ES2682925T3 - Nuevo método para tratar infecciones de H. pylori - Google Patents
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Abstract
Una composición inmunogénica que comprende una forma enzimáticamente inactiva de H. pylori gamma-glutamil transpeptidasa (HPGGT) para uso como un medicamento, en la que HPGGT tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% o al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1, en la que la forma enzimáticamente inactiva de HPGGT carece de los residuos de serina en las posiciones 451 y 452 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, y en la que la forma enzimáticamente inactiva de HPGGT induce una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos con un efecto anulador sobre la supresión dependiente de HPGGT de la proliferación de linfocitos.
Description
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DESCRIPCION
Nuevo metodo para tratar infecciones de H. pylori
La presente invencion se relaciona con composiciones inmunogenicas que comprenden una forma enzimaticamente inactiva o un fragmento enzimaticamente inactivo de gamma glutamil transpeptidasa de Helicobacter pylori (HPGGT).
Helicobacter pylori es un patogeno gram-negativo que selectivamente coloniza la mucosa gastrica humana y es prevalente en mas del 50 % de la poblacion mundial. La infeccion en la mayona de los casos persiste toda la vida y ha estado implicada en la patogenesis de ulceras gastricas y duodenales, linfoma de tejido de tipo linfoide asociado a la mucosa gastrica, y cancer gastrico. Un sello caractenstico de la infeccion de Hpylori es la gastritis activa cronica, caracterizada por la infiltracion densa de la mucosa por los granulocitos neutrofflicos, linfocitos, y monocitos/macrofagos. Varios estudios han proporcionado evidencias que las celulas T-auxiliadoras de tipo 1 se aumentan y activan durante la gastritis asociada a H pylori- mostrando sobre-regulacion in vivo de CD25 y CD69. Ademas se obtiene una respuesta humoral fuerte para una variedad de antfgenos de H pylori. A pesar de esta respuesta inflamatoria, la infeccion no se aclara por el sistema inmunologico del huesped. Por lo tanto, parece que H. pylori interfiere con el sistema inmune, pero el mecanismo claro permanece poco conocido hasta ahora.
Algunos estudios se han encargado de este asunto y descrito las forma pasivas y activas de escape de H. pylori de la respuesta inmune. La resistencia de H pylori a la fagocitosis se ha reportado y depende de los genes de virulencia, tales como virB7 y virB11, que codifican componentes del aparato de secrecion de tipo IV. Zabaleta y otros reportaron inhibir la proliferacion de la celula T y reducir la expresion de la cadena Z del receptor de la celula T por la arginasa de H pylori. Un peptido proinflamatorio de H pylori ha mostrado que induce la disfuncion linfodtica activando los monocitos para producir radicales de oxfgeno reactivo. Estos datos enfatizan la interaccion de la bacteria con la respuesta inmune no espedfica; sin embargo, una respuesta espedfica de la celula T parece ser decisiva para la eliminacion de la bacteria porque las pruebas de vacunacion han fracasado en ratones deficientes de celulas T o interferon-gamma (IFN-gamma).
A pesar de estos esfuerzos, las razones para la persistencia cronica del patogeno gastrico permanecen poco conocidas.1 Se ha demostrado que las celulas T CD4 positivas son cruciales para la eliminacion bacteriana2 pero se inhiben en su proliferacion por H. pylori.3 En este contexto varios grupos han investigado los efectos inmunosupresivos de las protemas de H. pylori. Knipp y colaboradores parcialmente purificaron una llamada "protema de inhibicion de la proliferacion (PIP) ", que redujo la proliferacion de linfocitos y monocitos independientemente de los factores de virulencia CagA (gen A asociado a citotoxina) y VacA (citotoxina vacuolizante).4
En contraste, dos grupos recientemente reportaron que la proliferacion de linfocitos se suprimio en presencia de concentraciones altas de VacA purificada. 56 Paradojicamente sin embargo, mutantes de H. pylori deficientes de VacA no tuvieron defecto en sus propiedades de inhibicion de la proliferacion.5 Adicionalmente pronto se ha reconocido que esa inflamacion gastrica no se altera o aun aumenta en los pacientes infectados con cepas de Helicobacter que expresan VacA.7 8
Se demostro anteriormente, que los productos secretados de H. pylori inhibieron la proliferacion de linfocito T induciendo una detencion del ciclo celular en la fase G1.3 Este efecto fue independiente de los factores de virulencia conocidos que incluyen las protemas VacA y CagA.
A pesar de este creciente trabajo acerca de los posibles mecanismos de H. pylori para escapar de la eliminacion por el huesped, aun no se obtiene un exito sustancial en el desarrollo de medios clmicos para tratar o prevenir espedficamente la infeccion de H. pylori.
El documento EP 1 508 572 A1 divulga que la protema inductora de apoptosis de H. pylori es un complejo de protema compuesto por asociacion de dos tipos de protemas, que comprende una parte de la secuencia de aminoacidos encerrada por el gen de la gamma glutamil transpeptidasa (HP1118).
El problema subyacente de la presente invencion es proporcionar polipeptidos que son adecuados para provocar una respuesta inmune en un ser animal o humano, en donde tal respuesta inmune confiere proteccion en contra de la infeccion de H. pylori y cualquier enfermedad asociada con o causada por H. pylori.
Es un problema ademas subyacente de la presente invencion proporcionar una composicion inmunogenica que es adecuada para provocar tal respuesta inmune.
Estos problemas se solucionan por la materia de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependientes.
En una realizacion, la respuesta de anticuerpo comprende anticuerpos con un efector inhibidor en HPGGT, con mayor preferencia en la actividad espedfica de HPGGT.
En una realizacion, los linfocitos son celulas B o T.
En una realizacion, la composicion comprende uno o varios adyuvantes.
En una realizacion, la composicion comprende uno o varios antigenos de H. pylori.
En una realizacion, el antigeno se selecciona del grupo que comprende HpaA, Omp18 y combinaciones de los 5 mismos.
En una realizacion, la composicion es para la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad causada por o asociada con H. pylori, mas preferiblemente una enfermedad causada por o asociada con la infeccion de H. pylori.
En una realizacion, la enfermedad se selecciona del grupo que comprende infeccion con H. pylori, trastornos gastro duodenales causados por H. pylori, gastritis, gastritis cronica, ulcera gastrica o duodenal, cancer de estomago y 10 linfoma (MALT).
En una realizacion, la composicion inmunogenica es una vacuna.
Tambien se divulga aqu el uso de una composicion inmunogenica de acuerdo con la presente invencion para la fabricacion de un medicamento.
En una realizacion, el medicamento es una vacuna.
15 En una realizacion, el medicamento es para la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad causada por o asociada con H. pylori, con mayor preferencia una enfermedad causada por o asociada con infeccion de H. pylori.
Sin deseos de estar limitado a ninguna teona el presente inventor ha encontrado sorprendentemente que un ligando para la gamma glutamil transpeptidasa de Helicobacter pylori (HPGGT) (E.C. 2.3.2.2.) se puede usar para el tratamiento y/o prevencion de las infecciones de H. pylori, particularmente trastornos gastro duodenales, en donde el 20 ligando es un inhibidor de la actividad catalftica de la HPGGT y restaura la proliferacion de linfocitos en comparacion con un control que se suprime en presencia de esta enzima. Ademas, el presente inventor ha encontrado que cuando se incuba conjuntamente con HPGGT la proliferacion de linfocitos se bloquea por la actividad espedfica de HPGGT conduciendo a la detencion del ciclo celular en G1 en los linfocitos y con esto inhibiendo la proliferacion de linfocitos. Consecuentemente, la inhibicion de la actividad espedfica de HPGGT anula la inhibicion de la 25 proliferacion de linfocitos y en consecuencia hace que sea imposible para H. pylori escapar del sistema inmune del huesped. Asf, el uso de los ligandos como se sugiere por la presente invencion previene o al menos reduce sustancialmente la colonizacion de H. pylori dentro del huesped/paciente. Por ultimo, el presente inventor ha encontrado que la actividad catalftica de la gamma glutamil transpeptidasa (GGT) de H. pylori es necesaria para la supresion de la proliferacion de linfocitos, particularmente la proliferacion de celulas T dentro del huesped. Esto se 30 evidencio claramente mostrando que la bacteria mutante deficiente en la actividad GGT pierde la habilidad de anular la proliferacion de linfocitos, y al mismo tiempo fueron incapaces de colonizar ratones. El efecto inhibidor en los linfocitos estaba completamente presente con HPGGT recombinante. El analisis de sus efectos en la transduccion de senales en celulas T sugiere una alteracion de la via de senalizacion Ras conduciendo a la induccion de una detencion del ciclo celar en G1. Es importante notar que cada cepa de H. pylori posee HPGGT, y orientacion de esta 35 enzima por ligandos inhibidores proporcionara una terapia nueva aplicable a cada infeccion de H. Pylori, evitando de ese modo los problemas asociados con la terapia de antibiotico (resistencia, efectos secundarios, seleccion de mutaciones etc). De acuerdo con la presente invencion, preferiblemente la proteccion contra la infeccion de H. pylori se confiere inhibiendo la actividad catalftica de HPGGT y rompiendo de ese modo la supresion inmune que de cualquier otra forma impide una respuesta inmune eficaz contra H.pylori.
40 HPGGT se distribuye ampliamente entre los animales, plantas y bacterias. Representa una protema heterodimerica, la cual se traduce como una cadena sencilla de polipeptido y escinde post transduccionalmente en dos subunidades con diferentes pesos moleculares. La forma de la enzima en mamfero es una protema unida a membrana, que se expresa principalmente en la superficie luminal de las glandulas y tubulos del cuerpo entero. La localizacion celular de algunas GGTs bacterianas que incluyen el homologo de Helicobacter pylori es diferente de la enzima de 45 mamfero. La HPGGT se ha demostrado anteriormente que se secreta en el medio extracelular (Bumann y otros 2002). Ademas, una alineacion de las secuencias de aminoacidos de diferentes homologos de GGT revelo baja homologfa de 22 % entre HPGGT y GGTs humano y de otros mamfferos pero la homologfa mas alta hacia los homologos bacterianos. Otra diferencia importante entre HPGGT y homologos de otras especies es la falta de residuos GY en el extremo C-terminal de la HPGGT (Chevalier y otros 1999). Asf, son evidentes las diferencias 50 sustanciales con respecto a la localizacion celular y estructura de la protema entre el HPGGT y sus homologos de mamfferos.
La gamma-glutamiltransferasa se conoce ademas como glutamil transpeptidasa; a-glutamil transpeptidasa; g- glutamil peptidiltransferasa; g-glutamil transpeptidasa; g-GPT; g-GT; g-GTP; L-g-glutamil transpeptidasa; L-g- glutamiltransferasa; L-glutamiltransferasa; GGT; g-glutamiltranspeptidasa. La actividad espedfica (catalftica) es la 55 transferencia del residuo glutamil como se indica mas abajo:
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(5-L-glutamil)-peptido + un aminoacido = peptido + 5-L-glutamil aminoacido
Esta reaccion o la capacidad para realizar tal reaccion se denomina ademas en la presente descripcion como la actividad enzimatica de HPGGT o la actividad espedfica de HPGGT.
La actividad GTT se puede evaluar con metodos conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica (por ejemplo, usando L-gamma-glutamil-p-nitroanilida como sustrato donador; ver mas abajo). El ensayo de proliferacion de linfocitos en presencia o ausencia de HPGGT y/o el ligando se puede conducir como se describe en detalle en la presente descripcion.
GGT se ha descrito anteriormente por otros grupos como un factor de H. pylori importante para la colonizacion in vivo.1113 Sin embargo, la causa subyacente de esta observacion permanece poco conocida.
La presente invencion proporciona clara evidencia de una inhibicion de la proliferacion de linfocitos T humanos dependiente de GGT y la induccion de la detencion en G1 por H. pylori. Esto fue demostrado por una parte por el uso de mutantes isogenicos GGT knock out de las bacterias, que fracasaron para suprimir la proliferacion de las celulas T humanas primarias estimuladas por el antigeno, asf como de PBMC. Por otra parte un HPGGT recombinante expresado en E. coli inhibio la proliferacion de celulas T en ausencia de otras protemas secretadas por H. pylori. Curiosamente, nuestros datos muestran que los GGT de mamfero carecieron de este efecto inhibidor. Como se menciono anteriormente, se han reportado diferencias en la estructura y localizacion de mamffero y HPGGT. Nuestros resultados apuntan hacia distinciones adicionales en los mecanismos catalfticos y/o la especificidad de sustrato de mamfero y HPGGT siendo responsable de la incapacidad de GGT de mamfero para inhibir la proliferacion de linfocitos.
Estudios estructurales y experimentos de mutagenesis se han usado para identificar residuos de serina 451 y 452 como esenciales para la actividad catalftica de la GGT.21 Se demuestra en la presente descripcion que la mutagenesis sitio-dirigida de la serina 451/452 de HPGGT a alanina resulta en una anulacion completa de su actividad catalftica y particularmente inhibitoria hacia los linfocitos lo que esta en contraste con la ensenanza profesional de la tecnica anterior donde la posicion de aminoacido 380 (T380) se reporta que es crucial para la actividad catalftica de HPGGT 31. Como consecuencia, la incubacion de la HPGGT con el inhibidor de GGT acivicina suprime completamente la actividad catalftica, asf como el efecto inhibidor de la enzima. Asf, nuestros datos demuestran que la integridad estructural del dominio catalftico de HPGGT es un requisito previo necesario para su efecto inmunosupresor. En consonancia con un papel importante de la GGT de H. pylori durante la colonizacion in vivo1113, encontramos que esta enzima es catalfticamente activa aun en los valores de pH bajos presentes en la mucosa gastrica de huesped.
Esta bien establecido que las celulas epiteliales en el estomago humano forman una barrera continua que restringe el movimiento de las moleculas entre los compartimentos internos y externos. Adicionalmente la difusion pasiva de las macromoleculas a traves del espacio paracelular de esta barrera se previene por varios mecanismos, que incluyen uniones apretadas y adherentes. Asf, se plantea la cuestion de como la protema GGT secretada por Helicobacter pylori puede interactuar con el sistema inmune del huesped en el otro lado de la barrera epitelial para suprimir la proliferacion de celulas T. En este contexto se ha demostrado anteriormente que HP es capaz de debilitar la funcion de barrera del epitelio gastrico por varios mecanismos. Adicionalmente, se ha demostrado antes la alteracion de los complejos de union epiteliales de protemas VacA y CagA de HP, asf como el transporte aumentado de la protema transcitotica a traves de la barrera epitelial inducida por H. pylori ureasa. Estos mecanismos finalmente conducen a la presencia aumentada de protemas de HP en la lamina propia y su interaccion con las celulas del sistema inmunologico que infiltran la mucosa gastrica como resultado de la infeccion por H. pylori. En favor de una afeccion de celulas T en la mucosa gastrica por la HPGGT los resultados muestran una respuesta de anticuerpo serico pronunciada hacia este factor de virulencia en pacientes infectados con HP pero no en los de control no infectados. Esto apoya la idea de un procesamiento antigenico de los componentes proteicos GGT y la presentacion de estos antfgenos a los componentes del sistema inmune que incluyen los linfocitos T en la mucosa gastrica. Asf, la supresion de la proliferacion de linfocitos T en la mucosa gastrica a traves de HPGGT puede contribuir a los mecanismos de evasion inmune de Helicobacter pylori facilitando su persistencia cronica en el estomago humano.
Los resultados de la investigacion subyacente a la presente invencion revelan que los mecanismos importantes de la activacion de celulas T estan intactos durante la incubacion con sobrenadantes de H. pylori silvestre y ademas con HPGGT recombinante. Esto esta en consonancia con un estudio previo del presente inventor que muestra que la expresion de los antfgenos de superficie celular CD69 y CD25 (cadena a del receptor de IL-2) no se redujeron en presencia de sobrenadantes de H. pylori.3 Adicionalmente, se demuestra que la influencia supresora de HPGGT en los linfocitos se media por un mecanismo independiente de la apoptosis como la exposicion de fosfatidilserina, medida por tincion con Anexina V-FITC, no se aumento en presencia de sobrenadantes de H. pylori y HPGGT recombinante. Se ha descrito anteriormente que HPGGT induce el estres oxidativo y la apoptosis en las celulas epiteliales gastricas.1216 El efecto de la enzima en las celulas del sistema inmunologico, sin embargo, no se determino anteriormente, y las diferencias observadas pueden reflejar diferencias entre las celulas objetivo.
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El presente inventor analizo la interferencia de HPGGT con la progresion del ciclo celular en las celulas T y encontro que HPGGT inhibe la proliferacion de los linfocitos provocando una detencion en la fase G1 del ciclo celular. La detencion en G1 se caracterizo por cantidades aumentadas de inhibidor p27 de Cdk, as^ como niveles celulares reducidos de las protemas ciclinas. Las v^as dependientes de Ras y PI3K son de vital importancia durante la induccion, smtesis y ensamblaje de las ciclinas tipo D con sus parejas catalfticas.22-23 La activacion de la senalizacion de Ras induce la transcripcion de Ciclina D a traves de una cascada de protema que implica c-Raf y otras quinasas. 24 Adicionalmente, se establece que la induccion de la senalizacion de Ras conduce a una smtesis aumentada de la protema c-Myc 25 que juega un papel importante durante la regulacion del ciclo celular, crecimiento celular y transformacion.26 Estudios anteriores demostraron que la senalizacion de PI3K procede independiente de la senalizacion Ras en las celulas T.17 Mientras que el estado de activacion de mediadores importantes de senalizacion de PI3K (AKT, p70S6K y FoxO3) no se cambio en presencia de HPGGT, encontramos niveles reducidos de fosforilacion de c-Raf y protema c-Myc en las celulas incubadas con HPGGT. Asf, nuestros datos sugieren que la alteracion de la senalizacion dependiente de Ras, pero no de PI3K por GGT de H. pylori juega un papel durante la induccion de una detencion del ciclo celular en las celulas T conduciendo a anular la proliferacion celular.
Otra cuestion importante es como una enzima como la HPGGT puede influir en los eventos de senalizacion intracelular que conducen a la detencion del ciclo celular y la inhibicion de la proliferacion. Durante la reaccion de transpeptidacion, GGT cataliza la transferencia de una porcion de Y-glutamil de un donante a un sustrato aceptor .27 Por el analisis de la reduccion sistematica de aminoacidos el presente inventor encontro que el efecto inhibidor de la HPGGT se abolio completamente en ausencia del aminoacido glutamina del medio, sugiriendo que el efecto inhibidor de GGT a partir de H. pylori se media indirectamente por la formacion de metabolitos durante la transpeptidacion. Esto se apoya por nuestra observacion que la preincubacion del medio de cultivo con HPGGT y posterior inactivacion de la enzima antes de la adicion a las celulas es suficiente para la inhibicion de la proliferacion de linfocitos.
Estudios anteriores describieron varios factores de H. pylori distintos de GGT, que inhibieron la proliferacion de los linfocitos T humanos. Wang y colaboradores mostraron que H. pylori en una MOI de 300 (300 bacterias por celula T) inhibio la proliferacion de T celulas por induccion de apoptosis. Sin embargo, podna ser cuestionable si tales altas cantidades de bacterias entran en contacto con las celulas T en la lamina propia del estomago humano. En nuestra publicacion anterior (Gastroenterology 2005 2005;128(5):1327-39) el presente inventor demostro que aun una MOI de 1 mas baja 300 veces (1 bacteria por celula T) fue suficiente para inhibir la proliferacion de linfocitos en nuestro sistema. Cuando la concentracion de los sobrenadantes de cultivo HP incubados con linfocitos se elevo por encima de 100 |jg/ml se observo apoptosis en cantidades comparables como Wang y otros. Esto sugiere que el efecto inhibidor de HP hacia los linfocitos descritos en la presente descripcion es mas pronunciado que y diferente de los mecanismos descritos por este grupo.
Otro estudio por Zabaleta y otros describieron la inhibicion de la proliferacion de celulas T por la protema arginasa citoplasmatica de HP30. Los autores usaron lisados de celulas enteras de HP que contienen protemas citoplasmaticas y unidas a membrana de las bacterias. En contraste el presente inventor uso sobrenadantes de cultivo de HP que contienen sus protemas secretadas. Ya que la arginasa no se secreta por HP los posibles efectos inhibidores de esta enzima hacia las celulas T no se pudieron detectar en el sistema usado aqrn y es poco probable que se produzca in vivo.
Un trabajo de Gebert y otros sugirio que la citotoxina vacuolizante A (VacA) secretada por H. pylori inhibio la proliferacion de las celulas T. Los autores usaron los sobrenadantes bacterianos en una concentracion 25 veces mas alta (250 jg/ml) que la que hicimos en nuestro presente trabajo (10 pg/ml). En un estudio anterior el presente inventor demostro que altas concentraciones de sobrenadante de cultivo de HP (>100 jg/ml) indujeron cantidad significativa de apoptosis en los linfocitos. Adicionalmente, la presencia o ausencia de VacA no tuvo influencia en el efecto inhibidor de HP hacia linfocitos en nuestro sistema (Gastro 2005).
Asf, a pesar de otras formas de inhibicion de las celulas T por H. pylori descritas anteriormente, GGT secretada por la bacteria es necesaria y suficiente para inhibir la proliferacion de celulas T en el sistema que se uso aqrn.
En sumario, los datos subyacentes de la presente solicitud proporcionan un nuevo mecanismo para la evasion inmune aplicada por H. pylori, haciendo uso de una protema secretada para inhibir la progresion del ciclo celular de las celulas inmunes efectoras. Se muestra que la enzima GGT es responsable de la inhibicion de la proliferacion de celulas T por H. pylori, como el efecto inhibidor se suprimio completamente en mutantes deficientes de GGT de las bacterias. Este efecto depende claramente de la actividad catalttica de GGT, como los mutantes enzimaticamente inactivos de la protema recombinante HPGGT carecieron de la capacidad para suprimir la proliferacion de celulas T. Adicionalmente, se demuestra que una detencion del ciclo celular en la fase G1 de las celulas T se indujo solo en la presencia de GGT de H. pylori. De nuevo sin deseos de estar limitado a ninguna teona, los resultados adicionales apuntan hacia la alteracion de la senalizacion dependiente de Ras, pero no de PI3K por HPGGT como la causa de la detencion en G1 y proliferacion suprimida de celulas T. La identificacion de HPGGT como un factor inhibidor de los linfocitos forma la base biologica para las observaciones en los modelos animales, mostrando un papel importante de HPGGT para la colonizacion de H. pylori. El HPGGT y su posible papel en la colonizacion del huesped se discuten dentro de la WO 00/01825 y WO98/17804. Ambos documentos, sin embargo, no presentan evidencia de
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que la actividad HPGGT es la responsable de la supresion del sistema inmune del huesped y ellos no dicen nada sobre el impacto de la HPGGT en la proliferacion de celula T y la supresion inmune dentro del huesped.
El presente inventor ha encontrado que no solo HPGGT como tal, de preferencia la HPGGT silvestre que tiene la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la sec. con num. de ident:. 1, puede usarse como un antigeno para la generacion de anticuerpos, aptameros y espiegelmeros, donde preferiblemente cada uno se une espedficamente a la misma, y son adecuados para inhibir la actividad espedfica de HPGGT y/o un efecto anulador en la supresion dependiente de HPGGT de la supresion de linfocitos de la proliferacion de linfocitos, sino ademas fragmentos distintos de los mismos.
El alcance de la presente invencion esta definido en las reivindicaciones adjuntas.
Tambien se divulgan aqrn polipeptidos espedficos. Tales polipeptidos comprenden una secuencia de aminoacidos que es identica a o corresponde a una parte o extension de aminoacidos de regiones distintas de HPGGT. Preferiblemente la secuencia de aminoacidos de HPGGT comprende la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ. ID. NO:1.
Como se usa preferiblemente en el presente documento, una secuencia de aminoacidos es identica a otra secuencia de aminoacidos si la secuencia o el orden de los aminoacidos es el mismo en terminos tanto de la naturaleza de los aminoacidos como de su posicion relativa entre su En otra realizacion, la secuencia de aminoacidos primaria de la secuencia con la que son identicas, es la misma.
Como se usa en la presente descripcion preferiblemente una secuencia de aminoacidos es identica a otra secuencia de aminoacidos si la secuencia o el orden de los aminoacidos es el mismo tanto en terminos de la naturaleza de los aminoacidos como su posicionamiento relativo con respecto al otro.
En otra realizacion, la secuencia primaria de aminoacidos de las secuencias que se corresponden mutuamente es la misma, por la cual el contexto general de ambas secuencias de aminoacidos correspondientes es ya sea la misma o es diferente El contexto general de un aminoacido se define por el (los) aminoacido(s) que flanquea(n) uno o ambos extremos de la secuencia de aminoacidos.
Se reconocera por la persona experta en la tecnica que las secuencias que son identicas o que se corresponden mutuamente tienen una homologfa de secuencia de al menos 90 %, 95 % o 100 %.
En una realizacion el polipeptido divulgado aqrn comprende o consiste en una secuencia de aminoacidos que es identica o corresponde a una extension de aminoacidos consecutivos de HPGGT. Preferiblemente, y aplicable a cualquier realizacion y aspecto de la presente invencion, HPGGT tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ. ID. NO:1. Sera reconocido por la persona con experiencia en la tecnica que pueden existir variantes y mutaciones de HPGGT que se podran comprender por el termino HPGGT. Esta ademas dentro de la presente invencion que si la secuencia de HPGGT es diferente de la de HPGGT como se especifica en la sec. con num. de ident:. 1, que se describe en la presente descripcion en relacion con HPGGT que tiene la secuencia de aminoacidos como se especifica en SEQ. ID. NO: 1 es tambien aplicable a tal forma diferente de HPGGT. Mas espedficamente, la persona con experiencia en la tecnica identificara el (los) aminoacido(s) en tales formas diferentes, que corresponde(n) en su posicion, naturaleza qmmica y/o funcion a uno que se identifica y dirige, respectivamente, en HPGGT que tiene la secuencia de aminoacidos como se especifica en la SEQ. ID. NO: 1.
En una realizacion adicional, los polipeptidos divulgados aqrn son fragmentos de HPGGT, preferiblemente fragmentos inmunogenicos de HPGGt y con mayor preferencia fragmentos inmunogenicos de HPGGT que son adecuados para provocar una respuesta inmune en los organismos huesped, preferiblemente una respuesta de anticuerpos, por lo cual el anticuerpo tiene un efecto inhibidor en HPGGT, con mayor preferencia en la actividad espedfica de HPGGT y/o un efecto anulador en la supresion dependiente de HPGGT de la proliferacion de linfocitos. El fragmento inmunogenico divulgado aqrn comprende los aminoacidos 451 y 452 o de la HPGGT. El fragmento puede ser de cualquier longitud. Sin embargo, se usan los peptidos de 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoacidos, con mayor preferencia de 10 a 40, 10 a 30, o con maxima preferencia de 10 a 20. Los algoritmos de prediccion de epftopo para el diseno de vacunas basada en peptidos se aplican aqrn. Como se usa preferiblemente en la presente descripcion un organismo huesped es un animal, preferiblemente un mairnfero, o un ser humano que, preferiblemente son capaces de desarrollar una respuesta inmune contra un antfgeno.
Como se usa en la presente descripcion preferiblemente, un aminoacido es un alfa-aminoacido. Como se usa preferiblemente en la presente descripcion, un aminoacido es ya sea un D- o un L-aminoacido, preferiblemente un L- aminoacido. Todavfa preferiblemente un aminoacido es ya sea un aminoacido de origen natural.
El presente inventor encontro sorprendentemente ademas que la mutagenesis de los residuos de serina 451 y/o 452 a alanina de la HPGGT suprimio completamente la actividad enzimatica de HPGGT recombinante y anulo su inhibicion de la proliferacion de celulas T. Sin embargo, la sustitucion del residuo serina 385 (S385A) no redujo el efecto inhibidor dependiente de HPGGT en la proliferacion de celulas T, aunque la actividad catalttica de esta HPGGT mutante fue significativamente reducida (es decir, aproximadamente 50 %). En consecuencia, una sustancia farmaco adecuada para el tratamiento de la infeccion de H. pylori tiene que cumplir dos requisitos, es decir: (i) que
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tiene que exhibir un efecto inhibidor en la actividad catalttica de HPGGT y, ademas, tiene que restablecer la proliferacion de las celulas T cuando se incuba con HPGGT.
A la luces de este hallazgo la presente invencion se relaciona con el uso de una forma inactivada de HPGGT.
Una forma inactivada de HPGGT es una HPGGT que esta desprovista de la actividad enzimatica de HPGGT como se indica en la presente descripcion. Sera reconocido por las personas con experiencia en la tecnica que existen varias formas de proporcionar tal forma inactivada de HPGGT, incluyendo deleciones de uno o de varios aminoacidos, alteracion de uno o mas aminoacidos, siempre en comparacion con la HPGGT enzimaticamente activa. De acuerdo con la presente invencion, la forma inactivada de HPGGT es una que esta desprovista de los aminoacidos serina en las posiciones 451 y 452 de la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ. ID. NO:1. De acuerdo con la presente invencion, la forma inactivada de HPGGT todavfa es capaz de provocar una respuesta de anticuerpo en un animal y/o un ser humano, que comprende anticuerpos con un efecto anulador en la supresion dependiente de HPGGT de la proliferacion de linfocitos. Como se usa preferiblemente en la presente descripcion el termino actividad espedfica de HPGGT se usa de manera sinonima a la actividad enzimatica y mas espedficamente la actividad enzimatica de HPGGT como se describe en la presente descripcion.
Se entendera que una forma inactiva de HPGGT como se describe aqm, en una realizacion, conjugado a un material portador tal como KLH o hemocianina de lapa californiana, BSA, ovoalbumina, etc., para presentar el antigeno respectivo al sistema inmune del huesped de manera que permite o promueve la obtencion de una respuesta inmune y se obtienen anticuerpos de alto tftulo.
Se entendera que, en relacion con la presente invencion, la composicion inmunogenica se puede usar in vitro o in vivo. En el ultimo caso, tal composicion inmunogenica es tfpicamente una vacuna y preferiblemente formulada como tal vacuna. La composicion inmunogenica, y medicamento y vacuna, respectivamente, que comprende la misma se puede usar para la prevencion de la infeccion de H. pylori, preferiblemente en ninos, o para el tratamiento y/o prevencion de los animales y los seres humanos que sufren o estan en riesgo de sufrir de infeccion de H. pylori y cualquier enfermedad causada por o asociada con tal organismo.
En una realizacion, la composicion inmunogenica de la presente invencion comprende uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes preferiblemente son agentes que proporcionan una estimulacion generalizada del sistema inmune. Los adyuvantes son conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitarse a, polfmeros policationicos, desoxinucleotidos inmunoestimuladores (ODNs), peptidos sinteticos KLK, compuestos neuroactivos, alumina, adyuvantes completos o incompletos de Freund, toxina del colera. Preferiblemente, el polfmero policationico es un peptido policationico y/o en donde el compuesto neuroactivo es la hormona de crecimiento humano.
En una realizacion adicional, la composicion inmunogenica comprende protemas de la membrana externa de H. pylori tales como BabA, HpaA, Omp 18 y una combinacion de las mismas. HpaA y Omp18 son, por ejemplo, descritas en Voland p. y otros, Infection y Immunity, julio de 2003, p. 3837-3843. Esta dentro de la presente invencion que los terminos Bab A, Hpa A y Omp 18 comprende no solo el polipeptido completo, sino ademas cualquier fragmento o peptido inmunogenico del mismo. HpaA es una hemaglutinina N-acetil neuraminil lactosa de union putativa, Bab A es una protema de adhesion que se une a antfgenos de grupo sangumeo Lewis. Se entendera que otros antfgenos y, preferiblemente, protemas y polipeptidos, y respectivos fragmentos de los mismos, se pueden usar para aumentar la respuesta inmune contra H. pylori. Las protemas y polipeptidos preferidos, respectivamente, que se pueden usar en una realizacion de la presente invencion son protemas de la membrana externa que se incorporan tfpicamente en la membrana plasmatica externa de H. pylori y son importantes para, por ejemplo, el transporte de iones, adherencia, estabilidad estructural y osmotica y la virulencia bacteriana.
Los antfgenos adicionales que se pueden tomar de H. pylori y que puede formar parte de la composicion inmunogenica de acuerdo con la presente invencion, son los descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos 20070042448 publicada.
Se reconocera que las formas inactivas de HPGGT destinadas para la administracion al cuerpo animal o humano se formulan preferiblemente. Tales formulaciones se conocen por la persona experta en la tecnica. En una realizacion la formulacion es una que se describe en la patente de Estados Unidos 6,838,089. La formulacion descrita en esta patente de Estados Unidos es un sistema de entrega que comprende una pluralidad de partmulas de polfmeros, en donde un antfgeno de protema insoluble en agua se incorpora con partmulas de polfmeros, las partmulas de polfmeros que comprende una matriz de polfmero que comprende uno o mas homo- y/o copolfmeros, en donde el metodo comprende: (a) mezclar una fase acuosa (W) que comprende el agente insoluble en agua tal como una protema y uno o mas surfactantes hidrofilos a una concentracion de 0.1 a 100 veces la concentracion cntica de micela de los mismos con una fase organica (O) que comprende la matriz de polfmero en un solvente organico, cuyo solvente no desnaturaliza el antfgeno proteico y en donde O es inmiscible con W, para producir una emulsion W/O, en donde ya sea W u O o ambas comprenden ademas uno o mas agentes estabilizantes adicionados antes de que se mezcle para estabilizar la emulsion W/O en presencia de los agente(s) de solubilizacion y promover la incorporacion de la protema insoluble en agua dentro de las partmulas de polfmero durante la etapa (b); y (b) formar gotas de dicha emulsion W/O mediante la dispersion de la emulsion en un medio fluido, y eliminar dicho solvente de
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la fase O de las gotas de emulsion W/O para formar de ese modo las partmulas de poKmero que incorporan el antigeno de protema insoluble en agua.
En una realizacion adicional la formulacion y el agente de entrega de los agentes y compuestos descritos en la presente, es un sistema de microesfera tal como los descritos en la patente de Estados Unidos 6,372260.
En un aspecto de la presente invencion, la composicion inmunogenica se usa preferiblemente en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad que es causada por o se asocia con H. pylori, con mayor preferencia causada por la infeccion de H. pylori. En una realizacion la enfermedad son trastornos gastroduodenales, causados por la infeccion de H. pylori. En una realizacion adicional la enfermedad es gastritis, sobre todo gastritis cronica. Debido a que una gastritis cronica esta implicada en la patogenesis de la ulcera gastrica o duodenal, o incluso el cancer de estomago y linfoma de MALT, los agentes anteriores de la invencion se pueden usar para prevenir esas enfermedades. Se pueden usar ademas para tratar por ejemplo, la enfermedad de ulcera gastrica y duodenal y linfoma de (MALT). De acuerdo con la invencion, el termino general de "tratamiento" se usa - a menos que se defina explfcitamente de cualquier otra forma - como modo de curar, mitigar, diagnosticar o prevenir un trastorno patologico.
Como se utiliza preferiblemente en la presente, el termino promover la proliferacion de linfocitos significa en una realizacion preferida promover la activacion y proliferacion de linfocitos.
Tambien se divulga aqrn un metodo para producir HPGGT, mas espedficamente HPGGT recombinante que carece de la secuencia de secrecion (peptido senal) o con una secuencia de secrecion que es no funcional. Tal HpGGT que carece de una secuencia de secrecion funcional, es decir, aminoacidos 1- 26, sitio de escision entre pos. 26 y 27: LSA-AS, es ventajoso en cuanto a que tal HPGGT no es secretado a partir de una celula huesped durante la produccion en la celula huesped de ese tipo. En relacion con este aspecto, el organismo huesped es preferiblemente un procariota tal como E. coli, sin embargo, no se limita a el.
El experto en la tecnica esta consciente de los metodos para preparar tal HPGGT que carece de una secuencia de secrecion funcional. Por ejemplo, esto se puede lograr mediante la expresion de un gen que codifica una protema sin secuencia lfder secretora. Tal protema HPGGT modificada permanecera en su celula huesped y por lo tanto se puede purificar de ad.
Tambien se divulga en la presente memoria un acido nucleico que codifica la HPGGT inactiva divulgada en este documento. Se reconocera por el experto en la tecnica que conociendo el codigo genetico y, opcionalmente el uso de codones en un organismo huesped que expresa tal acido nucleico, dicho experto en la tecnica puede preparar tal acido nucleico. En un aspecto adicional, el acido nucleico esta contenido en un vector, preferiblemente un vector de expresion. En una realizacion, el vector de expresion comprende plasmidos, cosmidos, virus, bacteriofagos y otros vectores usados habitualmente en el campo de la ingeniena genetica. Se divulga ademas un organismo huesped que contiene tal vector. En una realizacion, el organismo huesped y, particularmente, la celula huesped es una celula huesped recombinante que contiene de forma transitoria o estable las moleculas de acidos nucleicos o vectores divulgados aqrn. Una celula huesped u organismo huesped se entiende que es un organismo capaz de adoptar in vitro el ADN recombinante y, si es el caso, sintetizar las protemas codificadas por las moleculas de acido nucleico divulgadas aqrn. Preferiblemente, estas celulas son celulas procariotas o eucariotas, por ejemplo celulas de mairnfero, celulas bacterianas, celulas de insecto o celulas de levadura. Las celulas huesped divulgadas aqrn se caracterizan preferiblemente por el hecho de que la molecula de acido nucleico introducida divulgada aqrn es ya sea heterologa con respecto a la celula transformada, es decir, que no es de origen natural en estas celulas, o esta localizada en un lugar en el genoma diferente de la secuencia de origen natural correspondiente.
Tambien se divulgan aqrn protemas aisladas que presentan propiedades biologicas de HPgGT, preferiblemente HPgGT en donde la secuencia de secrecion que normalmente se produce se ha eliminado o no es funcional, y que se codifican por las moleculas de acido nucleico divulgadas aqrn, asf como a metodos para su produccion, por la cual, por ejemplo, una celula huesped divulgada aqrn se cultiva bajo condiciones que permitan la smtesis de la protema y, posteriormente, la protema se afsla de las celulas cultivadas y/o el medio de cultivo. El aislamiento y purificacion de las protemas producidas de forma recombinante puede llevarse a cabo con instrumentos convencionales incluyendo cromatograffa preparativa y separaciones inmunologicas y por afinidad que implican la cromatograffa de afinidad con anticuerpos monoclonales o policlonales. Como se utiliza en la presente, el termino "protema aislada" incluye protemas sustancialmente libres de otras protemas, acidos nucleicos, lfpidos, carbohidratos u otros materiales con los que se asocia naturalmente. Tales protemas sin embargo, no solo comprenden protemas producidas de forma recombinante sino incluyen protemas aisladas de origen natural, protemas sinteticamente producidas, o protemas producidas por una combinacion de estos metodos. Instrumentos para preparar tales protemas se conocen bien en la tecnica. Las protemas divulgadas aqrn estan preferiblemente en una forma sustancialmente purificada.
Asf, se divulga ademas aqrn un metodo general para preparar una protema en celulas huesped procariotas o eucariotas, que es perjudicial para dichas celulas cuando se aplica externamente, que comprende: (a) cultivar una celula huesped transfectada con una secuencia de acido nucleico que codifica dicha protema con una secuencia senal secretora suprimida o no funcional bajo condiciones tales que se exprese dicha protema; y (b) recuperar dicha
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protema de las celulas. Lo mismo se aplica ademas a una celula huesped transfectada con un acido nucleico que codifica los polipeptidos divulgados aqu que se puede recuperar a partir de dichas celulas.
Dentro de la presente invencion, el termino HPGGT silvestre o expresiones similares se refieren preferiblemente al HPGGT silvestre que carece de la secuencia de secrecion, pero es catalfticamente activo, mas espedficamente cataliza la reaccion enzimatica descrita en la presente para HPGGT.
A continuacion la presente invencion se ilustrara mas aun con las figuras y ejemplos a partir de los que pueden tomarse caractensticas, realizaciones y ventajas adicionales.
La Fig.lA es una tabla que indica las protemas secretadas a partir de H. pylori con un peso molecular entre 30 y 66 kDa de acuerdo con Kim y otros y Bumann y otros910
La Fig. 1B es un SDS-PAGE despues de tincion con plata que indica protemas en las fracciones eluidas de la cromatograffa de exclusion por tamano, por el cual solo las fracciones b-f inhibieron la proliferacion de las celulas T humanas, mientras que todas las otras fracciones no; las bandas de protemas correspondientes al perfil inhibidor de las fracciones estan marcadas con flechas.
La Fig. 1C es un diagrama de barras que representa la actividad enzimatica GGT de las fracciones de filtracion en gel que se determino mediante un ensayo espectrofotometrico tal como se describe en el ejemplo 1. (HP = H. pylori)
Las Figs. 2A a C son diagramas de barras que muestran la proliferacion de celulas de PBMC estimulada (A) y linfocitos T humanos primarios aislados (C) en presencia o ausencia de HPSN indicado que se determino por el ensayo de incorporacion de 3H-timidina; el fenotipo GGT de las cepas knock-out construidas se confirmo mediante el ensayo de actividad enzimatica e inmunotransferencia usando un anticuerpo policlonal contra la subunidad mayor de GGT (B). Para inmunotransferencia se usaron 30 |jg de protema de HPSN. La inmunotransferencia con el anticuerpo anti-VacA sirvio como control de carga (ver inserto). Los datos representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. Valores de *P <.001 como determinado por la prueba de f-Student se consideraron significativos. (HP = H. pylori, SN = sobrenadante, WT = silvestre).
La Fig. 3A y B representa un gel despues de la tincion de plata (A) e inmunoelectrotransferencia (B) de las fracciones HPGGT recombinantes purificadas con el anticuerpo anti-GGT dirigido contra su subunidad mayor lo que muestra procesamiento de GGT. Asteriscos indican: *** pro-forma, subunidad ** mayor y * menor.
Las Figs. 3C a 3E son diagramas de barras que muestran la actividad enzimatica (C) e inhibicion de la proliferacion de PBMC humana (D) por HPGGT recombinante (rHPGGT) expresada en E. coli. El LPS de E. coli usado como un control no inhibio la proliferacion de PBMC. HPGGT recombinante mostro actividad catalttica en pH 2-10 (E). Los datos representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. Valor de *P <.001 como determinado por la prueba de f-Student se considero significativo. (FT = flujo continuo, HP = H. pylori).
Las Figs 4A a D son diagramas de barras que indican que la GGT purificada a partir de rinon equino mostro actividad catalftica de GGT (A), pero carecio de efecto inhibidor de la proliferacion de linfocitos (B). La mutagenesis sitio-dirigida del HPGGT recombinante en Ser 451/452 (S451/452A) suprimio la actividad enzimatica (A) y el efecto inhibidor (B) de GGT. La preincubacion de HPWTSN con acivicina (50 pM) durante 2 horas a 37 °C anulo la actividad de GGT (C) y la inhibicion de la proliferacion de PBMC (D). Los datos representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. Valores de *P <.05 como determinados por la prueba de f-Student se consideraron significativos. (HP = H. pylori, SN = sobrenadante, WT = silvestre).
Las Figs 5A y B son diagramas que indican la produccion de citocinas IL-2 (A) e IFN-y (B) por PBMC que se midio despues de 24 horas mediante ELISA como se describe en el ejemplo. Los datos representan la media ± SD de 3 experimentos independientes. Valores de P como determinados por la prueba de f-Student se indican.
La Fig. 5C representa el resultado de un analisis-FACS de celulas T Jurkat que se trataron durante 24 horas como se indica (curvas grises) y se tineron con Anexina V-FITC y yoduro de propidio. La tasa de celulas T Jurkat apoptoticas se determino mediante la adquisicion de 10000 eventos de analisis-FACS. El farmaco anti-cancer estaurosporina (curva en blanco), usado como control positivo, indujo fuertemente apoptosis a una concentracion de 1 jM. (HP = H. pylori, WT = silvestre).
La Fig 6A muestra el resultado de un analisis del ciclo celular de las celulas T Jurkat tratadas con o sin el HPSN indicado durante 24h. El porcentaje de celulas en la fase GI- (inferior izquierda), S temprana y tardfa- (superior izquierda y derecha) y G2- (inferior derecha) se representa (eje-y: BrdU-FITC; eje-x: PI). Los niveles celulares de protemas reguladoras del ciclo celular se determinaron en las mismas celulas por inmunoelectrotransferencia.
La Fig. 6B un SDS PAGE de protemas obtenidas a partir de 107 PBMC que se incubaron con diferentes concentraciones de HPWT y HPAGGTSN o rHPGGT durante 24h y 48h y posteriormente se lisaron. 35 jg de protema total se separaron mediante SDS-PAGE y analizaron por inmunoelectrotransferencia. Los niveles de protemas indicados se determinaron utilizando los anticuerpos correspondientes. Los datos se reprodujeron 2 veces con resultados similares. (HP = H. pylori, SN = sobrenadante, WT = silvestre).
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La Fig. 7 es una inmunoelectrotransferencia de sueros de H. pylori positivos (carriles 1-9) y negativos (carriles 1014), por la cual los pacientes se probaron para la presencia de anticuerpos dirigidos contra HPGGT mediante inmunoelectrotransferencia como se describe en el Ejemplo 1. El anticuerpo anti-GGT (aGGT) de conejo se uso como control positivo. Los asteriscos indican: *** pro-forma y ** subunidad mayor de la protema HPGGT.
La Fig. 8 es un diagrama de barras indicando que la inhibicion de la proliferacion de linfocitos por HPGGT depende de glutamina, pero no esta mediada por glutamato o g-glutamilglutamina, ni por la reduccion de glutamina. Las PBMC se estimularon con PMA/ionomicina (todo excepto basal) y se trataron como se indica. Rek. HPGGT como se usa a 2 pg/ml se inactivo despues de 24 horas. A continuacion, el medio se cambio y el medio tratado con HPGGT se anadio a las PBMC despues de la estimulacion. La glutamina se anadio a 2 mM al mismo tiempo (no se muestra) o tambien despues de 24 horas para investigar posible reduccion de glutamina. El glutamato o g-glutamilglutamina se anadieron despues de la estimulacion de BPMC para investigar posibles efectos inhibidores. Aminoacidos sin (w/o) glutamina se usaron para mostrar la dependencia del efecto inhibidor sobre la glutamina.
La Fig. 9 es un diagrama que indica el efecto inhibidor de los sueros de ratones inmunizados o infectados sobre la actividad enzimatica de HPGGT. Los ratones se inmunizaron con las formulaciones indicadas o recibieron PBS como control o se infectaron con H. pylori vivo. Los sueros se tomaron de las venas de la cola, 6 semanas despues de la inmunizacion o infeccion y se ensayaron para la actividad inhibidora en la actividad catalttica de GGT. Protema CT_GGT, CT soluble y GGT inactivo, protema [CT_GGT]enc, CT y GGT inactivo se encapsularon en microesferas.
Ejemplo 1: Materiales y metodos.
Cultivo bacteriano. La cepa de H. pylori silvestre G27 WT (vacA+ cagA+) usada en este estudio se obtuvo a partir de A. Covacci (IRIS, Siena, Italia). Las bacterias se cultivaron en placas de Wilkins-Chalgren o Infusion cerebro-corazon (BHI) suplementada con mezcla de antibioticos suplemento Dent (Oxoid, Wesel, Alemania) como se describio anteriormente .29 El cultivo lfquido de HP se realizo en caldo de BHI suplementado con 10 % de FCS (Sigma, Munich, Alemania) y 1 % de suplemento Dent. Para la produccion de sobrenadantes de HP, las bacterias se cultivaron en placas durante 48 h, se lavaron 3 veces en tampon fosfato salino (PBS) y se ajustaron a OD600nm de 1 (que corresponde a aproximadamente. 2x108 bacterias/ml). Las bacterias se incubaron en PBS durante 2h bajo condiciones microaerofflicas con agitacion vigorosa y se sedimentaron en etapas de centrifugacion posteriores a 3000 xg y 10000xg para eliminar bacterias y membranas. Posteriormente, los sobrenadantes se concentraron usando ultrafiltracion (Amicon Ultra MWCO 10 kDa, Millipore, Schwalbach, Alemania). El contenido total de protemas de los sobrenadantes se midio mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Virginia) con albumina serica bovina como estandar y se almaceno a -80 °C. E. coli se cultivaron en placas de agar caldo Luria (LB) (USB, Cleveland, Ohio) y para cultivo lfquido en caldo LB (USB) con antibioticos pertinentes.
Cromatograffa de filtracion en gel de sobrenadantes de H. pylori. Los sobrenadantes de la cepa de H. pylori silvestre G27 se prepararon como se describio anteriormente. La cromatograffa de exclusion por tamano se realizo como se describio antes3. En resumen, 500 pg de protema se cargaron en una columna de Superdex 200 10/300 (GE Healthcare, Munich, Alemania) y eluyeron con PBS desgaseado a 4 °C. Protemas estandares a-amilasa (200 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), albumina serica bovina (66 kDa), y anhidrasa carbonica (29 kDa) se usaron para la estimacion del peso molecular de las protemas eluidas. Cada fraccion se probo para la inhibicion de la proliferacion y actividad de GGT como se describe mas abajo.
Generacion de cepas mutantes de GGT. El plasmido k.o. GGT se transformo en la cepa de H. pylori G27 por transformacion natural. Los transformantes se incubaron en placas de agar que contienen 25 pg/ml de kanamicina (Sigma). Despues de 3 dfas los clones se recogieron y extendieron en placas de agar fresco con kanamicina. La insercion del plasmido se verifico por PCR (iniciador: sentido 5'-AAACGATTGGCTTGGGTGTGATAG-3' (SEQ. ID. NO:6); antisentido 5'-GACCGGCTTAGTAACGATTTGATAG-3' (SEQ. ID. NO:7)) del ADN bacteriano e inmunoelectrotransferencia de protemas AGGT de sobrenadantes de H. pylori.
Cultivo celular: El aislamiento de linfocitos de sangre periferica (PBMC) se realizo como se describio anteriormente3. Todas las celulas se incubaron a 37 °C con 5 % CO2. Las celulas T Jurkat y PBMC se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) con 10 % FCS. Las celulas T EL-4 se cultivaron en DMEM (Invitrogen) suplementado con 10 % suero de caballo (Cambrex, Verviers, Belgica).
Aislamiento de linfocitos T humanos primarios. Las celulas T humanas primarias se aislaron de las capas leucoplaquetarias o sangre venosa periferica heparinizada de voluntarios sanos no infectados con H. pylori mediante seleccion negativa usando el kit de aislamiento de celulas T Pan II (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayos de proliferacion celular: Celulas (105 PBMC, celulas T primarias purificadas o 104 celulas Jurkat/EL-4 /pocillo) se cultivaron en placas de 96-pocillos de fondo plano con medio completo. PBMC se estimularon por triplicado con PMA (20 ng/ml; Sigma) e Ionomicina (100 ng/ml; Sigma) y todas las celulas se cultivaron con o sin las concentraciones indicadas de protema total de sobrenadantes o protemas recombinantes de H. pylori. Celulas T humanas primarias se estimularon ya sea con PMA/Ionomicina como se describio anteriormente o con perlas anti- CD3/CD28 (Invitrogen) a 1 perla por celula T. La proliferacion celular se determino despues de 48h por la
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incorporacion de metil-[3H]-timidina (GE Healthcare) usando una matriz 9600 de contador beta dirigido Packard (Packard Instruments Co, Downer's Grove, Illinois).
Preparacion de protemas recombinantes. La protema GGT de H. pylori se expreso como protema con etiqueta 6xHis de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania). La region codificante de la protema GGT de H. pylori se amplifico por PCR (iniciador sentido: 5'-TGAAAGGAAAACcCATGGGACGGAG-3' (SEQ. ID. NO:8); antisentido: 5'-CaAaGgTaCCAAATTCTTTCCTTGG-3' (SEQ. ID. NO:9)). El producto de PCR se separo por electroforesis en gel de agarosa y purifico mediante extraccion del gel (Qiagen). Se restringio despues con NcoI y KpnI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) seguido por la ligacion dentro del vector sistema tri-pQE (Qiagen) despues de la re-purificacion. El vector resultante se transformo en la cepa M15 de E. coli. El caldo LB suplementado con 100 pg/ml de ampicilina (Sigma) y 25 pg/ml de kanamicina se inoculo con un cultivo de bacterias transformadas y crecio toda la noche a 37 °C con agitacion vigorosa hasta que la OD600 alcanzo 0.6. La expresion de HPGGT recombinante se indujo mediante la adicion de isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG; Applichem, Darmstadt, Alemania) a una concentracion final de 1 mM y se realizo durante 4 horas a 25 °C para minimizar la cantidad de cuerpos de inclusion. Despues todo el cultivo se centrifugo (5000xg) durante 10 min a 4 °C. Durante la lisis bajo condiciones nativas, los sedimentos se solubilizaron en tampon de union fno (20 mM de Tris/HCl. 500 mM de NaCl, 20 mM de imidazol (Sigma), pH 7.4) que contiene inhibidores de la proteasa (coctel inhibidor de proteasa para protemas con etiqueta His, Sigma). Las celulas se lisaron despues con dos ciclos de congelacion & descongelacion en N2 lfquido y posterior sonicacion (sonicacion de 2x1min con descanso de 5 min en hielo entre ciclo) en hielo. Despues de la centrifugacion (17500xg a 4 °C) durante 10 min, el sobrenadante se sometio a digestion de ADN y ARN. Despues de una etapa de centrifugacion adicional (22000xg durante10 min a 4 °C) los sobrenadantes se prepararon para la purificacion. En la primera etapa de la purificacion se usaron columnas HisTrapHP de 5 ml. La purificacion se llevo a cabo a temperatura ambiente y las muestras se mantuvieron en hielo todo el tiempo. El lisado de E. coli se cargo en la columna de Ni-sefarosa a 1 ml/min y se recogio en flujo continuo. Despues de cargar la muestra, la columna se lavo con diez volumenes de columna (cv) de tampon de union, diez cv de tampon de lavado (20 mM de Tris/HCl , 900 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 7.4) y otro tampon de union diez cv. La protema unida se eluyo con tampon de elucion (20mM de Tris/HCl, 500 mM de NaCl, 100-1000 mM de imidazol, pH 7.4) usando un gradiente gradual de imidazol (etapas de 100 mM). Los eluatos se recogieron en una fraccion por etapa de gradiente. Cada fraccion se probo despues para la actividad enzimatica de GGT y proceso para analisis de SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencia. Para la purificacion adicional de HPGGT recombinante, se agruparon las fracciones enzimaticamente activas a partir de la cromatograffa de afinidad Ni-sefarosa, dializaron durante 1 h contra 20 mM de Tris/HCl pH 7.5 a 4 °C y se procesaron en la segunda etapa de purificacion. La muestra dializada se cargo en una columna azul Affi-Gel® (BioRad) (cv: 12.3 ml). La columna se lavo con dos cv de tampon de union y la protema unida se eluyo con tampon de elucion (20 mM de Tris/HCl, 50-1000 mM de NaCl, pH 7.5) usando un gradiente gradual de NaCl (etapas de 50 mM). Todas las fracciones recogidas se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia usando el anticuerpo anti-GGT (ver mas abajo) y mediante el ensayo de actividad enzimatica de GGT (ver mas abajo) para la presencia de HPGGT recombinante. Las fracciones activas se agruparon, dializaron contra 20 mM de Tris/HCl pH 7.5 durante 90 min a 4 °C, alicuotaron y almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.
Mutagenesis sitio dirigida. La mutagenesis sitio-dirigida de HPGGT se realizo con un kit de mutagenesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene, Amsterdam, Pafses Bajos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secuencias iniciadoras fueron como sigue: S451/452A sentido: 5'-
CCAATAAGCGCCCTTTAGCCGCCATGTCGCCTACGATTGTG-3' (SEQ. ID. NO: 10); S451/452A antisentido: 5'- CACAATCGTAGGCGACATGGCGGCTAAAGGGCGCTTATTGG-3' (SEQ. ID. NO: 11). El exito de la mutagenesis se confirmo por secuenciacion.
Inmunoelectrotransferencia. Para el analisis de inmunoelectrotransferencia 107 celulas T Jurkat o PBMC se usaron. Antes del experimento, las celulas Jurkat se privaron de suero durante 18 h en medio que contiene 0.2 % de FCS. Despues, las celulas se liberaron con 10 % de FCS y se trataron como se describe. En los intervalos de tiempo indicados, se recogieron las celulas, lavaron una vez con PBS fno, resuspendieron en tampon de lisis 1x (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) que contienen inhibidores de proteasa (2.5 mM de pirofosfato sodico, 1 mM de p-glicerofosfato, 1 mM de Na3VO4, 1 pg/ml de leupeptina, 1 mM de PMSF; Sigma) y se sonico con un sonicador de punta micro en hielo durante 30 segundos. Los lisados se centrifugaron a 10000xg durante 10 min a 4 °C y los sobrenadantes se usaron para inmunoelectrotransferencia. Cantidades iguales de protema (determinado por el ensayo de Bradford, BioRad) se separaron por Tricina-SDS-PAGE y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad). Para la deteccion, las membranas se probaron con anticuerpos primarios anti-p27, anti- ciclina D3, anti-ciclina E, anti-c-Myc (Dianova, Hamburg, Alemania), anti-Cdk2 (Santa-Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania), anti-fosfo-AKT (Ser 473), anti-fosfo-c-Raf (Ser 338), anti-fosfo-p70S6K (Thr 389; Cell Signaling), anti-fosfo-FKHRL1/Foxo3 (Thr 32; Upstate, Lake Placid, Nueva York), anti-actina (Sigma) y anti-VacA (Austral Biologicals, San Ramon, California). La union de anticuerpos primarios se revelo usando anticuerpos secundarios adecuados conjugados a peroxidasa (Dianova) y reactivos de quimioluminiscencia (Perbio Science, Bonn, Alemania). Para la deteccion de la subunidad mayor de la protema HPGGT, se uso un anticuerpo policlonal de conejo anti-GGT generado contra un peptido sintetizado IQPDTVTPSSQIKPGM incluyendo los residuos de aminoacidos 356 a 371 del producto genico HP 1118 (Charles River, Kisslegg, Alemania).
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Transferencia del suero. Para la deteccion de anticuerpos espedficos HPGGT en sueros humanos, 0.1 |jg de protema recombinante HPGGT purificada se separo por SDS-PAGE y transfirio a membranas de nitrocelulosa como se describio anteriormente. La membrana se tino con solucion de Ponceau S (0,2 % Ponceaus S, 3 % de acido tricloroacetico en H2O) y se corto en tiras. Despues de bloquear (IxTBS + 5 % de leche en polvo baja en grasa) cada tira se incubo con suero (diluido 1:20000 en tampon de bloqueo) de pacientes infectados y no-infectados con H. pylori, respectivamente, a 4 °C con agitacion durante la noche. Despues del lavado, las tiras de membrana se incubaron con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a HRP (Dianova; dilucion 1:10000) y finalmente, despues de otra etapa de lavado, la union de anticuerpos sericos a la protema HPGGT se revelo mediante la reaccion de quimioluminiscencia como se describio anteriormente. El estado de los pacientes con infeccion por H. pylori se evaluo usando el ELISA convencional para IgG de H. pylori.
Analisis del ciclo celular. Antes del analisis, las celulas T Jurkat (5x106 celulas / analisis) se privaron de suero durante 18 h en medio que contiene 0.2 % de FCS. Despues de la liberacion con 10 % de FCS y el tratamiento de las celulas con sobrenadantes indicados de las cepas de H. pylori durante 24h, el analisis del ciclo celular se realizo con la tincion de BrdU-FITC / PI (Sigma) de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un anticuerpo anti-BrdU conjugado con FITC (BD Bioscience, Heidelberg, Alemania). Durante el analisis posterior de separacion celular activada por fluorescencia (FACS), usando un citometro de flujo FACScan Becton-Dickinson, se adquirieron 10000 eventos. Los datos se analizaron usando el paquete de software Cell Quest (BD Biosciences).
Ensayo de actividad Y-glutamil transpeptidasa (GGT). El ensayo para la actividad GGT se adapto a partir del metodo de Meister y otros27. En resumen, se preparo el tampon de reaccion que consiste en 20 mM de glicil-glicina (Sigma) como aceptor, 2.5 mM de L-Y-glutamil-p nitroanilida (Calbiochem, Schwalbach, Alemania) como sustrato donador y 100 mM de Tris-HCl (pH 8.0). En algunos experimentos el pH del tampon de ensayo se vario entre 2 y 10. Sobrenadantes de diferentes cepas de H. pylori, HPGGT recombinante purificada o GGT de rinon equino (Sigma) se anadieron, y la reaccion procedio a 37 °C durante 30 min. La liberacion de p-nitroanilida se controlo por espectrofotometna a 405 nm. Una unidad de actividad se definio como la cantidad de enzima que libero 1 jmol de p- nitroanilida por min y por mg de protema a 37 °C.
ELISA. Las PBMC (5x105 cada) se trataron durante 24 h como se representa. A intervalos de tiempo indicados las celulas se retiraron mediante centrifugacion y los sobrenadantes se analizaron para cantidades de IL-2 (eBioscience, San Diego, CA) y IFN-y (Biosource, Solingen, Alemania) por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los lfmites inferiores de deteccion fueron 4 pg/ml.
Analisis de apoptosis. 5x105 celulas T Jurkat se trataron como se indica. Despues de 24h las celulas se cosecharon por centrifugacion, lavaron, resuspendieron en tampon de union AnexinaV-500 pl (10 mM de HEPES/NaOH, pH 7.4, 140 mM de NaCl, 2.5 mM de CaCh) y se tineron durante 10 min cada una con 5 jl de Anexina V-FITC recombinante (Caltag, Burlingame, California) y 0.5 jg/ml de PI a temperatura ambiente en lo oscuro. Las celulas apoptoticas se midieron mediante analisis de FACS (ver mas abajo). Los datos se analizaron usando el software Cell Quest.
Estadfsticas. Los datos se presentan como media ± desviacion estandar (SD). Para analisis estadfstico la prueba de f-Student se uso. Los valores de p <0.05 se consideraron significativos.
Ejemplo 2: Identificacion de GGT como una protema putativa de H. Pylori que inhibe la proliferacion de celulas T
Se demostro previamente que una protema de bajo peso molecular secretada por H. pylori inhibe la proliferacion de los linfocitos T.3 Para identificar el factor inmunosupresor, se realizo la cromatograffa de exclusion por tamano con sobrenadantes de la cepa de H. pylori G27. En lmea con el trabajo anterior solo las fracciones que eluyen con un peso molecular entre 30-66 kDa inhibieron la proliferacion de linfocitos, mientras que todas las otras fracciones no (datos no mostrados).
Dos grupos independientes realizaron previamente un analisis sistematico de protemas secretadas de H. pylori mediante diferentes tecnicas de proteomica.910 Usando estos datos todas las protemas secretadas de H. pylori con un peso molecular entre 30 y 66 kDa se enumeraron (Fig. 1A). Las protemas obtenidas de las fracciones cromatograficas se analizaron por SDS-PAGE y tincion con plata (Fig. 1A). Cuatro posibles candidatos con un tamano entre 30 y 66 kDa se encontraron, que mostraron un perfil de elucion que coincide con el perfil de la actividad inhibidora de las fracciones (Fig. 1B; indicado por flechas). Todas las otras bandas de protema en las fracciones inhibidoras estaban tambien presentes en las fracciones no-inhibidoras y por lo tanto no podnan ser responsables de la inhibicion de la proliferacion de celulas T. Los pesos moleculares de dos de las cuatro protemas candidatas (Fig. 1B) correspondieron a los fragmentos de la protema secretada de H. pylori Y-glutamil transpeptidasa (GGT, HP1118). La primera banda en 60 kDa puede representar la pro-forma GGT (PM 61 kDa) y la otra en 38 kDa la subunidad mayor de GGT.11 Para investigar la presencia de HPGGT catalfticamente activo en estas fracciones de sobrenadante, se realizo un ensayo fotometrico de actividad GGT. La Figura 1C muestra que solo las fracciones que inhiben la proliferacion de linfocitos (b-f) muestran tambien actividad de GGT.
Ejemplo 3: Mutantes de H. pylori deficientes de GGT carecen de capacidad para eliminar la proliferacion de celulas T.
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Para determinar si GGT era responsable de la inhibicion observada de la proliferacion de linfocitos, se generaron mutantes isogenicos knock-out GGT de H. pylori. Los mutantes crecieron normalmente in vitro como descrito por otros grupos, lo que indica que la GGT no es esencial para la supervivencia de H. pylori.11,12,13 Los sobrenadantes de estos mutantes se probaron para su actividad inhibidora de la proliferacion con celulas T y PBMC humanas aisladas, estimuladas con anti-CD3/CD28 o PMA/ionomicina, en comparacion con la cepa de silvestre correspondiente (Fig. 2A, C). A diferencia de la cepa silvestre el potencial inhibidor de bacterias AGGT frente las celulas T y PBMC humanas primarias se anulo completamente. Para excluir la recombinacion espontanea y la reactivacion de GGT, los sobrenadantes de bacterias deficientes de GGT se verificaron midiendo la actividad enzimatica y mediante inmunoelectrotransferencia usando un anticuerpo policlonal que produjimos contra la subunidad mayor de HPGGT. El control de carga muestra la presencia de la protema secretada VacA en los sobrenadantes de las bacterias silvestre y deficientes de GGT (Fig. 2B). Asf, GGT es responsable de la inhibicion de la proliferacion de celulas T por Helicobacter pylori.
Ejemplo 4: HPGGT recombinante inhibe la proliferacion de linfocitos.
Para demostrar ademas que la inhibicion observada fue mediada unicamente por el HPGGT, una protema HPGGT recombinante con etiqueta His se expreso en E. coli. La protema se purifico hasta la homogeneidad por cromatograffa como se describio en la seccion de "Materiales y Metodos". sDS-PAGE y tincion de plata, asf como inmunoelectrotransferencia indicaron que HPGGT recombinante se sintetizo como un pro-forma y posteriormente se proceso en una subunidad mayor y menor, con pesos moleculares de ~38 y ~20 kDa, respectivamente (Fig. 3A, B). La protema recombinante mostro una fuerte actividad GGT (Fig. 3C) e inhibio eficazmente la proliferacion de PBMC (Fig. 3D). Adicionalmente, experimentos adicionales mostraron la actividad catalttica de la HPGGT en un intervalo de pH de 2-10 (Fig. 3E) que soporta la presencia de la enzima funcional en el sitio de la infeccion.
Ejemplo 5: El efecto inhibidor de HPGGT depende de la actividad catalftica de GGT.
Como la GGT se expresa tambien por celulas de mairnfero incluyendo las celulas T humanas nos inclinamos a determinar si un GGT de mamffero inhibfa tambien la proliferacion de linfocitos. GGT purificada de rinon equino mostro actividad catalftica (Fig. 4A). Sin embargo, incluso una cantidad cuatro veces mayor de GGT equina en comparacion con HPGGT fallo para inhibir la proliferacion de PBMC (Fig. 4B). Para explorar si era requerida la actividad transpeptidasa catalftica de GGT para la inhibicion de la proliferacion de celulas T, se genero un mutante de la protema recombinante. Encontramos que la mutagenesis de los residuos de serina 451 y 452 en alanina (S451/452A) suprimio completamente la actividad enzimatica de HPGGT recombinante (Fig. 4A) y anulo ademas la inhibicion de la proliferacion de linfocitos (Fig. 4B).
Para confirmar estos resultados, la HPGGT recombinante y sobrenadantes de la cepa de H. pylori silvestre G27 se preincubaron con el inhibidor acivicina de GGT. Este compuesto actua como un inhibidor irreversible y competitivo de GGT. La inhibicion de GGT por acivicina mostro involucrarse en su transformacion despues de unirse a la enzima en una especie inhibidora unida a un grupo hidroxilo espedfico de GGT.1415 La medicion de la actividad GGT enzimatica y determinacion de la proliferacion de linfocitos mostro que el pretratamiento con acivicina reprimio completamente la actividad de GGT (Fig. 4C) y la inhibicion de la proliferacion de PBMC (Fig. 4D) con sobrenadantes de H. pylori silvestre. Resultados similares se obtuvieron para HPGGT recombinante (datos no mostrados).
Ejemplo 6: HPGGT inhibe la proliferacion de linfocitos sin reducir la secrecion de IL-2 e IFNy y sin inducir apoptosis.
Hasta ahora no se sabfa nada sobre el papel de HPGGT en la supresion de la respuesta inmune del huesped. La inhibicion de la proliferacion de linfocitos por HPGGT informada en la presente puede resultar de la interferencia con la secrecion de citocinas de PBMCs humanos. Para probar esta hipotesis, las celulas se estimularon con PMA e ionomicina y se incubaron con o sin H. pylori silvestre y sobrenadantes de AGGT o HPGGT recombinante a diferentes concentraciones durante 24 h. En comparacion con el control estimulado, ninguno de estos tratamientos condujeron a la reduccion de la secrecion de IL-2 (Fig. 5A), la cual se sabe que es esencial para la proliferacion de los linfocitos. Adicionalmente la secrecion de IFN-y no se redujo (Fig. 5B). Asf, mostramos que la inhibicion de la proliferacion de celulas T por HPGGT no es causada con la disminucion de la activacion de estas celulas. Informes anteriores sugirieron la induccion de estres oxidativo y apoptosis por HPGGT en las celulas epiteliales gastricas.1216 Sin embargo, nada se sabe sobre el efecto de GGT de H. pylori frente a los linfocitos.
Informes adicionales sugieren la induccion de la apoptosis en las celulas T por H. pylori como un mecanismo para la inhibicion de la proliferacion de celulas T por la bacteria (Wang y otros J Immunol 2001). Para examinar la posibilidad de que la apoptosis es responsable de la reduccion de la proliferacion de linfocitos por la HPGGT descrita en la presente, se realizo la tincion con Anexina V-FITC/PI y posterior analisis FACS usando celulas T Jurkat (Fig. 5C). Ni los sobrenadantes de la cepa de H. pylori silvestre ni AGGT ni HPGGT recombinante usados en concentraciones, que causaron una fuerte inhibicion de la proliferacion de linfocitos, indujeron un aumento en la apoptosis. Por lo tanto, la anulacion de la proliferacion de celulas T por el HPGGT esta mediada por un mecanismo independiente de apoptosis.
Ejemplo 7: Efecto de HPGGT sobre la progresion del ciclo celular en las celulas T.
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A continuacion tratamos de caracterizar mas aun el efecto de HPGGT sobre los procesos celulares implicados en la proliferacion de celulas T. El analisis usando la tincion con BrdU/PI mostro una detencion del ciclo celular G1 en las celulas T Jurkat inducido por los sobrenadantes silvestre, pero no por los deficientes de GGT de H. pylori (Fig. 6A). Esta detencion se caracterizo por un aumento de celulas en la fase G1 (Fig. 6A; cuadrante inferior izquierdo) en presencia de GGT de H. pylori de 35 a 46 %. Como consecuencia, la cantidad de celulas en la fase S (cuadrantes superior izquierdo y derecho) se redujo a 38 % en comparacion con el control (Basal, 55 %) durante el tratamiento con los sobrenadantes silvestre, pero no con los deficientes de GGT de H. pylori. En lmea con esto, el analisis de inmunoelectrotransferencia de las mismas muestras revelaron una reduccion pronunciada de los niveles de protema celular ciclina D3, asf como E1. Adicionalmente, la cantidad del inhibidor Cdk p27Kip1 se elevo de una de manera GGT-dependiente (Fig. 6A). La diferencia en los niveles de protema ciclina entre las celulas tratadas con 10 y 5 p/ml de sobrenadante de HP WT indica que un umbral de la actividad de GGT ha de superarse para antagonizar la proliferacion de linfocitos. Este es, obviamente, el caso en una concentracion de 10 pg/ml de protema total en el sobrenadante. A concentraciones inferiores de 5 pg/ml se necesita mas tiempo para que la GGT inhiba la progresion del ciclo celular en los linfocitos. Usando la protema recombinante HPGGT, se observo una reduccion completa de los niveles de ciclina a una concentracion tan baja como 2 pg/ml
Estos resultados se confirmaron en PBMCs humanos, que exhiben una reduccion aun mas fuerte de las mismas protemas que regulan el ciclo celular (Fig. 6 B) cuando se trata con HPGGT recombinante o diferentes concentraciones de sobrenadantes de H. pylori silvestre pero no con cepas AGGT. Nuestros resultados apuntan claramente a GGT siendo el factor responsable de la induccion de una detencion del ciclo celular G1 en los linfocitos T por H. pylori.
Ejemplo 8: Interferencia de HPGGT con la senalizacion dependiente de Ras en celulas T.
Las vfas dependientes de Ras y PI3K son los principales reguladores de la progresion del ciclo celular. Como estas vfas demostraron que proceden independientemente una de otra en las celulas T17, investigamos la influencia de los sobrenadantes de H. pylori asf como HPGGT recombinante sobre el estado de activacion de miembros importantes de ambas vfas. El analisis por inmunoelectrotransferencia de lisados celulares a partir de celulas T Jurkat y PBMC mostro que los niveles celulares y la fosforilacion de AKT, p70S6k y Foxo 3, importantes mediadores de la senalizacion de PI3K no se redujeron en presencia de HPGGT (Fig. 6A). A diferencia, los niveles celulares de c-Myc, asf como la fosforilacion de la protema c-Raf, mediadores centrales de la via dependiente de Ras, se redujeron en presencia de HPGGT en las mismas celulas (Figura 6A, B).
Ejemplo 9: Respuesta de anticuerpos frente a HPGGT en sueros de pacientes HP-positivo
Aunque se demostro que la GGT de H. pylori se secreta al medio extracelular por la bacteria (Bumann y otros) no esta claro si la protema alcanza las celulas T en la lamina propia para ejercer sus efectos inmunosupresores. Para dirigir esta pregunta probamos el suero de 14 pacientes (9 infectado y 5 no-infectados con H. pylori) para detectar la presencia de anticuerpos espedficos a HPGGT. Los resultados mostraron una fuerte respuesta de anticuerpos frente a la pro-forma y la subunidad mayor de la HPGGT en pacientes H.pylori-positivo (Figura 7, 1-9) pero no en los no-infectados (Figura 7, 10-14) lo que sugiere una interaccion de HPGGT con el sistema inmunologico humano.
Ejemplo 10: Respuesta inmune inhibidora frente a HPGGT despues de la inmunizacion, sin infeccion
Los animales se inmunizaron ya sea con el peptido 356 IQPDTVTPSSQIKPGM 371 ubicado a una distancia separada del centro catalftico de la gammaglutamiltranspeptidasa (HPGGT) de Helicobacter pylori o con la protema recombinante HPGGT inactiva en combinacion con CT como adyuvante. Solo en los animales inmunizados con la forma inactiva de HPGGT, se detectaron anticuerpos inhibidores en el suero, usando el ensayo de activacion estandar de HPgGT. Ninguna respuesta inmune inhibitoria se detecto en los animales control que recibieron solo el tampon, en los animales infectados o en los animales inmunizados con el peptido 356-371. Estos resultados demuestran que una respuesta inmune inhibidora contra HPGGT se puede lograr, y depende altamente de la seleccion del antfgeno. Mas aun, la infeccion con H. pylori no induce dicha respuesta inhibidora.
Los resultados se muestran en la Fig. 9.
REFERENCIAS
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Claims (13)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Una composicion inmunogenica que comprende una forma enzimaticamente inactiva de H. pylori gamma-glutamil transpeptidasa (HPGGT) para uso como un medicamento,en la que HPGGT tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoacidos que es al menos 90% o al menos 95% identica a la SEQ ID NO: 1,en la que la forma enzimaticamente inactiva de HPGGT carece de los residuos de serina en las posiciones 451 y 452 de la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, yen la que la forma enzimaticamente inactiva de HPGGT induce una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos con un efecto anulador sobre la supresion dependiente de HPGGT de la proliferacion de linfocitos.
- 2. Una composicion inmunogenica que comprende un fragmento enzimaticamente inactivo de H. pylori gamma- glutamil transpeptidasa (HPGGT) para uso como un medicamento,en la que HPGGT tiene una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoacidos que es al menos 90% o al menos 95% identica a SEQ ID NO: 1,en la que el fragmento enzimaticamente inactivo de HPGGT consiste en un tramo de aminoacidos contiguos que comprende los aminoacidos 451 y 452 de HPGGT,en la que el fragmento enzimaticamente inactivo de HPGGT carece de los residuos de serina en las posiciones 451 y 452 de la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, yen la que el fragmento enzimaticamente inactivo de HPGGT induce una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos con un efecto anulador sobre la supresion dependiente de HPGGT de la proliferacion de linfocitos.
- 3. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que los residuos de serina en las posiciones 451 y 452 de la secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID NO: 1 son reemplazados por residuos de alanina.
- 4. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la respuesta de anticuerpos comprende anticuerpos con un efecto inhibidor sobre HPGGT, mas preferiblemente sobre la actividad enzimatica de HPGGT.
- 5. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion comprende uno o varios adyuvantes.
- 6. La composicion inmunogenica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composicion comprende uno o varios antfgenos de H. pylori.
- 7. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el antfgeno se selecciona del grupo que comprende protemas de membrana externa.
- 8. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el antfgeno se selecciona del grupo que comprende HpaA, Omp18 y combinaciones de los mismos.
- 9. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el medicamento es una vacuna.
- 10. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el medicamento o la vacuna es para la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad, en la que la enfermedad es causada por o esta asociada con H. pylori, mas preferiblemente una enfermedad causada por o asociada con la infeccion de H. pylori.
- 11. La composicion inmunogenica para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la enfermedad se selecciona del grupo que comprende infeccion con H. pylori, trastornos gastro duodenales causados por H. pylori, gastritis, gastritis cronica, ulcera gastrica o duodenal, cancer de estomago y linfoma (MALT).Frflcdofiei inhlbidcra* dei* proliferation
imagen1 imagen2 imagen3 Figura 1 A-CFigura 2 A-C% de! n hi b-icion de la proliferationimagen4 3pimagen5 IDAcllwdad <i<*l [nhl/ru]o B_fe_g_s_gimagen6 imagen7 imagen8 - 81.03-80-80S8S800H3Fracc16r>
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imagen12 Figura 4 A-DAlimagen13 Figura 5A-B88NJ00oHFigura 5 CCorneas Conttoi■SO 12CWJOI +0 SO 130imagen14 10’ 1Anexina-FHCimagen15 101 tf^ 1CAnexina-FITCBasalNJCDimagen16 Figura 6 A+ HP WT 10(jg/mlimagen17 + HPfiGOT lOjjg/mlimagen18 imagen19 Figura 6 BaGGTimagen20 t iFigura 7Basal+PMA/lonomicing+reK. GGT +rek.GGT,Glutamina +rek.GGT.Inactivacion+rek.GGT,lnactivaci6n,+L-Glutamina+Glutamato +g-,GI utamilcfiu lamina +rek.GGT,AS sin Glutaminaimagen21 DFigura 8imagen22 Figura 9imagen23
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