JP6106213B2 - ピロリ菌感染を治療するための新規の方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ
）のフラグメントであるポリペプチド、それらを含む免疫原性組成物、不活化形態のＨＰ
ＧＧＴを含む免疫原性組成物、そのようなポリペプチド及びＨＰＧＧＴの不活性フラグメ
ントの使用、そのようなポリペプチド及び不活性形態のＨＰＧＧＴに対する及びそれらに
特異的に結合する抗体、アプタマー及びスピーゲルマー、薬剤候補物質を同定するための
方法、ワクチンを開発するための方法、およびＨＰＧＧＴのリガンドの使用に関する。

ヘリコバクターピロリはヒト胃粘膜に選択的にコロニー形成するグラム陰性病原体であ
り、世界人口の５０％以上にまん延している。感染は、ほとんどが生涯にわたって持続し
、胃及び十二指腸潰瘍、胃粘膜に関連するリンパ様組織リンパ腫及び胃癌の病因に関係づ
けられてきた。ピロリ菌感染の顕著な特徴は、好中球性顆粒球、リンパ球及び単球／マク
ロファージによる粘膜の密な浸潤を特徴とする、慢性活動性胃炎である。いくつかの試験
は、ピロリ菌に関連する胃炎においてヘルパーＴ細胞１型が増加し、活性化されることの
証拠を提供し、インビボでのＣＤ２５及びＣＤ６９の上方調節を示した。様々なピロリ菌
抗原に対する強い体液性応答も惹起される。この炎症性応答にもかかわらず、感染は宿主
免疫系によって除去されない。このことから、ピロリ菌は免疫系に干渉すると思われるが
、その明確な仕組みはまだ曖昧なままである。

いくつかの研究がこの問題を取り上げ、ピロリ菌が免疫応答を免れる受動的経路と能動
的経路を説明した。食菌作用に対するピロリ菌の抵抗性が報告されており、これは、ＩＶ
型分泌装置の成分をコードする、ｖｉｒＢ７及びｖｉｒＢ１１のようなビルレンス遺伝子
に依存する。Ｚａｂａｌｅｔａ ｅｔ ａｌ．は、ピロリ菌アルギナーゼがＴ細胞増殖を
阻害し、Ｔ細胞受容体ζ鎖の発現を低下させることを報告した。ピロリ菌のプロ炎症性ペ
プチドは、単球を活性化して反応性酸素ラジカルを産生することによってリンパ球機能不
全を誘導することが示された。これらのデータは、細菌と非特異的免疫応答の相互作用を
強調する。しかし、Ｔ細胞又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）欠損マウスにおける
ワクチン接種試験が失敗に終わったことから、特異的Ｔ細胞応答は細菌の除去のために決
定的に重要であると思われる。

これらの取り組みにもかかわらず、胃病原体の慢性的残存の理由は曖昧なままである^１
。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は細菌の除去のために極めて重要であるが^２、ピロリ菌によってそれ
らの増殖が阻害されることが示された^３。これに関していくつかのグループは、ピロリ菌
からのタンパク質の免疫抑制作用を検討した。Ｋｎｉｐｐとその共同研究者達は、ビルレ
ンス因子ＣａｇＡ（細胞毒関連遺伝子Ａ）及びＶａｃＡ（空胞化細胞毒Ａ）とは無関係に
リンパ球及び単球の増殖を低下させる、いわゆる「増殖阻害タンパク質（ＰＩＰ）」を部
分的に精製した^４。

これに対し、２つのグループが最近、高濃度の精製ＶａｃＡの存在下でリンパ球増殖が
抑制されることを報告した^５，６。逆説的に、しかしながら、ＶａｃＡ欠損のピロリ菌突
然変異体はその増殖阻害特性に欠陥を有していなかった^５。加えて、ＶａｃＡを発現する
ヘリコバクター株に感染した患者において胃の炎症は変化しないか、さらには上昇するこ
とが早期に認識されている^７，８。

ピロリ菌の分泌産物は、Ｇ１期での細胞周期停止を誘導することによってＴリンパ球増
殖を阻害することが先に示された^３。この作用は、ＶａｃＡ及びＣａｇＡタンパク質を含
む公知のビルレンス因子とは無関係であった。

ピロリ菌が宿主による除去を免れる、考えられる機構について研究が増えつつあるにも
かかわらず、ピロリ菌感染を特異的に治療する又は予防するための臨床手段を開発する上
で実質的な成功はまだ得られていない。

本発明の基礎をなす問題は、動物又はヒトにおいて免疫応答を惹起するのに適したポリ
ペプチドを提供することであり、そのような免疫応答は、ピロリ菌感染及びピロリ菌に関
連する又はピロリ菌によって引き起こされる疾患に対する防護を与える。

そのような免疫応答を惹起するのに適した免疫原性組成物を提供することが、本発明の
基礎をなすさらなる問題である。

本発明の基礎をなすもう１つの問題は、ピロリ菌感染を治療する及び／又は予防するた
めの新規薬剤候補物質を同定するための手段並びにこの感染を治療し、予防するための方
法を提供することである。

これらや他の問題は、独立請求項の内容によって解決される。好ましい実施形態は従属
請求項から理解され得る。

より詳細には、前記問題は、第１の側面の実施形態において、アミノ酸配列を含むポリ
ペプチドであって、アミノ酸配列が、配列番号１に対応するアミノ酸配列を含むＨＰＧＧ
Ｔの領域の一続きの連続アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、そのような領域が
、
（ａ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００、又は
（ｂ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置４１０〜４８０
によって規定され、ＨＰＧＧＴの触媒活性を阻害することができる免疫応答を惹起するの
に適するポリペプチドによって解決される。

第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドは約１５〜約３０個のアミノ酸を含む
。

前記問題は、第２の側面において、
（ａ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００、又は
（ｂ）配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置４１０〜４８０
に対応するアミノ酸配列を含み、及び約１５〜約３０個のアミノ酸を含むポリペプチド、
好ましくは１番目の態様に従ったポリペプチドによって解決される。

第２及び第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記位置
の一続きの１５〜３０個の切れ目のないアミノ酸に対応する。

第２及び第１の側面の１つの実施形態では、ポリペプチドは、
ＱＲＱＡＥＴＬＫＥＡＲＥＲＦＬＫＹ（配列番号２）、
ＦＤＩＫＰＧＮＰＮＬＹＧＬＶＧＧＤＡＮＡＩ（配列番号３）、
ＤＦＳＩＫＰＧＮＰＮＬＹＧＬＶＧＧＤＡＮＡＩＥＡＮＫＲＰＬ（配列番号４）及び
ＳＳＭＳＰＴＩＶＬＫＮＮＫＶＦＬＶＶＧＳＰ（配列番号５）
を含む群から選択される配列を含む。

前記問題は、第３の側面の１つの実施形態において、第１及び第２の側面に従ったポリ
ペプチドの１つ又は数個を含む免疫原性組成物によって解決される。

前記問題は、第４の側面の１つの実施形態において、不活化形態のＨＰＧＧＴを含む免
疫原性組成物によって解決される。

前記問題は、第５の側面の１つの実施形態において、ＨＰＧＧＴのフラグメントを含む
免疫原性組成物であって、そのようなフラグメントが、ＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び
４５２を含む一続きの切れ目のないアミノ酸から成る免疫原性組成物によって解決される
。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は動物又はヒトのワクチン接
種用である。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、動物又はヒトの体内で免
疫応答を誘導することができる。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、前記免疫応答は抗体応答である。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、前記抗体応答は、ＨＰＧＧＴに対す
る、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖の
ＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌感染に罹患して
いる又はピロリ菌による感染を発症する危険度が高い患者においてリンパ球の活性化及び
増殖を促進することを目的とする。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、リンパ球はＢ又はＴ細胞である。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は１又は複数のアジュバント
を含む。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌からの１又は複
数の抗原を含む。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、抗原は、外膜タンパク質を含む群か
ら選択される。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、抗原は、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ １８及
びそれらの組み合わせを含む群から選択される。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、組成物は、ピロリ菌によって引き起
こされる又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こさ
れる又はピロリ菌感染に関連する疾患の予防及び／又は治療を目的とする。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌による感染、ピロ
リ菌によって引き起こされる胃十二指腸障害、胃炎、慢性胃炎、胃又は十二指腸潰瘍、胃
癌及び（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む群から選択される。

第３、第４及び第５の側面の１つの実施形態では、免疫原性組成物はワクチンである。

本発明の基礎をなす問題は、第６の側面によれば、薬剤の製造のための、本発明の第１
の側面に従ったポリペプチドの使用によって解決される。

本発明の基礎をなす問題は、第７の側面において、薬剤の製造のための、本発明の第３
、第４及び第５の側面に従った免疫原性組成物の使用によって解決される。

本発明の第６及び第７の側面の１つの実施形態では、薬剤はワクチンである。

本発明の第６及び第７の側面１つの実施形態では、薬剤は、ピロリ菌によって引き起こ
される又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされ
る又はピロリ菌感染に関連する疾患の予防及び／又は治療を目的とする。

本発明の基礎をなす問題は、第８の側面において、試料中のＨＰＧＧＴに対する抗体を
検出するための、第１の側面に従ったポリペプチドの使用によって解決される。

第８の側面の１つの実施形態では、前記抗体は、ＨＰＧＧＴの酵素活性及び／又はリン
パ球増殖へのＨＰＧＧＴの阻害活性を阻害することができる。

本発明の基礎をなす問題は、第９の側面において、第１の側面に従ったポリペプチドに
特異的に結合する抗体によって解決される。

第９の側面の１つの実施形態では、前記抗体は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくは
ＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑
制を無効にする作用を有する。

本発明の基礎をなす問題は、第１０の側面において、第９の側面に従った抗体をコード
する核酸によって解決される。

本発明の基礎をなす問題は、第１１の側面において、第１の側面に従ったポリペプチド
に特異的に結合するか又はＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び４５２を含む一続きの切れ目
のないアミノ酸から成るＨＰＧＧＴのフラグメントに特異的に結合する核酸分子であって
、アプタマー及びスピーゲルマーを含む群から選択される核酸分子によって解決される。

１１番目の態様の１つの実施形態では、核酸は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくは
ＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑
制を無効にする作用を有する。

本発明の基礎をなす問題は、第１２の側面において、薬剤の製造のための、第９の側面
に従った抗体の使用によって解決される。

本発明の基礎をなす問題は、第１３の側面において、薬剤の製造のための、第１１の側
面に従った核酸の使用によって解決される。

第１２及び第１３の側面の１つの実施形態では、薬剤は、ピロリ菌によって引き起こさ
れる又はピロリ菌に関連する疾患、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる
又はピロリ菌感染に関連する疾患の治療及び／又は予防を目的とする。

本発明の基礎をなす問題は、第１４の側面において、薬剤候補物質の、
ａ．ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼの特異的活性に対する阻害作用、
及び
ｂ．リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用
を評価する工程を含む疾患の治療のための薬剤候補物質を同定するための方法によって解
決される。

第１４の側面の１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌によって引き起こされるか又は
ピロリ菌に関連し、より好ましくは疾患は、ピロリ菌感染、より好ましくはヒトにおける
ピロリ菌感染によって引き起こされるか又はそれに関連する。

本発明の基礎をなす問題は、第１５の側面において、
ａ）ＨＰＧＧＴ又はその少なくとも１つのフラグメントを含む免疫原性組成物を提供す
る工程と、
ｂ）該免疫原性組成物で動物を免疫し、それによって抗体を作製する工程と、
ｃ）該抗体を、ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼの特異的活性に対する
それらの阻害作用及びリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にするそれらの作用に
関して評価する工程と、
ｄ）適切な免疫原性組成物を選択する工程とを含むワクチンを開発するための方法によ
って解決される。

第１５の側面の１つの実施形態では、前記ワクチンは、ヒトにおけるピロリ菌感染に対
するワクチンである。

本発明の基礎をなす問題は、第１６の側面において、予防及び／又は疾患のための薬剤
の製造のためのＨＰＧＧＴのリガンドの使用であって、リガンドが、ＨＰＧＧＴ活性を有
意に阻害し、リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする、前記使用によって解決
される。

第１６の側面の１つの実施形態では、前記疾患は、ピロリ菌によって引き起こされる又
はピロリ菌に関連する、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる又はピロリ
菌感染に関連する。

第１６の側面の１つの実施形態では、リガンドは、９番目の態様に従った抗体、又は１
１番目の態様に従った核酸である。

第１６の側面の１つの実施形態では、リンパ球増殖及び／又は活性化は、リンパ球増殖
アッセイにおいて評価される。

本発明の基礎をなす問題は、第１７の側面において、免疫抑制剤組成物の製造のための
ＨＰＧＧＴの使用によって解決される。

本発明の基礎をなす問題は、第１８の側面において、ＨＰＧＧＴとグルタミンを、ＨＰ
ＧＧＴ特異的活性を可能にする培地でインキュベートした後に上清として得られる免疫抑
制剤組成物によって解決される。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、発明者は、意外にも、ヘリコバクタ
ーピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）に対するリガンド（Ｅ．
Ｃ．２．３．２．２．）が、ピロリ菌感染、特に胃十二指腸障害の治療及び／又は予防の
ために使用でき、前記リガンドが、ＨＰＧＧＴの触媒活性の阻害剤であり、この酵素の存
在下で抑制される対照と比較してリンパ球増殖を回復されることを見出した。さらに、本
発明の発明者は、ＨＰＧＧＴと共にインキュベートしたとき、前記リンパ球増殖が、リン
パ球においてＧ１細胞周期停止を導き、それによってリンパ球増殖を阻害する、ＨＰＧＧ
Ｔ特異的活性によってブロックされることを認めた。その結果として、ＨＰＧＧＴ特異的
活性の阻害はリンパ球増殖の阻害を無効にし、その結果ピロリ菌が宿主の免疫系を免れる
ことを不可能にする。そこで、本発明によって示唆されるようなリガンドの使用は、宿主
／患者の体内でのピロリ菌のコロニー形成を予防する又は少なくとも実質的に低減する。
最後に、発明者は、ピロリ菌のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の触媒活
性がリンパ球増殖、特に宿主の体内でのＴ細胞増殖の抑制のために必要であることを見出
した。これは、ＧＧＴ活性を欠く突然変異型細菌がリンパ球の増殖を廃する能力を喪失し
、同時にマウスにコロニー形成することができないことを示すことによって明らかに実証
された。リンパ球への阻害作用は、組換えＨＰＧＧＴに関して完全に存在した。Ｔ細胞に
おけるシグナル伝達へのその作用の分析は、Ｇ１細胞周期停止の誘導を導くＲａｓシグナ
ル伝達経路の崩壊を示唆する。あらゆるピロリ菌株がＨＰＧＧＴを有すること、及び阻害
性リガンドによるこの酵素の標的は、あらゆるピロリ菌感染に適用し得る新規治療を提供
し、それによって抗生物質療法に関連する問題（耐性、副作用、突然変異の選択等）を回
避することに留意することが重要である。本発明に従って、ＨＰＧＧＴの触媒活性を阻害
し、それにより、さもなければピロリ菌に対する有効な免疫応答を妨げる免疫抑制を打破
することによって、好ましくはピロリ菌感染に対する防護が与えられる。

ＨＰＧＧＴは、動物、植物及び細菌の間に広く分布する。ヘテロ二量体タンパク質であ
り、１本のポリペプチド鎖として翻訳され、翻訳後、異なる分子量を有する２つのサブユ
ニットに切断される。この酵素の哺乳動物形態は膜結合タンパク質であり、主として全身
の腺及び細管の管腔表面で発現される。ヘリコバクターピロリのホモログを含む一部の細
菌ＧＧＴの細胞局在は、哺乳動物酵素のものとは異なる。ＨＰＧＧＴは、細胞外液中に分
泌されることが以前に示された（Ｂｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。加えて、種
々のＧＧＴホモログのアミノ酸配列のアラインメントは、ＨＰＧＧＴとヒト及び他の哺乳
動物のＧＧＴとの間の２２％という低い相同性を明らかにしたが、細菌ホモログに対して
はより高い相同性を示した。ＨＰＧＧＴと他の種からのホモログとの間のもう１つの重要
な相違は、ＨＰＧＧＴのＣ末端におけるＧＹ残基の欠如である（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９９）。したがって、ＨＰＧＧＴとその哺乳動物ホモログとの間での細
胞局在及びタンパク質構造に関する実質的な相違は明白である。

γ−グルタミルトランスペプチダーゼはまた、グルタミルトランスペプチダーゼ；α−
グルタミルトランスペプチダーゼ；ｇ−グルタミルペプチジルトランスフェラーゼ；ｇ−
グルタミルトランスペプチダーゼ；ｇ−ＧＰＴ；ｇ−ＧＴ；ｇ−ＧＴＰ；Ｌ−ｇ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ；Ｌ−ｇ−グルタミルトランスフェラーゼ；Ｌ−グルタミルト
ランスフェラーゼ；ＧＧＴ；ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼとしても知られる。特
異的（触媒）活性は、以下で概説するようなグルタミル残基の転移である。
（５−Ｌ−グルタミル）−ペプチド＋アミノ酸＝ペプチド＋５−Ｌ−グルタミルアミノ
酸

この反応又はそのような反応を実施する能力を、ここではまた、ＨＰＧＧＴの酵素活性
又はＨＰＧＧＴの特異的活性とも称する。

ＧＴＴ活性は、当業者に公知の方法で（例えばＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリ
ドを供与体基質として使用して；以下参照）評価することができる。ＨＰＧＧＴ及び／又
はリガンドの存在下又は不在下でのリンパ球増殖アッセイは、ここで詳細に述べるように
実施できる。

ＧＧＴは、以前に他のグループによって、インビボでのコロニー形成のために重要なピ
ロリ菌からの因子であると述べられた^{１１，１３}。しかし、この所見の根拠となる理由は
曖昧なままであった。

本発明は、ヒトＴリンパ球増殖のＧＧＴ依存性阻害及びピロリ菌によるＧ１停止の誘導
についての明確な証拠を提供する。これは、一方では、細菌の同質遺伝子的ＧＧＴノック
アウト突然変異体の使用によって明らかにされ、前記突然変異体は、抗原刺激した一次ヒ
トＴ細胞並びにＰＢＭＣの増殖を抑制することができなかった。他方で、大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）において発現された組換えＨＰＧＧＴは、ピロリ菌によって分泌される他のタン
パク質の不在下でＴ細胞増殖を阻害した。興味深いことに、我々のデータは、哺乳動物Ｇ
ＧＴがこの阻害作用を欠如していたことを示す。上述したように、哺乳動物とＨＰＧＧＴ
の構造及び局在性の相違が報告されている。我々の結果は、哺乳動物ＧＧＴがリンパ球の
増殖を阻害できないことの原因である、哺乳動物とＨＰＧＧＴの触媒機構及び／又は基質
特異性のさらなる違いを示すものである。

セリン残基４５１及び４５２がＧＧＴの触媒活性のために必須であることを同定するた
めに構造試験及び突然変異誘発実験が使用された^２１。アミノ酸位置３８０（Ｔ３８０）
がＨＰＧＧＴの触媒活性のために極めて重要であると報告されている先行技術の学術的教
示^３１と異なり、ＨＰＧＧＴのセリン４５１／４５２のアラニンへの部位指定突然変異誘
発が、リンパ球に対するその触媒活性、特にその阻害活性の完全な廃止を生じさせること
がここで示される。よって、ＧＧＴ阻害剤であるアシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）とのＨ
ＰＧＧＴのインキュベーションは、酵素の触媒活性並びに阻害作用を完全に無効にする。
したがって、我々のデータは、ＨＰＧＧＴの触媒ドメインの構造的完全性がその免疫抑制
作用のために必要な前提条件であることを明らかにする。インビボでのコロニー形成にお
けるピロリ菌からのＧＧＴの重要な役割と一致して^{１１，１３}、我々は、この酵素が宿主
の胃粘膜中に存在する低いｐＨ値でも触媒的に活性であることを認めた。

ヒトの胃における上皮細胞が、内側区画と外側区画との間の分子の移動を制限する連続
的なバリアを形成することは広く確立されている。加えて、このバリアの細胞間空隙を通
しての高分子の受動拡散は、タイト結合及び接着結合を含む様々な機構によって妨げられ
る。そこで、ヘリコバクターピロリによって分泌されるＧＧＴタンパク質は、Ｔ細胞増殖
を抑制するために上皮バリアの反対側の宿主免疫系とどのようにして相互作用し得るのか
という疑問が生じる。これに関して、以前に、ＨＰはいくつかの機構によって胃上皮のバ
リア機能を弱めることができることが明らかにされた。加えて、ＨＰタンパク質ＶａｃＡ
及びＣａｇＡタンパク質による上皮結合複合体の破壊並びにピロリ菌ウレアーゼによって
誘導される上皮バリアを横断するトランスサイトーシスタンパク質輸送の上昇が、以前に
明らかにされている。これらの機構が最終的に、粘膜固有層内のＨＰタンパク質の存在増
加及びピロリ菌感染の結果として胃粘膜を浸潤する免疫系の細胞とのそれらの相互作用を
導く。ＨＰＧＧＴによる胃粘膜内のＴ細胞の障害の裏付けとして、我々の結果は、ＨＰ感
染患者で認められるが非感染対照患者では認められない、このビルレンス因子に対する著
明な血清抗体応答を示す。これは、ＧＧＴタンパク質成分の抗原プロセシング及び胃粘膜
内のＴリンパ球を含む免疫系の成分に対するこれらの抗原の提示という概念を裏付ける。
したがって、ＨＰＧＧＴによる胃粘膜内のＴリンパ球増殖の抑制は、ヘリコバクターピロ
リの、ヒトの胃におけるその慢性的残存を促進する免疫回避機構に寄与し得る。

本発明の基礎をなす研究の結果は、Ｔ細胞活性化の重要な機構が、ピロリ菌野生型上清
及びまた組換えＨＰＧＧＴとのインキュベーションの間も無傷であることを明らかにする
。これは、細胞表面抗原ＣＤ６９及びＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）の発現がピロリ菌
上清の存在下で低下しないことを示した本発明の発明者の以前の試験と一致する^３。加え
て、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色によって測定されるホスファチジルセリンの露出がピロ
リ菌上清及び組換えＨＰＧＧＴの存在下で上昇しなかったことから、リンパ球へのＨＰＧ
ＧＴの抑制作用がアポトーシス非依存性機構によって媒介されることが明らかにされる。
ＨＰＧＧＴは胃上皮細胞において酸化的ストレス及びアポトーシスを誘導することが以前
に記述されている^{１２，１６}。免疫系の細胞へのこの酵素の作用は、しかしながら、これ
まで測定されておらず、認められた相違は標的細胞の間の相違を反映する可能性がある。

発明者は、Ｔ細胞における細胞周期進行へのＨＰＧＧＴの干渉を分析し、ＨＰＧＧＴが
、細胞周期のＧ１期で停止を生じさせることによってリンパ球の増殖を阻害することを認
めた。Ｇ１停止は、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７の量の増加並びにサイクリンタンパク質の細胞レ
ベル低下によって特徴づけられた。Ｒａｓ及びＰＩ３Ｋ依存性経路は、その触媒パートナ
ーによるＤ型サイクリンの誘導、合成及び構築において中心的な重要性を持つ^{２２，２３}
。Ｒａｓシグナル伝達経路の活性化は、ｃ−Ｒａｆ及び他のキナーゼを含むタンパク質カ
スケードを通してサイクリンＤの転写を誘導する^２４。加えて、Ｒａｓシグナル伝達の誘
導は、細胞周期、細胞増殖及び形質転換において重要な役割を果たすｃ−Ｍｙｃタンパク
質の合成増強を導くことが確立されている^２５。これまでの試験は、ＰＩ３Ｋシグナル伝
達がＴ細胞内でＲａｓシグナル伝達とは独立して進行することを明らかにした^１７。ＰＩ
３Ｋシグナル伝達の重要なメディエイター（ＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６Ｋ及びＦｏｘｏ３）の活
性化状態はＨＰＧＧＴの存在下で不変であったが、我々は、ＨＰＧＧＴと共にインキュベ
ートした細胞においてｃ−Ｒａｆリン酸化及びｃ−Ｍｙｃタンパク質のレベル低下を認め
た。よって、我々のデータは、ピロリ菌からのＧＧＴによる、ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝
達ではなくＲａｓ依存性シグナル伝達の破壊が、細胞増殖の排除を導くＴ細胞における細
胞周期停止の誘導において役割を果たすことを示唆する。

もう１つの重要な疑問は、ＨＰＧＧＴのような酵素が、細胞周期停止及び増殖阻害を導
く細胞内シグナル伝達事象にどのようにして影響を及ぼし得るかということである。ペプ
チド転移反応において、ＧＧＴは供与体から受容体基質へのγ−グルタミル部分の転移を
触媒する^２７。体系的なアミノ酸枯渇分析により、発明者は、ＨＰＧＧＴの阻害作用が培
地からのアミノ酸グルタミンの不在下では完全に無効化され、ピロリ菌からのＧＧＴの阻
害作用がペプチド転移の間の転写産物の形成によって間接的に媒介されることを示唆する
ことを認めた。これは、ＨＰＧＧＴと培養基のプレインキュベーション及びその後の細胞
添加に先立つ酵素の不活化が、リンパ球増殖の阻害のために十分であるという我々の所見
によって裏付けられる。

これまでの試験は、ヒトＴリンパ球の増殖を阻害する、ＧＧＴとは異なるピロリ菌のい
くつかの因子を記述した。Ｗａｎｇとその共同研究者達は、３００のＭＯＩ（Ｔ細胞当た
り３００細菌）のピロリ菌がアポトーシスの誘導によってＴ細胞の増殖を阻害することを
示した。しかし、そのような高い量の細菌がヒトの胃の粘膜固有層においてＴ細胞と接触
するかどうかは疑わしいと考えられる。我々の以前の公表文献において（（Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００５ ２００５：１２８（５）：１３２７−３９）、発明者
は、３００倍低い１のＭＯＩ（Ｔ細胞当たり１細菌）でさえも我々の系においてリンパ球
増殖を阻害するために十分であることを示した。リンパ球と共にインキュベートしたＨＰ
培養上清の濃度を１００μｇ／ｍｌ以上に上げたとき、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．と同等の
量でアポトーシスが観察された。これは、ここで述べるリンパ球に対するＨＰの阻害作用
が、このグループによって記述された機構よりも著明であり、その機構とは異なることを
示唆する。

Ｚａｂａｌｅｔａ ｅｔ ａｌ．によるもう１つの試験は、細胞質ＨＰタンパク質アル
ギナーゼによるＴ細胞増殖の阻害を述べた^３０。著者らは、細菌の細胞質タンパク質及び
膜結合タンパク質を含むＨＰからの全細胞溶解産物を使用した。これに対し本発明の発明
者は、ＨＰの分泌タンパク質を含むＨＰからの培養上清を使用した。アルギナーゼはＨＰ
によって分泌されないので、この酵素のＴ細胞に対する阻害作用はここで使用した系では
検出できず、インビボで起こる可能性は低い。

Ｇｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．による研究は、ピロリ菌によって分泌される空胞化細胞毒
Ａ（ＶａｃＡ）がＴ細胞の増殖を阻害することを示唆した。著者らは、我々が本試験にお
いて使用した（１０μｇ／ｍｌ）よりも２５倍高い濃度（２５０μｇ／ｍｌ）の細菌上清
を使用した。以前の試験で、本発明の発明者は、高濃度のＨＰ培養上清（≧１１０μｇ／
ｍｌ）がリンパ球において有意量のアポトーシスを誘導することを明らかにした。加えて
、ＶａｃＡの存在又は不在は、我々の系ではリンパ球に対するＨＰの阻害作用に影響を及
ぼさなかった（Ｇａｓｔｒｏ ２００５）。

したがって、これまでに記述されたピロリ菌によるＴ細胞阻害の他の方法にもかかわら
ず、細菌によって分泌されるＧＧＴが、ここで使用した系においてＴ細胞増殖を阻害する
ために必要且つ十分である。

要するに、本出願の基礎となるデータは、免疫エフェクター細胞の細胞周期進行を阻害
するために分泌タンパク質を利用する、ピロリ菌によって適用される免疫回避のための新
規機構を提供する。この細菌のＧＧＴ欠損突然変異体では阻害作用が完全に無効化された
ので、酵素ＧＧＴがピロリ菌によるＴ細胞増殖の阻害に関与することが示される。組換え
ＨＰＧＧＴタンパク質の酵素的に不活性な突然変異体はＴ細胞増殖を抑制する能力を欠如
していたので、この作用は明らかにＧＧＴの触媒活性に依存した。加えて、Ｔ細胞のＧ１
期における細胞周期停止がピロリ菌からのＧＧＴの存在下でのみ誘導されたことが示され
る。やはり特定の理論に縛られることを望むものではないが、さらなる結果は、Ｇ１停止
及びＴ細胞増殖抑制の原因として、ＨＰＧＧＴによる、ＰＩ３Ｋ依存性シグナル伝達では
なくＲａｓ依存性シグナル伝達の破壊を示唆する。リンパ球阻害因子としてのＨＰＧＧＴ
の同定は、ピロリ菌コロニー形成のためのＨＰＧＧＴの重要な役割を示す、動物モデルで
の所見に関する生物学的根拠を形成する。ＨＰＧＧＴ及び宿主のコロニー形成におけるそ
の役割の可能性は、ＷＯ００／０１８２５及びＷＯ９８／１７８０４で論じられている。
どちらの資料も、しかしながら、ＨＰＧＧＴ活性が宿主の免疫系の抑制に関与することの
証拠を提示しておらず、宿主におけるＴ細胞増殖及び免疫抑制へのＨＰＧＧＴの作用につ
いては記述していない。

本発明の発明者は、ＨＰＧＧＴ自体、好ましくは配列番号１に従ったアミノ酸配列を有
する野生型ＨＰＧＧＴだけでなく、その特定フラグメントも、各々が好ましくはＨＰＧＧ
Ｔに特異的に結合し、ＨＰＧＧＴの特異的活性を阻害する及び／又はリンパ球増殖のＨＰ
ＧＧＴ依存性抑制の無効化効果に適する抗体、アプタマーならびにスピーゲルマーの作製
のための抗原として使用し得ることを見出した。

したがって、本発明の１つの側面は、特異的ポリペプチドに関する。そのようなポリペ
プチドは、ＨＰＧＧＴの特定領域のアミノ酸の部分又は一続きのアミノ酸に同一である又
は対応するアミノ酸の配列を含む。好ましくは、ＨＰＧＧＴのアミノ酸配列は、配列番号
１に従ったアミノ酸配列を含む。

ここで好ましく使用されるように、２つのアミノ酸の配列もしくは順序がアミノ酸の性
質及び互いに対する相対的位置に関して同じである場合、１つのアミノ酸配列はもう１つ
のアミノ酸配列に同一である。もう１つの実施形態では、同一である配列の一次アミノ酸
配列は同じである。

ここで好ましく使用されるように、２つのアミノ酸の配列又は順序がアミノ酸の性質及
び互いに対する相対的位置に関して同じである場合、１つのアミノ酸配列はもう１つのア
ミノ酸配列に同一である。もう１つの実施形態では、互いに対応する配列の一次アミノ酸
配列は同じであり、両方の対応するアミノ酸配列の全体的状況は同じであるか又は異なる
。アミノ酸の全体的状況は、アミノ酸配列の一方又は両方の末端に隣接するアミノ酸によ
って定義される。

同一である又は互いに対応する配列が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は
１００％の配列相同性を有することは当業者に認識される。

１つの実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴの一続きの連続アミノ
酸に同一である又は対応するアミノ酸配列を含む又は前記アミノ酸配列から成る。好まし
くは、及び本発明のいずれかの実施形態及び態様に該当する場合、ＨＰＧＧＴは配列番号
１に従ったアミノ酸配列を有する。ＨＰＧＧＴの用語に包含されるＨＰＧＧＴの変異体及
び突然変異体が存在し得ることは当業者に認識される。また、ＨＰＧＧＴの配列が配列番
号１で規定されるＨＰＧＧＴのものと異なる場合、配列番号１で規定されるアミノ酸配列
を有するＨＰＧＧＴに関してここで開示されるものがそのような異なる形態のＨＰＧＧＴ
にも適用されることは本発明の範囲内である。より詳細には、当業者は、それぞれその位
置、化学的性質及び／又は機能に関して配列番号１で規定されるアミノ酸配列を有するＨ
ＰＧＧＴにおいて同定されるものに対応し、指定されるそのような異なる形態のアミノ酸
を同定する。

ここで開示されるように、本出願によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴの特定領域のアミ
ノ酸配列に同一であるか又は対応する。１つの実施形態では、そのような領域は、配列番
号１に従ったアミノ酸配列のアミノ酸位置１５０〜２００によって定義される領域である
。もう１つの実施形態では、そのような領域は、配列番号１に従ったアミノ酸配列のアミ
ノ酸位置４１０〜４８０によって定義される領域である。

本発明の発明者は、意外にも、アミノ酸１５０〜２００によって定義されるＨＰＧＧＴ
の部分及びアミノ酸４１０〜４８０によって定義されるＨＰＧＧＴの部分が、ＨＰＧＧＴ
の触媒活性を阻害することができ、したがってピロリ菌に感染している又はピロリ菌に感
染する危険度が高い生物においてピロリ菌に対する又は少なくともＨＰＧＧＴに対する免
疫応答を惹起する前提条件を提供する、抗体の作製のための抗原又はワクチンとして使用
されるために特に有益であることを見出した。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、発明者は、アミノ酸位置１５０〜２
００及びアミノ酸位置４１０〜４８０によって定義される領域の両方がＨＰＧＧＴの酵素
活性と特別な関係を有すると推測する。より詳細には、アミノ酸位置４１０〜４８０によ
って定義されるＨＰＧＧＴの領域は、ＨＰＧＧＴの活性中心に関連する又は近接すると言
われている。より詳細には、ＨＰＧＧＴのこの領域は、直接活性中心と接するループ領域
及び活性中心自体の部分を含む。したがって、ＨＰＧＧＴのこの部分のブロッキングは、
おそらくＨＰＧＧＴの触媒活性の基質の侵入をブロックすることによって、ＨＰＧＧＴの
酵素活性を阻害するための適切な手段である。同じことが、原則として、アミノ酸位置１
５０〜２００によって定義されるＨＰＧＧＴの領域にも当てはまる。配列番号１に従った
ＨＰＧＧＴのアミノ酸位置１５０〜２００のこの領域は、ＨＰＧＧＴの活性中心の外側の
ループに関連する又はループ（の部分）を形成するが、基質に対する結合ポケットに空間
的に近接する。これを考慮すると、これらの領域に特異的に干渉する分子は、ここでより
詳細に述べるように、この種の結合特性を有する抗体に関して使用できる作用物質である
。抗体のほかに、先行技術において記述されているペプチドアプタマー、アンチカリン、
アプタマー及びスピーゲルマーは、抗体に関してここで開示する様々な目的のために、そ
れぞれ作製され、使用され得る。

本出願は、その配列が以下のアミノ酸位置に対応する又は同一であるポリペプチドを提
供する。
（ａ）（１５０＋ｎ）から（１５０＋ｎ＋ｍ）まで［式中、ｎは０から３５までの何ら
かの整数であり、ｍは１５から３０までの何らかの整数である］。このようにして定義さ
れる位置は、ｎとｍの何らかの組み合わせから生じるものであることが了解される。その
ような組み合わせは、好ましくは、そのように定義される上限位置が約２００である範囲
に限定されることがさらに了解される。（１５０＋ｎ）によって定義される位置は下限位
置とも称され、及び（１５０＋ｎ＋ｍ）によって定義される位置は上限位置とも称される
。
（ｂ）（４１０＋ｎ）から（４１０＋ｎ＋ｍ）まで［式中、ｎは０から５５までの何ら
かの整数であり、ｍは１５から３０までの何らかの整数である］。このようにして定義さ
れる位置は、ｎとｍの何らかの組み合わせから生じるものであることが了解される。その
ような組み合わせは、好ましくは、そのように定義される上限位置が約２００である範囲
に限定されることがさらに了解される。（４１０＋ｎ）によって定義される位置は下限位
置とも称され、及び（４１０＋ｎ＋ｍ）によって定義される位置は上限位置とも称される
。

さらなる実施形態では、本発明によるポリペプチドは、ＨＰＧＧＴのフラグメント、好
ましくはＨＰＧＧＴの免疫原性フラグメント、より好ましくは宿主生物において免疫応答
、好ましくは抗体応答を惹起するのに適したＨＰＧＧＴの免疫原性フラグメントであり、
抗体は、ＨＰＧＧＴに対する、より好ましくはＨＰＧＧＴの特異的活性に対する阻害作用
及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する。好ましくは
、本発明による免疫原性フラグメントは、ＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び／又は４５２
を含む。フラグメントはいかなる長さであってもよい。しかし、１０〜約５０アミノ酸残
基のペプチド、より好ましくは１０〜４０、１０〜３０又は最も好ましくは１０〜２０ア
ミノ酸残基のペプチドが使用される。ペプチドに基づくワクチンのためのエピトープ予測
アルゴリズムがここで適用される。ここで好ましく使用されるように、宿主生物は、好ま
しくは、抗原に対する免疫応答を発現することができる動物、好ましくは哺乳動物又はヒ
トである。

ここで好ましく使用されるように、アミノ酸はα−アミノ酸である。同じくここで好ま
しく使用されるように、アミノ酸はＤ−又はＬ−アミノ酸のいずれか、好ましくはＬ−ア
ミノ酸である。さらに好ましくは、アミノ酸は天然に生じるアミノ酸である。

本発明の発明者はまた、驚くべきことに、ＨＰＧＧＴのセリン残基４５１及び／又は４
５２からアラニンへの突然変異誘発が、組換えＨＰＧＧＴの酵素活性を完全に排除し、そ
のＴ細胞増殖の阻害を無効にすることを認めた。しかし、セリン残基３８５（Ｓ３８５Ａ
）の置換はＴ細胞増殖へのＨＰＧＧＴ依存性阻害作用を低減しなかったが、この突然変異
型ＨＰＧＧＴの触媒活性は有意に（すなわち約５０％）低下した。したがって、ピロリ菌
感染の治療のための適切な薬剤物質は、２つの必要条件、すなわち（ｉ）ＨＰＧＧＴの触
媒活性への阻害作用を示さなければならないこと、さらに、ＨＰＧＧＴと共にインキュベ
ートしたときＴ細胞増殖を回復しなければならないこと、を満たす必要がある。適切な薬
剤候補物質の同定のための本発明による有効な方法は、両方の評価を含む。

この所見を踏まえて、本発明のもう１つの側面は不活化形態のＨＰＧＧＴの使用に関す
る。

不活化形態のＨＰＧＧＴは、１つの実施形態では、ここで示すＨＰＧＧＴの酵素活性を
欠くＨＰＧＧＴである。そのような不活化形態のＨＰＧＧＴを提供するために、常に酵素
的に活性なＨＰＧＧＴと比較して、１又は複数のアミノ酸の欠失、１又はそれ以上のアミ
ノ酸の変化を含む、様々な方法が存在することは当業者に認識される。不活化形態のＨＰ
ＧＧＴの１つの実施形態は、配列番号１に従ったアミノ酸配列の４５１位及び４５２位の
セリンアミノ酸を欠くものである。１つの実施形態では、不活化形態のＨＰＧＧＴは、こ
こで述べる免疫応答、好ましくは野生型ＨＰＧＧＴへの阻害作用、より好ましくはＨＰＧ
ＧＴの特異的活性への阻害作用及び／又はリンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制に対する
無効化作用を有する抗体を含む動物及び／又はヒトにおける抗体応答を、まだ惹起するこ
とができる。ここで好ましく使用されるように、ＨＰＧＧＴの特異的活性という用語は、
酵素活性、より詳細にはここで述べるＨＰＧＧＴの酵素活性と同義的に使用される。不活
化形態のＨＰＧＧＴのさらなる実施形態は、野生型アミノ酸配列を有するＨＰＧＧＴであ
るが、その酵素作用はＨＰＧＧＴの酵素活性に対する阻害剤の添加によって抑制されてい
る。そのような阻害剤は、抗体、スピーゲルマー、アプタマー、又はＨＰＧＧＴの酵素活
性のために必要とされるイオンを含む因子をＨＰＧＧＴから奪う何らかの分子であり得る
。

ポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ及びＨＰＧＧＴは、ここではまた、特にそれに
特異的に結合する抗体、アプタマー及びスピーゲルマーの作製に関連して標的分子とも称
される。

本発明のさらなる態様は、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ又はＨ
ＰＧＧＴ、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型のＨ
ＰＧＧＴに対する抗体に関する。

好ましくはここで使用される抗体は、それぞれその製造と作製が当業者に周知である、
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方を含む。

標的に特異的な抗体の製造は当業者に公知であり、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ
Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）に述べられている。好ましくは、Ｋｏｅｈｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎのプロトコール及びそれに基づくさらなる開発に従って
製造され得るモノクローナル抗体は、本発明に関連して使用され得る。

ここで使用される抗体は、それらが適切であり、標的に結合することができる限り、完
全抗体、抗体フラグメント又は誘導体、例えばＦａｂフラグメント、Ｆｃフラグメント及
び一本鎖抗体、又はアンチカリンを含むが、これらに限定されない。モノクローナル抗体
のほかに、ポリクローナル抗体も使用及び／又は作製され得る。ポリクローナル抗体の作
製も当業者に公知であり、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ
Ｙ，（１９８８）に述べられている。好ましくは、治療のために使用される抗体は、ヒト
化又はヒト抗体である。

本発明に従って使用され得る抗体は、１又はいくつかのマーカー又は標識を有し得る。
そのようなマーカー又は標識は、その診断適用又はその治療適用において抗体を検出する
ために有用であり得る。好ましくは、マーカー及び標識は、アビジン、ストレプトアビジ
ン、ビオチン、金及びフルオレセインを含む群から選択され、例えばＥＬＩＳＡ法におい
て使用される。これらやさらなるマーカー並びに方法は、例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａ
ｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８８）に述べられている。加えて又は選択的に
、ここで述べる抗体並びに他のいずれかの標的アンタゴニスト又は相互作用パートナーは
、ここでより一般的に述べるような標識アンタゴニストであり得る。

標識又はマーカーが、他の分子との相互作用のような、検出以外の付加的な機能を示す
ことも本発明の範囲内である。そのような相互作用は、例えば他の化合物との特異的相互
作用であり得る。これら他の化合物は、ヒト又は動物の身体のような抗体が使用される系
、又はそれぞれの抗体を使用することによって分析される試料に固有のものであり得る。
適切なマーカーは、例えば、ビオチン又はフルオレセインと、アビジン及びストレプトア
ビジン及びそのようにマーク又は標識された抗体と相互作用するためにそれぞれの化合物
又は構造上に存在する同様のもののような、その特異的相互作用パートナーであり得る。
やはりこれも、アプタマー及びスピーゲルマーのようなここで述べるその他の標的相互作
用パートナーにも当てはまる。

１つの実施形態では、抗体は、組換えＨＰＧＧＴのアミノ酸４５１及び／又は４５２を
含むＨＰＧＧＴのエピトープに対して特異的活性を有する抗体、好ましくはモノクローナ
ル抗体である。もう１つの実施形態では、抗体は、これらのアミノ酸位置に空間的に近接
するエピトープを標的し、好ましくは前記位置に隣接するループを標的して特異的に結合
し、より好ましくはエピトープは、配列番号１のＨＰＧＧＴのアミノ酸位置１５０〜２０
０、より好ましくはアミノ酸位置１７４〜１９０によって定義される、又は配列番号１の
ＨＰＧＧＴのアミノ酸位置４１０〜４８０、より好ましくはアミノ酸位置４２３〜４４３
によって定義されるＨＰＧＧＴの一続きの範囲、及びそれらが基本的に同一の免疫反応性
を示すことを条件とするそれらの誘導体によって定義される又はそれらに含まれる。

好ましくは、本発明の抗体は、ＨＰＧＧＴ特異的活性を阻害し、宿主内でのリンパ球増
殖のＨＰＧＧＴ依存性阻害を少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も
好ましくは少なくとも８０％又は９０％抑制する。同じく好ましくは、本発明による抗体
はさらに、ＨＰＧＧＴ特異的活性への阻害作用を示し、インビトロで評価されるＴ細胞増
殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする。

抗体と同じ方法で、したがって同じ目的のために本発明に従って使用できる相互作用パ
ートナーのもう１つのクラスは、標的結合ポリペプチドの特定形態である、いわゆる「ア
ンチカリン」である。アンチカリン及びそれらの製造方法は、中でも特に、ドイツ特許出
願第ＤＥ １９７ ４２ ７０６号に述べられている。

抗体と同じ方法で、したがって同じ目的のために使用できる分子のさらなるクラスは、
いわゆるペプチドアプタマーである。標的を使用して、ペプチドアプタマーは、ここでよ
り詳細に説明するポリペプチドライブラリーを利用したスクリーニング工程を用いて作製
できる。選択基準は、選択されたポリペプチドが実際に及び特異的に標的に結合すること
である。

より詳細には、そのようなペプチドアプタマーは、ファージディスプレイのような技術
水準に従った方法を使用することによって作製され得る。基本的には、ファージの形態な
どの、ペプチドのライブラリーを作製し、この種のライブラリーを標的分子と接触させる
。標的分子に結合しているペプチドを、その後、好ましくは標的分子との複合体として、
それぞれの反応から取り出す。結合特性が、少なくともある程度までは、塩濃度等のよう
な個々に実施される実験設定に依存することは当業者に公知である。より高い親和性又は
より大きな力で標的分子に結合しているポリペプチドをライブラリーの非結合成員から分
離した後、また場合により標的分子とポリペプチドの複合体から標的分子を分離した後、
続いてそれぞれのポリペプチドを特性決定し得る。特性決定の前に、場合により、例えば
ポリペプチドをコードするファージを増殖させることによって、増幅工程が実施される。
特性決定は、好ましくは標的結合ポリペプチドの、及び最終的にはここで定義される標的
のアンタゴニスト又は相互作用パートナーとして働くポリペプチドの配列決定を含む。基
本的には、ポリペプチドはそれらに長さに関して限定されないが、好ましくは約８〜２０
アミノ酸長を有するポリペプチドが、好ましくはそれぞれの方法で入手される。ライブラ
リーの大きさは、約１０^２〜１０^１８、好ましくは１０^８〜１０^１５の異なるポリペプチ
ドであり得るが、それらに限定されない。

本発明のさらなる側面は、本発明によるポリペプチドに対する、不活化形態のＨＰＧＧ
Ｔ又はＨＰＧＧＴに対する、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を
有する野生型のＨＰＧＧＴに対するアプタマーに関する。

アプタマーは、一本鎖又は二本鎖であり、標的分子と特異的に相互作用するＤ−核酸で
ある。アプタマーの製造と選択は、例えば欧州特許第ＥＰ ０ ５３３ ８３８号に述べ
られている。基本的には、以下の工程が実施される。第一に、各々の核酸が、典型的には
数個の、好ましくは少なくとも８個のその後ランダム化されるヌクレオチドのセグメント
を含む、核酸の混合物、すなわち潜在的アプタマーを提供する。この混合物を、その後、
標的分子と接触させ、それにより核酸は、候補混合物と比較して、例えば標的に対する高
い親和性に基づいて又はそれに対するより大きな力で標的分子に結合する。結合核酸を、
その後、残りの混合物から分離する。場合により、このようにして得られた核酸を、例え
ばポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する。これらの工程を数回反復して、最後に、標的
に特異的に結合する核酸の高い比率を有する核酸の混合物を得、場合によりそこから最終
的な結合核酸を選択する。これらの特異的に結合する核酸をアプタマーと称する。アプタ
マーの作製又は同定のための方法のいかなる段階でも、個々の核酸の混合物の試料を、標
準手法を用いてその配列を決定するために採取し得る。アプタマーを、例えばアプタマー
を作製する技術分野の当業者に公知である定義された化学基を導入することなどにより、
安定化し得ることは本発明の範囲内である。そのような修飾は、例えばヌクレオチドの糖
部分の２’位置にアミノ基を導入することであり得る。アプタマーは現在、治療薬及び診
断薬の両方として使用されている。しかし、そのように選択又は作製されたアプタマーを
、標的の確認のため及び／又は薬剤、好ましくは低分子に基づく薬剤の開発のための先導
物質として使用し得ることも本発明の範囲内である。これは、実際には競合アッセイによ
って実施され、競合アッセイでは、標的分子とアプタマーとの間の特異的相互作用が候補
薬剤によって阻害され、標的とアプタマーの複合体からのアプタマーの置換後、それぞれ
の薬剤候補物質は標的とアプタマーとの間の相互作用の特異的阻害を可能にし、相互作用
が特異的である場合、前記候補薬剤は、少なくとも原理上、標的をブロックするのに適し
ており、したがってそのような標的を含むそれぞれの系においてその生物学的アベイラビ
リティー又は活性を低下させると推測され得る。そのようにして得られた低分子を、次に
、毒性、特異性、生分解性及びバイオアベイラビリティーのようなその物理的、化学的、
生物学的及び／又は医学的特性を最適化するためにさらなる誘導体化及び修飾に供し得る
。

本発明のさらなる側面は、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ又はＨ
ＰＧＧＴ、好ましくは、典型的には配列番号１に従ったアミノ酸配列を有する野生型のＨ
ＰＧＧＴに対するスピーゲルマーに関する。

スピーゲルマーはアプタマーの特殊形態である。標的を用いて本発明に従って使用又は
作製し得るスピーゲルマーの作製又は製造は、同様の原理に基づく。スピーゲルマーの製
造は、ＷＯ９８／０８８５６に述べられている。スピーゲルマーはＬ−核酸であり、これ
は、それらが、Ｄ−ヌクレオチドで構成されるアプタマーと異なり、Ｌ−ヌクレオチドか
ら成ることを意味する。スピーゲルマーは、生物系において非常に高い安定性を有し、ア
プタマーと遜色なく、それらが対象とする標的分子と特異的に相互作用するという事実に
よって特徴づけられる。スピーゲルマーを作製するには、Ｄ−核酸の不均一な集団を創製
し、この集団を標的分子の光学的対掌体と、ここでは、例えば標的の天然に生じるＬ−鏡
像異性体のＤ−鏡像異性体と接触させる。その後、標的分子の光学的対掌体と相互作用し
ないＤ−核酸を分離する。しかしながら、標的分子の光学的対掌体と相互作用するＤ−核
酸を分離して、場合により測定及び／又は配列決定し、その後、Ｄ−核酸から得られた核
酸配列情報に基づいて対応するＬ−核酸を合成する。標的分子の光学的対掌体と相互作用
する前記Ｄ−核酸と配列に関して同一であるこれらのＬ−核酸は、標的分子の光学的対掌
体ではなく天然に生じる標的分子と特異的に相互作用する。アプタマーの作製のための方
法と同様に、様々な工程を数回反復し、標的分子の光学的対掌体と特異的に相互作用する
核酸を冨化することも可能である。

さらなる側面では、本発明は免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、本発明によ
るポリペプチド及び／又は不活化形態のＨＰＧＧＴ、特にここで述べるような不活化形態
のＨＰＧＧＴ、及び／又は野生型ＨＰＧＧＴの少なくとも１つを含む。本発明による前記
ポリペプチド及び／又は前記不活化形態のＨＰＧＧＴ、特にここで述べるような不活化形
態のＨＰＧＧＴ、及び／又は前記野生型ＨＰＧＧＴが、１つの実施形態では、免疫応答の
惹起を可能にする又は促進する方法で宿主の免疫系にそれぞれの抗原を提示し、高力価の
抗体を惹起するために、ＫＬＨ又はキーホールリンペットヘモシアニン、ＢＳＡ、オボア
ルブミン等のような担体物質に結合されることは了解される。

本発明に関連して、免疫原性組成物がインビトロ又はインビボで使用できることは了解
される。後者の場合そのような免疫原性組成物は、典型的にはワクチンであり、好ましく
はそのようなワクチンとして製剤される。免疫原性組成物、及びそれぞれ免疫原性組成物
を含有する薬剤及びワクチンは、好ましくは小児における、ピロリ菌感染の予防のため、
又は、ピロリ菌感染及びそのような生物によって引き起こされるもしくはそのような生物
に関連する何らかの疾患に罹患しているもしくは罹患する危険度が高い動物及びヒトの治
療ならびに／又は予防のために使用できる。

１つの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は１又はいくつかのアジュバントを含む
。好ましくは、アジュバントは、免疫系の全身性刺激を提供する物質である。アジュバン
トは当分野において公知であり、ポリカチオン性ポリマー、免疫刺激性デオキシヌクレオ
チド（ＯＤＮ）、合成ＫＬＫペプチド、神経活性化合物、ミョウバン、フロイント完全又
は不完全アジュバント、コレラ毒素を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ポリ
カチオン性ポリマーはポリカチオン性ペプチドであり及び／又は神経活性化合物はヒト成
長ホルモンである。

さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、Ｂａｂ Ａ、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ １８及び
それらの組み合わせのような、ピロリ菌の外膜タンパク質を含む。ＨｐａＡ及びＯｍｐ
１８は、例えばＶｏｌａｎｄ ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍ
ｕｎｉｔｙ，Ｊｕｌｙ ２００３，ｐ．３８３７−３８４３に述べられている。Ｂａｂ
Ａ、ＨｐａＡ及びＯｍｐ １８という用語が、完全長ポリペプチドだけでなく、そのいか
なる免疫原性フラグメント又はペプチドも包含することは本発明の範囲内である。Ｈｐａ
Ａは、推定上のＮ−アセチルノイラミニルラクトース結合赤血球凝集素であり、Ｂａｂ
Ａは、ルイス血液型抗原に結合する接着タンパク質である。他の抗原ならびに好ましくは
タンパク質及びポリペプチド、及びそれらのそれぞれのフラグメントが、ピロリ菌に対す
る免疫応答を高めるために使用され得ることは了解される。それぞれ、本発明の１つの実
施形態において使用され得る好ましいタンパク質及びポリペプチドは、典型的にはピロリ
菌の外形質膜に組み込まれ、及び例えばイオン輸送、接着、構造的及び浸透圧安定性、及
び細菌ビルレンスのために重要である、外膜タンパク質である。

ピロリ菌から採取でき、本発明による免疫原性組成物の一部であり得るさらなる抗原は
、米国特許出願公開第２００７００４２４４８号に記載されているものである。

不活化形態のＨＰＧＧＴ及び野生型ＨＰＧＧＴを含む、本発明のポリペプチド及びタン
パク質、並びに動物又はヒトの身体への投与用のここで述べるいずれかの他の化合物は、
好ましくは製剤されることが認識される。そのような製剤は当業者に公知である。１つの
実施形態では、製剤は米国特許第６，８３８，０８９号に述べられているものである。こ
の米国特許に述べられている製剤は、複数のポリマー粒子を含む送達システムであって、
水不溶性タンパク質抗原がそのポリマー粒子と共に組み込まれており、ポリマー粒子は、
１又はそれ以上のホモポリマー及び／又はコポリマーを含むマトリックスポリマーであり
、その方法は以下を含む：（ａ）タンパク質のような水不溶性物質及びその臨界ミセル濃
度の０．１〜１００倍の濃度の１又はそれ以上の親水性界面活性剤を含む水相（Ｗ）を、
タンパク質抗原を変性させない有機溶媒中にマトリックスポリマーを含む有機相（Ｏ）と
混合して、Ｗ／Ｏ乳剤を生成すること、但しＯはＷと不混和性であり、Ｗ又はＯ又はその
両方が、可溶化剤の存在下でＷ／Ｏ乳剤を安定化し、工程（ｂ）の間のポリマー粒子内へ
の水不溶性タンパク質の組込みを促進するために混合の前に添加される１又はそれ以上の
安定剤をさらに含む、及び（ｂ）乳剤を液体媒質に分散させることによって前記Ｗ／Ｏ乳
剤の液滴を形成し、Ｗ／Ｏ乳剤液滴のＯ相から前記溶媒を除去して、水不溶性タンパク質
抗原を組み込んだポリマー粒子を形成すること。

さらなる実施形態では、ここで述べる作用物質及び化合物のための製剤及び送達物質は
、米国特許第６，３７２，２６０号に述べられているようなミクロスフェアシステムであ
る。

本発明の１つの側面では、本発明によるポリペプチド、不活化形態のＨＰＧＧＴ、抗体
、スピーゲルマー及びアプタマー、本発明に従ってこれらのいずれかを含む免疫原性組成
物、医薬組成物は、好ましくはピロリ菌によって引き起こされる又はピロリ菌に関連する
、より好ましくはピロリ菌感染によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療におい
て使用される。１つの実施形態では、疾患は、ピロリ菌感染によって引き起こされる胃十
二指腸障害である。さらなる実施形態では、疾患は、胃炎、特に慢性胃炎である。慢性胃
炎は、胃又は十二指腸潰瘍、さらには胃癌及びＭＡＬＴリンパ腫の病因に関与するので、
本発明の方法及び上記作用物質はこれらの疾患を予防するために使用できる。また、例え
ば胃及び十二指腸潰瘍疾患及び（ＭＡＬＴ）リンパ腫を治療するためにも使用できる。本
発明によれば、一般的用語「治療」は、明白に異なる定義が為されない限り、病的障害の
何らかの形態の治療・治癒（ｃｕｒｉｎｇ）、緩和、診断又は予防として使用される。

本発明のさらなる態様では、及びリンパ球増殖、特にＴ細胞増殖へのその抑制作用に関
して、ＨＰＧＧＴは宿主において免疫抑制を引き起こし、したがって新規免疫抑制剤とし
て適用され得る。免疫抑制剤は、例えば移植後の臓器移植拒絶反応の危険性を低減するた
め、又は慢性関節リウマチ、クローン病又はアトピー性湿疹のような自己免疫疾患の治療
のために使用できる。ＨＰＧＧＴの触媒活性は、γ−グルタミルのための供与体／受容体
として機能するためにグルタミンの存在を必要とする。そこで、ＨＰＧＧＴを含有する免
疫抑制剤組成物は、好ましくはグルタミンをさらに含む。

さらに、発明者は、リンパ球増殖アッセイのために適用される細胞培養基の、グルタミ
ン、ロイシン及びヒスチジン及び活性ＨＰＧＧＴとのプレインキュベーションが、ＨＰＧ
ＧＴがその後不活性化されたときでも、Ｔ細胞に対する抗増殖作用を示すことを明らかに
することができた。よって、免疫抑制作用はＨＰＧＧＴ依存性であると結論された。しか
しながら、酵素反応のまだ同定されていない直接又は間接産物が作用の形態に関わってい
る。したがって、本発明の１つの実施形態は、好ましくは医薬的に許容されるインキュベ
ーション培地内で、ＨＰＧＧＴとグルタミン、ロイシン及びヒスチジンをインキュベート
し、ＨＰＧＧＴ特異的反応を可能にすることによって得られる免疫抑制組成物に関する。
この反応の上清は、その後、適切な免疫抑制組成物として適用され得る。好ましくは、こ
の組成物は、そのような基質へのグルタミンの転移によって生成されるグルタミル−ペプ
チド、例えばポリ−グルタミル−グルタメート又はグルタミル誘導体を含む。

この態様に関して使用されるＨＰＧＧＴが、ここで述べる特異的酵素活性を有する何ら
かのＨＰＧＧＴであることは本発明の範囲内である。ＨＰＧＧＴという用語が野生型ＨＰ
ＧＧＴ、完全長ＨＰＧＧＴ及び何らかの誘導体、より詳細にはこの種の酵素活性を有する
何らかのフラグメントを包含する。そのような誘導体及びフラグメントは、当分野におい
て周知の方法を使用することにより、当業者によって生産され得る。

ここで好ましく使用されるように、リンパ球の増殖を促進するという用語は、好ましい
実施形態では、リンパ球の活性化及び増殖を促進することを意味する。

さらなる態様では、本発明は、ＨＰＧＧＴ、より詳細には分泌配列（シグナルペプチド
）を欠く又は非機能性の分泌配列を有する組換えＨＰＧＧＴを生産する方法に関する。機
能的分泌配列、すなわちアミノ酸１〜２６、２６位と２７位の間の切断部位：ＬＳＡ−Ａ
Ｓを欠くそのようなＨＰＧＧＴは、そのようなＨＰＧＧＴが宿主細胞における生産の間に
そのような宿主細胞から分泌されない限りにおいて好都合である。この態様に関して、宿
主生物は、好ましくは大腸菌のような原核生物であるが、それらに限定されない。

当業者は、機能的分泌配列を欠くそのようなＨＰＧＧＴを作製する方法を認識する。例
えばこれは、タンパク質をコードする遺伝子を分泌リーダー配列なしで発現することによ
って達成され得る。そのような改変されたＨＰＧＧＴタンパク質はまだその宿主細胞内に
とどまり、それにより、そこから精製することができる。

さらなる態様では、本発明は、抗体の作製のための本発明によるポリペプチド及び本発
明に従った不活性ＨＰＧＧＴの使用に関する。密接に関連する態様では、抗体の作製のた
めに動物を免疫化するため、及び当業者に公知であるように、ハイブリドーマ細胞系の作
製のためにそれぞれスターター細胞及び細胞系を提供するために使用される。そのような
ハイブリドーマはさらに培養され、さらに選択され得ることが当業者に認識される。した
がって、本発明によるポリペプチド及び本発明による活性及び不活性ＨＰＧＧＴが、本発
明によるポリペプチド及び本発明による不活性ＨＰＧＧＴに対する及び／又はそれらと特
異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定するためのスクリーニングア
ッセイにおいて使用されることも本発明の範囲内である。詳細には、ハイブリドーマは、
ＨＰＧＧＴの触媒及び阻害機能を無効にする抗体を産生するハイブリドーマを同定するた
めにＨＰＧＧＴ活性アッセイをスクリーニングに適用することによって選択され得る。

さらなる態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド及び本発明による不活性ＨＰ
ＧＧＴをコードする核酸に関する。そのような核酸を発現する宿主生物における遺伝暗号
、及び場合によりコドン使用頻度を知ることにより、当業者がそのような核酸を作製し得
ることは当業者に認識される。さらなる態様では、核酸は、ベクター、好ましくは発現ベ
クター内に含まれる。１つの実施形態では、ベクターという用語は、プラスミド、コスミ
ド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子工学の分野で通常使用される他のベクター
を含む。尚さらなる態様では、本発明は、そのようなベクターを含む宿主生物に関する。
１つの実施形態では、宿主生物、特に宿主細胞は、本発明の核酸分子又はベクターを一過
性に又は安定に含む組換え宿主細胞である。宿主細胞又は宿主生物は、インビトロで組み
換えＤＮＡを受け入れることができ、場合によっては、本発明の核酸分子によってコード
されるタンパク質を合成することができる生物であると理解される。好ましくは、これら
の細胞は、原核又は真核細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、昆虫細胞又は酵母細胞で
ある。本発明の宿主細胞は、好ましくは本発明の導入核酸分子が形質転換細胞に対して異
種である、すなわち天然ではこれらの細胞において生じない又は対応する天然に生じる配
列とは異なるゲノム内の位置に局在するという事実によって特徴づけられる。

本発明のさらなる実施形態は、ＨＰＧＧＴ、好ましくは通常生じる分泌配列が除去され
ているか又は非機能性であるＨＰＧＧＴの生物学的性質を示し、及び本発明の核酸分子に
よってコードされる単離タンパク質、並びに、例えば本発明の宿主細胞を、前記タンパク
質の合成を可能にする条件下で培養し、その後タンパク質を培養細胞及び／又は培養基か
ら単離することによる、前記タンパク質の生産のための方法に関する。組換え生産された
タンパク質の単離と精製は、分取クロマトグラフィー、及びモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを含むアフィニティー及び免疫学的
分離を包含する従来の手段によって実施される。ここで使用されるように、「単離タンパ
ク質」という用語は、それが天然に結合している他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物
又は他の物質を実質的に含まないタンパク質を包含する。そのようなタンパク質は、しか
し、組換え生産されたタンパク質を含むのみならず、単離された天然に生じるタンパク質
、合成生産されたタンパク質又はこれらの方法の組み合わせによって生産されたタンパク
質を包含する。そのようなタンパク質を作製するための手段は当分野において広く理解さ
れている。本発明のタンパク質は、好ましくは実質的に精製された形態である。

そこで、本発明はまた、原核又は宿主細胞において、外部から適用されたとき前記細胞
に対して有害であるタンパク質を作製する一般的方法であって、（ａ）分泌シグナル配列
を欠失している又は非機能性分泌シグナル配列を有する前記タンパク質をコードする核酸
配列でトランスフェクトした宿主細胞を、前記タンパク質が発現される条件下で培養する
ことと、（ｂ）前記タンパク質を細胞から回収することと、を含む方法に関する。これは
また、前記細胞から回収され得る、本発明によるポリペプチドをコードする核酸でトラン
スフェクトした宿主細胞にも当てはまる。

本発明による抗体、アンチカリン、ペプチドアプタマー、アプタマー及びスピーゲルマ
ーが、好ましくはヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧ
ＧＴ）に対するリガンドとみなされ得ることは了解される。

本発明の範囲内で、野生型ＨＰＧＧＴという用語又は同様の表現は、好ましくは、分泌
配列を欠くが触媒的に活性である、より詳細にはＨＰＧＧＴに関してここで述べる酵素反
応を触媒する、野生型のＨＰＧＧＴを指す。

本発明を、ここで図面及び実施例によってさらに説明し、それらからさらなる特徴、実
施形態及び利点が理解され得る。

図１Ａは、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．及びＢｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．^９，１０に従った、分子量３０〜６６ｋＤａを有するピロリ菌からの分泌タンパク質を示す表である。図１Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーからの溶出分画中のタンパク質を示す銀染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、ｂ−ｆの分画だけがヒトＴ細胞の増殖を阻害し、他のすべての分画は増殖を阻害しなかった。分画の阻害プロフィールに対応するタンパク質バンドを矢印で示す。図１Ｃは、実施例１で述べる分光光度アッセイによって測定したゲルろ過分画の酵素ＧＧＴ活性を示す棒グラフである。（ＨＰ＝ピロリ菌） ^３Ｈ−チミジン取込みアッセイによって測定した、指示されているＨＰＳＮの存在下又は不在下での刺激ＰＢＭＣ（Ａ）及び単離一次ヒトＴリンパ球（Ｃ）の細胞増殖を示す棒グラフである。構築したノックアウト菌株のＧＧＴ表現型を、酵素活性アッセイ及び大型ＧＧＴサブユニットに対して惹起したポリクローナル抗体を使用した免疫ブロット法によって確認した（Ｂ）。免疫ブロット法のためにＨＰＳＮのタンパク質３０μｇを使用した。抗ＶａｃＡ抗体による免疫ブロットを負荷対照として使用した（挿入図参照）。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。^＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．００１を有意とみなした。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型） 図３Ａ及び図３Ｂは、ＧＧＴの大型サブユニットに対する抗ＧＧＴ抗体による精製組換えＨＰＧＧＴ分画の銀染色（Ａ）及び免疫ブロット法（Ｂ）後のゲルがＧＧＴのプロセシングを示すことを明らかにする。星印は以下を示す：^＊＊＊プロ形態、^＊＊大型及び^＊小型サブユニット。図３Ｃ〜図３Ｅは、大腸菌において発現された組換えＨＰＧＧＴ（ｒＨＰＧＧＴ）によるヒトＰＢＭＣの酵素活性（Ｃ）及び増殖阻害（Ｄ）を示す棒グラフである。対照として使用した大腸菌からのＬＰＳはＰＢＭＣの増殖を阻害しなかった。組換えＨＰＧＧＴは、ｐＨ２〜１０で触媒活性を示した（Ｅ）。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。^＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．００１を有意とみなした。（ＦＴ＝フロースルー、ＨＰ＝ピロリ菌） ウマ腎臓からの精製ＧＧＴは触媒ＧＧＴ活性を示すが（Ａ）、リンパ球に対する増殖阻害作用を欠く（Ｂ）ことを示す棒グラフである。Ｓｅｒ４５１／４５２（Ｓ４５１／４５２Ａ）における組換えＨＰＧＧＴの部位指定突然変異誘発は、ＧＧＴ酵素活性（Ａ）及び阻害作用（Ｂ）を無効にした。３７℃で２時間のアシビシン（５０μＭ）とＨＰＷＴＳＮのプレインキュベーションは、ＧＧＴ活性（Ｃ）及びＰＢＭＣ増殖の阻害（Ｄ）を無効にした。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。^＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値＜０．０５を有意とみなした。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型） 実施例で述べるように２４時間後にＥＬＩＳＡによって測定したＰＢＭＣによるサイトカインＩＬ−２（Ａ）及びＩＦＮ−γ（Ｂ）の産生を示すグラフである。データは３回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）を示す。^＊スチューデントｔ検定によって決定したＰ値を示す。 指示されているように２４時間処理し（灰色の曲線）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色したジャーカットＴ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。アポトーシスしたジャーカットＴ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析によって１００００事象を取得して測定した。陽性対照として使用した抗癌剤、スタウロスポリン（白色の曲線）は、１μＭの濃度でアポトーシスを強力に誘導した。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＷＴ＝野生型） 指示されているＨＰＳＮと共に又はＨＰＳＮなしで２４時間処理したジャーカットＴ細胞の細胞周期分析の結果を示す。Ｇ１期（左下）、初期及び後期Ｓ期（左上及び右上）及びＧ２期（右下）の細胞のパーセンテージが示されている（ｙ軸：ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ；ｘ軸：ＰＩ）。細胞周期調節タンパク質の細胞レベルを同じ細胞において免疫ブロット法によって測定した。 種々の濃度のＨＰＷＴ及びＨＰΔＧＧＴＳＮ又はｒＨＰＧＧＴと共に２４時間及び４８時間インキュベートし、その後溶解した１０^７ＰＢＭＣから得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。全タンパク質３５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロット法によって分析した。指示されているタンパク質のレベルを、対応する抗体を用いて測定した。データを２回再現し、同様の結果を得た。（ＨＰ＝ピロリ菌、ＳＮ＝上清、ＷＴ＝野生型） ピロリ菌陽性（レーン１〜９）及び陰性（レーン１０〜１４）患者からの血清の免疫ブロットであり、患者を、実施例１で述べるように免疫ブロット法によってＨＰＧＧＴに対する抗体の存在に関して試験した。ウサギ抗ＧＧＴ抗体（αＧＧＴ）を陽性対照として使用した。星印は以下を示す：^＊＊＊ＨＰＧＧＴタンパク質のプロ形態及び^＊＊大型サブユニット。 ＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖の阻害がグルタミンに依存し、グルタメート又はｇ−グルタミルグルタミンによって又はグルタミン枯渇によって媒介されるのではないことを示す棒グラフである。ＰＢＭＣをＰＭＡ／イオノマイシンで刺激し（基礎を除くすべて）、指示されているように処理した。２μｇ／ｍｌで使用したＲｅｋ．ＨＰＧＧＴを２４時間後に不活化した。次に培地を交換し、ＨＰＧＧＴ処理した培地を刺激後のＰＢＭＣに添加した。グルタミンを同時に（図示しない）又はグルタミン枯渇の可能性を検討するために２４時間後に２ｍＭで添加した。阻害作用の可能性を検討するためにＰＢＭＣ刺激後にグルタメート又はｇ−グルタミルグルタミンを添加した。グルタミンに対する阻害作用の依存性を示すためにグルタミンを含まない（ｗ／ｏ）アミノ酸を使用した。 ＨＰＧＧＴの酵素活性に対する免疫化された又は感染マウスからの血清の阻害作用を示すグラフである。マウスを指示されている製剤で免疫するか又は対照としてＰＢＳを与えるか又は生ピロリ菌に感染させた。免疫化又は感染の６週間後に尾静脈から血清を採取し、ＧＧＴ触媒活性に対する阻害活性に関して検定した。ＣＴ＿ＧＧＴ、可溶性ＣＴ及び不活性ＧＧＴタンパク質、［ＣＴ＿ＧＧＴ］ｅｎｃ、ＣＴ及び不活性ＧＧＴタンパク質は、ミクロスフェアに封入された。

実験材料及び方法
細菌培養。この試験で使用したピロリ菌野生型株Ｇ２７ ＷＴ（ｖａｃＡ^＋ｃａｇＡ^＋
）はＡ．Ｃｏｖａｃｃｉ（ＩＲＩＳ，Ｓｉｅｎａ，Ｉｔａｌｙ）より入手した。細菌を、
先に述べられているように^２９Ｄｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｍｉｘ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したウィルキンス‐チャル
グレン（Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ）又はブレインハートインフュージョン（Ｂ
ｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ−Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ＢＨＩ）プレートで培養した。ＨＰの液体
培養を、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１％Ｄｅｎｔ
ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加したＢＨＩブロにおいて実施した。ＨＰ上清の生成のため
に、細菌をプレートで４８時間増殖させ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１
のＯＤ_{６００ｎｍ}（約２×１０^８細菌／ｍｌに相当する）に調整した。細菌を、微好気的
条件下で強く振とうしながらＰＢＳ中で２時間インキュベートし、その後の、細菌と膜を
除去するための３０００×ｇ及び１００００×ｇでの遠心分離工程によってペレット化し
た。その後、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて上清を濃縮した。上清の総
タンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを標準品としてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）によって測定し、−
８０℃で保存した。大腸菌をルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌ
ａｎｄ，ＯＨ）で培養し、液体培養については適切な抗生物質を添加したＬＢブロス（Ｕ
ＳＢ）中で培養した。

ピロリ菌上清のゲルろ過クロマトグラフィー。ピロリ菌野生型株Ｇ２７からの上清を上
述したように調製した。サイズ排除クロマトグラフィーを以前に述べられているように^３
実施した。簡単に述べると、タンパク質５００μｇをＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／
３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に負荷し
、４℃にて脱気したＰＢＳで溶出した。標準タンパク質α−アミラーゼ（２００ｋＤａ）
、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）及
びカルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を溶出タンパク質の分子量評価のために使
用した。各々の分画を増殖阻害及び以下で述べるＧＧＴ活性に関して試験した。

ＧＧＴ突然変異株の作製。ＧＧＴ ｋ．ｏ．プラスミドを自然形質転換によってピロリ
菌株Ｇ２７に形質転換した。形質転換体を、２５μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）
を含む寒天プレートでインキュベートした。３日後、クローンを採取し、カナマイシンを
含む新鮮寒天プレートに塗布した。プラスミドの挿入を、細菌ＤＮＡのＰＣＲ（プライマ
ー：センス５’−ＡＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧＡＴＡＧ−３’（配列番号
６）；アンチセンス５’−ＧＡＣＣＧＧＣＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＴＴＴＧＡＴＡＧ−３’
（配列番号７））及びピロリ菌△ＧＧＴ上清からのタンパク質のウエスタンブロット法に
よって確認した。

細胞培養。末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）の単離を以前に述べられているように^３実施し
た。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。ジャーカットＴ細胞及び
ＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌ
ｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養した。ＥＬ−４ Ｔ細胞を、１０％ウマ血清（Ｃａ
ｍｂｒｅｘ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）で培養した。

一次ヒトリンパ球の単離。一次ヒトＴ細胞を、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄ
ｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の指示に従って使用して、ピロリ菌非感染健常志願
者からのバフィーコート又はヘパリン化末梢静脈血から陰性選択によって単離した。

細胞増殖アッセイ。細胞（１０^５ＰＢＭＣ、精製一次Ｔ細胞又は１０^４ジャーカット／
ＥＬ−４細胞／穴）を９６穴平底プレートにて完全培地中で培養した。ＰＢＭＣをＰＭＡ
（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）及びイオノマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）
で３回刺激し、すべての細胞を、指示されている総タンパク質濃度のピロリ菌上清又は組
換えタンパク質と共に又はそれらなしで増殖させた。一次ヒトＴ細胞を、上述したように
ＰＭＡ／イオノマイシンで又は１ビーズ／Ｔ細胞の抗−ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激した。細胞増殖を、４８時間後にＰａｃｋａｒｄ Ｄｉｒｅｃｔ
Ｂｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍａｔｒｉｘ ９６００（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ Ｃｏ．，Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用してメチル−［^３Ｈ
］−チミジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）取込みによって測定した。

組換えタンパク質の作製。ピロリ菌のＧＧＴタンパク質を、製造者の指示に従って（Ｑ
ｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）６×Ｈｉｓタグタンパク質として発現させ
た。ピロリ菌からのＧＧＴタンパク質のコード領域をＰＣＲ（プライマー センス：５’
−ＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）；アンチ
センス：５’−ＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号
９））によって増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲル抽
出（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。それを次にＮｃｏＩとＫｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で制限し、続いて再精製後にｐＱＥ
−Ｔｒｉ Ｓｙｓｔｅｍベクター（Ｑｉａｇｅｎ）に連結した。生じたベクターを大腸菌
株Ｍ１５に形質転換した。１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）及び２５μｇ／
ｍｌカナマイシンを添加したＬＢブロスに形質転換細菌の一晩培養物を接種し、ＯＤ_６０
０が０．６に達するまで強く振とうしながら３７℃で増殖させた。最終濃度１ｍＭのイソ
プロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒ
ｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加することによって組換えＨＰＧＧＴの発現を誘導
し、封入体の量を最小限に抑えるために２５℃で４時間実施した。その後全培養物を４℃
で１０分間遠心分離した（５０００×ｇ）。非変性条件下での溶解のために、ペレットを
、プロテアーゼ阻害剤（Ｈｉｓタグタンパク質のためのプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｓ
ｉｇｍａ）を含む氷冷結合緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２
０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４）に可溶化した。次に液体Ｎ_２中での２
回の凍結／解凍サイクル及びその後の氷上での超音波処理（氷上で５分間の休止をはさん
で１分間の超音波処理を２回）によって細胞を溶解した。１０分間の遠心分離（４℃で１
７５００×ｇ）後、上清をＤＮＡ及びＲＮＡ消化に供した。さらなる遠心分離工程（４℃
、２２０００×ｇで１０分間）後、上清を精製のために調製した。最初の精製工程では、
５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。室温で
精製を実施し、全体を通じて試料を氷上に保持した。大腸菌の溶解産物を１ｍｌ／分でＮ
ｉ−セファロースカラムに負荷し、フロースルーを収集した。試料負荷後、カラムを１０
カラム容量（ｃｖ）の結合緩衝液、１０ｃｖ洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、９０
０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）及びもう一度１０ｃｖ結合緩衝
液で洗浄した。結合タンパク質を、段階イミダゾール勾配（１００ｍＭ段階）を用いて溶
出緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００〜１０００ｍＭイミ
ダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出液を勾配の段階につき１分画で収集した。次に
各々の分画をＧＧＴ酵素活性に関して試験し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット分析に
供した。組換えＨＰＧＧＴのさらなる精製のために、Ｎｉ−セファロースアフィニティー
クロマトグラフィーからの酵素的に活性な分画をプールし、４℃で２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ ｐＨ７．５に対して透析して、２回目の精製工程に供した。透析した試料をＡｆｆｉ
−Ｇｅｌ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ）カラム（ｃｖ：１２．３ｍｌ）に負荷
した。カラムを２ｃｖの結合緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を、段階ＮａＣｌ勾配（５
０ｍＭ段階）を用いて溶出緩衝液（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０〜１０００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．５）で溶出した。収集したすべての分画を、抗ＧＧＴ抗体（以下参照）を
用いた免疫ブロット法によって又はＧＧＴ酵素活性アッセイ（以下参照）によって組換え
ＨＰＧＧＴの存在に関して分析した。活性分画をプールし、４℃で９０分間、２０ｍＭト
リス／ＨＣｌ ｐＨ７．５に対して透析して、アリコートに分け、さらなる使用時まで−
８０℃で保存した。

部位指定突然変異誘発。ＨＰＧＧＴの部位指定突然変異誘発を、製造者のプロトコール
に従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ 部位指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。プライマー配列は
以下の通りであった：Ｓ４５１／４５２Ａセンス：５’−ＣＣＡＡＴＡＡＧＣＧＣＣＣＴ
ＴＴＡＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＴＴＧＴＧ−３’（配列番号１０）；Ｓ
４５１／４５２Ａアンチセンス：５’−ＣＡＣＡＡＴＣＧＴＡＧＧＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧ
ＧＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＣＴＴＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１１）。突然変異誘発の成功
を配列決定によって確認した。

免疫ブロット法。免疫ブロット分析のために１０^７ジャーカットＴ細胞又はＰＢＭＣを
使用した。実験の前に、ジャーカット細胞を、０．２％ＦＣＳを含む培地で１８時間血清
飢餓させた。その後、１０％ＦＣＳで細胞を放出させ、記述されているように処理した。
指示されている時点で、細胞を採集し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄して、プロテアーゼ阻害剤
（２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ β−グリセロリン酸、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ
_４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ）を含む１×溶解緩衝液
（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）に再
懸濁し、氷上で３０秒間、マイクロチップソニファイアーで超音波処理した。溶解産物を
４℃で１０分間、１００００×ｇで遠心分離し、上清を免疫ブロット法のために使用した
。等量のタンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した、ＢｉｏＲａｄ）をト
リシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に電気
転移した。検出のために、膜を一次抗体、抗ｐ２７、抗サイクリンＤ３、抗サイクリンＥ
、抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗Ｃｄｋ２（Ｓ
ａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）、抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ ４７３）、抗ホスホｃ−Ｒａｆ（Ｓｅｒ ３３８）、
抗ホスホｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ ３８９；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホＦ
ＫＨＲＬ１／Ｆｏｘｏ３（Ｔｈｒ ３２；Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，Ｎ
Ｙ）、抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）及び抗ＶａｃＡ（Ａｕｓｔｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌｓ，Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）でプローブした。適切なペルオキシダーゼ結合二次抗
体（Ｄｉａｎｏｖａ）及び化学発光試薬（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）を用いて一次抗体の結合を明らかにした。ＨＰＧＧＴタンパク質の大型サ
ブユニットの検出のために、ＨＰ １１１８遺伝子産物のアミノ酸残基３５６〜３７１を
含む合成ペプチドＩＱＰＤＴＶＴＰＳＳＱＩＫＰＧＭ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｋ
ｉｓｓｌｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対して挙げられたポリクロナールウサギ抗ＧＧＴ抗
体を使用した。

血清ブロット法。ヒト血清におけるＨＰＧＧＴ特異的抗体の検出のために、精製組換え
ＨＰＧＧＴタンパク質０．１μｇを上述したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニ
トロセルロース膜に移した。膜をＰｏｎｃｅａｕ Ｓ溶液（０．２％Ｐｏｎｃｅａｕｓ
Ｓ、Ｈ_２Ｏ中３％トリクロロ酢酸）で染色し、細片に切断した。ブロッキング（１×ＴＢ
Ｓ＋５％低脂肪粉乳）後、各々の細片をそれぞれピロリ菌感染患者及び非感染患者の血清
（ブロッキング緩衝液で１：２００００希釈）と共に４℃で攪拌しながら一晩インキュベ
ートした。洗浄後、膜細片をＨＲＰ結合抗ウサギ二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ；１：１００
００希釈）と共にインキュベートし、最後に、再度の洗浄工程後、ＨＰＧＧＴタンパク質
への血清抗体の結合を上述したような化学発光反応によって明らかにした。患者のピロリ
菌感染の状態を従来のピロリ菌ＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて評価した。

細胞周期分析。分析の前に、ジャーカットＴ細胞（５×１０^６細胞／分析）を、０．２
％ＦＣＳを含む培地で１８時間血清飢餓させた。１０％ＦＣＳで細胞を放出させ、指示さ
れているピロリ菌株の上清で２４時間処理した後、ＦＩＴＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者のプ
ロトコールに従って、ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ／ＰＩ（Ｓｉｇｍａ）染色によって細胞周期分
析を実施した。その後の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析において、Ｂｅｃｔｏ
ｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して１００００事
象を取得した。Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエアパッケージ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ）を用いてデータを解析した。

γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性アッセイ。ＧＧＴ活性についての
アッセイを、Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．^２７の方法から適合させた。簡単に述べると
、受容体としての２０ｍＭグリシルグリシン（Ｓｉｇｍａ）、供与体基質としての２．５
ｍＭ Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｃｈｗａｌ
ｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）から成る反応
緩衝液を調製した。一部の実験では、アッセイ緩衝液のｐＨを２〜１０の間で変化させた
。種々のピロリ菌株、精製組換えＨＰＧＧＴ又はウマ腎ＧＧＴ（Ｓｉｇｍａ）の上清を添
加し、３７℃で３０分間反応を進行させた。ｐ−ニトロアニリドの放出を４０５ｎｍで分
光光度法によって観測した。活性の１単位は、３７℃で１分当たり及びタンパク質１ｍｇ
当たりにｐ−ニトロアニリド１μｍｏｌを放出する酵素の量と定義した。

ＥＬＩＳＡ。ＰＢＭＣ（各々５×１０^５）を表示されているように２４時間処理した。
指示されている時点で遠心分離によって細胞を除去し、上清を、ＥＬＩＳＡにより製造者
の指示に従ってＩＬ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＩ
ＦＮ−γ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の量に関して分析
した。検出の下限は４ｐｇ／ｍｌであった。

アポトーシスの分析。５×１０^５のジャーカットＴ細胞を指示されているように処理し
た。２４時間後、細胞を遠心分離によって採集し、洗浄して、アネキシンＶ結合緩衝液（
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ Ｃ
ａＣｌ_２）５００μｌに再懸濁し、暗所にて室温で組換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｃａ
ｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）５μｌ及び０．５μｇ／ｍｌ ＰＩで各々１０
分間染色した。アポトーシス細胞をＦＡＣＳ分析によって測定した（上記参照）。Ｃｅｌ
ｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエアを用いてデータを解析した。

統計。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として提示している。統計解析のためにスチ
ューデントｔ検定を使用した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。

ピロリ菌の推定上のＴ細胞増殖阻害タンパク質としてのＧＧＴの同定
ピロリ菌から分泌される低分子量タンパク質はＴリンパ球の増殖を阻害することが以前
に示された^３。免疫抑制因子を同定するため、ピロリ菌株Ｇ２７からの上清に関するサイ
ズ排除クロマトグラフィーを実施した。先の研究と一致して、３０〜６６ｋＤａの分子量
で溶出する分画だけがリンパ球の増殖を阻害し、他のすべての分画はリンパ球の増殖を阻
害しなかった（データは示していない）。

２つの独立したグループが以前に、種々のプロテオミクス手法によって分泌ピロリ菌タ
ンパク質の体系的分析を実施した^９，１０。これらのデータを使用して、３０〜６６ｋＤ
ａの分子量を有するすべての分泌ピロリ菌タンパク質を列挙した（図１Ａ）。得られたク
ロマトグラフィー分画のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によってさらに分析し
た（図１Ａ）。分画の阻害活性プロフィールに一致する溶出プロフィールを示す、３０〜
６６ｋＤａの大きさの４つの潜在的候補物質を認めた（図１Ｂ；矢印で示している）。阻
害分画中の他のすべてのタンパク質バンドは非阻害分画にも存在し、したがってＴ細胞増
殖の阻害の原因ではあり得なかった。４つの候補タンパク質のうち２つの分子量は（図１
Ｂ）、分泌ピロリ菌タンパク質γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ、ＨＰ１１
１８）のフラグメントに対応する。６０ｋＤａの１番目のバンドはＧＧＴのプロ形態（分
子量６１ｋＤａ）を示すと考えられ、３８ｋＤａの他方のバンドはＧＧＴの大型サブユニ
ットを示すと考えられる^１１。これらの上清分画における触媒的に活性なＨＰＧＧＴの存
在を調べるため、分光光度ＧＧＴ活性アッセイを実施した。図１Ｃは、リンパ球増殖を阻
害する分画（ｂ−ｆ）だけが同時にＧＧＴ活性を示すことを明らかにする。

ＧＧＴ欠損ピロリ菌突然変異化物はＴ細胞増殖を阻害する能力を欠く。
ＧＧＴが認められたリンパ球増殖阻害の原因であるかどうかを判定するため、ピロリ菌
の同系ＧＧＴノックアウト突然変異株を作製した。突然変異株は、他のグループによって
述べられているようにインビトロで正常に増殖し、ＧＧＴがピロリ菌の生存のために必須
ではないことを示唆した^{１１、１２、１３}。これらの突然変異株の上清を、対応する野生
型菌株と比較して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した単離ヒト
Ｔ細胞及びＰＢＭＣに対するそれらの増殖阻害活性に関して試験した（図２Ａ、２Ｃ）。
野生型菌株と異なり、一次ヒトＴ細胞及びＰＢＭＣに対する△ＧＧＴ細菌の阻害潜在能は
完全に廃止された。ＧＧＴの自発的組換え及び活性化を排除するため、ＧＧＴ欠損細菌か
らの上清を、酵素活性を測定することによって及びＨＰＧＧＴの大型サブユニットに対し
て惹起したポリクローナル抗体を使用した免疫ブロット法によって確認した。負荷対照は
、野生型及びＧＧＴ欠損細菌からの上清において分泌ＶａｃＡタンパク質の存在を示す（
図２Ｂ）。したがって、ＧＧＴはヘリコバクターピロリによるＴ細胞増殖の阻害の原因で
ある。

組換えＨＰＧＧＴはリンパ球の増殖を阻害する。
認められた阻害がＨＰＧＧＴによってのみ媒介されることをさらに示すため、大腸菌に
おいて組換えＨｉｓタグＨＰＧＧＴタンパク質を発現させた。タンパク質を、「実験材料
及び方法」の章で述べたようにクロマトグラフィーによって精製し、均質にした。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び銀染色並びに免疫ブロット法は、組換えＨＰＧＧＴがプロ形態として合成
され、その後分子量約３８及び約２０ｋＤａの分子量を有する大形及び小型サブユニット
にそれぞれプロセシングされることを指示した（図３Ａ，Ｂ）。組換えタンパク質は強力
なＧＧＴ活性を示し（図３Ｃ）、ＰＢＭＣ増殖を効率的に阻害した（図３Ｄ）。加えて、
さらなる実験は、２〜１０のｐＨ範囲でＨＰＧＧＴの触媒活性を示し（図３Ｅ）、感染部
位における機能的酵素の存在を裏付けた。

ＨＰＧＧＴの阻害作用は触媒的ＧＧＴ活性に依存する。
ＧＧＴはまた、ヒトＴ細胞を含む哺乳動物細胞によっても発現されるので、哺乳動物Ｇ
ＧＴもリンパ球増殖を阻害するかどうかを判定することを試みた。ウマ腎からの精製ＧＧ
Ｔは触媒活性を示した（図４Ａ）。しかし、ＨＰＧＧＴと比較して４倍高い量のウマＧＧ
ＴはＰＢＭＣ増殖を阻害することができなかった（図４Ｂ）。ＧＧＴ触媒的トランスペプ
チダーゼ活性がＴ細胞増殖の阻害のために必要とされるかどうかを探索するため、我々は
組換えタンパク質の突然変異体を作製した。我々は、セリン残基４５１及び４５２のアラ
ニンへの突然変異誘発（Ｓ４５１／４５２Ａ）は組換えＨＰＧＧＴの酵素活性を完全に廃
止し（図４Ａ）、同時にリンパ球増殖の阻害も無効にする（図４Ｂ）ことを認めた。

これらの結果を確認するため、組換えＨＰＧＧＴ及びピロリ菌野生型株Ｇ２７からの上
清をＧＧＴ阻害剤、アシビシンと共にプレインキュベートした。この化合物は、ＧＧＴの
不可逆性で競合的な阻害剤として働く。アシビシンによるＧＧＴの阻害は、ＧＧＴの特定
ヒドロキシル基に結合した阻害種における酵素への結合後のその形質転換を含むことが示
された^{１４，１５}。酵素ＧＧＴ活性の測定及びリンパ球増殖の測定は、アシビシンによる
前処理がピロリ菌野生型上清によるＧＧＴ活性（図４Ｃ）及びＰＢＭＣ増殖の阻害（図４
Ｄ）を完全に抑制することを示した。同様の結果が組換えＨＰＧＧＴに関して得られた（
データは示していない）。

ＨＰＧＧＴは、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの分泌を低下させることなく及びアポトーシス
を誘導することなくリンパ球増殖を阻害する。
これまで、宿主の免疫応答の抑制におけるＨＰＧＧＴの役割については全く知られてい
なかった。ここで報告するＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖阻害は、ヒトＰＢＭＣのサイト
カイン分泌への干渉から生じると考えられる。この仮説を調べるため、細胞をＰＭＡ及び
イオノマイシンで刺激し、種々の濃度のピロリ菌野生型及び△ＧＧＴ上清又は組換えＨＰ
ＧＧＴと共に又はそれらなしで２４時間インキュベートした。刺激した対照と比較して、
これらの処理のいずれもが、リンパ球の増殖のために必須であることが知られる、ＩＬ−
２分泌の低下を導かなかった（図５Ａ）。加えてＩＦＮ−γの分泌も低下しなかった（図
５Ｂ）。したがって我々は、ＨＰＧＧＴによるＴ細胞増殖の阻害がこれらの細胞の活性化
低下によって引き起こされるのではないことを示す。これまでの報告は、胃上皮細胞での
ＨＰＧＧＴによる酸化的ストレス及びアポトーシスの誘導を示唆した^{１２，１６}。しかし
、ピロリ菌からのＧＧＴのリンパ球に対する作用については不明である。

さらなる報告は、ピロリ菌によるＴ細胞でのアポトーシスの誘導を、細菌によるＴ細胞
増殖の阻害についての機構として示唆した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ ２００１）。アポトーシスがここで述べるＨＰＧＧＴによるリンパ球増殖の低下の原
因である可能性を検討するため、ジャーカットＴ細胞を使用したアネキシンＶ−ＦＩＴＣ
／ＰＩ染色及びその後のＦＡＣＳ分析を実施した（図５Ｃ）。リンパ球増殖の強力な阻害
を引き起こす濃度で使用したピロリ菌野生型及び△ＧＧＴ株又は組換えＨＰＧＧＴからの
上清のいずれもが、アポトーシスの上昇を誘導しなかった。したがって、ＨＰＧＧＴによ
るＴ細胞増殖の排除はアポトーシス非依存性機構によって媒介される。

Ｔ細胞における細胞周期進行へのＨＰＧＧＴの作用
次に我々は、Ｔ細胞の増殖に関わる細胞過程へのＨＰＧＧＴの作用をさらに特性決定す
ることを試みた。ＢｒｄＵ／ＰＩ染色を用いた分析は、野生型によってジャーカットＴ細
胞におけるＧ１細胞周期の停止が誘導されるが、ピロリ菌からのＧＧＴ欠損上清では細胞
周期の停止が誘導されないことを示した（図６Ａ）。この停止は、ピロリ菌ＧＧＴの存在
下でのＧ１期の細胞の３５％から４６％への増加（図６Ａ；左下象限）を特徴とした。し
たがって、野生型による処理においてはＳ基の細胞の量（左上及び右上象限）が対照（基
礎、５５％）と比較して３８％に低下したが、ピロリ菌のＧＧＴ欠損上清では低下しなか
った。これと一致して、同じ試料の免疫ブロット分析は、細胞サイクリンＤ３並びにＥ１
タンパク質レベルの顕著な低下を明らかにした。加えて、Ｃｄｋ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐｌの
量がＧＧＴ依存的に増加した（図６Ａ）。１０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌのＨＰ野生型上
清で処理した細胞の間でのサイクリンタンパク質レベルの差は、リンパ球増殖に拮抗する
ためにはＧＧＴ活性の閾値を上回らなければならないことを指示する。これは明らかに、
上清中の総タンパク質１０μｇ／ｍｌの濃度に該当する。５μｇ／ｍｌというより低い濃
度では、ＧＧＴがリンパ球において細胞周期進行を阻害するためにより長い時間を要する
。組換えＨＰＧＧＴタンパク質を使用して、我々は２μｇ／ｍｌという低濃度でサイクリ
ンレベルの完全な低下を認めた。

これらの結果はヒトＰＢＭＣで確認され、ヒトＰＢＭＣは、組換えＨＰＧＧＴ又は種々
の濃度のピロリ菌野生型からの上清で処理したとき、同じ細胞周期調節タンパク質のさら
に強力な低下を示したが（図６Ｂ）、△ＧＧＴ株で処理したときには低下を示さなかった
。我々の結果は、ＧＧＴを、ピロリ菌によるＴリンパ球でのＧ１細胞周期停止の誘導の原
因となる因子として明らかに指し示す。

Ｔ細胞におけるＲａｓ依存性シグナル伝達へのＨＰＧＧＴの干渉
Ｒａｓ及びＰＩ３Ｋ依存性経路は、細胞周期進行の鍵となる調節因子である。これらの
経路はＴ細胞において互いに独立して進行することが示されているので^１７、我々は、両
方の経路の重要な成員の活性化状態へのピロリ菌上清並びに組換えＨＰＧＧＴの影響を検
討した。ジャーカットＴ細胞及びＰＢＭＣからの細胞溶解産物の免疫ブロット分析は、Ｐ
Ｉ３Ｋシグナル伝達の重要なメディエイターであるＡＫＴ、ｐ７０Ｓ６ｋ及びＦｏｘｏ
３の細胞レベル及びリン酸化がＨＰＧＧＴの存在下で低下しないことを示した（図６Ａ）
。これに対し、Ｒａｓ依存性経路の中心的メディエイターであるｃ−Ｍｙｃの細胞レベル
並びにｃ−Ｒａｆタンパク質のリン酸化は、同じ細胞においてＨＰＧＧＴの存在下で低下
した（図６Ａ、Ｂ）。

ＨＰ陽性患者の血清中のＨＰＧＧＴに対する抗体応答
ピロリ菌からのＧＧＴは細菌によって細胞外液中に分泌されることが示されたが（Ｂｕ
ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、このタンパク質が粘膜固有層中のＴ細胞に達してその免疫抑
制作用を及ぼすかどうかは不明である。この問題を調べるため、１４名の患者（ピロリ菌
感染患者９名と非感染患者５名）からの血清をＨＰＧＧＴ特異的抗体の存在に関して試験
した。結果は、ピロリ菌陽性患者でのＨＰＧＧＴのプロ形態及び大型サブユニットに対す
る強い抗体応答を示した（図７、１〜９）が、非感染患者では抗体応答を示さず（図７、
１０〜１４）、ヒト免疫系とＨＰＧＧＴの相互作用を示唆した。

免疫後のＨＰＧＧＴに対する阻害性免疫応答と感染後の免疫応答の不在
動物を、アジュバントとしてのＣＴと組み合わせた、ヘリコバクターピロリのγ−グル
タミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）の触媒中心から遠く離れた場所に位置するペ
プチド３５６ ＩＱＰＤＴＶＴＰＳＳＱＩＫＰＧＭ ３７１又は不活性組換えＨＰＧＧＴ
タンパク質のいずれかでワクチン摂取した。不活性形態のＨＰＧＧＴでワクチン接種した
動物においてのみ、標準ＨＰＧＧＴ活性化アッセイを用いて血清中の阻害抗体が検出可能
であった。緩衝液だけを摂取した対照動物、感染動物又はペプチド３５６〜３７１でワク
チン接種した動物では阻害性免疫応答は検出されなかった。これらの結果は、ＨＰＧＧＴ
に対する阻害性免疫応答が達成され得、抗原の選択に高度に依存することを実証する。さ
らに、ピロリ菌による感染はそのような阻害応答を惹起しない。

結果を図９に示す。

参考文献

数字を使用してここで参照する先行技術の資料は以下の通りであり、それらの全体が参
照によりここに組み込まれる。

本明細書、特許請求の範囲、及び／又は図面に開示された本発明の特徴は、個別でも、
またいずれかの組み合わせによっても、本発明を様々な形態で実現する材料であり得る。

Claims (13)

1. ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）の酵素的に不活性な形態を含む免疫原性組成物であって、
   前記ＨＰＧＧＴが、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列の４５１位及び４５２位のセリン残基が変化または欠失しており、かつ、（ｉ）ＨＰＧＧＴに対する阻害作用及び／又は（ｉｉ）リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む抗体応答を誘導する、免疫原性組成物。
2. ヘリコバクターピロリのγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＨＰＧＧＴ）の酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントを含む免疫原性組成物であって、
   前記ＨＰＧＧＴが、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有し、
   前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントが、前記ＨＰＧＧＴのアミノ酸位置４５１及び４５２を含む一続きの切れ目のないアミノ酸からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸配列の４５１位及び４５２位のセリン残基が変化または欠失しており、かつ、（ｉ）ＨＰＧＧＴに対する阻害作用及び／又は（ｉｉ）リンパ球増殖のＨＰＧＧＴ依存性抑制を無効にする作用を有する抗体を含む抗体応答を誘導する、免疫原性組成物。
3. 前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態又は前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４５１位及び４５２位のセリン残基がアラニンに置換されており、前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態又は前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントが、機能性の分泌配列を欠失している、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
4. 前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態又は前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントが、機能性の分泌配列を欠失している、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
5. 前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性な形態又は前記ＨＰＧＧＴの酵素的に不活性かつ免疫原性のフラグメントが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２６位のアミノ酸を欠失している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
6. １又は複数のアジュバントを含む請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性組成物。
7. ピロリ菌からの１又は複数の抗原を含む請求項１〜６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
8. 前記抗原が、外膜タンパク質を含む群から選択される請求項７に記載の免疫原性組成物。
9. 前記抗原が、ＨｐａＡ、Ｏｍｐ１８及びそれらの組み合わせを含む群から選択される請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. ワクチンとして製剤される請求項１〜９のいずれかに記載の免疫原性組成物。
11. ピロリ菌によって引き起こされる若しくはピロリ菌に関連する疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造における請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。
12. 前記疾患が、ピロリ菌による感染、ピロリ菌によって引き起こされる胃十二指腸障害、胃炎、慢性胃炎、胃もしくは十二指腸潰瘍、胃癌ならびに（ＭＡＬＴ）リンパ腫を含む群から選択される請求項１１に記載の使用。
13. 前記疾患が、ピロリ菌による感染である請求項１２に記載の使用。

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