JP6162713B2 - 高相同性オリゴヌクレオチドによる非特異的増幅の抑制 - Google Patents

高相同性オリゴヌクレオチドによる非特異的増幅の抑制 Download PDF

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Description

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅は、生物医学研究、診断、及びバイオテクノロジーにおいて多くの用途を有する。ＰＣＲ法のユニークな特異性は、他の配列の圧倒的な量の存在下での特定の核酸配列の選択的増幅を可能にする。さらに、ＰＣＲは、１つの塩基対しか違わない別の配列から標的配列を区別することを可能にする。例えば、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）は、野生型の非変異ＤＮＡの存在下で、ＤＮＡの小さな変化さらには単一ヌクレオチド変異さえ検出することができる（米国特許第６，６２７，４０２号）。対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイでは、少なくとも１つのプライマーは対立遺伝子特異的であるように、すなわち標的配列（配列の特異的変種）と優先的に一致するように設計されるが、非標的配列（配列の他の変種）との判別ミスマッチを含む。理想的には、対立遺伝子特異的プライマーが標的配列にハイブリダイズされた場合にのみ、プライマー伸長が発生する。成功する対立遺伝子特異的ＰＣＲでは、核酸の標的変種が増幅されるが、他の非標的変種は、少なくとも検出可能なレベルまでは増幅されない。残念ながら、多くの標的でこの理想は達成できない。ＰＣＲの後期サイクルでは、配列の非標的変種の増幅も検出可能になるのが一般的である。この現象は「ブレイクスルー増幅（breakthrough amplification）」と呼ばれる。ＡＳ−ＰＣＲプライマーが、標的配列と完全に相補的（又は、少なくとも高度の相補性を共有する）であって、非標的配列とはミスマッチしていても（又は、より多くのミスマッチを有しても）、非標的配列の増幅は、しばしば完全には回避できない。
ブレイクスルー増幅は、試料が、少量の標的配列と多量の非標的配列とを含有するアッセイにおいて、特別な関心事である。例えば、腫瘍の体細胞突然変異を標的とするアッセイでは、患者の試料からの細胞の一部のみが腫瘍細胞である。腫瘍細胞のある画分が突然変異を含み、特定の抗腫瘍薬剤に対して感受性を示すことがある（例えば、米国特許第７，２９４，４６８号及び第７，９６０，１１８号に記載されている突然変異を参照）。このような試料では、少数の標的（変異）の配列は、多数の非標的（非変異）配列と混合される。非変異配列のブレイクスルー増幅は、偽陽性結果を与え、誤って突然変異の存在を示し、患者の治療を誤った方向に向けるであろう。アッセイの特異性がブレイクスルー増幅により制限されている場合は、そのアッセイの臨床的有用性が制限される。
非特異的増幅を防止又は低下させるための種々の手段が提唱されている（例えば、増幅プライマーの特異性に影響を与える化学的修飾、米国特許第６，０１１，６１１号を参照；ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用して、米国特許出願公開第２００９５３７２０を参照）。しかし、これらの方法は、ブレイクスルー増幅を完全に排除することに必ずしも成功していない。従って、核酸増幅反応においてブレイクスルー増幅を防止又は最小化するための代替法に対するニーズがある。
ある態様において本発明は、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有する、核酸増幅反応で使用されるサプレッサーオリゴヌクレオチドである。
別の態様において本発明は、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを選択するための配列整列アルゴリズムを使用して、核酸増幅反応で使用されるサプレッサーオリゴヌクレオチドを設計する方法である。
さらに別の態様において本発明は、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅反応を実施することを含む、核酸増幅反応における非標的核酸鋳型の増幅を低減する方法である。
さらに別の態様において本発明は、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む、非標的配列の増幅が低下している増幅反応を実施するためのキットである。
さらに別の態様において本発明は、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む、非標的配列の増幅が低下している増幅反応を実施するための反応混合物である。
さらに別の態様において本発明は、非特異的増幅を低減するための核酸増幅反応における、標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドの使用である。
図１は、プライマーの１つとしても使用される抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２（コドン１２を含む）の増幅を示す。図１Ａは、抑制されていないブレイクスルー増幅（破線）を示し、図１Ｂは、非標的配列増幅の抑制を示す。 同上
図２は、標的配列と相補的でない抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン３（コドン６１を含む）の増幅を示す。図２Ａは、サプレッサーオリゴヌクレオチドが無しにはブレイクスルー増幅の抑制が無いことを示し、図２Ｂは、サプレッサーオリゴヌクレオチドが低濃度で存在する場合には抑制が無いことを示し、図２Ｃは、サプレッサーオリゴヌクレオチドがより相対的高濃度で存在する場合の抑制を示す。 同上 同上
図３は、標的配列と相補的でない抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子の増幅を示す。図３Ａは、サプレッサーオリゴヌクレオチドの非存在下でのブレイクスルー増幅を示し、図３Ｂは、サプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下でのブレイクスルー増幅の抑制を示す。 同上
図４は、標的配列に相補的でない抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー増幅抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＢＲＡＦ遺伝子（コドン４６９と６００を含む）の増幅を示す。図４Ａは、サプレッサーオリゴヌクレオチドの非存在下でのブレイクスルー増幅を示し、図４Ｂは、コドン４６９反応におけるサプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下でのブレイクスルー増幅の抑制を示す。図４Ｃは、サプレッサーオリゴヌクレオチドの非存在下でのブレイクスルー増幅を示し、図４Ｄは、コドン６００反応におけるサプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下でのブレイクスルー増幅の抑制を示す。 同上 同上 同上
図５は、エクソン３についてＭ１３標的（コドン６１）の同時線形増幅によるブレイクスルー抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２と３の増幅を示すが、エクソン２（コドン１２）についてはブレイクスルー抑制が無いことを示す。 同上 同上 同上
図６は、標的ゲノムと異なる程度の相同性を有する抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー抑制を用いる、対立遺伝子特異的ＰＣＲによるヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２の増幅を示す。図６Ａは、相同性の程度が低いサプレッサーオリゴヌクレオチドにより、ブレイクスルー増幅の抑制が無いことを示す；図６Ｂは、中程度の相同性を有するオリゴヌクレオチドによる、部分的抑制を示す；及び、図６Ｃは、高度の相同性を有するオリゴヌクレオチドによる、完全な抑制を示す。 同上 同上
図７は、抑制オリゴヌクレオチドの設計のための、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２中の目的の領域のＢＬＡＳＴ（登録商標）検索の結果を示す。
図８は、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２中の関係する目的の抑制オリゴヌクレオチドを選択する例を示す。
本開示の理解を容易にするために、ここで使用される用語の以下の定義が提供される。
用語「対立遺伝子特異的プライマー」又は「ＡＳプライマー」は、標的配列の２つ以上の変種にハイブリダイズしてもよいが、標的配列の変種を区別することができるプライマーを指し、従って、プライマーが１つの特定の変種にハイブリダイズした場合のみ、適切な条件下で核酸ポリメラーゼによるプライマーの効率的な伸長が起きる。標的配列の他の変種では、伸長はあまり効率的ではないか非効率的である。
用語「アンプリコン」は、ポリメラーゼ連鎖反応の生成物として形成される核酸を指す。
用語「共通プライマー」は、対立遺伝子特異的プライマーを含む、プライマー対中の第２のプライマーを指す。共通プライマーは対立遺伝子特異的ではなく、すなわち、対立遺伝子特異的が区別する標的配列の変種間を区別しない。
用語「相補的」又は「相補性」は、ワトソン−クリック塩基対合則によって関係づけられるポリヌクレオチドの逆平行鎖に関連して使用される。相補的な核酸鎖は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で２本鎖を形成することができる。用語「完全に相補的」又は「１００％相補的」は、逆平行鎖間のすべての塩基のワトソンクリック対合を有する相補的な配列を指し、従ってポリヌクレオチド２本鎖内のいずれの２つの塩基間にもミスマッチが存在しないことを指す。用語「部分的に相補的」又は「不完全に相補的」は、１００％未満の完全性である逆平行ポリヌクレオチド鎖間の塩基の整列を指す（例えば、ポリヌクレオチド２本鎖内に少なくとも１つのミスマッチ又は一致しない塩基が存在する）。より小さい核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチド）が、より大きな核酸（例えば、遺伝子又はゲノム）中の領域（部位）に相補的であってよい。標準的なハイブリダイゼーション条件下では、完全な相補性が存在しない場合も逆平行鎖間に２本鎖が形成される。しかし、部分的に相補的な鎖間の２本鎖は、一般に完全に相補的な鎖間の２本鎖よりも不安定である。
核酸増幅アッセイの文脈における「増殖曲線」は、独立変数が増幅サイクルの数であり、従属変数が、各増幅サイクルで測定される増幅依存性の測定可能なパラメータである、関数のグラフである。典型的には増幅依存性の測定可能なパラメータは、ハイブリダイゼーションにより、又は核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によるプローブの加水分解時に、プローブから放出される蛍光の量である（Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88：7276-7280、及び米国特許第５，２１０，０１５号を参照）。典型的なポリメラーゼ連鎖反応では、増殖曲線は指数増殖の部分を含み、その後に平坦部分が続く。増殖曲線は典型的には、測定可能なパラメータの所定の大きさが達成されるサイクル数である「サイクル閾値」又は「Ｃｔ」値によって特徴付けられる。より小さい又は「より早い」Ｃｔ値はより迅速な増幅を表し、一方、より高い又は「より後の」Ｃｔ値は遅い増幅を表す。
用語「相同性」及び「相同性領域」は、２つの核酸が少なくとも部分的相補性を共有する領域（部位）を指す。相同性領域は、配列の一部のみにまたがっていてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの一部のみがゲノム中の部位に相同的でもよい。オリゴヌクレオチドの異なる部分が、ゲノム中のいくつかの異なる部位に対して相同的で、一方、全オリゴヌクレオチドが、ゲノム中の別の部位に対して相同的であってもよい。任意の部分的に相補的な核酸配列のように、２つの配列が整列される場合、相同性領域は１つ又はそれ以上のミスマッチ及びギャップを含んでよい。より小さい核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチド）は、より大きな核酸（例えば、遺伝子又はゲノム）中の領域（部位）に相同的でもよい。２つの配列間の用語「相同性の程度」は、配列間の同一性の程度を指す。同一性の程度は一般に、ヌクレオチドの総数に対する相同性領域中のミスマッチヌクレオチドの比率（パーセントで示される）として表される。例えば、２つのミスマッチを有する標的ゲノム中の相同性領域（部位）にハイブリダイズする２０塩基のオリゴヌクレオチドは、その領域に対して９０％の同一性を有すると言われる。用語「標的ゲノムに対する相同性の程度」は、標的ゲノム中に存在するオリゴヌクレオチドに対する相同性領域の数と同一性パーセントの尺度である。相同性の程度の高いオリゴヌクレオチドは、標的ゲノムを通して高い割合の同一性を有する相同性領域を有し、相同性の程度の低い領域は、その標的ゲノム中に同一性の割合が低い、より少ない相同性領域を有するであろう。
用語「ハイブリダイズした」及び「ハイブリダイゼーション」は、２つの少なくとも部分的に相補的な（本明細書で定義されるように）核酸鎖間の塩基対合相互作用を指し、これは２本鎖の生成に至る。ハイブリダイゼーションを達成するために、２つの核酸がその全長にわたって１００％の相補性を有することは必須ではない。より小さい核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチド）は、より大きな核酸（例えば、遺伝子又はゲノム）中の領域（部位）にハイブリダイズすることができるであろう。
標的ゲノムの領域に相同的なサプレッサーオリゴヌクレオチドに関連する用語「複数の相同性領域」は、オリゴヌクレオチドの抑制性を支持するのに充分な、標的ゲノム中のそのような領域の数を記載するために使用される。一般に「複数」は、２つ以上、例えば２、３、２０、３０、２００、３００、２０００、３０００などを意味し、その間のすべての整数を意味する。しかし、標的ゲノムの複雑さに依存して充分な数は変化し、すなわち、あまり複雑ではないゲノムでは、抑制現象が起きるのにより小さい数で充分であり、一方、より複雑なゲノムではより大きな数が必要であろう。
用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（又はリボ核酸）のポリマーを説明するために同義で使用され、プライマー、プローブ、種々の生物のゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ、及びゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡのフラグメント、並びに他の遺伝子要素、例えばプラスミド、コスミドなどを含む。これらの用語は長さによっては限定されず、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、及びプリンもしくはピリミジン塩基の任意の他のＮ−グリコシド、又は修飾プリンもしくはピリミジン塩基のポリマーに一般的である。これらの用語は、２本鎖核酸及び１本鎖核酸を含む。核酸は、天然に存在するホスホジエステル結合又は修飾結合（特に限定されないが、チオエステル結合を含む）を含むことができる。同様に核酸は、５つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）又は他の修飾された非標準的な又は誘導体化された塩基成分を含むことができる。
用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」は同義に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、時に、より短いポリヌクレオチドを記載するために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチドで最大１００ヌクレオチドからなる。
用語「１次配列」は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列を指す。例えば窒素性塩基修飾、糖修飾、又は他の骨格修飾などのヌクレオチド修飾は、一次配列の一部ではない。オリゴヌクレオチドに結合した発色団などの標識物もまた、一次配列の一部ではない。すなわち、２つのオリゴヌクレオチドは同じ一次配列を共有するが、修飾や標識物に関して異なることができる。
用語「プライマー」は、標的核酸中の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、合成に適した条件下で核酸の相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができる。プライマー伸長が起きるのに、完全な相補性は必要ではない。しかし、完全な相補的性を有するプライマー（特に３’末端の近く）は、ミスマッチ（特に３’末端の又はその近くのミスマッチ）を有するプライマーより効率的に伸長されるであろう。
用語「プローブ」は、標的核酸中の配列とハイブリダイズし、検出可能に標識し得るオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、修飾、例えばプローブを核酸ポリメラーゼによって伸長しないようにする３’末端の修飾、又は１つ又はそれ以上の発色団による修飾を有することができる。同じ配列を有するオリゴヌクレオチドは、あるアッセイではプライマーとして機能し、異なるアッセイではプローブとして機能してもよい。
用語「目的の領域」は、そこからサプレッサーオリゴヌクレオチドが設計される標的ゲノムの領域を指す。
用語「試料」は、核酸を含有するか又は含有すると推定される任意の組成物を指す。これは、ある個体からの組織又は液体の試料を含む。例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、器官及び腫瘍、個体から採取した細胞から樹立されたインビトロ培養物の試料、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）を含む試料、及びそこから単離される核酸の試料。
用語「サプレッサーオリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ混合物中に存在する場合、非標的配列の増幅を抑制するか又は検出可能に低減するオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの例では、サプレッサーオリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ中の非標的配列の指数関数的増幅を検出可能に低減する。サプレッサーオリゴヌクレオチドは、標的配列の増幅のためのプライマーとして機能することを含む追加の機能を、任意に有してもよい。
「鋳型」又は「標的」は、増幅すべき、検出すべき、又はその両方である核酸を指す。標的又は鋳型は、そこにプライマー又はプローブがハイブリダイズする配列である。鋳型核酸は、微生物、複雑な生物学的混合物、組織、体液、血清、保存された生物学的試料、環境分離株、インビトロ調製物などを含む基本的に任意の供給源から誘導することができる。鋳型又は標的は、核酸分子の全部又は一部を構成してもよい。
用語「標的生物」は、その核酸試料が分析されている生物を指す。標的生物のゲノムは、「標的ゲノム」と呼ばれる。
用語「標的配列」は、増幅が所望される標的生物の配列を指す。用語「非標的配列」は、その増幅が所望ではなくかつ避けるべき別の配列を指す。対立遺伝子特異的ＰＣＲの文脈において、関心の非標的配列は、多くの場合、標的配列の非常に類似した変種である。望まれていないが、非標的配列は時に、標的配列と一緒に対立遺伝子特異的ＰＣＲによって増幅されるが、より低い効率で増幅される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、はるかに多い数の他の配列の中で、標的核酸配列を特異的に増幅することができる。対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）は、１つのヌクレオチドしか異ならない配列間を区別することができる方法である。ＰＣＲ及びＡＳ−ＰＣＲの感受性と特異性は、核酸の標的変種が、はるかに多い量の非標的変種と無関係の配列の存在下でさえ、選択的に増幅されることができるようなものである。理想的には、非標的核酸は決して検出可能なレベルまで増幅されない。しかし、ＰＣＲ及びＡＳ−ＰＣＲの感受性は、「ブレイクスルー増幅」と呼ばれる現象により挑戦され、これは、ＰＣＲの後期サイクル中の非標的核酸配列の検出可能な増幅である。
対立遺伝子特異的ＰＣＲを実施する場合、本発明者は、いくつかのオリゴヌクレオチド（最初はプライマーとして使用される）がＡＳ−ＰＣＲアッセイ中に存在する場合、ブレイクスルー増幅を顕著に低減することを発見した（実施例１、図１）。これらのサプレッサーオリゴヌクレオチドをさらに調べると、最も驚くべきことに、このオリゴヌクレオチドは、無関係の標的（すなわち、抑制オリゴヌクレオチドと相補性の領域が無い標的）に対して同じ作用を示すことが発見された（実施例２、図２、実施例３、図３、及び実施例４、図４）。従って本発明者は、ＰＣＲ及びＡＳ−ＰＣＲアッセイを改善するために、このようなオリゴヌクレオチドを設計し使用する方法を考案した。
理論に拘束されるつもりはないが、本発明者は、ブレイクスルー増幅が普通に発生する時に、ブレイクスルー抑制の機構の１つが、増幅の後期サイクルでＰＣＲ試薬を隔離しているかも知れないと仮定した。ＰＣＲの後期サイクルでは、一部には、変性したアンプリコンの１本鎖へのプライマーのアニーリングより、２本鎖アンプリコンの再アニーリングが動力学的に優先されるため、標的配列の増幅が停止する（プラトーに達する）。この段階で、過剰のプライマーは、非標的配列にハイブリダイズしたミスマッチプライマーの延長を含む、あまり特異的ではない（従って効率の低い）ブレイクスルー増幅のために利用可能になる。しかし、ミスマッチプライマー伸長の熱力学的パラメータは好ましくない。従って、ミスマッチプライマーの伸長は、ヌクレオチドや核酸ポリメラーゼのような成分の枯渇又は隔離に大きく影響される。サプレッサーオリゴヌクレオチドの性質は、ゲノム中の別の場所での線形プライマー伸長を可能にし、及び（任意に）ゲノム中の別の場所で追加のアンプリコンの指数関数的な生成を可能にする。これらの外部の反応は、ほぼ間違いなくあまり効率的ではないが、重要な試薬を隔離し、これらの試薬を必要とするブレイクスルー増幅を阻害する。
この仮説を検定するために、本発明者は、実施例５に記載の実験を行った。この実施例では、複数の線形伸長反応を開始させることができる改変したプライマー／標的の組合せの存在下で、そのブレイクスルー増幅について知られているＡＳ−ＰＣＲアッセイ（図５Ａ）を行った。この複数の線形伸長反応は、ある程度の枯渇効果を生成し、ブレイクスルー増幅を抑制すると予測された。実際に、ブレイクスルー増幅のある程度の抑制が観察された（図５Ｂ）。
ある態様において本発明は、増幅反応、例えばＰＣＲ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）において、非標的配列の増幅を抑制するためのサプレッサーオリゴヌクレオチドである。サプレッサーオリゴヌクレオチドは、標的生物のゲノム中の複数の部位に対して相同的である。標的ゲノム中のこれらの部位は、サプレッサーオリゴヌクレオチドとの相同性領域を含む。ある態様において、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノムの間の相同性領域は、少なくとも７５％の同一性を有する。ある態様において相同性領域は、少なくとも１５塩基対の長さである。しかし、いくつかの配列（例えば、ＧＣリッチ配列）について、７５％未満の同一性を有するより短い相同性領域は、満足できる結果を与えることがある。実施例６、図６で証明されるように、一般に、相同性領域のそれぞれにおいて同一性が高いほど、抑制作用は良好である。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドの３’末端の最後の４塩基対内で、相同性領域は２以下のミスマッチを含む。ある態様において、この少なくとも１つの相同性領域は少なくとも１５塩基対の長さであり、又は／及びサプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、又は／及び３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含む。ある態様において、この少なくとも１つの相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチド及び標的ゲノムと少なくとも７５％の同一性である相同性を有する以外に、以下の特性：少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；３’末端から４ヌクレオチド以内で２以下のミスマッチを含む、の１つ以上を含む。別の態様において、サプレッサーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５を有する核酸配列を含むか又はこれらからなる（表１を参照）。
サプレッサーオリゴヌクレオチドは、標的配列の増幅及び検出の最小の妨害を引き起こすことが望ましい。サプレッサーオリゴヌクレオチドが追加の（非標的）アンプリコンを生成することができる場合、これらの追加のアンプリコンは検出され、従って標的配列の検出を妨害し得る。サプレッサーオリゴヌクレオチドによるこれらのアンプリコンの生成は避けることが好ましい。この態様の変形態様では、サプレッサーオリゴヌクレオチドは追加の特性を有する：これは追加のアンプリコンを生成することができない。ＰＣＲアンプリコンは、前進プライマーと逆進プライマーがの両方が存在している場合のみ、指数関数的に生成される。従って、オリゴヌクレオチドは、同じ核酸の相補鎖上の配列にハイブリダイズすることができる別のオリゴヌクレオチド（自身を含む）と対になっている場合には、アンプリコンの指数関数的な合成を開始することができる（前記配列は、第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位から約１０００塩基対を超えない位置にある）。いくつかの例では、例えば、前進性の高い核酸ポリメラーゼ（例えば米国特許第７，８５５，０５５号を参照）が使用される場合、１０００塩基対よりも長い非標的アンプリコンを生成することもでき、標的核酸の増幅と検出を妨害することができる。従って、前進性の高いポリメラーゼが使用される場合は、潜在的なサプレッサーオリゴヌクレオチドは１０００塩基対よりも高い上限値に基づいて排除されることがある。その場合、より多くの潜在的なサプレッサーオリゴヌクレオチドが排除されるであろう。一方、断片化された核酸（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ＦＦＰＥＴから単離された核酸）では、より長いアンプリコンは可能ではなく、潜在的なサプレッサーオリゴヌクレオチドは、１０００塩基対よりも短い制限に基づいて、排除されることがある。その場合、より少ない潜在的なサプレッサーオリゴヌクレオチドが排除されるであろう。本発明によれば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的ゲノムの相補鎖の上に少なくとも２つの相同性領域を有する場合、サプレッサーオリゴヌクレオチドとして使用されず、ここで、この領域は、オリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の同一性を有し、前記相同性領域は、約１０００未満の塩基対により分離されている。
サプレッサーオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを調製するための任意の適切な方法により、通常は市販の試薬と装置を使用する化学合成により、調製することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは市販品を購入することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で公知である（例えば、Narang et al., Meth. Enzymol. 68：90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68：109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22：1859-1862, 1981; 又は米国特許第４，４５８，０６６号を参照）。
本態様の変形において、本発明は、配列番号１〜５のサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む。
別の態様において本発明は、増幅反応、例えばＰＣＲ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）における非標的配列の増幅を抑制するためのサプレッサーオリゴヌクレオチドを設計する方法である。本発明のサプレッサーオリゴヌクレオチドを設計する方法は、配列整列アルゴリズムに依存する。ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチド設計法は、配列整列ソフトウェアを使用する。そのようなソフトウェアは広く入手可能であり、多くの場合、無償で公に利用できる。例えば、米国国立衛生研究所は、そのウェブサイトからＢＬＡＳＴ（登録商標）（Basic Local Alignment Search Tool）ソフトウェアパッケージを無償で利用できるようにしている。本発明はＢＬＡＳＴ（登録商標）に限定されず、ＢＬＡＳＴ（登録商標）は適切なソフトウェアパッケージの単なる例である。対になった配列整列ソフトウェアの他の例は、ＡＣＡＮＡ（Huang et al. (2006) Accurate anchoring alignment of divergent sequences. Bioinformatics 22：29-34）、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Fred Hutchinson Cancer Research Centerにより無償で配布されているオープンソースソフトウェア）、ＦＥＡＳＴ（University of Waterloo, Canada、により無償で配布されているソフトウェアパッケージ）、ＦＡＳＴＡ（University of Virginiaにより無償で配布されているソフトウェアパッケージ）ＲＥＰｕｔｅｒ、（Kurtz et al. (2001) REPuter： The Manifold Applications of Repeat Analysis on a Genomic Scale, Nucleic Acids Res., 29(22)：4633-4642）、ＳＷＩＦＴ ＢＡＬＳＡＭ（BAsic fiLter for Semigobal non-gapped AlignMent search）（Rasmussen et al. (2006) Efficient q-Gram Filters for Finding All epsilon-Matches over a Given Length, J. Comp. Biol. 13(2), 296-308）を含む。従って、ある態様において、本発明のサプレッサーオリゴヌクレオチドを設計する方法で使用される配列整列アルゴリズムは、Basic Local Alignment Search Tool、Smith-Waterman process、ＡＣＡＮＡ、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，ＦＥＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＲＥＰｕｔｅｒ、及びＳＷＩＦＴ ＢＡＬＳＡＭから選択される。
ある態様において本発明の方法は、標的ゲノムと相同性の複数の領域を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドを選択するための配列整列アルゴリズムの使用を含む。ある態様においてこの方法は、サプレッサーと標的ゲノムとの間の相同性領域が少なくとも７５％の同一性であるオリゴヌクレオチドを選択するために、配列整列アルゴリズムを使用する。ある態様においてこの方法は、相同性領域が少なくとも１５塩基対の長さであるオリゴヌクレオチドを選択するために、配列整列アルゴリズムを使用する。さらに別の態様においてこの方法は、相同性領域がオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがるオリゴヌクレオチドを選択するために、配列整列アルゴリズムを使用する。さらに別の態様においてこの方法は、オリゴヌクレオチドの３’末端の最後の４塩基対内で２以下のミスマッチを含むオリゴヌクレオチドを選択するために、配列整列アルゴリズムを使用する。ある態様において、少なくとも１つの相同性領域は、少なくとも１５塩基対の長さであるか、又は／及びサプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、又は／及び３’末端からの最後の４ヌクレオチド内で相同性領域が２以下のミスマッチを含む。ある態様において、少なくとも１つの相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノムの間の相同性が少なくとも７５％の同一性を有する以外に、１つ又はそれ以上の以下の特性：少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；３’末端からの最後の４ヌクレオチド内で２以下のミスマッチを含む、を有する。本態様の変形では、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドが標的ゲノムの相補鎖上に少なくとも２つの相同性領域を有する場合、サプレッサーオリゴヌクレオチドとしての使用からオリゴヌクレオチドを排除するための配列整列の使用を含み、ここでこの領域は、オリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の同一性を有し、この相同性領域は、約１０００未満の塩基対により分離されている。
本発明のある態様において、サプレッサーオリゴヌクレオチドは、ユーザーにより選択される目的の領域から得られる。目的の領域は、標的配列を含むか又はこれに隣接してもよく、又はゲノムに無関係の領域でもよい。目的の領域のサイズについていは制限は無いが、一般に、より大きな領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドの設計についてより多くの選択肢を与えることができる。一般に、目的の領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドについて所望の特徴のいくつかのを有するはずである。本方法のいくつかの態様では、目的の領域は、少なくとも７５％の同一性を有し少なくとも１５ヌクレオチドの長さである標的ゲノムと、複数の相同性領域を含む。
ある態様において本発明の方法は、配列整列アルゴリズムを使用して行われる以下の工程：
（ａ）１つ又はそれ以上の目的の領域を同定する；
（ｂ）目的の領域を検索物として使用して標的ゲノム配列の検索を行って、目的の領域と標的ゲノムとの相同性領域を同定する；
（ｃ）標的ゲノムと最も多くの相同性領域を有する、目的の領域の部分を選択する；
（ｄ）工程（ｃ）で選択される部分中の１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを設計する；
（ｅ）工程（ｄ）で設計されたオリゴヌクレオチドを用いて標的ゲノムの検索を行って、標的ゲノムと最大数の相同性領域を有し、以下の基準：少なくとも７５％の同一性と、オリゴヌクレオチドの３’末端領域内に２以下のミスマッチの存在、の１つ又は両方を満足するオリゴヌクレオチドを同定する；
（ｆ）任意に、工程（ｄ）で設計されたオリゴヌクレオチドを用いて標的ゲノムの検索を行って、標的ゲノム配列の相補鎖上に位置し、約１０００未満の塩基対により分離されている、少なくとも２つの相同性領域を有するオリゴヌクレオチドを同定し排除する、
を含む。
一般に、目的の領域と、工程（ｅ）で同定され、任意に非標的アンプリコン（ｆ）を生成することができないとして選択された、最も多くの相同性領域を有するオリゴヌクレオチドとが選択される。しかし、過剰な数の相同性領域は、全体としてはアッセイに有害となることがある。例えば、標的ゲノム中の反復性の高い要素と相同性のオリゴヌクレオチドは、過剰な数のプライマー伸長を開始し、これが反応を圧倒するであろう。例えば、Kazazian, H (2004) Mobile Elements： Drivers of Genome Evolution, Science 303 (5664)： 1626-1632を参照（Ａｌｕ反復性要素はヒトゲノムの１１％を構成し、すなわちゲノム全体を通して約２×１０8回出現する）。
実施例６は、本方法の応用を示す。図７は、ＢＬＡＳＴ（登録商標）を使用して行われた工程（ａ）〜（ｃ）の例示である。図８は、ＢＬＡＳＴ（登録商標）を使用して行われた工程（ｄ）〜（ｅ）の例示である。
プライマーをうまく伸長させるために、プライマーは標的配列と少なくとも部分的な相補性を有することが必要である。一般に３’末端での相補性は、プライマーの５’末端での相補性より重要である（Innis et al. Eds. PCR Protocols, (1990) Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11）。従って本発明は、表１に開示されたオリゴヌクレオチド、並びに５’末端変種を有するこれらのオリゴヌクレオチドの変種を包含する。
ある態様において本発明は、標的生物のゲノム配列中の複数の部位に相同的なサプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下で、増幅、例えばＡＳ−ＰＣＲを実施することを含む増幅反応、例えばＰＣＲ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）における非標的配列の増幅を抑制又は低減するための方法である。ある態様において、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノム間の相同性領域は少なくとも７５％の同一性を有する。ある態様において、相同性領域は少なくとも１５塩基対合の長さである。さらに別の態様において、相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドの３’末端の最後の４塩基対内で、相同性領域は２以下のミスマッチを含む。ある態様において、少なくとも１つの相同性領域は、少なくとも１５塩基対の長さであるか、又は／及び、サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、又は／及び３’末端から４ヌクレオチド内に２以下のミスマッチを含む。ある態様において、少なくとも１つの相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノム間に少なくとも７５％の同一性の相同性を有する以外に、１つ又はそれ以上の以下の特性：少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；３’末端の最後の４ヌクレオチド内で２以下のミスマッチを含む、を有する。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドが標的ゲノムの相補鎖上に少なくとも２つの相同性領域を有する場合、オリゴヌクレオチドはサプレッサーオリゴヌクレオチドとして使用されず、ここでこの相同性領域は、オリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の同一性を有し、この相同性領域は、約１０００未満の塩基対により分離されている。本態様の変形において、本方法は、配列番号１〜５を有する核酸配列を含むか又はこれらからなるサプレッサーオリゴヌクレオチドの使用を含む。
本発明の方法は、従来のＰＣＲ並びに対立遺伝子特異的ＰＣＲに適用可能である。対立遺伝子特異的ＰＣＲは、プライマーが、標的配列を増幅するが他の密接に関連した配列の増幅を避けるように設計された、ＰＣＲの変種である。対立遺伝子特異的ＰＣＲは、例えば米国特許第６，６２７，４０２号に記載されている。対立遺伝子特異的ＰＣＲでは、プライマーの少なくとも１つは、標的配列と配列相補性を有するが非標的配列とはミスマッチを有する識別性プライマーである。典型的には、プライマー中の識別性ヌクレオチド、すなわち標的配列とのみ一致するヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドである。プライマーが標的配列と完全には相補的ではない場合でも、これは、非標的配列と比較して、標的配列と高度の相補性を含む。対立遺伝子特異的プライマーの設計及び核酸増幅用のプライマーを最適化するための一般的方法は、例えばPCR Protocols： A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., (1990) Academic Pressに記載されている。
典型的にはプライマーは、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴヌクレオチドからなる合成オリゴヌクレオチドである。しかし、通常は核酸中には見出されない従来とは異なる塩基ヌクレオチドを使用することもできる。例えば、いくつかの修飾塩基は、増幅の特異性を上昇させることが知られており、例えば米国特許第６，００１，０１１号を参照されたい。 Innis et al. （前出）もまた、ＰＣＲに使用するための核酸ポリメラーゼを選択する場合のガイドを含む。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、,サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、サーマス種（Thermus sp. ）Ｚ０５（例えば、米国特許第５，６７４，７３８号を参照）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）、サーマス種（Thermus sp.）ｓｐｓ１７、デイノコッカス・ラジオデュランス（Deinococcus radiodurans）、Hot Spring family B/clone 7、バシラス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、及びサーモシホ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）由来のものを含む。
増幅生成物の検出は、当該分野で公知の任意の方法により行うことができる。これらの検出法は、標識プライマーやプローブ並びに種々の核酸結合色素の使用を含む。検出手段は、標的配列の変種に特異的であるか、又は標的配列のすべての変種もしくはすべての２本鎖ＤＮＡに特異的でもよい。増幅生成物は、増幅が完了した後に、例えば非標識生成物のゲル電気泳動と核酸結合色素によるゲルの染色により検出してもよい。あるいは、増幅生成物は、合成中の取り込みにより、又は標識プライマーにより、放射活性標識物もしくは化学標識物を有してもよい。電気泳動後又はその最中に、標識された増幅生成物は、当該分野で公知の適切な放射性もしくは化学的手段を用いて検出してもよい。電気泳動後、生成物はまた、当該分野で公知の任意の１つの方法により標識された標的特異的プローブを用いて検出してもよい。標識プローブはまた、電気泳動無しで、すなわち「ドットブロット」アッセイなどで、標的に適用してもよい。
ある態様において、増幅生成物の存在は、均一アッセイ（すなわち、発生中の生成物が増幅サイクル中に検出され、増幅後の操作が不要なアッセイ）で検出してもよい。ヌクレアーゼプローブを使用する均一系増幅アッセイは、米国特許第５，２１０，０１５号に記載されている。核酸インターカレート色素を使用する均一系増幅アッセイは、米国特許第５，８７１，９０８号及び６，５６９，６２７号に記載されている。均一アッセイはまた、伸長産物へのプローブのハイブリダイゼーションがプローブの酵素的消化と生じる蛍光の検出とを与える、１つ又はそれ以上の蛍光性プローブを使用してもよい（TaqMan（登録商標）probe method, Holland et al. (19919 P.N.A.S. USA 88：7276-7280）。他の方法は、２つの相互作用性蛍光色素で標識された２つのプローブを使用する。このようなプローブの例としては、「分子ビーコン」プローブ（Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14：303-308）、又は蛍光標識ヌクレアーゼプローブ（Livak et al., (1995) PCR Meth. Appl., 4：357-362）がある。
均一アッセイでは、反応は、各ＰＣＲサイクルでプローブの蛍光の上昇を示す増殖曲線により特徴付けられる（Holland et al., (前出)、及び米国特許第５，２１０，０１５号を参照）。各増殖曲線は、「サイクル閾値」又は「Ｃｔ」値によって特徴付けられる。より低いＣｔ値は、増幅のより迅速な完了を表し、一方、より高いＣｔ値は、増幅のより遅い完了を表す。より低いＣｔ値はまた、標的核酸のより大きな初期投入を示し、より高いＣｔ値は、より少ない初期投入量を示す。しかし対立遺伝子特異的ＰＣＲの場合、より低いＣｔ値は効率的な増幅を示す。ブレイクスルー増幅中に、大量の非標的配列の存在にもかかわらず、非標的配列は非常に高いＣｔ値を与える。高いＣｔ値は、非標的核酸の非常に非効率的な増幅を反映する。
さらに別の態様において本発明は、非標的配列の増幅が低下している増幅反応（例えばＰＣＲ又はＡＳ−ＰＣＲ）を実施するのに必要な試薬を含むキットである。試薬は、少なくとも、標的ゲノムと複数の相同性領域を有することを特徴とするサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、少なくとも一つの相同性領域は、少なくとも１５塩基対の長さであり、又は／及びサプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、又は／及び３’末端から４ヌクレオチド内に２以下のミスマッチを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノム間に少なくとも７５％の同一性の相同性を有する以外に、１つ又はそれ以上の以下の特性：少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；３’末端の最後の４ヌクレオチド内で２以下のミスマッチを含む、を有する。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドが標的ゲノムの相補鎖上に少なくとも２つの相同性領域を有する場合、オリゴヌクレオチドはサプレッサーオリゴヌクレオチドとしてキット内に含まれず、ここでこの相同性領域は、オリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の同一性を有し、この相同性領域は、約１０００未満の塩基対により分離されている。本態様の変形において、本方法は、サプレッサーオリゴヌクレオチドは配列番号１〜５の核酸配列を含むか又はこれらからなる。
ある態様においてキットは、サプレッサーオリゴヌクレオチド以外に、１つ又はそれ以上の対立遺伝子特異的プライマー、１つ又はそれ以上の対応する共通プライマー、及び任意に１つ又はそれ以上のプローブからなる群から選択される少なくとも１つの他の試薬を含む。キットはさらに、増幅及び検出アッセイの実施に必要な試薬、例えばヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ、又は／及びポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含んでよい。ある態様において、プローブは検出可能に標識される。そのような態様において、キットは標識物を検出するための試薬を含んでよい。任意にキットはまた、ＰＣＲの実施を増強する試薬（混入を低減するためのｄＵＴＰ及びウラシル−Ｎ−グリコシレート（ＵＮＧ）、及び特異性を改善するためのベタイン）を含んでよい。
さらに別の態様において本発明は、非標的配列の増幅が低下している増幅反応（例えばＰＣＲ又は対立遺伝子特異的ＰＣＲ）を実施するための反応混合物である。この混合物は、少なくとも、標的ゲノムと相同性の複数の領域を有することを特徴とするサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、相同性領域は、１つ又はそれ以上の以下の特性：サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列間に少なくとも７５％の同一性を有する；少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；及びオリゴヌクレオチドの３’末端から最後の４塩基対内で、相同性領域は２以下のミスマッチを含む、を有する。ある態様では、少なくとも１つの相同性領域は、少なくとも１５塩基対の長さであるか、又は／及びサプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、又は／及び３’末端から最後の４ヌクレオチド内に２以下のミスマッチを含む。ある態様において、少なくとも１つの相同性領域は、サプレッサーオリゴヌクレオチドと標的ゲノム間に少なくとも７５％の同一性の相同性を有する以外に、１つ又はそれ以上の以下の特性：少なくとも１５塩基対の長さである；サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがる；３’末端からの４ヌクレオチド内に２以下のミスマッチを含む、を有する。ある態様において、この混合物は、サプレッサーオリゴヌクレオチド以外に、１つ又はそれ以上の対立遺伝子特異的プライマー、１つ又はそれ以上の対応する共通プライマー、及び任意に１つ又はそれ以上のプローブを含んでよい。ある態様において、この反応混合物はさらに、ヌクレオシド３リン酸、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ、又は／及びポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含んでよい。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドが標的ゲノムの相補鎖上に少なくとも２つの相同性領域を有する場合、オリゴヌクレオチドはサプレッサーオリゴヌクレオチドとして反応混合物内に含まれず、ここでこの相同性領域は、オリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の同一性を有し、この相同性領域は、約１０００未満の塩基対により分離されている。本態様の変形において、サプレッサーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５を有する核酸配列を含むか又はこれらからなる。
実施例１
ＰＣＲプライマーによるブレイクスルー増幅の抑制
この例では、ブレイクスルー増幅の抑制が、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のコドン１２中のＡＳ−ＰＣＲ標的化変異において観察された。実施例１で使用されたプライマーとプローブは、表２に示される。配列番号６〜２３から選択される上流プライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２中のアミノ酸変化Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、及びＧ１２Ｖに対応する変異３５Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ｔ、３５Ｇ＞Ａ、３４Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ａ、及び３５Ｇ＞Ｔの１つに一致し、野生型配列とはミスマッチしていた。配列番号２４〜２６から選択される下流プライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２の変異体と野生型配列の間で共通しており、検出プローブは配列番号２７〜２９から選択される。
標準的ＰＣＲ混合物は、ヌクレオシド３リン酸（ｄＵＴＰを含む）、ＤＮＡポリメラーゼ、０．１μＭずつの選択的プライマー、０．１〜０．７μMの共通プライマー、検出プローブ、標的ＤＮＡ（１００コピーの変異体プラスミドを有する９９００コピーの野生型Ｋ５６２細胞株、又は１０，０００コピーの野生型細胞株ＤＮＡ、又は１０，０００コピーのＮＲＡＳ野生型エクソン２又は３プラスミド）、及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含んだ。増幅と分析は、Roche LightCycler（登録商標）480 装置（Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.）を使用して行われた。以下の温度プロフィール：９５℃（１０秒）〜６２℃（３０秒）を２サイクルの後に、９３℃（１０秒）〜６２℃（３０秒）のサイクリングを５５回、が使用された。蛍光データは、５５サイクルプログラムの各６２℃工程の最初に採取された。
結果は、図１に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、野生型配列を含有するプラスミドの増幅は太い実線で示され、変異型ＤＮＡ（標的配列）の増幅は狭い実線で示される。この結果は、上流の変異特異的プライマーが配列番号２４〜２６から選択される下流のプライマーの１つと対合すると、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅が検出されたことを示している。図１Ａ（破線）を参照されたい。同じ変異特異的プライマーが、配列番号１〜５から選択された異なる下流のプライマーと対合すると、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅は抑制された、図１Ｂを参照されたい。プラスミド中に存在する非標的配列の増幅が影響を受けず、抑制されない（太い実線）ことは、重要である。
実施例２
追加の抑制オリゴヌクレオチドによるブレイクスルー増幅の抑制
この例では、ブレイクスルー増幅の抑制が、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のコドン６１中のＡＳ−ＰＣＲ標的化変異において観察された。実施例２で使用されたプライマーとプローブは、表３に示される。配列番号３０〜４７から選択される上流プライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のアミノ酸変化Ｑ６１Ｈａ、Ｑ６１Ｈｂ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、及びＱ６１Ｒに対応する変異１８３Ａ＞Ｔ、１８３Ａ＞Ｃ、１８１Ｃ＞Ａ、１８２Ａ＞Ｔ、１８２Ａ＞Ｃ、１８２Ａ＞Ｇの１つに一致し、野生型配列とはミスマッチしていた。配列番号４８〜５０から選択される下流プライマー及び配列番号５１〜５３から選択される検出プローブは、ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン３で変異体と野生型配列の間で共通している。配列番号１〜５から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチドは、この例で使用されるプライマー対により規定されるアンプリコンのいずれともハイブリダイズしない。
この例では、実施例１と同じ反応条件が使用されたが、上流プライマー及び下流プライマー以外に、配列番号１〜５から選択されたサプレッサーオリゴヌクレオチドの１つが０．１又は０．７μMで反応に加えられた。
結果は、図２に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、変異型ＤＮＡ（標的配列）の増幅は狭い実線で示される。この結果は、共通のプライマー及びＱ６１変異特異的プライマーからなるプライマー対を用いた場合、非標的配列のブレイクスルー増幅が検出されたことを示している。図２Ａ（破線）を参照されたい。サプレッサーオリゴヌクレオチドが０．１μＭで反応混合物中に存在した場合、非標的配列のブレイクスルー増幅は抑制されなかった、図２Ｂを参照されたい。しかし、サプレッサーオリゴヌクレオチドが反応混合物中に０．７μＭで存在した場合、非標的配列のブレイクスルー増幅は抑制された。図２Ｃを参照されたい。この例では、すべてのプライマーが０．１μMで存在し、抑制オリゴヌクレオチドは０．１μｍ又は０．７μＭのいずれかで存在した。
実施例３
サプレッサーオリゴヌクレオチドによる無関係な鋳型ＰＩ３ＫＣＡのブレイクスルー増幅の抑制
この例では、ブレイクスルー増幅の抑制が、ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子のコドン１０４９中のＡＳ−ＰＣＲ標的化突然変異で観察された。実施例３で使用されたプライマーとプローブは、表４に示される。配列番号５４〜５６から選択される上流プライマーは、ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中のアミノ酸変化Ｇ１０４９Ｒに対応する変異３１４５Ｇ＞Ｃに一致し、野生型配列とミスマッチしていた。配列番号５７〜５９から選択される下流プライマーと配列番号６０と９６及び６１と９７から選択されるプローブは、変異体配列と野生型配列の間で共通である。配列番号１〜５から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチド（ヒトＮＲＡＳ遺伝子に特異的）は、この例で使用されたＰＩ３ＫＣＡアンプリコンにハイブリダイズしない。
この例では、実施例１と同じ反応条件が使用されたが、上流プライマー及び下流プライマー以外に、配列番号１〜５から選択されたサプレッサーオリゴヌクレオチドの１つが１．０μMで反応に加えられた。
結果は、図３に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、変異型ＤＮＡ（標的配列）の増幅は狭い実線で示される。この結果は、Ｇ１０４９Ｒ特異的プライマーと共通プライマーからなるプライマー対を使用した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅が検出されたことを示している。図３Ａ（破線）を参照されたい。反応混合物中に配列番号１〜５から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチドも存在した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅は抑制されず、標的（変異型Ｇ１０４９Ｒ）配列（実線）の特異的増幅に対する影響はなかった、図３Ｂを参照されたい。配列番号１〜５から選択された同じ抑制オリゴヌクレオチドも、ＰＩ３ＫＣＡ変異１２５８Ｔ＞Ｃ、１６３５Ｇ＞Ｔ、１６３４Ａ＞Ｇ、及び１６３３Ｇ＞Ａを検出するために設計された対立遺伝子特異的ＰＣＲに加えられた。同じ傾向が観察された：標的（変異）配列の特異的増幅に対する影響は無く、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅の抑制に対する影響もなかった（データは示していない）。
実施例４
サプレッサーオリゴヌクレオチドによる無関係な鋳型ＢＲＡＦのブレイクスルー増幅の抑制
この例では、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のコドン４６９と６００中のＡＳ−ＰＣＲ標的化変異で、ブレイクスルー増幅の部分的抑制が観察された。実施例４で使用されたプライマーとプローブは、表５に示される。コドン４６９中の変異について、上流プライマーは配列６２〜７０から選択された。これらのプライマーは、エクソン１１中のコドン４６９で種々の変異に一致した。コドン６００中の変異について、上流プライマーは配列番号７５〜８６から選択された。これらのプライマーは、エクソン１５中のコドン６００で種々の変異に一致した。コドン４６９の変異について、共通下流プライマーは配列番号７１〜７２から選択され、プローブは、配列番号７３と９８及び７４と９９から選択された。コドン６００の変異について、下流プライマーは配列番号８７〜８９から選択され、プローブは配列番号９０〜９２から選択された。配列番号１〜５（ヒトＮＲＡＳ遺伝子に特異的）から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチドは、この例で使用された任意のプライマー対により規定されるＢＲＡＦアンプリコンにハイブリダイズしない。
この例では、実施例３と同じ反応条件が使用された。
結果は図４に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、ＢＲＡＦコドン４６９と６００標的の増幅は実線で示される。この結果は、コドン４６９変異と共通プライマーからなるプライマーの１つと一致するプライマーからなるプライマー対を使用した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅が検出されたことを示している。図４Ａ（破線）を参照されたい。反応混合物中に配列番号１〜５から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチドも存在した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅が抑制され（点線）、変異配列の特異的増幅に対してわずかに影響があった（実線）。図４Ｂを参照されたい。コドン６００変異と共通プライマーの１つと一致するプライマーからなるプライマー対を使用した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅が検出された。図４Ｃを参照されたい（破線）。反応混合物中に配列番号１〜５から選択されるサプレッサーオリゴヌクレオチドも存在した場合、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅は部分的に抑制された。図４Ｄを参照されたい。ＢＲＡＦ系で観察された、非標的増幅の不完全な抑制と標的増幅に対するわずかな影響は、抑制現象が配列依存性であることを示唆する。
実施例５
線形プライマー伸長反応によるブレイクスルー増幅の抑制
この例では、ＮＲＡＳ鋳型のブレイクスルー増幅の抑制が、Ｍ１３鋳型と一連のＭ１３特異的プライマーの存在下で観察された。ＡＳ−ＰＣＲは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のコドン１２と６１中の変異を標的とした。実施例５で使用されたＭ１３プライマーは表６に示される。ＮＲＡＳ標的について、上流プライマーは配列番号３０〜４７から選択された。これらのプライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のアミノ酸変化Ｑ６１Ｈａ、Ｑ６１Ｈｂ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、及びＱ６１Ｒに対応する変異１８３Ａ＞Ｔ、１８３Ａ＞Ｃ、１８１Ｃ＞Ａ、１８２Ａ＞Ｔ、１８２Ａ＞Ｃ、１８２Ａ＞Ｇの１つに一致し、野生型配列とはミスマッチしていた。配列番号４８〜５０から選択される下流プライマー及び配列番号５１〜５３から選択されるプローブは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン３の変異体と野生型配列の間で共通している。配列番号６〜２３から選択される上流プライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２中の変異３５Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ｔ、３５Ｇ＞Ａ、３４Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ａ、及び３５Ｇ＞Ｔの１つに一致し、野生型配列とはミスマッチしていた。配列番号２４〜２６から選択される下流プライマー及び配列番号２７〜２９から選択される検出プローブは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子中のエクソン２の変異体と野生型配列の間で共通している。反応混合物はまた、ウイルス鋳型の線形増幅を確実にするために、バクテリオファージＭ１３の１本鎖環状ＤＮＡと、同じ方向を向いた３つのプライマー（配列番号９３〜９５、表６）とを含有した。
この例では、実施例１と同じ反応条件が使用されたが、Ｍ１３１本鎖バクテリオファージ鋳型は１０，０００コピー／反応で加えられ、プライマー（配列番号６３〜６５）は、それぞれ０．０３３μMの等モルで総濃度が０．１μMになるように加えられた。
結果は、図５に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、ＮＲＡＳコドン１２又はコドン６１変異体標的は実線で示される。この結果は、コドン６１中の変異と共通プライマーとの１つと一致する対立遺伝子特異的プライマーからなるプライマー対を使用した場合、非標的（野生型）ＮＲＡＳ配列のブレイクスルー増幅が検出されたことを示している。図５Ａ（破線）を参照されたい。反応混合物中にＭ１３ＤＮＡとＭ１３ＤＮＡの線形増幅を可能にする３つのプライマーが反応混合物中に存在した場合も、非標的（野生型）配列のブレイクスルー増幅は抑制された。図５Ｂを参照されたい。比較して、コドン１２中の変異と共通プライマーの１つと一致する対立遺伝子特異的プライマーからなるプライマー対を使用した場合、非標的（野生型）ＮＲＡＳ配列のブレイクスルー増幅が検出された。図５Ｃを参照されたい（破線）。このブレイクスルー増幅は、Ｍ１３ＤＮＡと線形増幅を可能にする３つのプライマーにより、抑制されなかった。図５Ｄを参照されたい。
実施例６
標的ゲノムに対して異なる程度の相同性を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドによるブレイクスルー抑制
この例では、いくつかのサプレッサーオリゴヌクレオチドによるブレイクスルー増幅の抑制が、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のコドン１２中のＡＳ−ＰＣＲ標的化変異で観察された。上流プライマーは配列番号６〜２３から選択され、プライマーは、ヒトＮＲＡＳ遺伝子のコドン１２変異（アミノ酸変化Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、及びＧ１２Ｖに対応する３５Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ｔ、３５Ｇ＞Ａ、３４Ｇ＞Ｃ、３４Ｇ＞Ａ、及び３５Ｇ＞Ｔ）の１つに一致し、野生型配列とはミスマッチしていた。上流プライマーは、ブレイクスルー増幅のサプレッサーとして作用する異なる下流プライマーと対合した。配列番号１〜５及び配列番号２４〜２６から選択される下流プライマーは、標的ゲノムと、異なる程度の相同性（本発明の方法に従って測定して、低、中、及び高相同性）を有する（実施例８及び図８を参照）。
この例では、実施例１と同じ反応条件が使用された。低、中、及び高相同性を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドは０．１μMで使用された。
結果は、図６に示される。野生型ゲノムＤＮＡの増幅は破線で示され、ＮＲＡＳコドン１２標的の増幅は実線で示される。この結果は、本発明の方法により測定して標的ゲノムと最も高い程度の相同性を有する下流プライマー（配列番号１）が、最も高レベルの抑制（図６Ｃを参照）を与え示し、中程度の相同性を有する下流プライマー（配列番号２〜５）が、より低レベルの抑制を与えた（図６Ｂを参照）ことを示し、中程度の相同性を有する下流プライマー（配列番号２〜５）は、低レベルの抑制を与えた。図６Ｂを参照されたい。最も低い程度の相同性を有する下流プライマー（配列番号２４〜２６）は、野生型ブレイクスルー増幅に対して何の影響も無く、抑制を示さなかった（図６Ａを参照）。抑制オリゴヌクレオチド（配列番号１〜５）は異なる程度の抑制を有するが、Ｃｔにより測定される特異的増幅に対して負の影響が無かったことも、重要である。
実施例７
目的の領域内の相同性領域の選択
この例では、サプレッサーオリゴヌクレオチドを設計するための目的の領域としてヒトＮＲＡＳ遺伝子が選択された。アルゴリズム「ｂｌａｓｔｎ」を使用して「ある程度同様の配列」を見つける選択肢を選択する緩和された条件下で、ＮＲＡＳ遺伝子のエクソン２からの４８８塩基対領域が、ヒトゲノム配列と比較すべき検索配列として使用された。図７は、この検索が、検索配列のヌクレオチド１８０〜２７０及び３６０〜４５０により定義される部分中の複数の相同性領域を明らかにすることを示す。これらの配列は、サプレッサーオリゴヌクレオチドの設計のための目的の領域として選択された。
実施例８
目的の領域からのサプレッサーオリゴヌクレオチドの選択
この例では、本発明により与えられる基準を満足するヒトゲノム中の相同性領域を決定するために、目的の領域からいくつかのオリゴヌクレオチドが設計され、ＢＬＡＳＴ（登録商標）分析にかけられた。図８は、反応中のブレイクスルー増幅を抑制するための、各オリゴヌクレオチドのパラメータと実際の能力とを示す。これらのパラメータは、列「ｎＭｅｒ」のオリゴヌクレオチドの長さを含む。列「全ヒット数」は、プログラムＢｌａｎｔｎが見つけることができたオリゴヌクレオチドと標的遺伝子との「Ｂｌａｓｔヒット」の総数である。プログラムの厳密性は、「やや類似の配列」に設定された。列「基準を満たすヒット」において、これは７５％の同一性と３’末端で２未満のミスマッチの判断基準を満たすヒットの総数である。列「相同性の程度」は、以下：１つのみのヒットが、本発明により与えられた基準を満たす場合、標的ゲノムとの相同性の程度は「低い」と言われ、１０又はそれ以下のヒットが基準を満たす場合、相同性の程度は「中程度」と言われ、１０を超えるヒットが基準を満たす場合、相同性の程度は「高い」と言われる、のように割り当てられる値を含む。最後に、列「ブレイクスルー」は、オリゴヌクレオチドの存在下で、ブレイクスルー増幅が観察されたか否かを示す。

Claims (10)

  1. 標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有する、非特異的増幅を低減させるために核酸増幅反応で使用するためのサプレッサーオリゴヌクレオチドであって、
    前記の少なくとも１つの相同性領域が少なくとも１５塩基対の長さであり、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、且つ３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含み、そして
    前記サプレッサーオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜５からなる群から選択される核酸配列を含む、サプレッサーオリゴヌクレオチド。
  2. 非標的配列の増幅を低減させるための、核酸増幅反応で使用するためのサプレッサーオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、
    （ａ）標的生物のゲノム中の１つ又はそれ以上の目的の領域を同定する工程；
    （ｂ）各目的の領域について、目的の領域を検索物として使用して標的ゲノム配列の検索を行って、目的の領域と標的ゲノムとの相同性領域を同定する工程；
    （ｃ）標的ゲノム中において、最も多くの相同性領域を有する目的の領域の部分を選択する工程；
    （ｄ）工程（ｃ）で選択される部分中の１つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを設計する工程；
    （ｅ）工程（ｄ）で設計されたオリゴヌクレオチドを用いて標的ゲノムの検索を行って、少なくとも１５塩基対の長さである標的ゲノムと最大数の相同性領域を有し、前記数の相同性領域と少なくとも７５％の同一性を有し、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、加えて２以下のミスマッチがオリゴヌクレオチドの３’末端領域の４ヌクレオチド以内に存在する、オリゴヌクレオチドを同定する工程；
    （ｆ）工程（ｅ）で同定されたオリゴヌクレオチドをサプレッサーオリゴヌクレオチドとして選択する工程
    を含む、方法。
  3. 工程（ｅ）と工程（ｆ）の間に、工程（ｄ）で設計されたオリゴヌクレオチドを用いて標的ゲノムの検索を行って、標的ゲノムの相補鎖上に位置する少なくとも２つの相同性領域を有するオリゴヌクレオチドを同定し、そして排除する工程を含み、ここで前記相同性領域は、前記オリゴヌクレオチドと前記標的ゲノム配列との間に少なくとも７５％の相同性を有し、前記相同性領域は１０００未満の塩基対により分離されている、請求項２に記載の方法。
  4. 標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドの存在下で、増幅反応を実施することを含む、核酸増幅反応における非標的核酸鋳型の増幅を低減する方法であって、前記の少なくとも１つの相同性領域が、少なくとも１５塩基対の長さであり、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、そして３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含む、方法。
  5. 前記サプレッサーオリゴヌクレオチドが配列番号１〜５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む、非標的配列の増幅が低下している増幅反応を実施するためのキットであって、前記の少なくとも１つの相同性領域が、少なくとも１５塩基対の長さであり、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、そして３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含む、キット。
  7. 対立遺伝子種プライマー、共通プライマー、プローブ、ヌクレオシド３リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液、の１つ又はそれ以上をさらに含む、請求項６に記載のキット。
  8. 標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有するサプレッサーオリゴヌクレオチドを含む、非標的配列の増幅が低下している増幅反応を実施するための反応混合物であって、前記の少なくとも１つの相同性領域が、少なくとも１５塩基対の長さであり、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、そして３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含み、そしてさらに以下：対立遺伝子種プライマー、共通プライマー、プローブ、ヌクレオシド３リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液の１つ又はそれ以上を含む、反応混合物。
  9. 標的生物のゲノム中の複数の部位と少なくとも７５％の同一性を有する、少なくとも１つの相同性領域を含む配列を有する、非特異的増幅を減少させるための核酸増幅反応におけるサプレッサーオリゴヌクレオチドの使用であって、前記の少なくとも１つの相同性領域が、少なくとも１５塩基対の長さであり、前記サプレッサーオリゴヌクレオチドの３’末端にまたがり、そして３’末端から４ヌクレオチド以内に２以下のミスマッチを含む、使用。
  10. 前記サプレッサーオリゴヌクレオチドが配列番号１〜５からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項９に記載の使用。
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