WO2005075652A1

WO2005075652A1 - グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（改変ＧＧＴ）の製造方法

Info

Publication number: WO2005075652A1
Application number: PCT/JP2005/001533
Authority: WO
Inventors: Hideyuki Suzuki; Hidehiko Kumagai
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2004-02-03
Filing date: 2005-02-02
Publication date: 2005-08-18
Also published as: JPWO2005075652A1

Abstract

　生物界に広く分布している酵素であるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）を用いて、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ペプチド（即ち、改変ＧＧＴ）を製造することを本発明の課題とする。本発明に従って、ＧＧＴにおいて、１）γ−グルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は２）活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、からなる群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することによって、グルタリル−７−アミノセファロスポラン酸（ＧＬ−７−ＡＣＡ）アシラーゼ活性が増強された改変ＧＧＴを製造することができる。

Description

明細書

グルタリルー 7—アミノセファロスポラン酸（GL— 7— ACA)アシラーゼ活性が増強された改変 _Ίーグルタミルトランスぺプチダーゼ (B女変 GGT)の製造方法技術分野

[0001] 本発明は、 γ—ダルタミルトランスぺプチダーゼ（GGT)の 1又はそれ以上のアミノ酸残基を置換することを特徴とする、ダルタリルー 7—アミノセファロスポラン酸 (GL— 7— A CA)アシラーゼ活性が増強された改変 GGTの製造方法、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGT、該改変 GGTをコードする核酸分子、及び該改変 GG Tを発現している細胞に関する。さらに、本発明は、前記改変 GGTを用いて、 GL-7 ACAを処理し、セファロスポリン系（セフエム系）抗生物質の原料となる 7—アミノセファロスポラン酸（7— ACA)を製造する方法にも関する。

背景技術

[0002] 2002年の半合成セファロスポリンの販売額は、同年の医薬品の世界市場の総売り上げ約 4, 000億ドルのうちの 76億ドルを占め、抗生物質のなかで販売額の最も多い医薬品である。半合成セファロスポリンは、 7—アミノセファロスポラン酸（7— ACA) の 3位と 7位の側鎖を修飾することにより、生産されている。それゆえ、 7— ACAの効率的な生産は、製薬業界にとって極めて重大な関心事である。工業的には、カビの一種である Acremonium chrysogenumの発酵生産するセファロスポリン Cの 7位の側鎖を主として化学的に脱ァシルイ匕することにより生産されている。

[0003] し力しながら、化学的方法の場合、何段階もの複雑なプロセスを経ること、純度の高ぃセファロスポリンを必要とすること、特殊な条件 (例えば、低温)で反応を行うこと、毒性を持ったィ匕合物を使うこと、廃棄物として多量の化学物質が出ることなどの欠点がある。

[0004] そこで、半合成ペニシリンの中間体である 6—ァミノべ-シラン酸力ペニシリンを微生物由来のペニシリンアシラーゼで脱ァシルイ匕して工業生産されているのと同様、セファロスポリンアシラーゼを生産する微生物を見つけ、その酵素によりセファロスポリン Cを 7— ACAに変換する酵素法の開発が長く検討されてきた。セファロスポリン Cを直接脱ァシルイ匕する酵素も見つ力つている力セファロスポリン cを基質とした場合の活性は極めて低い。そこで、セファロスポリン Cをィ匕学的に GL— 7— ACAに変換した後、セファロスポリンアシラーゼで 7— ACAに脱ァシル化する方法が 1978年より工業化されていた (非特許文献 1)。一方、最近工業化されたバイオプロセスでは (非特許文献 2)、 D アミノ酸ォキシダーゼとセファロスポリンアシラーゼの 2種類の酵素が利用されている。このプロセスにおいて、セファロスポリン Cは D アミノ酸ォキシダーゼによりケトアジボイル 7— ACAに変換された後、この反応で副生した過酸ィ匕水素により非酵素的に GL— 7— ACAに変換される。ついで、 GL— 7— ACAはセファロスポリンァシラーゼにより脱ァシル化されて、 7— ACAになる。これらいずれのプロセスでも、効率的な変換を触媒するセファロスポリンアシラーゼが重要であり、広範なスクリーニングが行われてきたが、この活性を持った微生物は、限られた種類の細菌にしか見つかつていない。

[0005] 効率的な酵素法のために、多種多様な生物に存在し、セファロスポリンアシラーゼに代わって 7— ACA生成の反応を触媒する酵素が強く求められている。

[0006] 他方、 γ ダルタミルトランスぺプチダーゼ（GGT)は、細菌、植物、動物などの広範囲な生物種において存在し、 y ダルタミルイ匕合物のアミド基の C Ν結合を加水分解する酵素として広く知られている。例えば、 γ ダルタミルペプチド + 水 → グルタミン酸 + ペプチドの反応を触媒する。

[0007] しかしながら、今までのところ、 GGTが GL— 7— ACAアシラーゼ活性をもつことを示す報告は、全くなされていない。

非特許文献 1：都築勝沼、小松謙一、巿川茂彰、渋谷友三. 酵素法による 7 -ァミノセファロスポラン酸（7— ACA)製造技術の研究. 日本農芸化学会誌， 63, 184 7-1853 (1989) .

非特許文献 2 : A. Schmid, F. Hollmann, J. B. Park, and B. Buhler. The use of enzymes in the chemical industry in Europe. Current Opinion in Biotechnology, 13, 359-366 (2002).

発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGTを製造する方法、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGT、該改変 GGTをコードする核酸分子、及び該改変 GGTを発現している細胞を提供することを目的とする。さらに、本発明は、上記 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGTを用いて GL— 7— ACAを処理し、セファロスポリン系（セフエム系）抗生物質の原料となる 7—アミノセファロスポラン酸 (7-ACA)を生産する方法を提供することもさらなる目的とする。課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、セファロスポリン系抗生物質の原料となる 7— ACAを、酵素法により効率的に生産する方法を開発すべく鋭意研究を行った。その結果、 GGTにおいて、 1) γ—ダルタミルイ匕合物と相互作用するアミノ酸残基、又は 2)活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、からなる群より選択される 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することにより、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGTを製造することに成功した。

[0010] これまで、 GGTの遺伝子が同定されクローユングされている種としては、大腸菌（ Escherichia coli K~12)、 Bacillus suDtilis、 Bacillus natto、 Helicobacter pylori 26695、 Pseudomonas A14、 Rat、 Mouse, Pig, Humanがある。これらの種の間でアミノ酸配列が完全に保存されて、るのは、大腸菌の GGTの 580アミノ酸残基のうちの 76ァミノ酸残基である。そこで、この 76アミノ酸残基について、 GGTとクラス IVセファロスポリンアシラーゼとの間で配列を比較したところ、 GGTの 76アミノ酸残基のうち、 58ァミノ酸残基は、クラス IVセファロスポリンアシラーゼ（Y. Kim, K.-H. Yoon, Y. Khang, S. Turley, and W. G. J. Hoi. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acylase. Structure, 8, 1059-1068 (2000).)でも保存されていることがわかった。 GGTとクラス I Vセファロスポリンアシラーゼとの間で相違する 18アミノ酸残基については、これまでに 2つの菌株から見つかったクラス IVセファロスポリンアシラーゼの間では保存されていた（図 la— lc及び 2を参照のこと）。しかしながら、大腸菌の GGTは、 GL— 7— AC Aの加水分解活性を有さず、一方、クラス IVセファロスポリンアシラーゼは、 GL— 7— ACAを加水分解する活性を有する。そこで、本発明者らは、 GGTにおいて、生物種間で保存されて、るが、クラス IVセファロスポリンアシラーゼとの間では異なるアミノ酸残基に注目した。

[0011] 大腸菌の GGTの 433番目の残基であるァスパラギン酸 (Asp— 433)に相当するヒトの GGTのアミノ酸残基 (Asp— 423)は、 γ—グルタミル化合物の α位のアミノ基と相互作用して安定化させていることが示唆されていた (N. Taniguchi, and Y. Ikeda. y -Glutamyl transpeptidase: catalytic mechanism and gene expression. Ad

v. Enzymol. Rel. Areas Mol. Biol. 72, 239-278 (1998))。この大腸菌 GGTの 433番目に相当するアミノ酸残基は、 GGT間では完全に保存されているがクラス IVセファロスポリンアシラーゼとの間で異なる 18アミノ酸残基のうちの一つであった。また、クラス IVセファロスポリンアシラーゼの基質である GL— 7— ACAの 7位の側鎖は、グルタリル基が 7位のアミノ基にアミド結合した構造である。グルタリル基は、 γ—ダルタミル基の a位のアミノ基が脱アミノ化した構造である。

[0012] そこで、本発明者らは、 GGT〖こ γ—ダルタミル化合物との相互作用が変化するような変異を導入することにより、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された改変 GGT を作製することができるという仮説をたてた。この仮説に基づき、本発明者らは、 y - ダルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した改変 G GTを作製したところ、該改変 GGTは、改変前より有意に高い GL— 7— ACAアシラーゼ活性を有していた。驚くべきことに、この改変 GGTは、従来のセファロスポリンァシラーゼよりも、 GL— 7— ACAに対して、低い Km値を有し、高い基質特異性を示していた。

[0013] また、大腸菌 GGTの 391番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基が活性に必須なアミノ酸残基の一つであるということが、本発明者らによってすでに明らかにされていた。そこで、本発明者らは、 GGTの活性中心周辺領域 (例えば、大腸菌 GGT の 391番目のスレオニン残基に相当するアミノ酸残基の周辺領域）に変異を導入することにより、活性中心周辺領域のコンフオメーシヨンが変化し、活性中心が GL— 7— ACAの 7位炭素の隣のアミド結合に接近し、アミド結合を加水分解するという仮説をたてた。この仮説に基づき、 GGTの活性中心周辺領域に変異を導入すれば、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性の増強された改変 GGTが得られ得る。

[0014] すなわち、本発明は、以下の事項に関する。項 1.

γーグルタミルトランスぺプチダーゼ（GGT)にお!/ヽて、

1) γ -ダルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は

2)活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、

からなる群より選択される 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、グルタリル- 7-アミノセファロスポラン酸（GL— 7-ACA)アシラーゼ活性が増強された改変 GGTの製造方法。

項 2.

GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 5 0— 78残基、第 93— 98残基、第 114一 125残基、第 147— 188残基、第 209— 34 7残基、第 391— 434残基、第 452— 487残基及び第 508— 569残基の領域から選択される 1又はそれ以上の領域に相当する領域において、 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項 1に記載の方法。

項 3.

GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 1 6残基、第 94残基、第 98残基、第 114残基、第 115残基、第 209残基、第 227残基、第 242残基、第 263残基、第 334残基、第 342残基、第 433残基、第 452残基、第 460残基、第 461残基、第 462残基、第 468残基、第 484残基から選択される 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項 1に記載の方法。

項 4.

GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 4 33残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、項 1一 3のいずれかに記載の方法。

項 5.

前記他のアミノ酸残基が、ァスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、フエ二ルァラニン力もなる群より選択される少なくとも 1種のアミノ酸残基である、項 4に記載の方法。前記他のアミノ酸残基がァスパラギンである、項 5に記載の方法。

項 7.

項 1一 6のいずれかに記載の方法により取得された改変 GGT。

項 8.

項 7に記載の改変 GGTをコードする核酸分子。

項 9.

項 7に記載の改変 GGTを発現して、る細胞。

項 10.

項 7に記載の改変 GGTで GL— 7— AC Aを処理する工程を包含する、 7—アミノセファロスポラン酸（7— ACA)の製造方法。

[0015] 以下、本発明について詳細に説明する。

[0016] 本発明における GL— 7— ACAアシラーゼ活性は、特に記載しない限り、 GL— 7— A CAの 7位の側鎖のアミド結合を加水分解する活性を意味する。

[0017] 改変前の「 γ—ダルタミルトランスぺプチダーゼ（GGT)」は、任意の生物由来の、天然に存在する GGT及び非天然の GGT (人工的に合成された GGT、 GL—7— ACA アシラーゼ活性以外の性質 (例えば、熱安定性など)の改良を目的として改変された GGTを含む)を包含する。また、 GGT全長ではなぐ N末端欠失型、 C末端欠失型、 N及び C末端欠失型の GGTも同様に用いられる。 N末端欠失型 GGTとしては、例えば、大腸菌の 1一 34番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失した GGTが例示できる。 C末端欠失型 GGTとしては、例えば、大腸菌の 572— 580番目のァミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が欠失した GGTが例示できる。 N及び C末端欠失型としては、例えば、大腸菌の 1一 34及び 572— 580番目のアミノ酸残基に相当するァミノ酸残基が欠失した GGTが例示できる。

[0018] GGTの由来となる任意の生物としては、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌、納豆菌、スードモナス（Pseudomonas)、ピロリ菌等）、動物（例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ブタ、ゥサギ、ハムスター等）、昆虫（例えば、カイコ）、植物（例えば、インゲンマメ等）、藍藻 (例えば、ァォコ、スイセンジノリ、ュレモ、ネンジュモ等）、酵母 (例えば、 Sacc haromyces属等）が挙げられる（これらに限定されない）。

[0019] 「γ ダルタミルイ匕合物と相互作用するアミノ酸残基」としては、 γ ダルタミル化合物に相互作用するアミノ酸残基であれば、いかなる残基でもよい。このようなアミノ酸残基としては、例えば、 γ ダルタミル化合物の α位のアミノ基 (一 ΝΗ 、一 ΝΗ +)、 a

2 3 位のカルボキシル基 (—COOH基、—COO—基）、 β位及び Ζ又は Ί位のメチレン基（ CH基)と相互作用するアミノ酸残基が挙げられる。相互作用は、当業者が通常認識

2

し得るような作用であり、例えば、イオン結合、水素結合、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等である。

[0020] y ダルタミル化合物の α位のアミノ基と相互作用するアミノ酸残基としては、ァミノ基と相互作用し得るアミノ酸残基であればヽかなるアミノ酸残基であってもよヽが、好ましくは、ァスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレ才ニン、システィン、グルタミン、ァスパラギン、チロシンが例示できる（これらに限定されない)。

[0021] y ダルタミル化合物の a位のカルボキシル基と相互作用するアミノ酸残基としては、カルボキシル基と相互作用し得るアミノ酸残基であれば、かなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、グルタミン、ァスパラギン、セリン、システィン、スレオニンが例示できる（これらに限定されない)。

[0022] y ダルタミル化合物の β位及び Ζ又は Ύ位のメチレン基 (CH基）と相互作用す

2

るアミノ酸残基としては、メチレン基と相互作用し得るアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸残基であってもよいが、好ましくはフエ-ルァラニン、ァラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、ノリンが例示できる（これらに限定されない)。

[0023] 「活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、活性中心及び活性中心と二次元及び三次元的に近、アミノ酸残基であれば、かなるアミノ酸残基であってもよ、。このような活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基として、例えば、大腸菌の GGT の 391番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基の周辺の領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。

[0024] 従って、「 γ ダルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基」としては、例えば、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の G GTのアミノ酸配列の第 50— 78残基、第 93— 98残基、第 114一 125残基、第 147 一 188残基、第 209— 347残基、第 391— 434残基、第 452— 487残基及び第 508 一 569残基の領域から選択される 1又はそれ以上の領域に相当する GGTの領域におけるアミノ酸残基が挙げられる。 γ—ダルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基の一つである大腸菌 GGTの Asp— 433に相当する GGTのアミノ酸残基や、 GGT活性の活性中心に存在するアミノ酸残基の一つである大腸菌 GGTの Thr— 391に相当する GGTのアミノ酸残基は、これらの領域内に存在している。

本発明の 1つの好ましい実施形態において、本発明に従って置換されるアミノ酸残基は、 GGTにおいて、生物種間で保存され且つクラス IVセファロスポリンアシラーゼとの間で保存されていないアミノ酸残基である。力かるアミノ酸残基は、例えば、大腸菌の Asp— 433、 Leu— 16、 Gly— 94、 Phe— 98、 Arg— 114、 Glu— 115、 Phe— 209、 Leu— 227、 Phe— 242、 Thr— 263、 Tyr~334、 Gly— 342、 Asn— 452、 Pro— 460 、 Leu— 461、 Ser-462, lie— 468、 Gly— 484に相当するアミノ酸残基である。

置換後の「他のアミノ酸残基」は、置換前のアミノ酸残基と異なるアミノ酸残基であれば、いかなるアミノ酸であってもよい。好ましくは、置換前のアミノ酸残基と異なる性質 (例えば、側鎖の、酸性 Z中性 Z塩基性、親水性 Z疎水性、嵩高さ等)をもつアミノ酸残基である。例えば、置換前のアミノ酸残基が酸性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が塩基性である場合、他のアミノ酸残基は酸性又は中性であり、置換前のアミノ酸残基が中性である場合、他のアミノ酸残基は塩基性又は酸性のアミノ酸残基である。また、例えば、置換前のアミノ酸が疎水性である場合、他のアミノ酸残基は親水性であり、置換前のアミノ酸が親水性である場合、他のアミノ酸残基は疎水性である。例えば、大腸菌の GGTの 433番目のァスパラギン酸に相当する GGTのアミノ酸残基を置換する場合、他のアミノ酸残基は、例えば、ァスパラギン、グノレタミン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、グノレタミン酸、システィン、アルギニン、リジン、スレ才ニン、セリン、フエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、ノリン（これらに限定されない）であり、好ましくは、ァスパラギン、チロシン、グルタミン、トリプトファン、フエ-ルァラニンであり、より好ましくは、ァスパラギン、チロシンであり、特に好ましくはァスパラギンである。本発明の 1つの好ましい実施形態において、他のアミノ酸残基は、図 la— c中の G GTのアミノ酸配列におヽて下線が弓 Iかれてヽるアミノ酸残基に対応するクラス IVセファロスポリンアシラーゼのアミノ酸残基である。

[0026] 「グルタリルー 7—アミノセファロスポラン酸（GL— 7— ACA)アシラーゼ活性が増強された (される）」とは、前述のような置換によって、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性がいくらか増加した (高められた)ことを意味する。また、置換前の GGTが GL— 7— ACAァシラーゼ活性を有していなくても、有していてもよい。活性が増強された量 (増加量）は、少しでも増加していれば、特に限定されず、例えば、 0. OOOlUZmg以上の増加量である。

[0027] 「改変 GGT」とは、本発明の方法に従って製造された、 GL— 7— ACAアシラーゼ活性が増強された GGTの改変ペプチド及び Z又は改変タンパク質を意味する。

「改変 GGTをコードする核酸分子」とは、改変 GGTと同じアミノ酸配列へ転写 *翻訳される DNA分子及び Z又は RNA分子を意味する。なお、改変 GGTをコードする核酸分子は、改変 GGTを正しくコードしている限り、いかなるコドンを選択してもよい。コドンの選択は、常法に従って行うことができる。例えば、利用する宿主のコドンの使用頻度などを考慮し決定することができる。

[0028] 「改変 GGTを発現してヽる細胞」とは、該改変 GGTを発現してヽる細胞（改変 GG Tをコードする核酸分子で形質転換された細胞を含む)であれば、ヽかなる細胞であつてもよい。力かる細胞の種は、いかなる種であってもよいが、 GGTの由来の種と同じであることが好ましい。

[0029] 上述のような「改変 GGTをコードする核酸分子」、「改変 GGT」及び「改変 GGTを発現している細胞」は、常法に従って、取得することができる。

[0030] 改変 GGTをコードする核酸分子は、例えば、 Kunkel法、 Eckstein法、 AlteredSi te法、 PCR法、 Ito法などの変異導入法により、取得することができる。なお、これらの変異導入法を行うときに使用するプライマーは、採用する変異導入方法や改変 GGT をコードする核酸分子の配列情報に基づいて、適宜設計でき、常法に従って合成できる。

[0031] 取得した核酸分子の単離及び精製は、例えば、 H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of y -glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988)に記載される方法、ゲル電気泳動による分離精製又は分子ふるい操作などの通常用いられる方法によって、行うことができる。

[0032] また、上記のように得られた核酸分子は、必要に応じて、例えば、ジデォキシ法やマキサムギルバート法などに従って、又は巿販のシークェンスキットなどを用いて、配列が決定される。

[0033] 「改変 GGT」及び「改変 GGTを発現して、る細胞」の取得にっ、ては、前述ように取得された改変 GGTをコードする核酸分子を用いて、常法の遺伝子組換技術に従つて行つこと力 Sでさる (Sambrook, J., Frisch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989 Current Protocls in Molecular Biology. John Wiley Sons, Inc. 1998.など）。簡潔には、例えば、改変 GGTをコードする核酸分子を適当な発現ベクターへ挿入した後、これを適当な宿主細胞へ導入して形質転換し、適切な条件下において改変 GG Tを発現させることにより、改変 GGTを発現している細胞を取得することができる。さらに、この改変 GGTを発現している細胞から、改変 GGTを回収することができる。この回収した改変 GGTを、文献（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T.

Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K— 12 ggt and rapid isolation of y -glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988))に記載の方法又は常法に従って、さらに精製してもよい。

[0034] ここで、発現プラスミドを宿主細胞へ導入する方法は、特に限定されず、一般的な方法を採用することができる。例えば、エレクト口ポレーシヨン、リボソーム法、リン酸力ルシユウム法、 DEAEデキストラン法などを用いることができる。また、各ステップにおいて、目的物を選別する必要がある場合、適宜、サブクローユング操作やシークェンシングなどを行ってもよ！、。

[0035] 発現プラスミドを導入するための宿主細胞としては、あらゆる種の原核生物及び真核生物の細胞 (榭立細胞を含む)を使用することができる。

[0036] 原核生物細胞としては、例えば、大腸菌（例えば、 Escherichia coli)、枯草菌（例えば、 Bacillus subtilis)、納豆菌、スードモナス、ピロリ菌又は藍藻（これらに限定されない）の細胞が挙げられる。大腸菌の細胞としては、例えば、 K12株、 B株、 SH6 41株、 CM9株、 SH703株に分類される細胞株（これらに限定されない）が好適である。また、枯草菌の細胞としては、とりわけ MH2308株 (これらに限定されない）が好適である。

[0037] 真核生物細胞としては、例えば、動物由来細胞 (例えば、ヒト、ラット、マウス由来細胞）、昆虫由来細胞 (例えば、カイコ由来細胞）、植物由来細胞 (例えば、インゲンマメ由来細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。動物由来の榭立細胞としては、具体的には、サルの腎臓細胞である COS細胞（Cell, 23: 175 (1981))、 Vero細胞及び MK細胞、チャイニーズノ、ムスターの卵巣細胞である CHO細胞、マウスの線維芽細胞である NIH3T3細胞 (J.Viol., 4:549(1969))、及びヒトの T細胞リンパ腫由来細胞である Jurkat細胞 (J.Immunol., 133:123(1984))などが挙げられる。酵母細胞（例えば、 Saccharomyces属）もまた、好適に利用される。

[0038] 原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に改変 GGTをコードする核酸分子、該核酸分子の上流にプロモーター、 SD (シャインーダルガーノ）配列、及び必要に応じて開始コドン (例えば、 ATG )を付与した発現プラスミドを、好適に利用することができる。

[0039] 上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えば pBR322、 pBR325 、 pUC18、 pUC19がよく用いられる力これらに限定されず、既知の各種ベクターを用いることができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えば pGEX— 4T、 pKK223— 3 (Amersham Pharmacia Biotech社）、 pMAL— C2、 pMAL— P2 (New England Biolabs社）、 pET21、 pET2lZlacI^q ( Invitrogen社）、 pBADZHis (Invitrogen社）（これらに限定されない）を例示できる。

[0040] プロモーターについても特に限定はなぐ Escherichia属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン（trp)プロモーター、 lppプロモーター、 lacプロモーター、 recAプ口モーター、 PL/PR プロモーター、 tacプロモーター、 T7プロモーター、 trcプロモ一ター（これらに限定されな、）などを好ましく利用できる。宿主力 bacillus属菌である場合は、 SP01プロモーター、 penPプロモーターなどが好ましい。

[0041] 真核生物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しょうとする核酸分子の上流にプロモーター、 RN Aのスプライシング部位、ポリアデ-ル化部位及び転写終了配列を保有し、更に必要に応じて複製起点を有するものが挙げられる。該発現べクタ一の例としては、例えば SV40の初期プロモーターを保有する pSV2d hfr (Mol. Cell. Biol, 1 : 854 (1981)) (これらに限定されない）が例示できる。上記以外にも既知の各種巿販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系の場合、発現ベクターとしては、例えば、 pCI (Promega社）、 pIND (Invitrogen社）、 pcDNA3. lZHis (Invitrogen社）、 pEFlZV5— His (Invitrogen社）などの動物細胞用ベクター、 pFastBac HT (GibciBRL社）、 pAcGHLT (PharMingen社 )、 pAc5ZV5— His、 pMTZV5— His、 pMT/Bip/V5-his (以上 Invitrogen 社)などの昆虫細胞用ベクター（これらに限定されない）が挙げられる。

[0042] また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、 SV40 由来のプロモーター、レトロウイノレスのプロモーター、メタ口チォネインのプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイノレスプロモーター、 SR aプロモーター、アデノウィルスプロモーター、ェロンゲーシヨンファクターのプロモーター（これらに限定されない）を例示できる。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えば、 pH05 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター（これらに限定されな!ゝ）を好適に利用できる。

[0043] このように取得された改変 GGTの精製は、本発明者らが、既に報告した方法 (H. buzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Eschencnia coli K-12 ggt and rapid isolation of y— glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988))又は常法に従って、行うことができる。

[0044] さらに、本発明の改変 GGTで GL— 7— AC Aを処理し、 7— ACAを製造することができる。

[0045] GL— 7— AC Aの合成については、例えば、 Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T.

Fujn. Isolation and properties of 7 β— (4— carboxybutanamidoノ cephalosporanic acid acylase— producing bacteria. Agric. Biol. し hem., 45, 1561—1567 (1981)に従って、行うことができる。

[0046] 処理は、常法を用いて（例えば、インキュベーションによって)行う。例えば、 Tris— HC1 (例えば、 pH7. 6—9. 0)中で、改変 GGT及び GL—7—ACAを、 37°Cにて、 3 時間、インキュベーションする。この処理によって、該 GL— 7— ACAカ^ー ACAに変換される。

[0047] GL— 7— ACAと 7— ACAの測定は、例えば、逆相 HPLC、アミノ酸アナライザーなどの慣例的な方法に従う。

[0048] さらに必要に応じて、 7— ACAは、分離及び精製される。この分離及び精製は、例えば、 DOWEX 1X8および逆相 HPLC等によって行う。

発明の効果

[0049] 本発明により、グルタリル— 7—アミノセファロスポラン酸（GL— 7— ACA)アシラーゼ活性が増強された改変 GGTを製造することが可能になった。また、本発明により製造された改変 GGTの GL—7— ACAに対する Km値は、従来のセファロスポリンァシラーゼに比べて小さぐ本発明の改変 GGTは、 GL— 7— ACAに対して優れた基質特異性を有している。

[0050] さらに、本発明により、 7— ACAの効率的な酵素的製造方法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、且つ環境に優しぐセファロスポリン系（セフヱム系）抗生物質の原料である 7— ACAを生産することが可能となった。

図面の簡単な説明

[0051] [図 la]GGT及びクラス IVセファロスポリンアシラーゼの全配列のアラインメントを図 la 一図 lcに示す。各配列は、 SwissProt又は GenBankより入手可能である。上から、 Pseudomonas sp. ¾E83 cephalosporin acylase (¾wissProt Accession No. P15557 :酉己歹¹ J番号 19)、 Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase (SwissProt Accession No. Q05053 :配列番号 21)、 Escherichia coli K- 12 GGT (SwissProt Accession No. P18956 :配列番号 1)、 Bacillus subtilis 168 GGT (SwissProt Accession No. P54422：配列番号 3)、 Bacillus natto GGT (GenBank Accession No. 2321184A:配列番号 5) 、 Helicobacter pylori 26695 GGT (GenBank Accession No. AE000618 :配列番号 7) 、 Pseudomonas A14 GGT (SwissProt Accession No. P36267 :配列番号 9)、 Rat GGT (SwissProt Accession No. P07314 :配歹 [J番号 11)、 Mouse GGT (SwissProt Accession No. Q60928 :配列番号 13)、 Pig GGT (SwissProt Accession No. P20735 :配列番号 15)、 Human GGT1 (SwissProt Accession No. P19440 :配列番号 17)の配列である。下線を引いた斜体で表された残基は、すべての GGTで保存されているがクラス IVセファロスポリンアシラーゼでは異なって、る GGTの箇所を示して、る。斜体（下線無し )の残基は、すべての GGT及びクラス IVセファロスポリンアシラーゼで保存されている残基を示した。図 laは、前記アラインメントの一部を示す。

[図 lb]図 lbは、図 laに示したアラインメントの続きである。

[図 lc]図 lcは、図 lbに示したアラインメントの続きである。

[図 2]図 2は、 GGT間でよく保存されている領域の一つである、大腸菌の GGTの活性中心である Thr— 391から今回変異をかけた Asp— 433付近のアラインメントを示す。各配列は、 SwissProt又は GenBankより入手可能な前記配列（配列番号 1、 3、 5、 7、 9 、 11、 13、 15、 17、 19、 21)の咅分酉己歹 IJである。上力ら川頁に、 Escherichia coli K— 12 GGT (配列番号 24)、 Bacillus subtilis 168 GGT (配列番号 25)、 Bacillus natto GGT ( 配列番号 26)、 Helicobacter pylori 26695 GGT (配列番号 27)、 Pseudomonas A14 GGT (配列番号 28)、 Rat GGT (配列番号 29)、 Mouse GGT (配列番号 30)、 Pig GGT (配列番号 31)、 Human GGT1 (配列番号 32)、 Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylase (酉己列番号 33)、 Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylase ( 配列番号 34)のアミノ酸配列である。すべての GGTで保存されてヽる残基を斜体（下線無し)で示した。下線を引いた斜体の文字は、すべての GGTで Asp残基として保存されている力クラス IVセファロスポリンアシラーゼでは Asn残基となっている GGTの箇所を示している。アラインメントの左右に示した数字は、この図の左端、右端の残基がそれぞれの N末端から何番目の残基であるかを示して、る。

[図 3]図 3は、酵素反応の HPLCのチャートを示す。反応混合液（2mM GL— 7— AC A、 50mM Tris— HCl (pH8. 73)、0. lmg/ml D433N)を、 37。Cでインキュべーシヨンすることによって、反応を行った。（A)は反応 0時間、（B)は反応 3時間のサンプルである。

[図 4]図 4は、 D443Nの GL— 7— ACA加水分解反応の至適 pHを検討した結果を示す。緩衝液は、 ρΗ6. 5-7. 5ではリン酸カリウム緩衝液、 pH 7. 5-8. 73では Tri s— HC1緩衝液、 pH8. 73— 10. 5では NH C1— NH OH緩衝液を用いた。

4 4

[図 5]図 5は、 NMRの結果を示す。（A)は市販品の GL-7-ACA、（B)はこの実施例で得られた標品の NMRのチャートである。

[図 6]図 6は、実施例 1一 25において取得される各種改変 GGTを示す。大腸菌の改変 GGTに相当する、 Bacillus subtilis 168 (B. subtilis)、 Bacillus natto (B. natto)、 Helicobacter pylori 26695 (H. pylori)、 Pseudomonas A14 (Pseudo)、 rat、 mouse、 pig 、 humanの改変 GGTを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0052] 以下に実施例を示すが、これは、本発明の単なる例示であって、本発明を何ら制限するものではない。なお、以下の実施例では大腸菌の GGTを用いている力 GGTのアミノ酸配列は大腸菌と他の生物種との間でよく保存されており、大腸菌以外の様々な生物種においても本発明を同様に実施できる。

[0053] ここで、本願の特許請求の範囲、明細書及び図面に記載されるアミノ酸、タンパク質、塩基配列、核酸等の略語による表示は、 IUPAC、 IUBの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書の作成のためのガイドライン」（特許庁編)及び当該分野における慣用記号に従うものとする。

[0054] また、配列表に記載の各配列については、以下の通りである；

配列番号 1 : Escherichia coli K-12 GGTのアミノ酸配列

配列番号 2 : Escherichia coli K-12 GGTの核酸配列

配列番号 3 : Bacillus subtilis 168 GGTのアミノ酸配列

配列番号 4 : Bacillus subtilis 168 GGTの核酸配列

配列番号 5 : Bacillus natto GGTのアミノ酸配列

配列番号 6 : Bacillus natto GGTの核酸配列

配列番号 7 Helicobacter pylori 26695 GGTのアミノ酸配列

配列番号 8 Helicobacter pylori 26695 GGTの核酸配列

配列番号 9 : Pseudomonas A14 GGTのアミノ酸配列

配列番号 10 : Pseudomonas A14 GGTの核酸配列配列番号 11 : Rat GGTのアミノ酸配列

配列番号 12： Rat GGTの核酸配列

配列番号 13 : Mouse GGTのアミノ酸配列

配列番号 14 : Mouse GGTの核酸配列

配列番号 15 : Pig GGTのアミノ酸配列

配列番号 16： Pig GGTの核酸配列

配列番号 17 : Human GGT1のアミノ酸配列

配列番号 18 : Human GGT1の核酸配列

酉己歹¹ J番 19： Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseのア^ノ酸酉 ti歹 U 酉己列番 20： Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの核酸酉己列

酉己歹¹ J番 21： Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseのア^ノ酸目 ti歹 U

酉己列番 22 : Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの核酸酉己列

配列番号 23：実施例 1で変異株を取得するために用いたプライマーの核酸配列配列番号 24 :図 2に示される、 Escherichia coli K-12 GGTの部分アミノ酸配列配列番号 25 :図 2に示される、 Bacillus subtilis 168 GGTの部分アミノ酸配列配列番号 26 :図 2に示される、 Bacillus natto GGTの部分アミノ酸配列

配列番号 27 :図 2に示される、 Helicobacter pylori 26695 GGTの部分アミノ酸配列配列番号 28 :図 2に示される、 Pseudomonas A14 GGTの部分アミノ酸配列配列番号 29 :図 2に示される、 Rat GGTの部分アミノ酸配列

配列番号 30 :図 2に示される、 Mouse GGTの部分アミノ酸配列

配列番号 31：図 2に示される、 Pig GGTの部分アミノ酸配列

配列番号 32 :図 2に示される、 Human GGT1の部分アミノ酸配列

配列番号 33 :図 2に示される、 Pseudomonas sp. SE83 cephalosporin acylaseの部分アミノ酸配列

配列番号 34 :図 2に示される、 Pseudomonas sp. V22 cephalosporin acylaseの部分ァミノ酸配列。

実施例 1

栾¾株の取得方法 1.野牛.型 GGTへの D433N変異の導入

まず、 GGTのアミノ酸配列の中で Asp— 433を Asn— 433に変えるように設計した合成オリゴヌクレオチド 5， -AACCAGATGGATA*ATTTCTCCGCC-3，（A*は、野生型 GGTでは Gである）（配列番号 23)をプライマーとし、デォキシゥラシルを導入した 1本鎖の pSH1248 (pTZ18Rの Hindlllサイトに pSH253 (J. 0. Claudio, H. buzuki, H. Kumagai, and T. Tochkura. Excretion and rapid purincation of y -glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K— 12. J. Ferment. Bioeng., 72, 125-127 (1991).)の約 0.9 kbの Hindlll— Hindlllフラグメントを挿入したもの）を铸型として Kunkel法 (T. A. Kunkel. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488-492 (1985).)により変異操作を行い、 DH5 α株を形質転換した。得られた菌株カもプラスミドを抽出し、 DNA シークェンスを行い、 2株で目的の変異が入っていることを確認し、その 1つのプラスミドを pCM2とした。 pCM2の約 0. 9kbの Hindlll— Hindlllフラグメントと pSH253を Hindlllで切断して得られる 5. 4 kbのフラグメントをライゲーシヨンし、 pCM3を得た

[0056] pCM3の 3. 2 kbの Smal— Sphlフラグメントを EcoRVと Sphlで切断した pBR322 にライゲーシヨンした。得られたプラスミド pCM7で、 GGT欠損株 SH641を形質転換したものを CM9 (D433N)株とした（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K— 12 ggt and rapid isolation of y -glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988).)。実施例 2

[0057] 酵素の精製

野生型と変異型 (D433N)の酵素はすでに報告して、る方法に従ってそれぞれ S H642株と CM9株から精製した（H. Suzuki, H. Kumagai, T. Echigo, and T.

Tochikura. Molecular cloning of Escherichia coli K— 12 ggt and rapid isolation of y -glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 33-38 (1988))。実施例 3

[0058] GL— 7— ACAを某晳としたときの D433Nの加水分解活性 1.某晳 GL - 7 - AC Aの合成法

基質 GL— 7— AC Aの合成法を行うにあたり、 Y. Shibuya, K. Matsumoto, and T. Fujn. Isolation and properties of 7 β— (4— carboxybutanamidoノ cephalosporanic acid acylase- producing bacteria. Agric. Biol. し hem., 45, 1561-1567 (1981)を参照した。反応液の組成は、以下の表 1に示すとおりである。

[0059] [表 1] 反応液組成

A液

1 1 . 4 gの無水ダルタル酸をアセトンに溶かしたもの 6 0 m l B液

2 7 . 2 gの 7— A C Aを 1 N 炭酸水素ナトリウム水溶液に溶かし、

N a O Hでp H 9 . 0に調整したもの 2 8 0 m l

A液を B液に加え、 NaOHで pHを 9. 0に保ちながら、室温で 3時間混合した。ロータリーエバポレーターでアセトンを蒸発させ、濃縮した。濃塩酸で pHを 1. 5に調整後、酢酸ェチルをカ卩え、分液ろ斗を用いて、酢酸ェチル層を抽出した。水層に残った分を再び酢酸ェチルで抽出した。ロータリーエバポレーターで酢酸ェチルを蒸発させ、乾燥させた。再び酢酸ェチルをカ卩えて溶解し、ろ過した。ろ液をロータリーエバポレ一ターで乾燥させた。

[0060] 本法により、収率 80%で、 GL— 7— ACAが得られた。得られた GL— 7— AC A標品は¹ H— NMRにより、 GL— 7— AC Aであることを確認した。

[0061] 2. GL— 7— ACA ^^ したのま ]^ (力分解 ]^

反応液組成は、 50 mM Tris— HC1緩衝液（pH 8. 73) , 0. 2—2 mM GL— 7— ACA、 0. 04— 1 mg/ml D433N酵素とし、 37°Cで反応した。酵素溶液を反応液に加えることにより反応を開始した。経時的にサンプリング（200 1)を行い、等量の 3. 5 N CH COOHをカ卩えてボルテクスすることにより反応を停止し、メンブレ

3

ンフィルターでろ過した。

[0062] 3. GL—7— ACAと 7— ACAの測定法

反応液中の GL—7— ACAと 7— ACAの濃度は逆相 HPLCにより測定した。 Inersil ODS-3 カラム（GL Sciences, 4. 6 x 250 mm)を装着した HPLC (島津製作所、 LC— 10)に通常 50 1のサンプルをインジェタトし、 280 nmの吸収を測定した。移動相 Aは 0. 05%のトリフルォロ酢酸水溶液、移動相 Bは 0. 05%のトリフルォロ酢酸を含むァセトニトリルとした。 0— 25分で Bの割合を 0— 50% (リニアグラジェント）、 25— 34分は Bの割合を 50%、 34— 35分で Bの割合を 50— 0% (リニアグラジェント）、 35— 50分は Bの割合を 0%、流速 1 mlZminで溶出した。

[0063] GL— 7— ACAと 7— ACAの溶出位置と濃度の計算には、上記のように生成した GL — 7— ACAと市販の 7— ACA (Aldrich Chem. Co. )を標準品として用いた。実施例 4

[0064] 酵素反]^液の HPLCのチャート

酵素反応液の HPLCのチャートを図 3に示す。

例 5

[0065] GL— 7— ACA したの ]^ (加水分解 ]^)の商 ΏΗ

反応液組成は、 50 mM緩衝液、 2 mM GL— 7— ACA、 1. 04 mgZml酵素とし、 37°Cで 3時間反応した。 100°Cで 1分間煮沸することにより反応を停止させた後、メンブレンフィルターでろ過した。加水分解反応の至適 pHにつ!/、て検討した結果を図 4に示す。

例 6

[0066] 1. D433N の反^により GL— 7— ACAから牛.成したものが 7— ACAであるこの讓

ここまで、 D433Nによる GL— 7— ACAから 7— ACAへの加水分解反応は、逆相 HP LCでのリテンションタイムが市販の 7— ACAと一致するピーク力 7— ACAのピークであるという前提にたって行ってきた。し力し、本当にこのピークが 7— ACAであるかどうかについては確認していなかった。そこで、市販の 7— ACAと一致するリテンションタィムを示したものを大量に精製し、 NMR分析によりそのものが 7— ACAであり、 D43 3Nにより GL— 7— ACAから 7— ACAが生成したことを確認した。

[0067] 反条件

50 mM Tris— HCl緩衝液（pH 8. 73)、2 mM GL— 7— ACA、 30. 9 mu/ ml ( y GpNAを基質とした場合の加水分解活性で) D433N酵素とし、全量 730 ml、 37°Cで反応した。

[0068] 7— ACAの精製条件

7— ACAの精製には、 DOWEX 1X8カラム（30 mlカラム）を用いた。

[0069] くカラムの準備〉

2N NaOH をカラム体積の 5倍量流した。次に、蒸留水をカラム体積の 5倍量流した（カラムからの流出液の pHが水の pHに等しくなるまで)。さらに、 0. 5N CH CO

3

OHをカラム体積の 5倍量流した。次いで、蒸留水をカラム体積の 5倍量流した (カラムからの流出液の pHが水の pHに等しくなるまで)。

[0070] <サンプノレのアプライ >

サンプルをアプライした。

[0071] <溶出>

蒸留水、 0. OIN CH COOH、 0. 05N CH COOH, 0. IN CH COOH, 0. 5

3 3 3

N CH COOH, IN CH COOH, 5N CH COOHの順番で、各々、カラム体積

3 3 3

の 5倍量流した。 7— ACAは 0. 5N CH COOHで溶出した。

3

[0072] <確認 >

ニンヒドリン反応により、生成物の溶出箇所を確認した。具体的には、溶出した各フラクシヨンをろ紙に 20 1スポットし、乾燥させた後、上力も-ンヒドリン溶液を散布し、乾燥させたのち、ニンヒドリン反応を観察した。

[0073] <HPLCによる確認 >

呈色したフラクションを HPLCにかけ、市販品の 7— ACAの溶出位置と一致することを確認した。収量 18. 4 mgであった。

[0074]

DOWEX 1X8カラムにより溶出された生成物（7— ACA)のフラクションを 80°Cのディープフリーザー内で凍結させた後、凍結乾燥機により乾燥させた。

[0075] HPLCによる精製

凍結乾燥させたサンプルを蒸留水に溶かし、逆相 HPLCにより精製した。使用カラムは、 COSMOSIL Code No. 38150—41 Size 20 X 250mmであり、インジェクト量は、 500 1である。 7— ACAの画分を凍結乾燥した。

[0076] NMRの結果

NMRの結果を、図 5に示す。この結果から、精製したものは 7— ACAであることが確認できた。

[0077] 2.比活性、 Km値、 kcat値

D433Nの GL—7— ACAを基質とした場合の Km値を求めた。結果を以下に示す。 Km ： 0. 108 (mM)

実飾 17— 25

[0078] 実施例 1一 6に従って、図 6に記載の改変 GGTを作製し、その GL— 7— ACAァシラーゼ活性を測定する。このように作製された改変 GGTは、大腸菌 GGT(D433N)と同様に、 GL-7-ACAアシラーゼ活性を有し得る。

産業上の利用可能性

[0079] 本発明により、広く生物界に存在する酵素である γ ダルタミルトランスぺプチダーゼ (GGT)を原料として用い、該 GGTのアミノ酸残基を置換することにより、 GL-7 ACAアシラーゼ活性が増強された改変ペプチド (即ち、改変 GGT)を製造することが可能になった。素晴らしいことに、本発明の改変 GGTは、 GL— 7— ACAに対して、小さい Km値を有し、優れた基質特異性を有する。

[0080] さらに、本発明により、 7— ACAの効率的な酵素法が提供され、従来の化学法よりも安全、簡便、低コスト、短時間、且つ環境に優しぐセファロスポリン系（セフム系）抗生物質の原料である 7— ACAを生産することが可能になった。セファロスポリン系（セフエム系）抗生物質は、非常に需要の大きい医薬品の一つであるため、本発明が医薬品業界に与える利益は大きい。

[0081] また、本発明は、生物界に広く分布している酵素を利用して GL— 7— ACAアシラーゼの新しいソースを提供しており、今後、本発明に基づいて、多種多様な生物種の GGTを用いて、抗生物質の酵素的製造方法につ!、ての研究が盛んになされるであろう。

Claims

請求の範囲

[1] γーグルタミルトランスぺプチダーゼ（GGT)にお!/ヽて、

1) γ -ダルタミル化合物と相互作用するアミノ酸残基、又は

2)活性中心周辺領域におけるアミノ酸残基、

[2] GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 5

0— 78残基、第 93— 98残基、第 114一 125残基、第 147— 188残基、第 209— 34 7残基、第 391— 434残基、第 452— 487残基及び第 508— 569残基の領域から選択される 1又はそれ以上の領域に相当する領域において、 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項 1に記載の方法。

[3] GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 1

6残基、第 94残基、第 98残基、第 114残基、第 115残基、第 209残基、第 227残基、第 242残基、第 263残基、第 334残基、第 342残基、第 433残基、第 452残基、第 460残基、第 461残基、第 462残基、第 468残基、第 484残基から選択される 1又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項 1 に記載の方法。

[4] GGTにおいて、配列番号 1で表わされる大腸菌由来の GGTのアミノ酸配列の第 4

33残基に相当するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基で置換することを特徴とする、請求項 1一 3のいずれかに記載の方法。

[5] 前記他のアミノ酸残基が、ァスパラギン、グルタミン、チロシン、トリブトファン、フエ- ルァラニン力もなる群より選択される少なくとも 1種のアミノ酸残基である、請求項 4に記載の方法。

[6] 前記他のアミノ酸残基がァスパラギンである、請求項 5に記載の方法。

[7] 請求項 1一 6のいずれかに記載の方法により取得された改変 GGT。

[8] 請求項 7に記載の改変 GGTをコードする核酸分子。

[9] 請求項 7に記載の改変 GGTを発現して、る細胞。請求項 7に記載の改変 GGTで GL— 7— AC Aを処理する工程を包含する、 7—ァミノセファロスポラン酸（7— ACA)の製造方法。