4

De acuerdo con una cuarta realizacion, el objetivo de diagnostico es la dimension fractal de fibrosis, y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en acido hialuronico, glucemia, AST, Indice de protrombina y el 20 marcador cllnico de peso, edad, combinando dichos niveles en una funcion matematica, obtenidos como se describe anteriormente.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Dimension fractal de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST, edad, Indice de protrombina # 4A

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos. Cuando se seleccionan con el metodo bootstrap, las variables son las siguientes:

Dimension fractal de fibrosis

Acido hialuronico, glucemia, AST/ ALT, peso, plaquetas

# 4B

Puntuacion # 5

De acuerdo con una quinta realizacion, el objetivo de diagnostico es una esteatosis significativa determinada de acuerdo 5 con un umbral de area de esteatosis (>3%), y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en glucemia, AST/ALT, trigliceridos, hemoglobina, edad y sexo y opcionalmente una puntuacion como se obtiene de la primera realizacion (puntuacion # 1A) o la segunda (puntuacion # 2A) de la presente invencion, como se describe anteriormente, y combinando dichos niveles en una funcion matematica, obtenida como se describe anteriormente.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Esteatosis significativa: rAOS > 3% Glucemia, AST/ALT, trigliceridos, hemoglobina, edad, sexo + opcionalmente puntuacion 1A y/o puntuacion 2A # 5A

10

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos. Cuando se selecciona con el metodo bootstrap, las variables son las siguientes:

Esteatosis significativa: rAOS > 3% BMI, glucemia, trigliceridos # 5B

15 Puntuacion # 6

En la sexta realizacion, el objetivo de diagnostico es una esteatosis significativa determinada por NASH-CRN grado >1, y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de los biomarcadores seleccionados entre glucemia, AST, trigliceridos, AST/ALT, hemoglobina, los marcadores cllnicos se seleccionan del grupo que consiste en BMI y peso, y opcionalmente, uno o mas de la puntuacion 1, 2 y/o 4 y la combinacion de dichos niveles en una funcion matematica, 20 obtenida como se describe anteriormente.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Esteatosis significativa: NASH-CRN grado >1 Glucemia, AST, trigliceridos, AST/ALT, hemoglobina, BMI, peso + puntuaciones 1A, 2A y 4A # 6A

Esteatosis significativa: NASH-CRN grado >1 BMI, glucemia, trigliceridos, ferretina # 6B

25 Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos.

Puntuacion # 7

En la septima realizacion, el objetivo de diagnostico es el area de esteatosis y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en glucemia, AST, trigliceridos, ferritina, BMI y peso, y opcionalmente una o mas de las 30 puntuaciones 1 y/o 2, combinando dichos niveles en una funcion matematica, obtenida como se describe anteriormente.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion

Area de esteatosis: Glucemia, AST, trigliceridos, BMI, peso + opcionalmente puntuaciones 1 Y 2 # 7 A

Area de esteatosis (log)

BMI, Glucemia, trigliceridos, ferretina

# 7B

Puntuacion # 8

En la octava realizacion, el objetivo de diagnostico es la dimension fractal de esteatosis, y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste de glucemia, AST, ALT/ALAT, AST.ALT, ferritina, trigliceridos, BMI, peso, y 10 opcionalmente puntuaciones 1A y 2A y combinando dichos niveles en una funcion matematica, obtenida como se define en la realizacion 1 y 2 anteriormente en este documento.

Dimension fractal de esteatosis: Glucemia, AST, ALT/ALAT, AST.ALT, trigliceridos, BMI, # 8

: peso + puntuaciones 1A y 2A

15

Dimension fractal de esteatosis

BMI, glucemia, trigliceridos, ferretina

# 8B

Puntuacion # 9

En la novena realizacion, el objetivo de diagnostico es NASH de acuerdo con tres definiciones basadas en la puntuacion de actividad de NASH (NAS) por Kleiner et al., y el metodo de la invencion se realiza midiendo el nivel de al menos uno, 20 preferiblemente 2, 3, 4, mas preferiblemente todos los marcadores seleccionados del grupo que consiste en AST, ferritina, AST.ALT, BMI y opcionalmente puntuaciones 2A y/o 5A y/o 8A y combinando dichos niveles en una funcion matematica, obtenida como se describe anteriormente .

NASH: AST, ferretina, AST.ALAT + opcionalmente puntuacion 2A, 5A # 9A

: y/u 8A

Preferiblemente, los coeficientes de la funcion matematica son como se describen en los ejemplos. 25 Cuando se selecciona con el metodo bootstrap, las variables son las siguientes:

NAS > 3: BMI, AST, ferretina # 9B

NAS > 5: Ferretina # 10B

NAS 0-2/3-4/5-7: BMI, AST, ferretina # 11B

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

En el contexto de la presente invencion, se deben aplicar las siguientes definiciones:

• La fibrosis se define como una lesion patologica hecha de tejido cicatricial que incluye protelnas fibrilares o glicoprotelnas (colagenos, proteoglicanos ...).

• La puntuacion de fibrosis se define como una combinacion de marcadores (normalmente vinculados por una funcion matematica) para los cuales el objetivo de diagnostico es fibrosis.

• La esteatosis se define como una acumulacion de llpidos, usualmente trigliceridos, dentro de vacuolas en las celulas. Concierne principalmente de hlgado y musculo en el slndrome metabolico.

• El area de esteatosis (AOS) se define como la superficie del hlgado ocupada por las vacuolas de esteatosis como se observa en una muestra de hlgado observada en dos dimensiones.

• El area significativa de esteatosis (SAOS) se define como un umbral cllnico y estadlsticamente significativo de AOS, en el contexto de NAFLD, por ejemplo, mas o igual al 3% de la superficie del hlgado.

• Clasificacion/estadificacion de Kleiner: esta es una clasificacion patologica dedicada a la NAFLD basada en una descripcion morfologica en diferentes clases, ya sea para la esteatosis (denominada convencionalmente como clasificacion) o fibrosis (denominada convencionalmente como estadificacion). Este sistema semicuantitativo (ordinal en estadlstica) es la clasificacion histologica mas reciente y convencional. Este sistema tambien se conoce como el sistema de NASH Clinical Research Network (NASH-CRN).

• Clasificacion/estadificacion de Metavir: esto es una clasificacion patologica dedicada a la hepatitis viral cronica basada en una descripcion morfologica en diferentes clases, ya sea para la actividad necro-inflamatoria (convencionalmente denominada como clasificacion) o fibrosis (convencionalmente denominada como estadificacion). Este sistema semicuantitativo (ordinal en estadlstica) es la clasificacion histologica mas utilizada en la hepatitis viral. Tambien se utiliza en otras causas de enfermedades cronicas del hlgado tales como el alcohol y la NAFLD.

• Nivel: la cantidad de un biomarcador particular medida en la sangre o plasma de un paciente, usualmente expresada como una concentracion.

El objetivo es la esteatosis

El solicitante se enfoco especialmente en la "esteatosis" objetivo y encontro que la inclusion de la puntuacion de la fibrosis en un metodo in vitro para diagnosticar una afeccion hepatica que implica esteatosis, podrla ser de gran interes debido a la interaccion entre fibrosis y esteatosis (vease la figura 2 que muestra que la relacion entre AOS y estadios de fibrosis explica que la inclusion de la medicion no invasiva del estadio de fibrosis aumenta la precision de la medicion no invasiva de AOS)

De este modo, de acuerdo con una realizacion, un metodo de la invencion comprende medir el nivel de al menos uno, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 marcador(es) biologico(s) y al menos uno, preferiblemente dos, marcador(es) cllnico(s) y opcionalmente, pero preferiblemente, una puntuacion de fibrosis, y combinando dichos niveles, medidas y puntuacion en una funcion matematica apropiada.

De acuerdo con una primera realizacion, el al menos un marcador biologico se selecciona del grupo que consiste en glucemia (GLY), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), AST/ALT, acido hialuronico (HA), hemoglobina (Hb) y trigliceridos, preferiblemente glucemia (GLY), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), AST/ALT, acido hialuronico (HA), hemoglobina (Hb) y trigliceridos; el nivel de estos marcadores de sangre se puede dosificar facilmente con metodos ya conocidos en la tecnica; preferiblemente dos marcadores cllnicos se seleccionan del grupo que consiste en edad, sexo, BMI, peso; preferiblemente, se realiza una puntuacion.

De acuerdo con una segunda realizacion, la puntuacion de fibrosis de la presente invencion se determina a traves del metodo descrito en WO2005/116901, incorporado en este documento como referencia.

De acuerdo con una realizacion adicional, la puntuacion de fibrosis se determina midiendo en una muestra de dicho paciente y combinando en una funcion de regresion loglstica al menos tres marcadores seleccionados en el grupo que consiste en a-2 macroglobulina (A2M), acido hialuronico (HA o hialuronato), apoliprotelna A1 (ApoA1), propeptido N- terminal de procolageno tipo III (P3P), gamma-glutamiltranspeptidasa (GGT), bilirrubina, gammaglobulinas (GLB), plaquetas (pLt), nivel de protrombina (TP), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), urea, sodio (NA), glucemia (GLY), trigliceridos (TG), albumina (ALB), fosfatasas alcalinas (PAL), YKL-40 (glicoprotelna de cartllago humano 39), inhibidor tisular de la metaloproteinasa de matriz 1 (TIMP-1), metaloproteinasa de matriz 2 (MMP- 2), ferritina.

De acuerdo con otra realizacion, la puntuacion de fibrosis se mide combinando los niveles de al menos tres marcadores biologicos seleccionados del grupo que consiste en glucemia (GLY), aspartato aminotransferasa (AST), alanina

aminotransferasa (ALT), ferritina, acido hialuronico (HA), trigliceridos (TG), Indice de protrombina (PI), gammaglobulinas (GLB), plaquetas (PLT), peso, edad y sexo.

De acuerdo con incluso otra realizacion, se miden y combinan al menos 2, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 4, incluso mas preferiblemente al menos 5 marcadores biologicos, e incluso mas 5 preferiblemente al menos 6 marcadores biologicos y opcionalmente puntuacion de fibrosis y combinado en el metodo de la presente invention.

De acuerdo con otra realizacion, el metodo de acuerdo con la invencion comprende ademas medir al menos un marcador cllnico. Preferiblemente, el marcador cllnico se selecciona del grupo que consiste en la edad (edad), el Indice de masa corporal (BMI), el peso corporal, el perimetro de cadera, el perimetro abdominal y una proportion de los 10 mismos, tales como por ejemplo perimetro de cadera/perimetro abdominal; mas preferiblemente se miden dos marcadores clinicos.

De acuerdo con incluso otra realizacion, el metodo de acuerdo con la invencion comprende medir al menos tres biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en glucemia (GLY), aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), acido hialuronico (HA), hemoglobina (Hb) y trigliceridos, y al menos uno, preferiblemente dos 15 marcadores clinicos seleccionados del grupo que consiste en la edad (edad), el Indice de masa corporal (BMI), el peso corporal, el perimetro de cadera, el perimetro abdominal y una relation de los mismos, tales como, por ejemplo, perimetro de cadera/perimetro abdominal y una puntuacion de fibrosis y combination de dichos niveles de marcadores biologicos, puntuacion de fibrosis medida y marcadores clinicos medidos, mediante una funcion matematica apropiada, preferiblemente una funcion logistica o una funcion de regresion multiple.

20 Esteatosis por MRI

Otra divulgation es un metodo para cuantificar el area de esteatosis hepatica (AOS) en un paciente, que comprende realizar una MRI de eco de gradiente de eco multiple denominada MFGRE sobre todo o parte del higado del paciente, para medir el contenido de grasa hepatica sobre la senal de MRI resultante y comparar dicho contenido de grasa hepatica en la senal de MRI resultante al area de vacuolas de lipidos de la imagen de referencia.

25 (MFGRE) es un nuevo metodo desarrollado por el solicitante y basado en una secuencia de MRI de prototipo de eco multiple. El principio de la secuencia es un gradiente de eco en fase y fuera de fase, pero con la adquisicion de 16 ecos, permitiendo el calculo preciso de los parametros de decaimiento de senal: senal de agua (W), senal de grasa (F), campo local en homogeneidad (F) y ruido (N). La fraction de grasa se calcula utilizando la siguiente formula:

imagen2

30 Con este metodo, MFGRE se utiliza como un marcador no invasivo de esteatosis ya sea per se o con equivalencia en AOS utilizando una puntuacion de regresion lineal. Este marcador se puede utilizar como parte de una prueba de la misma manera que un marcador de sangre o cllnico.

Otra divulgacion es un metodo para cuantificar un area de esteatosis hepatica (AOS) en un paciente, que comprende:

a) medir el contenido de grasa en una senal de MRI del higado de un paciente;

35 b) medir el nivel de al menos un marcador biologico y/o puntuacion de fibrosis, y/o al menos uno, preferiblemente dos, marcador(es) clinico(s);

c) combinar el indice de contenido de grasa medido obtenido en la etapa (a) y los niveles medidos, puntuacion y/o marcadores clinicos obtenidos en la etapa (b) en una funcion matematica apropiada.

De acuerdo con incluso otra realizacion, el metodo para cuantificar un area de esteatosis hepatica (AOS) mide al menos 40 2, preferiblemente al menos 3, mas preferiblemente al menos 4 e incluso mas preferiblemente al menos 5 marcadores

biologicos y mas preferiblemente al menos 6 marcadores biologicos y opcionalmente puntuacion de fibrosis en la etapa (b).

Otra divulgacion es un metodo para diagnosticar la presencia y/o la gravedad de una esteatosis hepatica o enfermedad de higado graso en un paciente, que comprende implementar un metodo de medicion del area de esteatosis como se 45 describe en la presente invencion. El metodo de la invencion es de gran interes para diagnosticar y cuantificar lesiones hepaticas importantes, especialmente lesiones de NAFLD.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Otros objetos, ventajas y caracterlsticas de la presente invencion resultaran mas evidentes a la lectura de la siguiente descripcion no restrictiva de realizaciones preferidas de la misma, dada a modo de ejemplos con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1 Correlacion entre las caracterlsticas morfometricas de la fibrosis hepatica o esteatosis y las correspondientes pruebas de sangre en funcion de estadios de fibrosis o grados de esteatosis. Panel a: area de fibrosis, panel b: dimension fractal de fibrosis, panel c: area de esteatosis, panel d: dimension fractal de esteatosis. Las llneas representan la regresion lineal.

Figura 2 Relacion entre el area y la dimension fractal de esteatosis como una funcion de los grados de esteatosis. Las llneas representan las curvas de regresion LOWESS. El eje Y fue truncado para mostrar mas detalles.

Figura 3 Relacion entre las pruebas de sangre para NAS (panel a) o NASH (panel b) (eje Y) y NAS (eje X). Esquemas de caja (mediana, rango intercuartil y extremos).

Figura 4 Relacion entre el area y la dimension fractal como una funcion de estadios de fibrosis o grados de esteatosis. Paneles izquierdos (a y c): resultados morfometricos. Paneles de la derecha (b y d): pruebas de sangre. Paneles superiores (a y b): fibrosis; paneles inferiores (c y d): esteatosis. Las llneas representan las curvas de regresion LOWESS.

Figura 5 Relacion entre el area o la dimension fractal de fibrosis o esteatosis (eje Y) como una funcion de los estadios de fibrosis (eje X). Paneles izquierdos (a y c): resultados morfometricos. Paneles de la derecha (b y d): pruebas de sangre. Paneles superiores (a y b): area; paneles inferiores (c y d): dimension fractal. Esquemas de caja (mediana, rango intercuartil y extremos).

La figura 6 representa la correlacion entre la AOS (eje X) y la secuencia MFGRE por MRI (eje Y) en 23 pacientes: Rs = 0.77 y Ric = 0.85.

Ejemplos

Pacientes y metodos Pacientes

Dos centros terciarios, Angers and Rennes (Francia), reclutaron prospectivamente a 245 pacientes con NAFLD entre 2001 y 2006. Los criterios de inclusion y exclusion se describen en otra parte (Cales P et al, J Hepatol 2009, 50:165173). Diecinueve pacientes no fueron incluidos debido a que sus muestras hepaticas no estaban disponibles para su relectura; de este modo, la poblacion principal inclula a 226 pacientes. Otras 22 biopsias hepaticas no fueron apropiadas para el analisis de imagenes.

Datos cllnicos y pruebas de sangre

Se tomaron muestras de sangre en ayunas a la inclusion (fecha de la biopsia de hlgado ±7 dlas). Se incluyeron las variables cllnicas y sangulneas habituales, especialmente la glucosa en ayunas en la inclusion, as! como los siguientes marcadores de fibrosis: acido hialuronico, a2-macroglobulina, apolipoprotelna A1, Indice de protrombina, plaquetas, aspartato y alanina aminotransferasa (AST, ALT), g-glutamiltranspeptidasa, bilirrubina total y urea. Los metodos y reactivos se describieron previamente (Cales P et al, Clin Biochem 2008, 41:10-18). Una puntuacion de fibrosis sangulnea especlfica para NAFLD se calculo de acuerdo con la puntuacion publicada (Cales P et al, J Hepatol 2009, 50:165-173). La reproducibilidad interlaboratorio de los marcadores sangulneos se evaluo como excelente en un estudio previo (Cales P et al, Clin Biochem 2008, 41:10-18).

Biopsia hepatica

Una biopsia de hlgado percutanea se realizo generalmente en una semana (maximo 3 meses) de muestreo de sangre. Las longitudes de las muestras se midieron antes de la inclusion de parafina. A continuacion, se tineron secciones de 5 pm de espesor con solucion de hematoxilinoosina-azafran o 0.1% de rojo picrosirius y se utilizaron tanto para analisis opticos como de imagen.

Analisis optico

Las muestras de biopsia fueron reexaminadas centralmente por dos patologos del hlgado; los casos discordantes fueron revisados por un tercer patologo para llegar a un consenso. La esteatosis, la inflamacion lobular y el hinchamiento de los hepatocitos se clasificaron por separado de acuerdo con el sistema NASH Clinical Research Network (NASH-CRN) (Kleiner DE et al, Hepatology 2005, 41: 1313-1321). La adicion de estos 3 grados proporciono la puntuacion de actividad

5

10

15

20

25

30

35

de NAFLD (NAS). El diagnostico de NASH se evaluo de acuerdo con tres definiciones basadas en NAS: >3, >5 y 0-2/3- 4/5-7, respectivamente no, posible/limite, NASH definido (Kleiner DE et al, Hepatology 2005, 41: 1313-1321). La fibrosis se clasifico en 5 etapas, denominadas aqui F0 a F4, de acuerdo con la estadificacion de NASH-CRN desarrollada especificamente para NAFLD (Kleiner DE et al, Hepatology 2005, 41: 1313-1321). La estadificacion de Metavir (Hepatology 1994, 20: 15-20) desarrollada para hepatitis viral, pero tambien utilizada en enfermedades hepaticas cronicas alcoholicas y en NAFLD, tambien se evaluo para la fibrosis en estadio porto-septal en la zona acinar 1.

Analisis de imagen

Adquisicion de imagenes - Se utilizo un procesador de imagen escaner de diapositivas digital Aperio (Scanscope® CS System, Aperio Technologies, Vista CA 92081, EE.UU.) que proporcionaba imagenes de alta calidad de 30.000 x 30.000 pixeles con una resolucion de 0.5 pm/pixel (aumento x20). Se obtuvo una imagen binaria (blanco y negro) mediante una tecnica de umbral automatico utilizando un algoritmo desarrollado en nuestro laboratorio. Se analizo toda el area de la muestra. Se retiraron manualmente los artefactos de muestras de higado (pliegues, polvo).

Algoritmo para esteatosis - Se han descrito previamente algunos aspectos del algoritmo (Roullier V et al., Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2007; 2007:5575-5578) y tecnicas que proporcionan imagenes y mediciones de AOS han sido desarrolladas recientemente (Boursier J et al., J Hepatol 2009, 50:S357).

Datos calculados - AOF se midieron en las secciones de higado completas, como se describio anteriormente (Pilette C et al., J Hepatol 1998, 28:439-446), pero con varias mejoras en la adquisicion de imagenes como se describe anteriormente. AOS (%) se calculo como la proporcion: area de las vesiculas de esteatosis/superficie hepatica completa, y AOS relativa (rAOS, %) como la relacion: area de esteatosis/area hepatica no fibrosa (esto es, superficie hepatica completa menos AOF). Finalmente, se utilizo el metodo de recuento de cajas para evaluar la FD de Kolmogorov de esteatosis y fibrosis segun se detalla en otra parte (Moal F et al., Hepatology 2002, 36: 840-849).

Analisis estadistico

Las variables cuantitativas se expresaron como media ± SD, a menos que se especifique lo contrario. La regresion Lowess por minimos cuadrados ponderados se utilizo para determinar la tendencia media de las relaciones entre variables (Borkowf CB et al. Stat Med 2003, 22:1477-1493). Los predictores independientes se determinaron mediante el metodo bootstrap. Este metodo tambien se determino para calcular el sesgo de optimismo.

El rendimiento de diagnostico se expreso mediante el area bajo la caracteristica de funcionamiento del receptor (AUROC) o precision de diagnostico. Se determinaron los Kmites de diagnostico de acuerdo con el indice maximo de Youden y la precision diagnostica. La regresion lineal multiple por etapas y la regresion logistica binaria se utilizaron para determinar variables independientes. En la regresion lineal, todas las variables categoricas fueron dicotomizadas y el rendimiento de cada modelo fue expresado por el R2 ajustado (aR2). Los programas informaticos de estadisticas eran SPSS version 11.5.1 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) y SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

Resultados

Caracteristicas generales de los pacientes con NAFLD Se detallan en la tabla 1.

Tabla 1. Caracteristicas de 226 pacientes con NAFLD incluidos.

Variable: Valor (% o media ±)

Demografico:

Sexo (% hombres): 75.2

Edad (anos): 50.9 ± 10.8

Peso corporal (kg): 82.9 ± 15.8

BMI (kg/m2): 28.7 ± 4.9

Muestra de higado:

Tamanoa (mm) por patologo: 30.5 ± 11.9

Tamanob (mm) por ordenador: 23.4 ± 23.6

Areab (mm2): 11.7 ± 11.8

Fibrosis:

Estadio de fibrosis por Metavir (%): 44.2 / 29.2 / 9.3 /

Estado de fibrosis por NASH-CRN (%): 26.1 / 29.7 / 21.6 /

Area de fibrosis (%): 6.4 ± 5.4

Dimension fractal: 1.14 ± 0.20

Esteatosis:

Grado de esteatosis (% grado 0/1/2/3): 45.3 / 21.5 / 21.1 /

Area de esteatosis (%): 10.3 ± 9.7c

Dimension fractal: 1.52 ± 0.17

Tasa de actividad NAFLD: 0-2, 3-4, 5-7: 53.2 / 30.6 / 16.2

NASH(%): 46.8

a Antes de la incrustacion de parafina; b Mediante analisis computarizado de imagenes digitales tenidas; C intervalo: 0.242.5%; d NAS: interpretacion: no, posible/llmite, NASH definido.

Diagnostico de fibrosis Fibrosis significativa

Rendimiento de diagnostico - La prevalencia de fibrosis significativa fue significativamente mayor con NASH-CRN F>2: 43.9% que con Metavir F>2: 27.6% (p <10-3 por prueba de McNemar). Se ha comparado una prueba de sangre anterior 5 dirigida a Metavir F>2, denominado FibroMeter (FM) y un nuevo modelo de pruebas de sangre dirigido a NASH-CRN F>2 (tabla 2). Las tablas 2 y 3 muestran un rendimiento muy bueno (AUROC alto) para las puntuaciones de la invencion.

Tabla 2: Analisis multivariado que muestra variables independientemente asociadas con diferentes objetivos de

diagnostico.

El rendimiento de diagnostico se expreso mediante cualquiera AUROC para la puntuacion obtenida por regresion 10 loglstica binaria o aR2 para la puntuacion obtenida por regresion lineal multiple. En estos modelos, la prediccion fue el objetivo principal, por lo que las condiciones de las variables independientes fueron menos estrictas que en un modelo explicativo.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion Rendimiento

Fibrosis:

Fibrosis significativa: Metavir F> 2 Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferretina, plaquetas # 1A AUROC = 0.940

NASH-CRN F>2: Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferretina, Indice de protrombina # 2A AUROC = 0.884

Area de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST, ALT, plaquetas, Indice de protrombina # 3A aR2 = 0.520

Dimension fractal de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST, edad, Indice de protrombina # 4A aR2 = 0.524

Esteatosis:

Esteatosis significativa: rAOS > 3% Glucemia, AST/ALT, trigliceridos, hemoglobina, edad, sexo + puntuaciones 1 y 2 # 5A AUROC = 0.847

NASH-CRN grado >1: Glucemia, AST, trigliceridos, AST/ALT, hemoglobina, BMI, peso + puntuaciones 1, 2 y 4 # 6A AUROC = 0.848

Area de esteatosis: Glucemia, AST, trigliceridos, BMI, peso + puntuacion 1 y # 7 A aR2 = 0.365

Dimension fractal de esteatosis: Glucemia, AST, ALT, trigliceridos, BMI, peso + puntuaciones 1 y 2 # 8A aR2 = 0.346

NASH:

NASH: AST, ferritina, AST.ALAT + puntuaciones 2, 5 y 8 # 9A AUROC = 0.895

AST: aspartato aminotransferasa ALT: alanina aminotransferasa BMI: Indice de masa corporal

Tabla 2bis: Analisis multivariado que muestra variables independientemente asociadas con diferentes objetivos de

diagnostico.

El rendimiento de diagnostico se expreso mediante cualquiera AUROC para la puntuacion obtenida por regresion 5 loglstica binaria o aR2 para la puntuacion obtenida por regresion lineal multiple. En estos modelos, la prediccion fue el objetivo principal, por lo que las condiciones de las variables independientes fueron menos estrictas que en un modelo explicativo.

Puntuacion: Objetivo de diagnostico Variables Coeficiente P Exp (P) 95% de CI Exp (b) inf 95% de CI Exp (b) sup

1a: Fibrosis significativa Metavir F>2

N = 225: Intercepto -11.044 - - -


: Edad 0.071 1.074 1.021 1.130


: Peso 0.047 1.048 1.016 1.082

: AUROC = 0.941 Glucemia 0.429 1.536 1.120 2.106

: (0.927) AST 0.066 1.069 1.041 1.097


: ALT -0.024 0.976 0.960 0.993


: Ferretina 0.0009 1.001 1.000 1.002


: Plaquetas -0.0103 0.990 0.982 0.998

2a: Fibrosis significativa NASH-CRN F>2 Coeficiente P Exp (b) 95% de CI Exp (b) inf 95% de CI Exp (b) sup

N = 221: Intercepto -6.269 - - -


: Edad 0.033 1.034 0.996 1.072


: Peso 0.053 1.055 1.024 1.086

: AUROC = 0.884 Glucemia 0.388 1.474 1.013 2.146

: (0.867) AST 0.059 1.060 1.033 1.088


: ALT -0.014 0.986 0. 973 0.998


: Ferretina 0.001 1.001 1.000 1.002


: Indice de protrombina -0.046 0.955 0.916 0.996

3a: Area de fibrosis Coeficiente P 95% de CI (b) inf 95% de CI (b) sup

N = 202: Intercepto 11.597 5.724 17.470


: Glucemia 0.441 0.161 0.721

: aR2 = 0.520 AST 0.049 0.023 0.076

: (0.503) ALT -0.021 -0.037 -0.005


: Plaquetas -0.008 -0.016 0.001


: Indice de protrombina -0.089 -0.151 -0.027


: Acido hialuronico 0.021 0.015 0.027

4a: Dimension fractal de fibrosis Coeficiente P 95% de CI (b) inf 95% de CI (b) sup

N=202: Intercepto 0.920 0.636 1.203


: Edad 0.003 0.001 0.005

: aR2 = 0.507 Peso 0.002 0.0003 0.003

: (0.495) Glucemia 0.025 0.014 0.035


: AST 0.001 0.0007 0.002


: indice de protrombina -0.004 -0.006 -0.001


: Acido hialuronico 0.001 0.0003 0.0008

5a: Esteatosis significativa (rAOS >3%) Coeficiente P Exp (P) 95% de CI Exp (b) inf 95% de CI Exp (b) sup

N = 151: Intercepto -5.090 - - -


: Edad -0.065 0.937 0.880 0.998


: Sexo (M:0, F:1) 1.422 4.145 0.905 18.971

: AUROC = 0.866 Trigliceridos 0.956 2.602 1.203 5.624


: Glucemia 0.479 1.614 0.974 2.675


: AST/ALT -2.588 0.075 0.010 0.559


: Hemoglobina 0.238 1.269 0.765 2.105


: Puntuacion 1a -8.416 <0.001 <0.001 0.071


: Puntuacion 2a 13.450 >999.99 >999.99 >999.99

6a: Esteatosis significativa NASH-CRN grado>1 Coeficiente P Exp (P) 95% de CI Exp (b) inf 95% de CI Exp (b) sup

N=162: Intercepto -2.5933 - - -


: Peso -0.1066 0.899 0.846 0.956


: BMI 0.3864 1.472 1.189 1.822

: AUROC = 0.898 Glucemia 1.2142 3.368 1.738 6.525


: Trigliceridos 0.8002 2.226 1.141 4.344


: AST 0.0324 1.033 1.007 1.060


: AST/ALT -2.4952 0.082 0.008 0.803


: Hemoglobina 0.3510 1.421 0.899 2.246


: Puntuacion 1a -9.6939 <0.001 <0.001 0.010


: Puntuacion 2a 14.8116 >999.99 >999.99 >999.99


: Puntuacion 4a -14.2847 <0.001 <0.001 0.674

7a: Area de esteatosis (log) Coeficiente P 95% de CI (b) inf 95% de CI (b) sup

N = 151: Intercepto -2.28009 -3.64226 -0.91793


: Peso -0.01128 - 0.02990 0.00735


: BMI 0.10169 0.03838 0.16500

: aR2 = 0.310 Glucemia 0.18799 0.05920 0.31679


: Trigliceridos 0.20372 0.04126 0.36617


: AST 0.00922 0.00222 0.01621


: Puntuacion 1a -3.24488 -4.55881 -1.93095


: Puntuacion 2a 2.66894 1.34807 3.98981

8a: Dimension fractal de esteatosis Coeficiente P 95% de CI (b) inf 95% de CI (b) sup

N=151: Intercepto 0.95361 0.70956 1.19766


: Peso -0.00238 -0.00529 0.00054241


: BMI 0.01580 0.00592 0.02568


: Glucemia 0.02984 0.00932 0.05037

: aR2 = 0.350 Trigliceridos 0.03147 0.00637 0.05656


: AST 0.00438 0.00144 0.00733


: AST/ALT -0.18234 -0.31060 -0.05407


: AST.ALT -0.00002 -0.00003124 0.00000319


: Puntuacion 1a -0.40669 - 0.61323 - 0.20016


: Puntuacion 2a 0.43128 0.21917 0.64338

9a: NASH (NAS>3) Coeficiente P Exp (P) 95% de CI Exp (b) inf 95% de CI Exp (b) sup

N = 162: Intercepto -20.2665 - - -


: AST 0.1253 1.133 1.048 1.226


: AST.ALT -0.00042 1.000 0.999 1.000

: AUROC = 0.899 Ferretina 0.00275 1.003 1.001 1.005


: Puntuacion 2a -4.3346 0.013 <0.001 0.285


: Puntuacion 5a 4.0033 54.779 1.932 >999.99


: Puntuacion 8a 9.4028 >999.99 3.123 >999.99

Tabla 3: Analisis multivariado que muestra variables independientemente asociadas con diferentes objetivos de

diagnostico.

El rendimiento diagnostico se expreso mediante ya sea AUROC para la puntuacion obtenida por regresion loglstica 5 binario/ordinal o aR2 para la puntuacion obtenida por regresion lineal multiple. Las figuras entre parentesis indican AUROC corregida con sesgo de optimismo. En estos modelos, la explicacion fue el objetivo principal, por lo que las condiciones de las variables independientes fueron mas estrictas que en un modelo predictivo. Las variables fueron seleccionadas por el metodo bootstrap paso a paso.

Objetivo de diagnostico: Variables independientes Puntuacion Rendimiento

Fibrosis:

Fibrosis significativa: Metavir F> 2 Peso, edad, glucemia, AST, ALT, ferritina, plaquetas a # 1B AUROC = 0.932 (0.918)

NASH-CRN F>2: Peso, glucemia, AST, ALT, Indice de protrombina # 2B AUROC = 0.866 (0.856)

Area de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST, ALT, plaquetas, Indice de protrombina # 3B aR2=0.530 (0.518)

Dimension fractal de fibrosis: Acido hialuronico, glucemia, AST/ALT, peso, plaquetas # 4B aR2=0.529 (0.517)

Esteatosis

Esteatosis significativa: rAOS >3% BMI, glucemia, trigliceridos # 5B AUROC=0.797 (0.782)

NASH-CRN grado >1: BMI, glucemia, trigliceridos, ferretina # 6B AUROC=0.831 (0.815)

Area de esteatosis (log): BMI, glucemia, trigliceridos, ferretina # 7B aR2=0.213 (0.198)

Dimension fractal de esteatosis: BMI, glucemia, trigliceridos, ferretina # 8B aR2=0.247 (0.230)

NASH b:

NAS > 3: BMI, AST, ferritina # 9B AUROC=0.846 (0.836)

NAS > 5: Ferretina # 10B AUROC=0.709 (0.708)

NAS 0-2 / 3-4 / 5-7: BMI, AST, ferritina # 11B AUROC=0.815

AST: aspartato aminotransferasa ALT: alanina aminotransferasa BMI: Indice de masa corporal a El modelo original determinado por regresion loglstica binaria convencional b De acuerdo con 3 definiciones basadas en NAS

Tabla 3bis: Analisis multivariado que muestran variables independientemente asociadas con diferentes objetivos de

diagnostico.

El rendimiento diagnostico se expreso mediante ya sea AUROC para la puntuacion obtenida por regresion loglstica 5 binario/ordinal o aR2 para la puntuacion obtenida por regresion lineal multiple. Las figuras entre parentesis indican AUROC corregida a partir del sesgo de optimismo. En estos modelos, la explication fue el objetivo principal, por lo que la condition de no-colinealidad entre variables independientes fue mas estricta que en un modelo predictivo. Las variables se seleccionaron mediante un metodo bootstrap (analisis de regresion por etapas en 1.000 muestras de bootstrap).

Puntuacion: Objetivo de diagnostico Variables Coeficiente P Exp (P) 95% de CI 95% de CI




: inf sup

1b: Fibrosis significativa Metavir F>2 Exp (b) Exp (b)


: Intercepto -6.9269 - - -


: Edad 0.0671 1.069 1.016 1.126


: Glucemia 0.4239 1.528 1.125 2.076


: AST 0.0585 1.060 1.034 1.087


: ALT -0.0184 0.982 0.968 0.996


: Ferretina 0.00112 1.001 1.000 1.002


: Plaquetas -0.0105 0.990 0.982 0.997

2b: Fibrosis significativa NASH-CRN F>2 Exp (b) Exp (b)


: Intercepto -3.6323 - - -


: Peso 0.0539 1.055 1.026 1.086


: Glucemia 0.5166 1.676 1.131 2.485


: AST 0.0695 1.072 1.044 1.101


: ALT -0.0189 0.981 0.969 0.994


: indice de protrombina -0.0594 0.942 0.905 0.981

3b: Area de fibrosis P P


: Intercepto 11.59720 5.72423 17.47017


: Glucemia 0.44087 0.16118 0.72055


: AST 0.04949 0.02291 0.07606


: ALT -0.02083 - 0.03661 -0.00505


: Plaquetas -0.00752 - 0.01641 0.00138


: Indice de protrombina -0.08903 - 0.15085 -0.02721


: Acido hialuronico 0.02122 0.01509 0.02736

4b: Dimension fractal de fibrosis P P


: Intercepto 0.74800 0.59622 0.89978


: Peso 0.00247 0.00120 0.00374


: Glucemia 0.02634 0.0163 0 0.03637


: AST/ALT 0.19838 0.12788 0.26888


: Plaquetas -0.0005524 -0.0008494 -0.0002553


: Acido hialuronico 0.00035650 0.00011211 0.00060090

5b: Esteatosis Significativa (rAOS >3%) Exp (P) Exp (P)


: Intercepto -10.8186 - - -


: BMI 0.2667 1.306 1.136 1.500


: Glucemia 0.5154 1.674 1.047 2.678


: Trigliceridos 0.9728 2.645 1.388 5.042

6b: Esteatosis Significativa NASH-CRN grado >1 Exp (P) Exp (P)


: Intercepto -11.1031 - - -


: BMI 0.2124 1.237 1.108 1.380


: Glucemia 0.6451 1.906 1.180 3.080


: Trigliceridos 0.7650 2.149 1.261 3.663


: Ferretina 0.00149 1.001 1.000 1.003

7b: Area de esteatosis (log) P P


: Intercepto -1.78517 - 2.98336 -0.58698


: BMI 0.08947 0.05079 0.12815


: Glucemia 0.09542 -0.02158 0.21241


: Trigliceridos 0.22814 0.05665 0.39963


: Ferretina 0.0002852 -0.0001074 0.0006778

8b: Dimension fractal de esteatosis P P


: Intercepto 0.91010 0.72363 1.09658


: BMI 0.01502 0.00900 0.02103


: Glucemia 0.01625 -0.00195 0.03446


: Trigliceridos 0.03534 0.00865 0.06203


: Ferretina 0.0000576 -0.0000035 0.0001187

9b: NASH (NAS >3) Exp (P) Exp (P)


: Intercepto -7.5364 - - -


: BMI 0.1596 1.173 1.059 1.300


: AST 0.0479 1.049 1.024 1.075


: Ferretina 0.00256 1.003 1.001 1.004

10b: NASH (NAS >5)


: Intercepto -2.4712 - - -


: Ferretina 0.00148 1.001 1.001 1.002

11b: NASH (NAS 0-2/3-4/5- 7)


: Intercepto 3 -7.3898 - - -

5

10

15

20

25

30

35


: Intercepto 3 -5.3943 - - -


: BMI 0.1258 1.134 1.048 1.228


: AST 0.0255 1.026 1.010 1.042


: Ferretina 0.00158 1.002 1.001 1.003

Area y dimension fractal de fibrosis

Por regresion lineal multiple, se obtuvo la mayor precision con una combinacion de los predictores independientes de AOF (veanse las tablas 2 y 3). De este modo, la correlacion entre AOF pronosticada mediante prueba de sangre y medida por biopsia de hlgado fue: rp=0.731 (p<10-3) (figura 1a). La mayor exactitud para la fibrosis FD se obtuvo con una combinacion de los predictores independientes (veanse las tablas 2 y 3). De este modo, la correlacion entre fibrosis FD pronosticada mediante prueba de sangre y medida por biopsia de hlgado fue: rp = 0.734 (p<10-3) (figura 1 b).

Diagnostico de esteatosis hepatica

Esteatosis significativa

Rendimiento de diagnostico - La esteatosis significativa se definio de dos maneras. Se definio por primera vez por rAOS >3% ya que el area de la parcela vs FD mostro una inflexion en rAOS=3% y FD=1.4 (figura 2). La segunda definicion se baso en NASH-CRN grado >1. La prevalencia de esteatosis fue significativamente mayor con rAOS >3%: 68.8% que con NASH-CRN grado >1:54.7% (p<10-3 por prueba de McNemar).

Utilizando la regresion loglstica binaria, se diagnostico esteatosis significativa definida por rAOS >3% por las variables independientes como se muestra en las tablas 2 y 3. El rendimiento de diagnostico de este modelo fue: AUROC: 0.797±0.027 (IC del 95% 0.804-0.911), precision general: 77.4%.

Utilizando NASH-CRN grado >1 como objetivo de diagnostico, la mejor puntuacion se muestra en las tablas 2 y 3. Cantidad de esteatosis

Utilizando la regresion lineal multiple, se pudo estimar la rAOS, con una precision moderada (aR2 = 0.213), mediante una puntuacion que inclula sangre y variables cllnicas como se muestra en las tablas 2 y 3. De este modo, la correlacion entre rAOS pronosticada mediante prueba de sangre y medida por biopsia de hlgado fue: rp = 0.647 (p<10-3) (figura 1c).

Dimension fractal de esteatosis

Utilizando una regresion lineal multiple, se pudo estimar la FD de esteatosis, con una precision moderada (aR2 = 0.247), mediante una puntuacion que inclula sangre y variables cllnicas como se muestra en las tablas 2 y 3. De este modo, la correlacion entre la FD de esteatosis pronosticada mediante prueba de sangre y medida por biopsia de hlgado fue: rp=0.621 (p<10-3) (figura 1d).

Diagnostico de NASH

La NASH se pronostico independientemente como se muestra en las tablas 2 y 3 con AUROC correspondiente. La correlacion entre NASH pronosticada mediante prueba de sangre y NAS medida por biopsia de hlgado fue: rs = 0.726 (p<10-3) (figura 3b).

Relacion entre lesiones

Con el fin de validar las pruebas de sangre, se evaluo la capacidad de estas pruebas para reflejar las relaciones entre lesiones.

Area y FD - La relacion exponencial entre AOF histologico y FD (rs = 0.971, p<10-3) se reflejo bien en la relacion entre las respectivas pruebas de sangre (rs = 0.861, p <10-3) (figura 4a y B).

La relacion exponencial entre el rAOS histologico y la esteatosis FD (rs = 0.976, p<10-3) se reflejo bien en la relacion entre las respectivas pruebas de sangre (rs = 0.886, p<10-3) (figura 4c y d).

Fibrosis y esteatosis - Estadio de fibrosis NASH-CRN se considera en este documento como una referencia cronologica ya que se supone que aumenta en funcion del tiempo. AOS alcanzo su punto maximo en el estadio 2 de la fibrosis

5

10

15

20

25

30

35

NASH-CRN con una curva cuadratica, mientras que la AOF aumento casi linealmente en funcion del estadio de fibrosis (figura 5a). Estas relaciones se reflejaron bien en las pruebas de sangre respectivas, excepto paras AOS en F4, pero hubo algunos pacientes (figura 5b). Las mismas curvas se observaron con FD de fibrosis o esteatosis (figura 5c), mientras que se reflejaron bien en las respectivas pruebas de sangre (figura 5d).

Estudios de MRI

Se incluyeron 21 pacientes con esteatohepatitis, junto con dos controles sin esteatohepatitis.

Se realizo una biopsia de hlgado con el fin de diagnosticar esteatohepatitis alcoholica o no alcoholica.

El grado de esteatosis fue evaluado por un experto utilizando la clasificacion de esteatosis

- S0 (0% de hepatocitos),

- S1 (menos del 10%),

- S2 (entre el 10% y el 30%),

- S3 (entre el 30% y el 50%) y

- S4 (mas del 50%).

El area de esteatosis (AOS) (en porcentaje) se calculo mediante nuestro metodo de analisis automatico de imagenes, previamente descrito en la presente solicitud, que mide el area de vacuolas lipldicas presentadas en hepatocitos.

Se implementaron metodos de cuantificacion por MRI, ya descritos en la literatura, a saber: Hussain, Fast Spin Echo con y sin saturacion de grasa (FSE), Dixon de 2 puntos y Dixon de 3 puntos.

Se desarrollo un metodo adicional basado en MRI de eco de gradiente de eco multiple (MFGRE), como se describio previamente en la presente solicitud, y se aplico.

Las correlaciones fueron evaluadas por el coeficiente de correlacion de Spearman (Rs) y el coeficiente de correlacion intraclase (Ric).

Resultados

La distribucion de nuestra poblacion por clasificacion de esteatosis fue:

- S0 = 2 pacientes,

- S1 = 4 pacientes,

- S2 = 4 pacientes,

- S3 = 7 pacientes y

- S4 = 6 pacientes.

Correlacion entre la clasificacion de esteatosis y AOS:

AOS se correlaciono con los grados de esteatosis (Rs = 0.82 y p<0.001). AOS fue significativamente diferente entre todos los grados de esteatosis (p<0.001), por ejemplo, entre grados S0 a S2 (menos del 30%) y grados S3 a S4 (mas del 30%), respectivamente: 4.2 ± 2.4 versus 16.4 ± 8.9 (p<0.001).

Correlacion entre los metodos de cuantificacion de MRI y la clasificacion de esteatosis: La correlacion intraclase entre los grados de esteatosis y los metodos de cuantificacion de MRI fue Rs = 0.66 para MFGRE, Rs = 0.69 para Hussain, Rs = 0.80 para FSE; Rs = 0.68 para Dixon de 2 puntos y Rs = 0.73 para Dixon de 3 puntos (p<0.001 para todas las correlaciones).

Correlacion entre la cuantificacion de MRI y AOS:

La cuantificacion de esteatosis por metodo MFGRE se correlaciono mejor con AOS (Rs = 0.77 y Ric = 0.85) (vease la Figura 6).

Los coeficientes de correlacion obtenidos por otros metodos fueron, respectivamente: 0.71 y 0.57 para Hussain, 0.80 y 0.61 para FSE; 0.71 y 0.55 para Dixon de 2 puntos; 0.61 y 0.28 para Dixon de 3 puntos.

En la regresion lineal multiple, MFGRE fue el unico metodo de cuantificacion de MRI independientemente ligado a AOS.

Claims

Reivindicaciones

1. Un metodo no invasivo in vitro para cuantificar las lesiones del hlgado de un paciente que comprende:

medir los siguientes biomarcadores en una muestra del paciente: plaquetas, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), ferritina y glucemia y medir los siguientes marcadores cllnicos: edad y peso, y combinar 5 dichas medidas en una funcion loglstica.
2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la lesion es debida o esta relacionada con insuficiencia hepatica, fibrosis hepatica, esteatosis hepatica, enfermedad por hlgado graso no alcoholico (NAFLD), esteatohepatitis o esteatohepatitis no alcoholica (NASH).