JP6115897B2

JP6115897B2 - 抗ｂ型肝炎ウイルス薬

Info

Publication number: JP6115897B2
Application number: JP2013254238A
Authority: JP
Inventors: 馬場　昌範; 昌範馬場; 隆之 ▲濱▼崎; シャロンアショーカ; バルチャンドララータ; シャガラジャンアナンダラジャン; カスラモハン
Original assignee: Kagoshima University NUC
Current assignee: Kagoshima University NUC
Priority date: 2013-12-09
Filing date: 2013-12-09
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: JP2015113286A

Description

本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス薬として有用な新規炭素環ヌクレオシド類に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝炎は肝硬変や肝臓癌の主要な原因の１つである。現在、日本人の０．９％（約１１０万人）がＨＢＶのキャリアであると推定されており、世界では約３億人のキャリアが存在すると考えられている。ＨＢＶ感染予防にはワクチンが開発されており、また既にいくつかの抗ＨＢＶ薬も存在し、ラミブジン、アデホビル、そしてエンテカビルが上市されている。これらはすべて核酸アナログであり、逆転写機能を有するＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼを標的としている。これらの使用により、血中のＨＢＶは消失する。しかしながら、ＨＢＶは肝細胞内で安定な形のＤＮＡとして存在するため、抗ウイルス薬による化学療法を中断すると、肝炎が再燃するおそれがある。また、既存の抗ＨＢＶ薬に対する薬剤耐性ウイルスの出現も報告されている。このようなことから、既存の薬剤に加えて、新たな抗ＨＢＶ薬の開発が望まれている。

一方、炭素環ヌクレオシド類としては、特許文献１には２’−フルオロ−６’−メチレン炭素環ヌクレオシド類が抗ＨＢＶ活性を有することが記載されている。

非特許文献１には、次式（Ａ）：

（式中、Ｒは塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表す。）
で示される５−（５−ハロ−４−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（ヒドロキシメチル）シクロペント−３−エン−１，２−ジオールが抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）活性を示すことが記載されているが、５０％有効濃度（ＥＣ_５０）は、陽性対照のＫＺ−１６（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011, 415, 714-719記載のフェナントリジノン誘導体）が０．１７μＭであるのに対し、３７．３〜４６．２μＭであり、必ずしも十分なものではなかった。

ＨＣＶはＲＮＡウイルス、ＨＢＶはＤＮＡウイルスであり、核酸誘導体を含め、抗ＨＣＶ活性と抗ＨＢＶ活性との間には、一般に相互関係がないといわれている（非特許文献２）。

特表２０１３−５１０９０４号公報

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 7742-7747 Journal of Medicinal Chemistry 2009, 52, 206-213

本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス薬として有用な新規炭素環ヌクレオシド類を提供することを課題とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは、種々の炭素環ヌクレオシド類を合成し、培養細胞におけるＨＢＶ遺伝子複製の抑制を指標として、抗ＨＢＶ活性の検討することにより、新規化合物である５−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）シクロペント−３−エン−１，２−ジオールが優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記式（Ｉ）：

で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物に関する。

本発明の化合物は優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高い。

本発明の化合物についての抗ＨＢＶアッセイの結果を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
前記式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。

前記式（Ｉ）で示される化合物の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。
前記式（Ｉ）で示される化合物は、例えば、以下に示すようにして製造することができる。

（式中、Ｔｒはトリチル基を表す。）
(i) NIS, DMF, RT, 4h; (ii) (Boc)₂O, DMAP, THF, RT, 6h; (iii) sat.NaHCO₃, MeOH, RT, 3h; (iv) Ph₃P, DIAD, THF, 0-5℃, 2h; (v) 10% conc. HCl in CH₃OH, 60℃, 5h.

１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１）をＤＭＦ中、室温で４時間Ｎ−ヨードコハク酸イミドと反応させてヨード体（２）を得る。次いで、ヨード体（２）及び二炭酸ジ-tert-ブチル（(Boc)₂O）のＴＨＦ溶液を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下室温で撹拌する。反応終了後、過剰のＴＨＦを除去し、粗生成物をメタノールに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で、室温で３時間処理して、Ｎ−保護体（３）を得る。次いで、Ｎ−保護体（３）とシクロペンテン誘導体（４）を光延（Mitsunobu）カップリング反応させて化合物（５）を得た後、脱保護することにより本発明の化合物（Ｉ）を得ることができる。

前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。

前記の化合物は、抗ＨＢＶ薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。

結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。前記式（Ｉ）の化合物の注射剤中における割合は、５〜５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。

その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。

製剤化した抗ＨＢＶ薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。

経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。

非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。

また、本発明の化合物は、ＨＢＶ感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、本発明の化合物と組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えば、インターフェロン、ペグインターフェロン、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル、Telbivudine、Clevudine等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

［実施例１］本発明化合物（Ｉ）の合成

（ａ）ＴＨＦ中のＮ−保護体（３）（１．５ｍｍｏｌ）、シクロペンテン誘導体（４）（１．５７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３．７５ｍｍｏｌ）の混合物に、０℃でアゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）を滴下した。反応混合物を室温に戻し、撹拌を続けた。ＴＬＣで反応が終了したことを確認した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液；ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０→７０：３０）で精製し、カップリング生成物（５）を収率８５％で得た。

カップリング生成物（５）の化合物名及び物性を以下に示す。
Di-Boc-protected 3-iodo-1-((4R)-2,2-dimethyl-6-((trityloxy)methyl)-4,6a-dihydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-4-yl)-1H-pyrazolo-[3,4-d]pyrimidin-4-amine
mp: 89-99℃; MS (ESI) (m/z): [M⁺+1] 872.0; UV (MeOH): λ_max=264 nm; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ=8.97 (s, 1H, 2-CH), 7.21-7.46 (m, 15H, trityl), 6.04-6.08 (m, 2H, 1’,6’-CH), 5.33-5.35 (d, J=5.8 Hz, 1H, 2’-CH), 4.88-4.90 (d, J=5.9 Hz, 1H, 3’-CH), 3.95-3.99 (d, J=15.3 Hz, 1H, 5’-CH₂), 3.80-3.84 (d, J=15.3 Hz, 1H, 5’-CH₂), 1.45 (s, 3H, CH₃), 1.42 (s, 18H, Boc-6CH₃), 1.33 ppm (s, 3H, CH₃).

（ｂ）カップリング生成物（５）を、１０％塩酸含有メタノール中、６０℃で加熱することにより、保護基を脱離させた。ＴＬＣで反応が終了したことを確認した後、溶媒を減圧留去し、得られた固形物をアセトンで洗浄して、化合物（Ｉ）の塩酸塩を収率８１％で得た。

化合物（Ｉ）の化合物名及びその塩酸塩の物性を以下に示す。
(1S,2R,5R)-5-(4-Amino-3-iodo-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl)-3-(hydroxymethyl)cyclopent-3-ene-1,2-diol
mp:194-196℃; MS (ESI) (m/z): [M⁺+1] 390.0; [α]_D ²¹=-147.88 cm³g^-1dm^-1 (c=0.24 MeOH); UV (MeOH): λ_max=264 nm; ¹H NMR (400 MHz, [D₆]DMSO): δ=9.18-9.22 (bs, 1H, NH₂), 8.49 (s, 1H, 2-CH), 8.02-8.21 (bs, 1H, NH₂), 5.64-5.65 (m, 1H, 1’-CH), 5.56-5.57 (m, 1H, 6’-CH), 4.61-5.22 (bs, 3H, 2’, 3’ & 5’-OH), 4.38-4.39 (m, 1H, 2’-CH), 4.26-4.29 (m, 1H, 3’-CH), 4.07-4.11 ppm (m, 2H, 5’-CH₂); ¹³C NMR (100 MHz, [D₆]DMSO): δ=153.06, 152.10, 150.23, 148.93, 123.23, 102.68, 92.39, 76.45, 71.82, 67.00, 58.39 ppm.

［参考例１］各種炭素環ヌクレオシド類の合成
実施例１に準じて、あるいは非特許文献１（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 7742-7747）、非特許文献２（Journal of Medicinal Chemistry 2009, 52, 206-213）に記載の方法、又はその他の公知の方法に従って、表１に示す各種炭素環ヌクレオシド類を合成した。

［実施例２］抗ＨＢＶアッセイ
ＨｅｐＧ２．２．１５．７細胞（肝芽細胞腫（hepatoblastoma）細胞株ＨｅｐＧ２に、ＨＢＶ遺伝子がトランスフェクションされ、持続的にウイルスを産生するＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Journal of Virology, Aug. 1988, 62, 2836-2844）由来で、国立感染症研究所において樹立されたクローン細胞であり、親株であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞よりも効率良くウイルスを産生するクローン細胞）を用いて、各種炭素環ヌクレオシド類の抗ＨＢＶアッセイを以下のようにして行った。

１）ＨｅｐＧ２．２．１５．７細胞を９６穴マイクロタイタープレートに撒いた。（１×１０^４細胞／ｗｅｌｌ，培地１００μｌ）（培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０５６５−０１８）＋５μｇ／ｍｌインスリン＋５０μＭヒドロコルチゾン＋ＨＥＰＥＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％ＦＢＳ）
２）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で２４時間インキュベートした。
３）各試験化合物を様々な濃度で含有する新鮮な培地１００μｌをプレートに加えた。
４）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で３日間インキュベートした。
５）培地を、各化合物を含有する新たな培地で完全に置き換えた。
６）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で３日間インキュベートした。
７）培養上清１００μｌを新たな９６穴マイクロタイタープレートに移した。
８）細胞をＭＴＴアッセイにより分析し、細胞生存率を測定した。
９）各培養上清１０〜２０μｌに同容量のＳｉｄｅＳｔｅｐ^ＴＭ溶解・安定化緩衝液（Agilent Technologies #400900）を加えて、１分間ボルテックスして培地中の粗ＤＮＡを抽出した。
１０）ＤＮＡ溶液を使用するまで、ディープフリーザーで保存した。
１１）リアルタイムＰＣＲ法を用いて、培地中のＨＢＶＤＮＡを定量した。
結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１から、本発明の化合物（Ｉ）、及び非特許文献１に記載の前記式（Ａ）においてＲが臭素原子である化合物、すなわち、５−（５−ブロモ−４−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（ヒドロキシメチル）シクロペント−３−エン−１，２−ジオールは優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高いことがわかる。一方、その他の炭素環ヌクレオシド類は、抗ＨＢＶ活性を示さないか、示したとしてもその活性は極めて低かった。

Claims

下記式（Ｉ）：

で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物。