JP6296526B2

JP6296526B2 - 抗ｂ型肝炎ウイルス薬

Info

Publication number: JP6296526B2
Application number: JP2017100501A
Authority: JP
Inventors: 馬場　昌範; 昌範馬場; 隆之 ▲濱▼崎; シャロンアショーカ; バルチャンドララータ; シャガラジャンアナンダラジャン; カスラモハン
Original assignee: Kagoshima University NUC
Current assignee: Kagoshima University NUC
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2033-12-09
Also published as: JP2017165767A

Description

本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス薬に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性肝炎は肝硬変や肝臓癌の主要な原因の１つである。現在、日本人の０．９％（約１１０万人）がＨＢＶのキャリアであると推定されており、世界では約３億人のキャリアが存在すると考えられている。ＨＢＶ感染予防にはワクチンが開発されており、また既にいくつかの抗ＨＢＶ薬も存在し、ラミブジン、アデホビル、そしてエンテカビルが上市されている。これらはすべて核酸アナログであり、逆転写機能を有するＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼを標的としている。これらの使用により、血中のＨＢＶは消失する。しかしながら、ＨＢＶは肝細胞内で安定な形のＤＮＡとして存在するため、抗ウイルス薬による化学療法を中断すると、肝炎が再燃するおそれがある。また、既存の抗ＨＢＶ薬に対する薬剤耐性ウイルスの出現も報告されている。このようなことから、既存の薬剤に加えて、新たな抗ＨＢＶ薬の開発が望まれている。

一方、炭素環ヌクレオシド類としては、特許文献１には２’−フルオロ−６’−メチレン炭素環ヌクレオシド類が抗ＨＢＶ活性を有することが記載されている。

非特許文献１には、次式（Ａ）：

（式中、Ｒは塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表す。）
で示される５−（４−アミノ−３−ハロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）−３−（ヒドロキシメチル）シクロペント−３−エン−１，２−ジオールが抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）活性を示すことが記載されているが、５０％有効濃度（ＥＣ_５０）は、陽性対照のＫＺ−１６（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011, 415, 714-719記載のフェナントリジノン誘導体）が０．１７μＭであるのに対し、６．６〜８７．６μＭであり、必ずしも十分なものではなかった。

非特許文献２には、次式（Ｂ）：

（式中、Ｒは塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を表す。）
で示される５−（５−ハロ−４−メチル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（ヒドロキシメチル）シクロペント−３−エン−１，２−ジオールが抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）活性を示すことが記載されているが、５０％有効濃度（ＥＣ_５０）は、陽性対照のＫＺ−１６（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011, 415, 714-719記載のフェナントリジノン誘導体）が０．１７μＭであるのに対し、３７．３〜４６．２μＭであり、必ずしも十分なものではなかった。

ＨＣＶはＲＮＡウイルス、ＨＢＶはＤＮＡウイルスであり、核酸誘導体を含め、抗ＨＣＶ活性と抗ＨＢＶ活性との間には、一般に相互関係がないといわれている（非特許文献３）。

特表２０１３−５１０９０４号公報

ChemMedChem 2013, 8, 1673-1680 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 7742-7747 Journal of Medicinal Chemistry 2009, 52, 206-213

本発明は、新たな抗ＨＢＶ薬を提供することを課題とする。

前記課題を解決するため、本発明者らは、培養細胞におけるＨＢＶ遺伝子複製の抑制を指標として、種々の炭素環ヌクレオシド類について、抗ＨＢＶ活性の検討及び構造展開研究を遂行することにより、特定の化合物が優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）下記式（Ｉ）：

（式中、Baseは、次式（ａ）：

又は次式（ｂ）：

で示される基を表す。）
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗Ｂ型肝炎ウイルス薬。
（２）前記式（Ｉ）において、Baseが前記式（ａ）で示される基である前記（１）に記載の抗Ｂ型肝炎ウイルス薬。
（３）前記式（Ｉ）において、Baseが前記式（ｂ）で示される基である前記（１）に記載の抗Ｂ型肝炎ウイルス薬。

本発明の抗ＨＢＶ薬は優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高い。

化合物（Ｉａ）及び化合物（Ｉｂ）についての抗ＨＢＶアッセイの結果を示すグラフである。

以下、本発明を詳細に説明する。
前記式（Ｉ）で示される化合物の塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、ピロ硫酸、メタリン酸等の無機酸、又はクエン酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸）等の有機酸との塩が挙げられる。

前記式（Ｉ）で示される化合物の溶媒和物としては、例えば水和物が挙げられる。
前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、Baseが前記式（ａ）で示される基である化合物（Ｉａ）は、例えば、非特許文献１（ChemMedChem 2013, 8, 1673-1680）に記載の方法に従って、以下に示すようにして製造することができる。

（式中、Ｔｒはトリチル基を表す。）
(i) NIS, DMF, RT, 4h; (ii) (Boc)₂O, DMAP, THF, RT, 6h; (iii) sat.NaHCO₃, MeOH, RT, 3h; (iv) Ph₃P, DIAD, THF, 0-5℃, 2h; (v) 10% conc. HCl in CH₃OH, 60℃, 5h.

１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（１）をＤＭＦ中、室温で４時間Ｎ−ヨードコハク酸イミドと反応させてヨード体（２）を得る。次いで、ヨード体（２）及び二炭酸ジ-tert-ブチル（(Boc)₂O）のＴＨＦ溶液を４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下室温で撹拌する。反応終了後、過剰のＴＨＦを除去し、粗生成物をメタノールに溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で、室温で３時間処理して、Ｎ−保護体（３）を得る。次いで、Ｎ−保護体（３）とシクロペンテン誘導体（４）を光延（Mitsunobu）カップリング反応させて化合物（５）を得た後、脱保護することにより化合物（Ｉａ）を得ることができる。

前記式（Ｉ）で示される化合物のうち、Baseが前記式（ｂ）で示される基である化合物（Ｉｂ）は、例えば、非特許文献２（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 7742-7747）に記載の方法に従って製造することができる。

すなわち、前記Ｎ−保護体（３）の代わりに、次式（６）：

で示される化合物を用いて、当該化合物（６）とシクロペンテン誘導体（４）を光延（Mitsunobu）カップリング反応させた後、脱保護することにより化合物（Ｉｂ）を得ることができる。

前記のようにして得られる生成物を精製するには、通常用いられる手法、例えばシリカゲル等を担体として用いたカラムクロマトグラフィーやメタノール、エタノール、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル、水等を用いた再結晶法によればよい。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒としては、メタノール、エタノール、クロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。

前記の化合物は、抗ＨＢＶ薬として、慣用の製剤担体と組み合わせて製剤化することができる。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、無機塩類等を用いて常法に製造される。また、これらに加えて、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜添加することができる。

結合剤としては、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。

崩壊剤としては、例えばデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０等が挙げられる。

滑沢剤としては、例えばタルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等が挙げられる。

流動性促進剤としては、例えば軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

注射剤は、常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、オリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えてもよい。また、注射剤は、安定性の観点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。前記式（Ｉ）の化合物の注射剤中における割合は、５〜５０重量％の間で変動させ得るが、これに限定されるものではない。

その他の非経口剤としては、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、常法に従って製造される。

製剤化した抗ＨＢＶ薬は、剤形、投与経路等により異なるが、例えば、１日１〜４回を１週間から３ヶ月の期間、投与することが可能である。

経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、１日数回に分けて服用することが適当である。

非経口剤として所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、通常成人の場合、前記式（Ｉ）の化合物の重量として、例えば０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇを、静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射により投与することが適当である。

また、本発明の化合物は、ＨＢＶ感染に対して有効な他の薬剤と組み合わせて使用してもよい。これらは、治療の過程において別々に投与されるか、例えば錠剤、静脈用溶液、又はカプセルのような単一の剤形において、本発明の化合物と組み合わせられる。このような他の薬剤としては、例えば、インターフェロン、ペグインターフェロン、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル、Telbivudine、Clevudine等が挙げられる。

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。

［合成例１］各種炭素環ヌクレオシド類の合成
（１）化合物（Ｉａ）の合成

（ａ）ＴＨＦ中のＮ−保護体（３）（１．５ｍｍｏｌ）、シクロペンテン誘導体（４）（１．５７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（３．７５ｍｍｏｌ）の混合物に、０℃でアゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）を滴下した。反応混合物を室温に戻し、撹拌を続けた。ＴＬＣで反応が終了したことを確認した後、溶媒を減圧留去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液；ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０→７０：３０）で精製し、カップリング生成物（５）を収率８５％で得た。

カップリング生成物（５）の化合物名及び物性を以下に示す。
Di-Boc-protected 3-iodo-1-((4R)-2,2-dimethyl-6-((trityloxy)methyl)-4,6a-dihydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-4-yl)-1H-pyrazolo-[3,4-d]pyrimidin-4-amine
mp: 89-99℃; MS (ESI) (m/z): [M⁺+1] 872.0; UV (MeOH): λ_max=264 nm; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ=8.97 (s, 1H, 2-CH), 7.21-7.46 (m, 15H, trityl), 6.04-6.08 (m, 2H, 1’,6’-CH), 5.33-5.35 (d, J=5.8 Hz, 1H, 2’-CH), 4.88-4.90 (d, J=5.9 Hz, 1H, 3’-CH), 3.95-3.99 (d, J=15.3 Hz, 1H, 5’-CH₂), 3.80-3.84 (d, J=15.3 Hz, 1H, 5’-CH₂), 1.45 (s, 3H, CH₃), 1.42 (s, 18H, Boc-6CH₃), 1.33 ppm (s, 3H, CH₃).

（ｂ）カップリング生成物（５）を、１０％塩酸含有メタノール中、６０℃で加熱することにより、保護基を脱離させた。ＴＬＣで反応が終了したことを確認した後、溶媒を減圧留去し、得られた固形物をアセトンで洗浄して、化合物（Ｉａ）の塩酸塩を収率８１％で得た。

化合物（Ｉａ）の化合物名及びその塩酸塩の物性を以下に示す。
(1S,2R,5R)-5-(4-Amino-3-iodo-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl)-3-(hydroxymethyl)cyclopent-3-ene-1,2-diol
mp:194-196℃; MS (ESI) (m/z): [M⁺+1] 390.0; [α]_D ²¹=-147.88 cm³g^-1dm^-1 (c=0.24 MeOH); UV (MeOH): λ_max=264 nm; ¹H NMR (400 MHz, [D₆]DMSO): δ=9.18-9.22 (bs, 1H, NH₂), 8.49 (s, 1H, 2-CH), 8.02-8.21 (bs, 1H, NH₂), 5.64-5.65 (m, 1H, 1’-CH), 5.56-5.57 (m, 1H, 6’-CH), 4.61-5.22 (bs, 3H, 2’, 3’ & 5’-OH), 4.38-4.39 (m, 1H, 2’-CH), 4.26-4.29 (m, 1H, 3’-CH), 4.07-4.11 ppm (m, 2H, 5’-CH₂); ¹³C NMR (100 MHz, [D₆]DMSO): δ=153.06, 152.10, 150.23, 148.93, 123.23, 102.68, 92.39, 76.45, 71.82, 67.00, 58.39 ppm.

（２）その他の炭素環ヌクレオシド類の合成
非特許文献１（ChemMedChem 2013, 8, 1673-1680）及び非特許文献２（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2012, 22, 7742-7747）に記載の方法、又はその他の公知の方法に従って、表１に示す各種炭素環ヌクレオシド類を合成した。

［実施例１］抗ＨＢＶアッセイ
ＨｅｐＧ２．２．１５．７細胞（肝芽細胞腫（hepatoblastoma）細胞株ＨｅｐＧ２に、ＨＢＶ遺伝子がトランスフェクションされ、持続的にウイルスを産生するＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Journal of Virology, Aug. 1988, 62, 2836-2844）由来で、国立感染症研究所において樹立されたクローン細胞であり、親株であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞よりも効率良くウイルスを産生するクローン細胞）を用いて、各種炭素環ヌクレオシド類の抗ＨＢＶアッセイを以下のようにして行った。

１）ＨｅｐＧ２．２．１５．７細胞を９６穴マイクロタイタープレートに撒いた。（１×１０^４細胞／ｗｅｌｌ，培地１００μｌ）（培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０５６５−０１８）＋５μｇ／ｍｌインスリン＋５０μＭヒドロコルチゾン＋ＨＥＰＥＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋１０％ＦＢＳ）
２）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で２４時間インキュベートした。
３）各試験化合物を様々な濃度で含有する新鮮な培地１００μｌをプレートに加えた。
４）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で３日間インキュベートした。
５）培地を、各化合物を含有する新たな培地で完全に置き換えた。
６）細胞をＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で３日間インキュベートした。
７）培養上清１００μｌを新たな９６穴マイクロタイタープレートに移した。
８）細胞をＭＴＴアッセイにより分析し、細胞生存率を測定した。
９）各培養上清１０〜２０μｌに同容量のＳｉｄｅＳｔｅｐ^ＴＭ溶解・安定化緩衝液（Agilent Technologies #400900）を加えて、１分間ボルテックスして培地中の粗ＤＮＡを抽出した。
１０）ＤＮＡ溶液を使用するまで、ディープフリーザーで保存した。
１１）リアルタイムＰＣＲ法を用いて、培地中のＨＢＶＤＮＡを定量した。
結果を表１及び図１に示す。

表１及び図１から、化合物（Ｉａ）及び化合物（Ｉｂ）は優れた抗ＨＢＶ活性を有し、かつ安全性が高いことがわかる。一方、その他の炭素環ヌクレオシド類は、抗ＨＢＶ活性を示さないか、示したとしてもその活性は極めて低かった。

Claims

下記式（Ｉ）：

（式中、Baseは、次式（ｂ）：

で示される基を表す。）
で示される化合物、その塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗Ｂ型肝炎ウイルス薬。