JP6054303B2 - 腫瘍試料の多重遺伝子分析の最適化 - Google Patents
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Description
本発明は、腫瘍試料由来の核酸を分析するために最適化された方法、例えば、統合された最適化核酸選択、読み取りアライメント、および変異呼び出しを有する方法に関する。
(a)複数の標的メンバー、例えば、腫瘍メンバーを含むライブラリを、試料、例えば、腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させて選択されたメンバーを提供することと(本明細書で「ライブラリ捕獲物」と称される場合もある)、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からの腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りをアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置、例えば、複数のサブゲノム間隔のそれぞれ、例えば、複数の遺伝子のそれぞれにおいて事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該試料を分析し、
該分析において、
(i)X個のヌクレオチド位置がそれぞれ、ステップ(b)、(c)、(d)、もしくは(e)のうちの1つまたはそれらの組み合わせについて一意の組の条件下で分析される(一意とは、他のX−1個の組の条件とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、もしくは500である)。例えば、第1の組の条件、例えば、本明細書に記載の組の条件が、例えば、第1のサブゲノム間隔または遺伝子における第1のヌクレオチド位置のために使用され、第2の組の条件、例えば、本明細書に記載の第2の組の条件が、例えば、第2のサブゲノム間隔または遺伝子における第2のヌクレオチド位置のために使用される。
(ii)X個のヌクレオチド位置のそれぞれについて、ヌクレオチド位置で生じ得る事前選択された変化、例えば、変異の特性、例えば、本明細書に記載の特性に応答して、ヌクレオチド位置は、一意の組の条件下で分析され(一意とは、他のX−1個の組の条件とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、もしくは500である)。例えば、第1のサブゲノム間隔におけるヌクレオチド位置で生じ得る事前選択された変化、例えば、変異の特性、例えば、本明細書に記載の特性に応答して、ヌクレオチド位置は、第1の組の条件下で分析され、第2のサブゲノム間隔におけるヌクレオチド位置で生じ得る事前選択された変化、例えば、変異の特性、例えば、本明細書に記載の特性に応答して、ヌクレオチド位置は、第2の組の条件下で分析され、そこで(iii)該方法は、試料、例えば、保存された腫瘍試料上で、少なくとも2、5、10、20、50、もしくは100個のサブゲノム間隔、例えば、遺伝子におけるヌクレオチド位置に対して95、98、もしくは99%の感度または特異性を可能にする条件下で行われる。あるいは
(iv)方法は、以下のうちの1つ以上もしくはすべてを含む:
a)第1のサブゲノム間隔を配列決定して約500倍以上の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の5%を超えない細胞に存在する変異を配列決定すること、
b)第2のサブゲノム間隔を配列決定して約200倍以上、例えば、約200倍〜約500倍の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の10%を超えない細胞に存在する変異を配列決定すること、
c)第3のサブゲノム間隔を配列決定して約10〜100倍の配列決定深度を提供する、例えば、a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)単一ヌクレオチド多型(SNP)、またはb)患者を一意に特定する(例えば、フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNPから選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を配列決定すること、
d)第4のサブゲノム間隔を配列決定して約5〜50倍の配列決定深度を提供し、例えば、ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出すること。例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とする。そのようなベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる、または
e)第5のサブゲノム間隔を配列決定して約0.1〜300倍の配列決定深度を提供し、例えば、コピー数の変化を検出すること。一実施形態において、コピー数の変化を検出するための配列決定深度は、約0.1〜10倍の配列決定深度の範囲である。他の実施形態では、ゲノムDNAのコピー数獲得/喪失またはヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するための配列決定深度は、約100〜300倍の範囲である。
第1のベイトセットが、第1のサブゲノム間隔のために使用され、第2のベイトセットが、第2のサブゲノム間隔のために使用される。
第1のアライメント方法が、第1のサブゲノム間隔についての読み取りに適用され、第2のアライメント方法が、第2のサブゲノム間隔についての読み取りに適用される。
第1の変異呼び出し方法が、第1のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用され、第2の変異呼び出し方法が、第2のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用される。
ある実施形態において、
第1のヌクレオチド位置が、第1の組のベイト条件、第1のアライメント方法、および第1の変異呼び出し方法で分析され、
第2のヌクレオチド位置が、該第1の組のベイト条件、第2のアライメント方法、および該第1の変異呼び出し方法で分析され、
第3のヌクレオチド位置が、該第1の組のベイト条件、該第1のアライメント方法、および第2の変異呼び出し方法で分析され、
他の2つと比較して、それぞれ一意の条件下で分析された3個のヌクレオチド位置を提供する。
ある実施形態において、条件は、以下であるものを含む:
第1のベイトセットが、第1のサブゲノム間隔のために使用され、第2のベイトセットが、第2のサブゲノム間隔のために使用されること、
第1のアライメント方法が、第1のサブゲノム間隔についての読み取りに適用され、第2のアライメント方法が、第2のサブゲノム間隔についての読み取りに適用されること、または
第1の変異呼び出し方法が、第1のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用され、第2の変異呼び出し方法が、第2のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用されることを含む。
(i)変化が位置する遺伝子もしくは遺伝子型、例えば、癌遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子、事前選択されたバリアントもしくはバリアントの種類、例えば、変異、または事前選択された頻度の変異を特徴とする遺伝子もしくは遺伝子型、または本明細書に記載の他の遺伝子もしくは遺伝子型、
(ii)変化の種類、例えば、置換、挿入、欠失、または転座、
(iii)試料の種類、例えば、変化について分析されるFFPE試料、
(iv)評価される変化の該ヌクレオチド位置における配列またはその付近の配列、例えば、予想されるサブゲノム間隔の誤アライメント傾向に影響を及ぼし得る配列、例えば、ヌクレオチド位置における反復配列またはその付近の反復配列の存在、
(v)例えば、事前選択された腫瘍型における変化、例えば、変異を示す読み取りを観察する先行(例えば、文献)予想、
(vi)塩基呼び出しエラーのみによる変化を示す読み取りを観察する確率、あるいは
(vii)変化の検出に所望される事前選択された配列決定深度。
(i)方法、例えば、上述の方法の(b)は、本明細書に記載のベイトセット、例えば、表題「ベイト」もしくは「ベイトモジュール」に記載されるベイトセットの使用を含むこと、
(ii)方法、例えば、上述の方法の(c)は、一組もしくは一群のサブゲノム間隔についての読み取りを本明細書に記載の遺伝子の組もしくは群から取得することを含むこと、
(iii)方法、例えば、上述の方法の(d)は、本明細書に記載の複数のアライメント方法、例えば、表題「アライメント」もしくは「アライメントモジュール」に記載される方法の使用を含むこと、
(iv)方法、例えば、上述の方法の(e)は、ヌクレオチド値を本明細書に記載の事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てるための複数の方法、例えば、表題「変異呼び出し」もしくは「変異呼び出しモジュール」または表題「臨床癌検体の次世代配列決定由来の体細胞ゲノム変化の高感度検出に対するベイズ手法」の項に記載される方法の使用を含むこと、あるいは
(v)方法は、ヌクレオチド値を本明細書、例えば、表題「遺伝子選択または遺伝子選択モジュール」の項に記載の一組のサブゲノム間隔に割り当てることを含むこと。
アライメント
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー(本明細書でライブラリ捕獲物と称される場合もある)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りをアライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対して該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み
それによって、該腫瘍試料を分析し、
X個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれからの読み取りは、一意のアライメント方法でアライメントされ、一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意のアライメント方法とは、他のX−1個のアライメント方法とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2である。
ある実施形態において、Xは、少なくとも3、4、5、10、15、20、30、50、100、500、または1,000である。
ある実施形態において、少なくともX個の遺伝子、例えば、表1および表1Aの少なくともX個の遺伝子、例えば、表1および表1Aにおいて優先順位が1のアノテーションを有する遺伝子由来のサブゲノム間隔は、一意のアライメント方法でアライメントされ、Xは、2、3、4、5、10、15、20、または30に等しい。
該アライメント方法は、以下のうちの1つ以上もしくはすべての関数であるか、それらに応答して選択されるか、またはそれらのために最適化される:
(i)腫瘍型、例えば、該試料中の腫瘍型、
(ii)配列決定される該サブゲノム間隔が位置する遺伝子もしくは遺伝子型、例えば、事前選択されたバリアントもしくはバリアントの種類、例えば、変異、または事前選択された頻度の変異を特徴とする遺伝子もしくは遺伝子型、
(iii)分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)、
(iv)評価されるサブゲノム間隔内のバリアントの種類、例えば、置換、
(v)試料の種類、例えば、FFPE試料、および
(vi)評価される該サブゲノム間隔における配列もしくはその付近の配列、例えば、該サブゲノム間隔の予想される誤アライメント傾向、例えば、該サブゲノム間隔における反復配列またはその付近の反復配列の存在。
事前選択された再編成とアライメントするために事前選択される再編成参照配列を読み取りとのアライメントのために選択することと(実施形態において、参照配列はゲノム再編成と同一ではない)、
読み取りを該事前選択された再編成参照配列と比較する、例えば、アライメントすることを含む。
第1の組のパラメータ下で(例えば、第1のマッピングアルゴリズムまたは第1の参照配列との)読み取りの比較、例えば、アライメント比較を行うことと、該読み取りが第1の所定のアライメント基準を満たす(例えば、読み取りが、例えば、事前選択された数未満のミスマッチで、該第1の参照配列とアライメントされ得る)かを決定することと、
該読み取りが第1の所定のアライメント基準を満たすことができない場合、第2の組のパラメータ下で(例えば、第2のマッピングアルゴリズムまたは第2の参照配列との)第2のアライメント比較を行うことと、
任意で、該読み取りが該第2の所定の基準を満たす(例えば、読み取りが事前選択された数未満のミスマッチで該第2の参照配列とアライメントされ得る)かを決定することとを含んでもよく、
該第2の組のパラメータは、一組のパラメータ、例えば、該第1の組のパラメータと比較して、事前選択されたバリアント、例えば、再編成、例えば、挿入、欠失、または転座についての読み取りとのアライメントをもたらす見込みがより高い該第2の参照配列の使用を含む。
変異呼び出し
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを試料、例えば、腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー、例えば、ライブラリ捕獲物を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法または本明細書に記載の呼び出し方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
X個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれにおいてヌクレオチド位置に対して割り当てられるヌクレオチド値は、一意の呼び出し方法によって割り当てられ、一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意の呼び出し方法とは、他のX−1個の呼び出し方法とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2である。呼び出し方法は、例えば、異なるベイズ先行値に依存するという点で異なり、したがって、一意であり得る。
該X個のサブゲノム間隔のそれぞれにおける事前選択されたヌクレオチド位置に対して、
(i)腫瘍型Xにおける該事前選択されたヌクレオチド位置で事前選択されたバリアント、例えば、変異を示す読み取りを観察する先行(例えば、文献)予想であるか、またはそれを表す第1の値、
(ii)バリアントがある頻度で(例えば、1%、5%、10%等)試料中に存在する場合、および/またはバリアントが不在である(例えば、塩基呼び出しエラーのみによって読み取りにおいて観察される)場合、該事前選択されたヌクレオチド位置で該事前選択されたバリアントを示す読み取りを観察する確率を表す第2の一組の値、
を取得することと、
該値に応答して、例えば、本明細書に記載のベイズ方法によって、第1の値を用いて第2の組の値の間の比較を検討する(例えば、変異の存在の事後確率を算出する)ことによって、該事前選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当て(例えば、変異を呼び出す)、それによって、該試料を分析すること。
(i)少なくとも10、20、40、50、60、70、80、90、または100個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(この場合において、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値に基づく)、
(ii)(i)の方法の割り当てであって、少なくとも10、20、30、もしくは40個の割り当ては、例えば、事前選択された腫瘍型の細胞の5、10、または20%未満に存在する事前選択されたバリアントの確率の関数である第1の値を用いて行われること、
(iii)割り当てがそれぞれ事前選択された腫瘍型、例えば、該試料の腫瘍型に存在する(他のX−1個の割り当てではなく)一意の確率を有する事前選択されたバリアントに関連する、少なくともX個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(この場合において、任意で、それぞれの該X個の割り当ては、(他のX−1個の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値(X=2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100)に基づく)、
(iv)ヌクレオチド値を第1および第2のヌクレオチド位置で割り当てる(例えば、変異を呼び出す)ことであって、該第1のヌクレオチド位置における第1の事前選択されたバリアントが事前選択された腫瘍型(例えば、該試料の腫瘍型)に存在する可能性が、該第2のヌクレオチド位置での第2の事前選択されたバリアントが存在する可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30、または40倍大きく、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値に基づくこと、
(v)ヌクレオチド値を複数の事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てる(例えば、変異を呼び出す)ことであって、該複数の事前選択されたヌクレオチド位置は、以下の確率範囲:
.01未満、.01〜.02未満、
0.02より大きく0.03以下、
0.03より大きく0.04以下、
0.04より大きく0.05以下、
0.05より大きく0.1以下、
0.1より大きく0.2以下、
0.2より大きく0.5以下、
0.5より大きく1.0以下、
1.0より大きく2.0以下、
2.0より大きく5.0以下、
5.0より大きく10.0以下、
10.0より大きく20.0以下、
20.0より大きく50.0以下、ならびに
50より大きく100.0%以下
のうちの1つ以上、例えば、少なくとも3、4、5、6、7つ、もしくはすべてに分類されるバリアントの割り当てを含み、
確率範囲は、事前選択されたヌクレオチド位置における事前選択されたバリアントが、事前選択された腫瘍型(例えば、該試料の腫瘍型)に存在する確率の範囲であるか、または事前選択されたヌクレオチド位置における事前選択されたバリアントが、事前選択された型(例えば、該試料の腫瘍型)の腫瘍試料、腫瘍試料由来のライブラリ、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物中の列挙された%の細胞に存在する確率であり、
任意で、それぞれの割り当ては、一意の第1および/もしくは第2の値に基づく(例えば、列挙された確率範囲の他の割り当てではなく一意であるか、または他の列記された確率範囲のうちの1つ以上もしくはすべての第1および/もしく第2の値とは対照的に一意である)こと、
(vi)それぞれ独立して、該試料中のDNAの50、40、25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2、または0.1%未満に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(この場合において、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値に基づく)、
(vii)ヌクレオチド値を第1および第2のヌクレオチド位置で割り当てる(例えば、変異を呼び出す)ことであって、該試料のDNAにおける第1の位置での事前選択されたバリアントの可能性は、該試料のDNAにおける該第2のヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントの可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30、または40倍大きく、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値に基づくこと、
(viii)ヌクレオチド値を以下のうちの1つ以上もしくはすべてにおいて割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと、
(1)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の1.0%未満に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(2)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の1.0〜2.0%に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(3)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の2.0%より大きく3%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(4)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の3.0%より大きく4%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(5)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の4.0%より大きく5%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(6)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の5.0%より大きく10%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(7)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の10.0%より大きく20%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(8)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の20.0%より大きく40%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(9)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の40.0%より大きく50%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、あるいは
(10)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の50.0%より大きく100%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(この場合において、任意で、それぞれの割り当ては、一意の第1および/または第2の値に基づく(例えば、列挙された範囲(例えば、1%未満の(i)の範囲)の他の割り当てではなく一意であるか、または他の列記された範囲のうちの1つ以上もしくはすべてにおける決定のために、第1および/または第2の値ではなく一意である))、あるいは
(ix)ヌクレオチド値をX個のヌクレオチド位置のそれぞれに割り当てる(例えば、変異を呼び出す)ことであって、それぞれのヌクレオチド位置は、独立して、他のX−1個のヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントの可能性と比較して一意の(該試料のDNAに存在する事前選択されたバリアントの)可能性を有し、Xは、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100以上であり、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/または第2の値に基づくこと。
該X個のサブゲノム間隔のそれぞれについての閾値を取得し(該取得されたX個の閾値がそれぞれ他のX−1個の閾値と比較して一意である)、それによって、一意のX個の閾値を提供することと、
該X個のサブゲノム間隔のそれぞれについて、事前選択されたヌクレオチド位置において事前選択されたヌクレオチド値を有する読み取りの数の関数である観察された値をその一意の閾値と比較し、それによって、その一意の閾値を該X個のサブゲノム間隔のそれぞれに適用することと、
任意で、該比較の結果に応答して、ヌクレオチド値を事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てること。
式中、Xは、2以上である。
Xは、1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100以上である。
ベイト
(a)複数のメンバー(例えば、標的メンバー)を含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)ライブラリをベイトセットと接触させて選択されたメンバー(例えば、ライブラリ捕獲物)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りをアライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法または本明細書に記載の方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
この方法は、ライブラリを複数の、例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つのベイトまたはベイトセットと接触させることを含み、該複数のそれぞれのベイトまたはベイトセットは、(複数のベイトセットのうちの他のベイトセットとではなく)一意の事前選択された選択効率を有する。例えば、それぞれの一意のベイトまたはベイトセットは、一意の配列決定深度を提供する。本明細書で使用される「ベイトセット」という用語は、集合的に、1つのベイトまたは複数のベイト分子を指す。
a)約500倍以上の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の5%を超えない細胞に存在する変異を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
b)約200倍以上、例えば、約200倍〜約500倍の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の10%を超えない細胞に存在する変異を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
c)約10〜100倍の配列決定深度を提供する、例えば、a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)単一ヌクレオチド多型(SNP)、またはb)患者を一意に特定する(例えば、フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNPから選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
d)約5〜50倍の配列決定深度を提供する、例えば、ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット(例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とし、そのようなベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる)、または
e)約0.1〜300倍の配列決定深度を提供する、例えば、コピー数の変化を検出するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット。一実施形態において、配列決定深度は、コピー数の変化を検出するために、約0.1〜10倍の配列決定深度の範囲である。他の実施形態では、配列決定深度は、ゲノムDNAのコピー数獲得/喪失またはヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するために、約100〜300倍の範囲である。そのようなベイトセットを用いて、例えば、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子を検出することができる。
複数のメンバー、例えば、標的核酸メンバー(例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メンバー、および/またはPGxメンバーを含む)を含むライブラリ(例えば、核酸ライブラリ)を提供することと、
ライブラリを、例えば、溶液ベースの反応において、複数のベイト(例えば、オリゴヌクレオチドベイト)と接触させて、複数のベイト/メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
複数のベイト/メンバーハイブリッドを、例えば、該ハイブリダイゼーション混合物を、該複数のベイト/メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって、該ハイブリダイゼーション混合物から分離することと、を含み、
それによって、ライブラリ捕獲物(例えば、ライブラリ由来の核酸分子の選択または強化されたサブグループ)を提供し、
複数のベイトは、以下のうちの2つ以上を含む:
a)低頻度、例えば、約5%(すなわち、それらのゲノムにおける変化を持つ試料由来の細胞の5%)以下で出現する変化(例えば、1つ以上の変異)に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される、高レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上の腫瘍メンバー)を選択する第1のベイトセット(一実施形態において、第1のベイトセットは、約500倍以上の配列決定深度を必要とする変化(例えば、点変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である))、
b)a)における高レベルの標的よりも高い頻度、例えば、約10%(すなわち、それらのゲノムにおける変化を持つ試料由来の細胞の10%)の頻度で出現する変化(例えば、1つ以上の変異)に対する高レベルの感度を可能にするために高い対象範囲が要求される、中間レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上の腫瘍メンバー)を選択する第2のベイトセット(一実施形態において、第2のベイトセットは、約200倍以上の配列決定深度を必要とする変化(例えば、点変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である))、
c)高レベルの感度を可能にするために、例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子を検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、低レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上のPGxメンバー)を選択する第3のベイトセット(例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために、10〜100倍の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第3のベイトセットは、以下のうちの2つ以上を含む:a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)単一ヌクレオチド多型(SNP)、またはb)患者を一意に特定する(例えば、フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNPから選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を選択する)、
d)例えば、ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、第1のイントロン標的(例えば、イントロン配列を含むメンバー)を選択する第4のベイトセット(例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とする。該第4のベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる)、または
e)コピー数の変化を検出する能力を改善するために密でない対象範囲が要求される、第2のイントロン標的(例えば、イントロンメンバー)を選択する第5のベイトセット(例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために、0.1〜300倍の対象範囲を必要とする。一実施形態において、コピー数の変化を検出するための対象範囲深度は、約0.1〜10倍の範囲である。他の実施形態では、ゲノムDNAのコピー数獲得/喪失またはヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するための対象範囲深度は、約100〜300倍の範囲である。該第5のベイトセットを用いて、例えば、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子を検出することができる)。
(i)第1の事前選択された効率が、少なくとも約500倍以上の配列決定深度である第1の選択効率値を有する(例えば、第2、第3、第4、もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第2の選択効率値よりも約2〜3倍大きく、第3の選択効率値よりも約5〜6倍大きく、第4の選択効率値よりも約10倍大きく、第5の選択効率値よりも約50〜5000倍大きい)選択効率値を有する)。
(ii)第2の事前選択された効率が、少なくとも約200倍以上の配列決定深度である第2の選択効率値を有する(例えば、第3、第4、もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第3の選択効率値よりも約2倍大きく、第4の選択効率値よりも約4倍大きく、第5の選択効率値よりも約20〜2000倍大きい)選択効率値を有する)。
(iii)第3の事前選択された効率が、少なくとも約100倍以上の配列決定深度である第3の選択効率値を有する(例えば、第4もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第4の選択効率値よりも約2倍大きく、第5の選択効率値よりも約10〜1000倍大きい)選択効率値を有する)。
(iv)第4の事前選択された効率が、少なくとも約50倍以上の配列決定深度である第4の選択効率値を有する(例えば、第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第5の選択効率値よりも約50〜500倍大きい)選択効率値を有する)。または、
(v)第5の事前選択された効率が、少なくとも約10〜0.1倍の配列決定深度である第5の選択効率値を有する。
(i)異なるベイトセットの差次的表示:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計をより多い/より少ない数のコピーに含んで、相対的な標的の対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(ii)ベイトサブセットの差次的オーバーラップ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、隣接ベイト間により長いか、またはより短いオーバーラップを含ませて、相対的な標的の対象範囲を強化する/減少させることができる。
(iii)差次的ベイトパラメータ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、配列修正/より短い長さを含ませて、捕捉効率を減少させ、かつ相対的な標的の対象範囲を低下させることができる。
(iv)異なるベイトセットの混合:異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比で混合して、相対的な標的の対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(v)異なる種類のオリゴヌクレオチドベイトセットの使用:ある特定の実施形態において、ベイトセットは、以下のものを含んでもよい:
(a)1つ以上の化学的に(例えば、非酵素的に)合成された(例えば、個別に合成された)ベイト、
(b)アレイで合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えば、生体外で転写されたベイト、
(d)(a)、(b)、および/もしくは(c)の任意の組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記のうちのいずれかの組み合わせ。
(i)ベイト表示またはオーバーラップの増加/減少を用いて、同一のカテゴリー内の他の標的と比較して不十分に/過度に対象範囲とされる標的(例えば、標的メンバー)の対象範囲を強化する/減少させることができる。
(ii)標的配列(例えば、高GC含量配列)を捕捉するのが困難な低い対象範囲の場合、ベイトセットで標的化される領域を拡大して、例えば、隣接配列(例えば、GCが比較的豊富ではない隣接配列)を対象範囲とする。
(iii)ベイト配列の修正を行って、ベイトの二次構造を減少させ、かつその選択効率を強化することができる。
(iv)ベイト長の修正を用いて、同一のカテゴリー内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができる。ベイト長を直接的に(異なる長さを有するベイトを産生することによって)または間接的に(一貫した長さのベイトを産生し、ベイト末端を任意の配列に置き換えることによって)修飾することができる。
(v)同一の標的領域(すなわち、順方向鎖および逆方向鎖)に対して異なる配向を有するベイトの修正が、異なる結合効率を有し得る。それぞれの標的に最適な対象範囲を提供するいずれかの配向を有するベイトセットを選択することができる。
(vi)それぞれのベイト上に存在する結合実体、例えば、捕捉タグ(例えば、ビオチン)の量の修正が、その結合効率に影響を及ぼし得る。特定の標的を標的化するベイトのタグレベルの増加/減少を用いて、相対標的対象範囲を強化する/減少させることができる。
(vii)異なるベイトに使用されるヌクレオチドの種類の修正を変更して、標的に対する結合親和性に影響を及ぼし、かつ相対標的対象範囲を強化する/減少させることができる。または、
(viii)例えば、より安定した塩基対合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドベイトを使用して、高GC含量と比較して低いか、もしくは正常なGC含量の領域間の融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができる。
遺伝子選択
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー(例えば、ライブラリ捕獲物)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法または本明細書に記載の方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
該方法は、例えば、次世代配列決定方法を用いて、試料由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物由来のサブゲノム間隔を配列決定することを含み、遺伝子または遺伝子産物は、ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、またはTP53から選択される。
A)以下のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔:ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、もしくはTP53、
B)ABL2、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ATM、ATR、AURKA、AURKB、BAP1、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BRCA1、BRCA2、CBL、CARD11、CBL、CCND2、CCND3、CCNE1、CD79A、CD79B、CDH1、CDH2、CDH20、CDH5、CDK6、CDK8、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、DNMT3A、DOT1L、EPHA3、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHB1、EPHB4、EPHB6、ERBB3、ERBB4、ERG、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZH2、FANCA、FBXW7、FGFR4、FLT1、FLT4、FOXP4、GATA1、GNA11、GNAQ、GNAS、GPR124、GUCY1A2、HOXA3、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2R、IKBKE、IKZF1、INHBA、IRS2、JAK1、JAK3、JUN、KDM6A、KDR、LRP1B、LRP6、LTK、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MEN1、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYCL1、MYCN、NF2、NKX2−1、NTRK1、NTRK2、PAK3、PAX5、PDGFRB、PKHD1、PLCG1、PRKDC、PTPN11、PTPRD、RAF1、RARA、RICTOR、RPTOR、RUNX1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOX10、SOX2、SRC、TBX22、TET2、TGFBR2、TMPRSS2、TNFAIP3、TNK、TNKS2、TOP1、TSC1、TSC2、USP9X、VHL、もしくはWT1のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
C)表1、1A、2、3、もしくは4に従う、遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
D)腫瘍または癌に関連した(例えば、腫瘍もしくは癌の正もしくは負の治療応答予測因子であるか、腫瘍もしくは癌の正もしくは負の予後因子であるか、または腫瘍もしくは癌の差次的診断を可能にする)遺伝子もしくは遺伝子産物、例えば、ABL1、AKT1、ALK、AR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CEBPA、EGFR、ERBB2、FLT3、JAK2、KIT、KRAS、MET、NPM1、PDGFRA、PIK3CA、RARA、AKT2、AKT3、MAP2K4、NOTCH1、およびTP53のうちの1つ以上から選択される遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
E)ABL1遺伝子のコドン315;APCのコドン1114、1338、1450、もしくは1556;BRAFのコドン600;CTNNB1のコドン32、33、34、37、41、もしくは45;EGFRのコドン719、746〜750、768、790、858、もしくは861;FLT3のコドン835;HRASのコドン12、13、もしくは61;JAK2のコドン617;KITのコドン816;KRASのコドン12、13、もしくは61;PIK3CAのコドン88、542、545、546、1047、もしくは1049;PTENのコドン130、173、233、もしくは267;RETのコドン918;TP53のコドン175、245、248、273、もしくは306のうちの1つ以上から選択される変異コドンまたは野生型コドンを含む少なくとも5、6、7、8、9、10個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔(例えば、表1に示されるコドンのうちの1つ以上を含む、少なくとも5、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔)、
F)ABCB1、BCC2、ABCC4、ABCG2、C1orf144、CYP1B1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、ERCC2、ESR2、FCGR3A、GSTP1、ITPA、LRP2、MAN1B1、MTHFR、NQO1、NRP2、SLC19A1、SLC22A2、SLCO1B3、SOD2、SULT1A1、TPMT、TYMS、UGT1A1、もしくはUMPSから選択される薬物代謝、薬物応答性、または毒性(本明細書で「PGx」遺伝子とも称される)のうちの1つ以上に関連した遺伝子もしくは遺伝子産物に存在するサブゲノム間隔の変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP))由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
G)(i)薬物で治療された癌患者のより良好な生存率(例えば、パクリタキセル(例えば、ABCB1遺伝子)で治療された乳癌患者のより良好な生存率)、(ii)パクリタキセル代謝(例えば、表2に示される異なる遺伝子座および変異におけるCYP2C8遺伝子;CYP3A4遺伝子)、(iii)薬物に対する毒性(例えば、ABCC4遺伝子で見られる6−MP毒性(表2);DPYD遺伝子、TYMS遺伝子、もしくはUMPS遺伝子で見られる5−FU毒性(表2);TMPT遺伝子で見られるプリン毒性(表2);NRP2遺伝子、Clorf144遺伝子、CYP1B1遺伝子で見られるダウノルビシン毒性(表2))、または(iv)薬物の副作用(例えば、ABCG2、TYMS、UGT1A1、ESR1、およびESR2遺伝子(表2))のうちの1つ以上に関連した遺伝子もしくは遺伝子産物に存在するサブゲノム間隔の変異または野生型PGx遺伝子または遺伝子産物(例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP))由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
H)表3に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
J)表3に明記される癌型由来の固形腫瘍試料における、表3に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
K)表4に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
L)表4に明記される癌型由来のヘム腫瘍試料における、表4に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
M)表1〜4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、事前選択された位置における対立遺伝子変異は、事前選択された種類の腫瘍に関連し、該対立遺伝子変異は、該腫瘍型中の細胞の5%未満に存在する)、
N)GCが豊富な領域に埋め込まれる表1、表1A−4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物、あるいは
O)癌発生の遺伝(例えば、生殖細胞系危険)因子を示す少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、遺伝子もしくは遺伝子産物は、BRCA1、BRCA2、EGFR、HRAS、KIT、MPL、ALK、PTEN、RET、APC、CDKN2A、MLH1、MSH2、MSH6、NF1、NF2、RB1、TP53、VHL、もしくはWT1のうちの1つ以上から選択される)。
1.該サブゲノム間隔についての読み取りの誤アライメント傾向に関連した配列コンテキスト、例えば、サブゲノム間隔(例えば、評価される事前選択されたヌクレオチド位置)の配列コンテキスト。例えば、ゲノムの他の場所で繰り返される評価されるサブゲノム間隔における配列要素、またはその付近での配列要素の存在が、誤アライメントを引き起こし、それによって、性能を低下させ得る。誤アライメントを最小化するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。この場合において、アライメントセレクタの値は、配列コンテキスト、例えば、ゲノム(または分析されるゲノムの一部)で少なくとも事前選択された回数繰り返される事前選択された長さの配列の存在または不在の関数であり得る。
2.分析される腫瘍型。例えば、特定の腫瘍型は、欠失速度の増加を特徴とし得る。したがって、インデルにより敏感なアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。この場合において、アライメントセレクタの値は、腫瘍型の関数、例えば、腫瘍型の識別子であり得る。ある実施形態において、値は、腫瘍型、例えば、乳癌の識別である。
3.分析される遺伝子または遺伝子型、例えば、ある遺伝子または遺伝子型を分析することができる。癌遺伝子は、例として、多くの場合、置換またはインフレームインデルを特徴とする。したがって、これらのバリアントに特に敏感であり、かつ他のバリアントに対して特異的なアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。腫瘍抑制遺伝子は、多くの場合、フレームシフトインデルを特徴とする。したがって、これらのバリアントに特に敏感なアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。したがって、サブゲノム間隔と適合するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。この場合において、アライメントセレクタの値は、遺伝子または遺伝子型の関数、例えば、遺伝子または遺伝子型の識別子であり得る。ある実施形態において、値は、遺伝子の識別である。
4.分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)。この場合において、アライメントセレクタの値は、部位または部位型の関数、例えば、部位または部位型の識別子であり得る。ある実施形態において、値は、部位の識別である(例えば、その部位を含有する遺伝子が別の遺伝子と高度に相同する場合、標準/高速の短い読み取りアライメントアルゴリズム(例えば、BWA)は、2つの遺伝子を見分けるのが困難である場合があり、より集約的なアライメント方法(Smith−Waterman)またはさらにはアセンブリ(ARACHNE)を必要とする可能性がある。)同様に、遺伝子配列が複雑度の低い領域(例えば、AAAAAA)を含有する場合、より集約的なアライメント方法が必要であり得る。
5.評価されるサブゲノム間隔に関連したバリアントまたはバリアント型。例えば、置換、挿入、欠失、転座、または他の再編成。したがって、特定のバリアント型により敏感なアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。この場合において、アライメントセレクタの値は、バリアント型の関数、例えば、バリアント型の識別子であり得る。ある実施形態において、値は、バリアント型、例えば、置換の識別である。
6.試料の種類、FFPE、または他の固定試料。試料型/品質は、エラー(非参照配列の誤った観察)速度に影響を及ぼし得る。したがって、試料における真のエラー率を正確にモデル化するアルゴリズムまたはアルゴリズムパラメータを選択することによって、性能を強化することができる。この場合において、アライメントセレクタの値は、試料の種類の関数、例えば、試料の種類の識別子であり得る。ある実施形態において、値は、試料の種類、例えば、固定試料の識別である。
遺伝子または遺伝子産物の選択
遺伝子選択モジュール
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって、事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー(本明細書でライブラリ捕獲物と称される場合もある)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法または本明細書に記載の方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
方法は、例えば、次世代配列決定方法を用いて、試料由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物由来のサブゲノム間隔を配列決定することを含み、遺伝子もしくは遺伝子産物は、ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、またはTP53から選択される。
A)ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、またはTP53のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
B)ABL2、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ATM、ATR、AURKA、AURKB、BAP1、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BRCA1、BRCA2、CBL、CARD11、CBL、CCND2、CCND3、CCNE1、CD79A、CD79B、CDH1、CDH2、CDH20、CDH5、CDK6、CDK8、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、DNMT3A、DOT1L、EPHA3、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHB1、EPHB4、EPHB6、ERBB3、ERBB4、ERG、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZH2、FANCA、FBXW7、FGFR4、FLT1、FLT4、FOXP4、GATA1、GNA11、GNAQ、GNAS、GPR124、GUCY1A2、HOXA3、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2R、IKBKE、IKZF1、INHBA、IRS2、JAK1、JAK3、JUN、KDM6A、KDR、LRP1B、LRP6、LTK、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MEN1、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYCL1、MYCN、NF2、NKX2−1、NTRK1、NTRK2、PAK3、PAX5、PDGFRB、PKHD1、PLCG1、PRKDC、PTPN11、PTPRD、RAF1、RARA、RICTOR、RPTOR、RUNX1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOX10、SOX2、SRC、TBX22、TET2、TGFBR2、TMPRSS2、TNFAIP3、TNK、TNKS2、TOP1、TSC1、TSC2、USP9X、VHL、またはWT1のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
C)表1、1A、2、3、もしくは4に従う遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
D)腫瘍もしくは癌に関連した(例えば、腫瘍もしくは癌の正もしくは負の治療応答予測因子であるか、腫瘍もしくは癌の正もしくは負の予後因子であるか、または腫瘍もしくは癌の差次的診断を可能にする)遺伝子もしくは遺伝子産物、例えば、ABL1、AKT1、ALK、AR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CEBPA、EGFR、ERBB2、FLT3、JAK2、KIT、KRAS、MET、NPM1、PDGFRA、PIK3CA、RARA、AKT2、AKT3、MAP2K4、NOTCH1、およびTP53のうちの1つ以上から選択される遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
E)ABL1遺伝子のコドン315;APCのコドン1114、1338、1450、もしくは1556;BRAFのコドン600;CTNNB1のコドン32、33、34、37、41、もしくは45;EGFRのコドン719、746−750、768、790、858、もしくは861;FLT3のコドン835;HRASのコドン12、13、もしくは61;JAK2のコドン617;KITのコドン816;KRASのコドン12、13、もしくは61;PIK3CAのコドン88、542、545、546、1047、もしくは1049;PTENのコドン130、173、233、もしくは267;RETのコドン918;TP53のコドン175、245、248、273、もしくは306のうちの1つ以上から選択される変異コドンまたは野生型コドンを含む、少なくとも5、6、7、8、9、10個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔(例えば、表1もしくは表1Aに示されるコドンのうちの1つ以上を含む、少なくとも5、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔)、
F)ABCB1、BCC2、ABCC4、ABCG2、C1orf144、CYP1B1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、ERCC2、ESR2、FCGR3A、GSTP1、ITPA、LRP2、MAN1B1、MTHFR、NQO1、NRP2、SLC19A1、SLC22A2、SLCO1B3、SOD2、SULT1A1、TPMT、TYMS、UGT1A1、またはUMPSから選択される薬物代謝、薬物応答性、または毒性のうちの1つ以上に関連した遺伝子または遺伝子産物に存在するサブゲノム間隔の変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP))由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
G)(i)薬物で治療された癌患者のより良好な生存率(例えば、パクリタキセル(例えば、ABCB1遺伝子)で治療された乳癌患者のより良好な生存率)、(ii)パクリタキセル代謝(例えば、表2に示される異なる遺伝子座および変異におけるCYP2C8遺伝子、CYP3A4遺伝子)、(iii)薬物に対する毒性(例えば、ABCC4遺伝子で見られる6−MP毒性(表2);DPYD遺伝子、TYMS遺伝子、もしくはUMPS遺伝子で見られる5−FU毒性(表2);TMPT遺伝子で見られるプリン毒性(表2);NRP2遺伝子、Clorf144遺伝子、CYP1B1遺伝子で見られるダウノルビシン毒性(表2)、または(iv)薬物の副作用(例えば、ABCG2、TYMS、UGT1A1、ESR1、およびESR2遺伝子(表2))のうちの1つ以上に関連した遺伝子もしくは遺伝子産物に存在するサブゲノム間隔の変異または野生型PGx遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP))由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
H)表3に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化、
J)表3に明記される癌型由来の固形腫瘍試料における、表3に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
K)表4に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
L)表4に明記される癌型由来のヘム腫瘍試料における、表4に従う少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子もしくは遺伝子産物の転座変化、
M)例えば、事前選択された位置での対立遺伝子変異は、事前選択された腫瘍型に関連し、該対立遺伝子変異は、該腫瘍型の細胞の5%未満に存在する、表1、表1A−4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物、
N)GCが豊富な領域に埋め込まれる表1、表1A−4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物、あるいは
O)癌を発現させる遺伝(例えば、生殖細胞系危険)因子を示す少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物(例えば、遺伝子もしくは遺伝子産物は、BRCA1、BRCA2、EGFR、HRAS、KIT、MPL、ALK、PTEN、RET、APC、CDKN2A、MLH1、MSH2、MSH6、NF1、NF2、RB1、TP53、VHL、またはWT1のうちの1つ以上から選択される)。
一実施形態において、核酸試料のサブゲノム間隔は、遺伝子内領域または遺伝子間領域を含む。一実施形態において、サブゲノム間隔は、遺伝子もしくはその断片、エクソンもしくはその断片、または事前選択されたヌクレオチド位置を含む。別の実施形態では、サブゲノム間隔は、エクソンもしくはイントロン、またはその断片、典型的には、エクソンまたはその断片を含む。一実施形態において、サブゲノム間隔は、コード領域または非コード領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、5’非翻訳領域(5’UTR)、もしくは3’非翻訳領域(3’UTR)、またはその断片を含む。
(i) 核酸試料をフィンガープリントすること、
(ii) 核酸試料における遺伝子または遺伝子産物(例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物)の存在量を定量化すること、
(iii) 試料における転写物の相対存在量を定量化すること、
(iv) 特定の対象(例えば、正常な対照または癌患者)に属する核酸試料を特定すること、
(v) 核酸試料中の遺伝形質(例えば、1つ以上の対象の遺伝子構造(例えば、民族性、人種、家族性形質))を特定すること、
(vi) 核酸試料の倍数性を決定し、核酸試料におけるヘテロ接合性の消失を決定すること、
(vii) 核酸試料における遺伝子重複事象の存在もしくは不在を決定すること、
(viii) 核酸試料における遺伝子増幅事象の存在もしくは不在を決定すること、
あるいは
(ix) 核酸試料中の腫瘍/正常な細胞混合物のレベルを決定すること。
複数のメンバー、例えば、標的メンバー(例えば、複数の腫瘍もしくは癌関連のメンバー、参照メンバー、および/またはPGxメンバーを含む)を含むライブラリ(例えば、核酸ライブラリ)を提供することと、
ライブラリを、例えば、溶液もしくは固体支持体ベースの反応で、複数のベイト(例えば、オリゴヌクレオチドベイト)と接触させて、複数のベイト/メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
複数のベイト/メンバーハイブリッドを、例えば、該ハイブリダイゼーション混合物を、該複数のベイト/メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって、該ハイブリダイゼーション混合物から分離することと、を含み、
それによって、ライブラリ捕獲物(例えば、ライブラリ由来の核酸分子の選択または濃縮されたサブグループ)を提供し、
複数のベイトは、
a)本明細書に記載の腫瘍または参照遺伝子もしくは遺伝子産物、例えば、表1、1A、3、もしくは4に記載される腫瘍または参照遺伝子もしくは遺伝子産物由来のサブゲノム間隔を含む腫瘍もしくは癌関連または参照(例えば、野生型)メンバーを選択する第1のベイトセット、
b)表1もしくは表2に記載される遺伝子もしくは遺伝子産物由来のサブゲノム間隔を(aと同一または異なるサブゲノム間隔において)含むPGxメンバーを選択する第2のベイトセットのうちの少なくとも1つもしくは2つを含む。
核酸試料
ライブラリメンバー
ベイトの設計および構築
ベイト合成
ハイブリダイゼーション条件
ベイトモジュール
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)ライブラリをベイトセットと接触させて選択されたメンバー(例えば、ライブラリ捕獲物)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法によってアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法または本明細書に記載の方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
方法は、ライブラリを複数、例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、または5つのベイトセットと接触させることとを含み、該複数のベイトセットはそれぞれ、(他の複数のベイトセットとは対照的に)一意の事前選択された選択効率を有し、例えば、それぞれの一意のベイトセットは、一意の配列決定深度を提供する。
a)約500倍以上の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の5%を超えない細胞に存在する変異を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
b)約200倍以上、例えば、約200倍〜約500倍の配列決定深度を提供する、例えば、試料由来の10%を超えない細胞に存在する変異を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
c)約10〜100倍の配列決定深度を提供する、例えば、a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)単一ヌクレオチド多型(SNP)、b)患者を一意に同定する(例えば、フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、c)ゲノムDNAのコピー数の獲得/喪失およびヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座から選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を配列決定するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット、
d)約5〜50倍の配列決定深度を提供する、例えば、ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット(例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とし、そのようなベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる)、または
e)約0.1〜300倍の配列決定深度を提供する、例えば、コピー数の変化を検出するのに十分な数のサブゲノム間隔を含むメンバーを選択するベイトセット。一実施形態において、コピー数の変化を検出するための配列決定深度は、約0.1〜10倍の配列決定深度の範囲である。他の実施形態では、ゲノムDNAのコピー数獲得/喪失またはヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用されるゲノムSNP/遺伝子座を検出するための配列決定深度は、約100〜300倍の範囲である。そのようなベイトセットを用いて、例えば、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子を検出することができる。
複数のメンバー、例えば、標的核酸メンバー(例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メンバー、および/またはPGxメンバーを含む)を含むライブラリ(例えば、核酸ライブラリ)を提供することと、
ライブラリを、例えば、溶液またはアレイベースの反応で、複数のベイト(例えば、オリゴヌクレオチドベイト)と接触させて、複数のベイト/メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成することと、
複数のベイト/メンバーハイブリッドを、例えば、該ハイブリダイゼーション混合物を該複数のベイト/メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって、該ハイブリダイゼーション混合物から分離することと、を含み、
それによって、ライブラリ捕獲物(例えば、ライブラリ由来の核酸分子の選択または濃縮されたサブグループ)を提供し、
複数のベイトは、以下のうちの2つ以上を含む:
a)低頻度、例えば、約5%(すなわち、それらのゲノムにおける変化を持つ試料由来の細胞の5%)以下で出現する変化(例えば、1つ以上の変異)に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される、高レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上の腫瘍メンバー)を選択する第1のベイトセット(一実施形態において、第1のベイトセットは、約500倍以上の配列決定深度を必要とする変化(例えば、点変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である))、
b)a)における高レベルの標的よりも高い頻度、例えば、約10%(すなわち、それらのゲノムにおける変化を持つ試料由来の細胞の10%)の頻度で出現する変化(例えば、1つ以上の変異)に対する高レベルの感度を可能にするために高い対象範囲が要求される、中間レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上の腫瘍メンバー)を選択する第2のベイトセット(一実施形態において、第2のベイトセットは、約200倍以上の配列決定深度を必要とする変化(例えば、点変異)を含む腫瘍メンバーを選択する(例えば、それに相補的である))、
c)高レベルの感度を可能にするために、例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子を検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、低レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等のサブゲノム間隔を含む1つ以上のPGxメンバー)を選択する第3のベイトセット(例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために、10〜100倍の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第3のベイトセットは、a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノム(PGx)単一ヌクレオチド多型(SNP)、またはb)患者を一意に同定する(例えば、フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、c)ゲノムDNAのコピー数の獲得/喪失およびヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座から選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を選択する、
d)例えば、ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、第1のイントロン標的(例えば、イントロン配列を含むメンバー)を選択する第4のベイトセット(例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とする。該第4のベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる)、または
e)コピー数の変化を検出する能力を改善するためにわずかな対象範囲が要求される、第2のイントロン標的(例えば、イントロンメンバー)を選択する第5のベイトセット((例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために、0.1〜10倍の対象範囲を必要とする。該第5のベイトセットを用いて、例えば、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子を検出することができる)。
(i)第1の事前選択された効率が、少なくとも約500倍以上の配列決定深度である第1の選択効率値を有する(例えば、第2、第3、第4、もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第2の選択効率値よりも約2〜3倍大きく、第3の選択効率値よりも約5〜6倍大きく、第4の選択効率値よりも約10倍大きく、第5の選択効率値よりも約50〜5000倍大きい)選択効率値を有する)こと、
(ii)第2の事前選択された効率が、少なくとも約200倍以上の配列決定深度である第2の選択効率値を有する(例えば、第3、第4、もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第3の選択効率値よりも約2倍大きく、第4の選択効率値よりも約4倍大きく、第5の選択効率値よりも約20〜2000倍大きい)選択効率値を有する)こと、
(iii)第3の事前選択された効率が、少なくとも約100倍以上の配列決定深度である第3の選択効率値を有する(例えば、第4もしくは第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第4の選択効率値よりも約2倍大きく、第5の選択効率値よりも約10〜1000倍大きい)選択効率値を有する)こと、
(iv)第4の事前選択された効率が、少なくとも約50倍以上の配列決定深度である第4の選択効率値を有する(例えば、第5の事前選択された選択効率よりも大きい(例えば、第5の選択効率値よりも約50〜500倍大きい)選択効率値を有する)こと、または
(v)第5の事前選択された効率が、少なくとも約10〜0.1倍の配列決定深度である第5の選択効率値を有すること。
(i)異なるベイトセットの差次的表示:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計をより多い/より少ない数のコピーに含んで、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(ii)ベイトサブセットの差次的オーバーラップ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、隣接ベイト間により長いか、またはより短いオーバーラップを含ませて、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(iii)差次的ベイトパラメータ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、配列修正/より短い長さを含ませて、捕捉効率を減少させ、かつ相対標的対象範囲深度を低下させることができる。
(iv)異なるベイトセットの混合:異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比で混合して、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(v)異なる種類のオリゴヌクレオチドベイトセットの使用:ある特定の実施形態において、ベイトセットは、以下のものを含んでもよい:
(a)1つ以上の化学的に(例えば、非酵素的に)合成された(例えば、個別に合成された)ベイト、
(b)アレイで合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えば、生体外で転写されたベイト、
(d)(a)、(b)、および/もしくは(c)の任意の組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記のうちのいずれかの組み合わせ。
(i)ベイト表示またはオーバーラップの増加/減少を用いて、同一のカテゴリー内の他の標的と比較して不十分に/過度に対象範囲とされるされる標的(例えば、標的メンバー)の対象範囲を強化する/減少させることができること、
(ii)標的配列(例えば、高GC含量配列)を捕捉するのが困難な低対象範囲の場合、ベイトセットで標的化される領域を拡大して、例えば、隣接配列(例えば、GCが比較的豊富ではない隣接配列)を対象範囲とすること、
(iii)ベイト配列の修正を行って、ベイトの二次構造を減少させ、かつその選択効率を強化することができること、
(iv)ベイト長の修正を用いて、同一のカテゴリー内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができること(ベイト長を直接的に(異なる長さを有するベイトを産生することによって)または間接的に(一貫した長さのベイトを産生し、ベイト末端を任意の配列に置き換えることによって)修飾することができる)、
(v)同一の標的領域(すなわち、順方向鎖および逆方向鎖)に対して異なる配向を有するベイトの修正が、異なる結合効率を有し得ること(それぞれの標的に最適な対象範囲を提供するいずれかの配向を有するベイトセットを選択することができる)、
(vi)それぞれのベイト上に存在する結合実体、例えば、捕捉タグ(例えば、ビオチン)の量の修正が、その結合効率に影響を及ぼし得ること(特定の標的を標的化するベイトのタグレベルの増加/減少を用いて、相対標的対象範囲を強化する/減少させることができる)、
(vii)異なるベイトに使用されるヌクレオチドの種類の修正を変更して、標的に対する結合親和性に影響を及ぼし、かつ相対標的対象範囲を強化する/減少させることができること、または
(viii)例えば、より安定した塩基対合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドベイトを使用して、高GC含量と比較して低いか、もしくは正常なGC含量の領域間の融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができること。
A.癌表現型に関連した単一ヌクレオチド変化を含むエクソン配列を選択するベイトセット、
B.参照ヌクレオチド(例えば、染色体)配列由来の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、またはそれ以上のコドンのインフレーム欠失を選択するベイトセット、
C.遺伝子内欠失を選択するベイトセット、
D.遺伝子内挿入を選択するベイトセット、
E.全遺伝子の欠失を選択するベイトセット、
F.逆位、例えば、染色体内逆位を選択するベイトセット、
G.染色体間転座を選択するベイトセット、
H.タンデム重複、例えば、染色体内タンデム重複を選択するベイトセット、
I.非反復隣接配列に隣接する目的とするヌクレオチド配列を選択するベイトセット、
J.融合配列に対応する1つ以上のサブゲノム間隔、例えば、融合配列(例えば、融合転写物または非融合転写物の癌関連選択的スプライシングされた形態)に対応する事前選択された対のサブゲノム間隔(例えば、事前選択された対のエクソン)を選択するベイトセット、
K.望ましくない特徴を含むヌクレオチド配列、例えば、高GC含量のヌクレオチド配列、1つ以上の反復要素および/または逆位反復を含むヌクレオチド配列に隣接したサブゲノム間隔を選択するベイトセット、
L.再編成、例えば、ゲノム再編成(例えば、イントロン配列、例えば、5’もしくは3’−UTRを含む再編成)を選択するベイトセット、あるいは
M.癌関連遺伝子融合物に隣接したエクソンを含むサブゲノム間隔を選択するベイトセット。
一実施形態において、ベイトセットは、ハイブリダイゼーションによってメンバーを選択する(例えば、ベイトセット中のベイトまたは複数のベイトは、本明細書に記載の1つ以上のメンバー、例えば、第1〜第5のメンバー等の標的メンバー、腫瘍または非腫瘍メンバーに相補的である)。
第1のサブゲノム間隔の対象範囲の第1のパターンを有する第1のベイトセット、
第2のサブゲノム間隔の対象範囲の第2のパターンを有する第2のベイトセット、および
(任意で)第3のサブゲノム間隔の対象範囲の第3のパターンを有する第3、第4、または第5のベイトセット。
第1のサブゲノム間隔に対して第1のレベルのオーバーハング(正または負)を有する第1の複数のベイト、
第2のサブゲノム間隔に対して第2のレベルのオーバーハング(正または負)を有する第2の複数のベイト、
第3のサブゲノム間隔に対して第2のレベルのオーバーハング(正または負)を有する第3の複数のベイト、および
(任意で)第3のサブゲノム間隔に対して第2のレベルのオーバーハング(正または負)を有する第4または第5の複数のベイトのうちの少なくとも2つ、もしくはすべてを含み、少なくとも複数の該レベルは異なる。
別の態様では、本発明は、前述のベイトセットを作製する方法を特色とする。方法は、1つ以上の標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物のサブゲノム間隔に対応するベイト配列のうちのいずれか)を選択すること、標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを得ること(例えば、標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを、例えば、マイクロアレイ合成によって合成すること)、および任意で、オリゴヌクレオチドを増幅してベイトセットを産生することを含む。
ある特定の実施形態において、方法は、以下のうちの1つ以上をさらに含む:
(i) 核酸試料をフィンガープリントすること、
(ii) 核酸試料における遺伝子または遺伝子産物(例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物)の存在量を定量化すること(例えば、試料における転写物の相対存在量を定量化すること)、
(iii) 特定の対象(例えば、正常な対照または癌患者)に属するとして核酸試料を特定すること、
(iv) 核酸試料における遺伝形質(例えば、1名以上の対象の遺伝子構成(例えば、民族性、人種、家族性形質))を特定定すること、
(v) 核酸試料の倍数性を決定し、核酸試料におけるヘテロ接合性の消失を決定すること、
(vi) 核酸試料における遺伝子重複事象の存在もしくは不在を決定すること、
(vii) 核酸試料における遺伝子増幅事象の存在もしくは不在を決定すること、あるいは
(viii) 核酸試料における腫瘍/正常な細胞混合物のレベルを決定すること。
A.低頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される、高レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等の1つ以上の腫瘍メンバーおよび/もしくは参照メンバー)を選択する第1のベイトセット。例えば、約5%以下の頻度で出現する点変異の検出(すなわち、試料が調製された細胞の5%がそれらのゲノムでこの変異を持つ)。第1のベイトセットは、典型的には、高い検出信頼性を確保するために、約500倍以上の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第1のベイトセットは、ある特定の癌型、例えば、表1もしくは表1Aに従う優先順位が1の癌遺伝子または遺伝子産物において頻繁に変異する1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を選択する。
B.高レベルの標的よりも高い頻度、例えば、約10%の頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために対象範囲が要求される、中間レベルの標的標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等の1つ以上の腫瘍メンバーおよび/もしくは参照メンバー)を選択する第2のベイトセット。例えば、10%の頻度で出現する変化(例えば、点変異)の検出は、高い検出信頼性を確保するために、約200倍以上の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第2のベイトセットは、表1もしくは表1Aに従う癌遺伝子または遺伝子産物から選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を選択する。
C.高レベルの感度を可能にする、例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子を検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、低レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基等の1つ以上のPGxメンバー)を選択する第3のベイトセット。例えば、ヘテロ接合体対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために、10〜100倍の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第3のベイトセットは、から選択される1つ以上のサブゲノム間隔(例えば、エクソン)を選択する。a)異なる薬物を代謝する患者の能力を説明し得る薬理ゲノムSNP、b)患者を一意に特定する(フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、c)ゲノムDNAのコピー数獲得/喪失およびヘテロ接合性の消失(LOH)を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座。
D.ゲノム転座またはインデル等の構造ブレークポイントを検出するために低〜中程度の対象範囲が要求される、イントロン標的(例えば、イントロンメンバー)を選択する第4のベイトセット。例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とする。該第4のベイトセットを用いて、例えば、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子を検出することができる。
E.コピー数の変化を検出する能力を改善するために、わずかな対象範囲が要求される、イントロン標的(例えば、イントロンメンバー)を選択する第5のベイトセット。例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために、0.1〜10倍の対象範囲を必要とする。該第5のベイトセットを用いて、例えば、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子を検出することができる。
(i)異なるベイトセットの差次的表示:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計をより多い/より少ない数のコピーに含んで、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(ii)ベイトサブセットの差次的オーバーラップ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、隣接ベイト間により長いか、またはより短いオーバーラップを含ませて、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(iii)差次的ベイトパラメータ:所与の標的(例えば、標的メンバー)を捕捉するためのベイトセット設計に、配列修正/より短い長さを含ませて、捕捉効率を減少させ、かつ相対標的対象範囲深度を低下させることができる。
(iv)異なるベイトセットの混合:異なる標的セットを捕捉するように設計されるベイトセットを異なるモル比で混合して、相対標的対象範囲深度を強化する/減少させることができる。
(v)異なる種類のオリゴヌクレオチドベイトセットの使用:ある特定の実施形態において、ベイトセットは、以下のものを含んでもよい:
(a)1つ以上の化学的に(例えば、非酵素的に)合成された(例えば、個別に合成された)ベイト、
(b)アレイで合成された1つ以上のベイト、
(c)1つ以上の酵素的に調製された、例えば、生体外で転写されたベイト、
(d)(a)、(b)、および/もしくは(c)の任意の組み合わせ、
(e)1つ以上のDNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のDNAオリゴヌクレオチド)、
(f)1つ以上のRNAオリゴヌクレオチド(例えば、自然発生もしくは非自然発生のRNAオリゴヌクレオチド)、
(g)(e)および(f)の組み合わせ、または
(h)上記のうちのいずれかの組み合わせ。
(i)ベイト表示またはオーバーラップの増加/減少を用いて、同一のカテゴリー内の他の標的と比較して不十分に/過度に対象範囲とされる標的(例えば、標的メンバー)の対象範囲を強化する/減少させることができること、
(ii)標的配列(例えば、高GC含量配列)を捕捉するのが困難な低対象範囲の場合、ベイトセットで標的化される領域を拡大して、例えば、隣接配列(例えば、GCが比較的豊富ではない隣接配列)を対象範囲とすること、
(iii)ベイト配列の修正を行って、ベイトの二次構造を減少させ、かつその選択効率を強化することができること、
(iv)ベイト長の修正を用いて、同一のカテゴリー内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができること(ベイト長を直接的に(異なる長さを有するベイトを産生することによって)または間接的に(一貫した長さのベイトを産生し、ベイト末端を任意の配列に置き換えることによって)修飾することができる)、
(v)同一の標的領域(すなわち、順方向鎖および逆方向鎖)に対して異なる配向を有するベイトの修正が、異なる結合効率を有し得ること(それぞれの標的に最適な対象範囲を提供するいずれかの配向を有するベイトセットを選択することができる)、
(vi)それぞれのベイト上に存在する結合実体、例えば、捕捉タグ(例えば、ビオチン)の量の修正が、その結合効率に影響を及ぼし得ること(特定の標的を標的化するベイトのタグレベルの増加/減少を用いて、相対標的対象範囲を強化する/減少させることができる)、
(vii)異なるベイトに使用されるヌクレオチドの種類の修正を変更して、標的に対する結合親和性に影響を及ぼし、かつ相対標的対象範囲を強化する/減少させることができること、または
(viii)例えば、より安定した塩基対合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドベイトを使用して、高GC含量と比較して低いか、もしくは正常なGC含量の領域間の融解ハイブリダイゼーション動態を均等化することができること。
配列決定
アライメント
概要
挿入/欠失(インデル)
調整
調整:配列アライメントアルゴリズム
調整:アライメントパラメータ
調整:アルゴリズムおよびパラメータの配列コンテキストに基づく選択/調整
調整:アルゴリズムおよびパラメータの腫瘍型に基づく選択/調整
調整:アルゴリズムおよびパラメータの遺伝子型に基づく選択/調整
調整:アルゴリズムおよびパラメータの変異型に基づく選択/調整
アルゴリズムおよびパラメータの調整/変異部位に基づく選択/調整
調整:アルゴリズムおよびパラメータの試料型に基づく選択/調整
アライメントモジュール
アライメントの一般方法
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることによって事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー(本明細書でライブラリ捕獲物と称される場合もある)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、ベイズ方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)ことと、を含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
X個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれからの読み取りは、一意のアライメント方法とアライメントされ、一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意のアライメント方法とは、他のX−1個のアライメント方法とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2である。
(i)該試料における腫瘍型、例えば、腫瘍型、
(ii)配列決定される該サブゲノム間隔が位置する遺伝子または遺伝子型、例えば、バリアントまたはバリアント型、例えば、変異の事前選択された確率に関連した遺伝子または遺伝子型、
(iii)分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)、
(iv)評価されるサブゲノム間隔内のバリアント型、例えば、置換、
(v)試料型、例えば、FFPE試料、および
(vi)評価される該サブゲノム間隔における配列またはその付近の配列、例えば、該サブゲノム間隔の予想される誤アライメント傾向、例えば、該サブゲノム間隔における反復配列またはその付近の反復配列の存在。
一意のアライメント方法をX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、点変異であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100より大きく、例えば、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
一意のアライメント方法をX個のゲノム間隔のそれぞれ適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100より大きく、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
第1の一意のアライメント方法は、事前選択されたヌクレオチド位置を含む第1のサブゲノム間隔に適用され、そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し、
第2の一意のアライメント方法は、該第1の事前選択されたヌクレオチド位置以外の事前選択されたヌクレオチドを含むサブゲノム間隔、例えば、腫瘍表現型を有するバリアントを有しない位置に適用される。
a)第1のゲノム間隔のバリアントが腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントが、点変異、例えば、表6の変異である、第1の一意のアライメント方法を第1のゲノム間隔に適用することと、
b)第2のゲノム間隔のバリアントが腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントが、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座、例えば、表5の変異である、第2の一意のアライメント方法を第2のゲノム間隔に適用することと、
c)第3の一意のアライメント方法を第3のゲノム間隔、例えば、バリアントが腫瘍表現型または該試料におけるその型の腫瘍に関連しないゲノム間隔に適用することと、を含む。
例えば、チロシンキナーゼ領域における活性化変異に関連し得る癌遺伝子、
不活性化(例えば、ナンセンス)変異を伴い得る腫瘍抑制遺伝子、または
高活性もしくは低活性の生殖細胞系遺伝的バリエーションを伴い得る薬物ADME関連遺伝子である。
置換を含有する可能性の高い遺伝子の最大差ミスマッチペナルティパラメータの調節、設定、もしくは使用、
事前選択された腫瘍型によく見られる特異的変異型に基づく特定のミスマッチペナルティパラメータ(例えば、黒色腫におけるC→T)の調節、設定、もしくは使用、または
ある特定の試料型によく見られる特異的変異型に基づく特定のミスマッチペナルティパラメータ(例えば、FFPEによく見られる置換)の調節、設定、もしくは使用。
(i)比較的低い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される高レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第1のアライメント方法。例えば、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%以下の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、500倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、事前選択された癌において頻繁に変異されるエクソンである。
(ii)比較的高い頻度、例えば、上記の(i)の変異よりも高い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために高い対象範囲(実施形態において、上記の(i)の対象範囲未満であるが)が要求される中間レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第2のアライメント方法。例えば、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%を超え、最大10、15、もしくは20%の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、200倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、癌に関連した遺伝子における適用である。
(iii)低〜中程度の対象範囲(実施形態において、上述の(i)もしくは(ii)の対象範囲未満)が、ヘテロ接合体対立遺伝子に対する高レベルの感度を可能にするために要求される低レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第3のアライメント方法。例えば、バリアント、例えば、(1)薬物に応答するか、またはそれを代謝する患者の能力に関連し得る薬理ゲノムSNP、(2)患者を一意に特定する(フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、あるいは(3)ゲノムDNAおよびLOHのコピー数獲得/喪失を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。
(iv)中間レベルの標的(例えば、再編成、例えば、転座またはインデルにおける、例えば、構造ブレークポイント)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第4のアライメント方法。実施形態において、該対象範囲は、(i)、(ii)、または(iii)のうちの1つの対象範囲未満である。例えば、実施形態において、高い検出信頼性を確保するために5〜50倍の配列対スパン深度を必要とするバリアント、例えば、イントロンブレークポイントに応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。例となる適用は、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子である。
(v)わずかな対象範囲がコピー数の変化を検出する能力を改善し得るイントロン標的等の標的に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第5のアライメント方法。実施形態において、該対象範囲は、(i)、(ii)、(iii)、または(iv)のうちの1つの対象範囲未満である。例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために、0.1〜10倍の対象範囲を必要とする。例となる適用は、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子に対する。
d)読み取りと該選択されたアライメント方法(例えば、事前選択されたアルゴリズムまたはパラメータ)との比較、例えば、アライメント比較を行うこと、および
e)任意で、該読み取りが所定のアライメント基準(例えば、所定の基準は、事前選択された数未満のミスマッチまたはギャップを有する参照とのアライメントである)を満たすかを決定することをさらに含む。
f)サブゲノム間隔、例えば、バリアント、例えば、置換または再編成、例えば、インデルに関連したヌクレオチド位置を含むサブゲノム間隔のアライメントセレクタの値を取得すること、および
g)アライメントセレクタの該取得された値に応答して、読み取りを分析する、例えば、アライメントするためのアライメント方法を選択することによってアライメント方法を選択することを含むが、
但し、該アライメントセレクタが、以下のうちの1つ以上もしくはすべての関数であるか、それらに応答して選択されるか、またはそれらのために最適化されることを条件とする:
i)該試料における腫瘍型、例えば、腫瘍型、
ii)配列決定される該サブゲノム間隔が位置する遺伝子もしくは遺伝子型、例えば、事前選択された確率またはバリアント型、例えば、変異に関連した遺伝子もしくは遺伝子型、
iii)分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)、
iv)評価されるサブゲノム間隔に関連したバリアントの種類、例えば、置換、
v)試料の種類、例えば、FFPE試料、および
vi)評価される該サブゲノム間隔における配列またはその付近の配列、例えば、該サブゲノム間隔の予想される誤アライメント傾向、例えば、該サブゲノム間隔における反復配列またはその付近の反復配列の存在。
再編成をアライメントするための方法
c)事前選択された再編成とアライメントするために事前選択される再編成参照配列を読み取りとのアライメントのために選択すること(実施形態において、参照配列は、ゲノム再編成と同一ではない)(ある実施形態において、再編成参照配列断片(すなわち「代替の参照」)は、読み取りにおいて見られることが予想される再編成と同一である。この代替の参照が予想される再編成とも多少異なる(例えば、周辺の生殖細胞系バリアントも含有し得る)ことも可能である)、
e)該事前選択された再編成参照配列を読み取りと比較する、例えば、アライメントすること、および
f)任意で、該読み取りが所定のアライメント基準を満たすかを決定することを含むアライメント方法を用いること(例えば、所定の基準は、事前選択されたレベル未満のミスマッチまたはギャップを有する該事前選択された再編成参照とのアライメントであり得る)を含み、
それによって、読み取りを分析するが、
但し、少なくともX個の一意の事前選択された再編成アライメント配列は、少なくともX個の一意のサブゲノム間隔についての読み取りを分析するために使用されることを条件とし、一意とは、他のX−1とは異なることを意味し、Xは、2、3、4、5、10、15、20、30、50、100、300、500、1000、2000、または3000に等しい。
(g)該読み取りを分析する、例えば、アライメントするためにアライメント方法を選択または適用することをさらに含み、
それによって、該読み取りを分析するが、
但し、該アライメント方法が、以下のうちの1つ以上もしくはすべての関数であるか、それらに応答して選択されるか、またはそれらのために最適化されることを条件とする:
i)該試料における腫瘍型、例えば、腫瘍型、
ii)配列決定される該サブゲノム間隔が位置する遺伝子もしくは遺伝子型、例えば、バリアントまたはバリアント型、例えば、変異の事前選択された確率に関連した遺伝子もしくは遺伝子型、
iii)分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)、
iv)評価されるサブゲノム間隔に関連したバリアント型、例えば、置換、
v)試料型、例えば、FFPE試料、および
vi)評価される該サブゲノム間隔における配列またはその付近の配列、例えば、該サブゲノム間隔の予想される誤アライメント傾向、例えば、該サブゲノム間隔における反復配列またはその付近の反復配列の存在。
一意のアライメント方法をX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、点変異であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100より大きく、例えば、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
一意のアライメント方法をX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100より大きく、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
第1の一意のアライメント方法は、第1の事前選択されたヌクレオチド位置に適用され、そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し(例えば、表10に提供されるバリアント、例えば、一般的な上皮癌、すなわち、肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌におけるインデルバリアント)、
第2の一意のアライメント方法は、該第1の事前選択されたヌクレオチド位置以外の事前選択されたヌクレオチド、例えば、腫瘍表現型に関連したバリアントを有しない位置(例えば、表10において変数として存在しない配列)に適用される。
a)第1のゲノム間隔のバリアントが腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントが、点変異、例えば、表6の変異である第1のゲノム間隔に、第1の一意のアライメント方法を適用することと、
b)第2のゲノム間隔のバリアントが腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントが、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座、例えば、表5の変異である第2のゲノム間隔に、第2の一意のアライメント方法を適用することと、
c)第3の一意のアライメント方法を取得し、これを第3のゲノム間隔、例えば、バリアントが腫瘍表現型または該試料におけるその型の腫瘍に関連しないゲノム間隔に適用することとを含む。
例えば、変異チロシンキナーゼ領域における活性化に関連し得る癌遺伝子、
不活性化(例えば、ナンセンス)変異を伴い得る腫瘍抑制遺伝子、または
高活性もしくは低活性の生殖細胞系遺伝的バリエーションを伴い得る薬物ADME関連遺伝子である。
置換を含有する可能性の高い遺伝子の最大差ミスマッチペナルティパラメータの調節、設定、もしくは使用、
インデルを含有する可能性の高い遺伝子のギャップペナルティパラメータの調節、設定、もしくは使用(例えば、NSCLCにおけるEGFR)、
事前選択された腫瘍型によく見られる特異的変異型に基づく特定のミスマッチペナルティパラメータの調節、設定、もしくは使用(例えば、黒色腫におけるC→T)、または
ある特定の試料型によく見られる特異的変異型に基づく特定のミスマッチペナルティパラメータの調節、設定、もしくは使用(例えば、FFPEによく見られる置換)。
(i)比較的低い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される高レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第1のアライメント方法。例えば、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%以下の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、500倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、事前選択された癌において頻繁に変異されるエクソンである。
(ii)比較的高い頻度、例えば、上記の(i)の変異よりも高い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために高い対象範囲(実施形態において、上記の(i)の対象範囲未満であるが)が要求される中間レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第2のアライメント方法。例えば、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%を超え、最大10、15、もしくは20%の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、200倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、癌に関連した遺伝子における適用である。
(iii)低〜中程度の対象範囲(実施形態において、上述の(i)もしくは(ii)の対象範囲未満)が、ヘテロ接合体対立遺伝子に対する高レベルの感度を可能にするために要求される低レベルの標的(例えば、遺伝子、エクソン、または塩基)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第3のアライメント方法。例えば、バリアント、例えば、(1)薬物に応答するか、またはそれを代謝する患者の能力に関連し得る薬理ゲノムSNP、(2)患者を一意に特定する(フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、あるいは(3)ゲノムDNAおよびLOHのコピー数獲得/喪失を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座に応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。
(iv)中間レベルの標的(例えば、再編成、例えば、転座またはインデルにおける、例えば、構造ブレークポイント)に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第4のアライメント方法。実施形態において、実施形態において、該対象範囲は、(i)、(ii)、または(iii)のうちの1つの対象範囲未満である。例えば、実施形態において、高い検出信頼性を確保するために5〜50倍の配列対スパン深度を必要とするバリアント、例えば、イントロンブレークポイントに応答して選択されるか、またはそのために最適化されるアライメント方法。例となる適用は、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子である。
(v)わずかな対象範囲がコピー数の変化を検出する能力を改善し得るイントロン標的等の標的に応答して選択されるか、またはそのために最適化される第5のアライメント方法。実施形態において、該対象範囲は、(i)、(ii)、(iii)、または(iv)のうちの1つの対象範囲未満である。例えば、いくつかの末端エクソンの1コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために、0.1〜10倍の対象範囲を必要とする。例となる適用は、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子に対する。
d)読み取りと該選択されたアライメント方法(例えば、事前選択されたアルゴリズムまたはパラメータ)との比較、例えば、アライメント比較を行うことと、
e)任意で、該読み取りが所定のアライメント基準(例えば、所定の基準は、事前選択された数未満のミスマッチまたはギャップを有する参照とのアライメントである)を満たすかを決定することとをさらに含む。
f)サブゲノム間隔、例えば、バリアント、例えば、置換または再編成、例えば、インデルに関連したヌクレオチド位置を含むサブゲノム間隔のアライメントセレクタの値を取得すること、および
g)アライメントセレクタの該取得された値に応答して、読み取りを分析する、例えば、アライメントするためのアライメント方法を選択することによってアライメント方法を選択することを含むが、
但し、該アライメントセレクタが、以下のうちの1つ以上もしくはすべての関数であるか、それらに応答して選択されるか、またはそれらのために最適化されることを条件とする:
i)該試料における腫瘍型、例えば、腫瘍型、
ii)配列決定される該サブゲノム間隔が位置する遺伝子もしくは遺伝子型、例えば、事前選択された確率またはバリアント型、例えば、変異に関連した遺伝子もしくは遺伝子型、
iii)分析される部位(例えば、ヌクレオチド位置)、
iv)評価されるサブゲノム間隔に関連したバリアント型、例えば、置換、
v)試料型、例えば、FFPE試料、および
vi)評価される該サブゲノム間隔における配列またはその付近の配列、例えば、該サブゲノム間隔の予想される誤アライメント傾向、例えば、該サブゲノム間隔における反復配列またはその付近の反復配列の存在。
より困難な読み取りのアライメント
任意で、核酸を配列決定して読み取りを取得すること、
任意で、読み取りを取得すること(例えば、腫瘍および/または対照核酸試料(例えば、FFPE由来の核酸試料)から得られるヌクレオチド配列読み取りを取得すること)、
第1の組のパラメータ下で(例えば、第1のマッピングアルゴリズム下で、または第1の参照配列との)読み取りの比較、例えば、アライメント比較を行って、該読み取りが第1の所定のアライメント基準を満たす(例えば、読み取りが、例えば、事前選択された数未満のミスマッチを有する該第1の参照配列とアライメントされ得る)かを決定すること、
該読み取りが第1の所定のアライメント基準を満たすことができない場合、第2の組のパラメータ下で(例えば、第2のマッピングアルゴリズム下で、または第2の参照配列との)第2のアライメント比較を行うこと、および
任意で、該読み取りが該第2の所定の基準を満たす(例えば、読み取りが事前選択された数未満のミスマッチを有する該第2の参照配列とアライメントされ得る)かを決定することを含んでもよく、
該第2の組のパラメータは、一組のパラメータ、例えば、該第1の組のパラメータと比較して、事前選択されたバリアント、例えば、再編成、例えば、挿入、欠失、または転座についての読み取りとのアライメントをもたらす可能性が高い該第2の参照配列の使用を含み、
それによって、読み取りを分析する。
変異呼び出し
変異呼び出し:置換
そこで、そのような表を作成し、公開データベース内の十分な情報が利用可能な多遺伝子試験における任意の遺伝子の変異呼び出しアルゴリズムで用いることができる。
変異呼び出し:インデル
変異呼び出しモジュール
(a)複数のメンバーを含むライブラリを試料から、例えば、複数の腫瘍メンバーを含むライブラリを腫瘍試料から取得することと、
(b)任意で、例えば、ライブラリをベイトセット(または複数のベイトセット)と接触させることとによって事前選択された配列のライブラリを濃縮して、選択されたメンバー(本明細書でライブラリ捕獲物と称される場合もある)を提供することと、
(c)サブゲノム間隔についての読み取りを、例えば、配列決定を含む方法によって、例えば、次世代配列決定方法を用いて、該ライブラリまたはライブラリ捕獲物からのメンバー、例えば、腫瘍メンバーから取得することと、
(d)該読み取りを、アライメント方法、例えば、本明細書に記載のアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、本明細書に記載のベイズ方法または呼び出し方法を用いて、例えば、変異を呼び出す)こととを含み、
それによって、該腫瘍試料を分析し、
X個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれにおいてヌクレオチド位置に対して割り当てられるヌクレオチド値は、一意の呼び出し方法によって割り当てられ、一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意の呼び出し方法とは、他のX−1個の呼び出し方法とは異なることを意味し、Xは、少なくとも2である。呼び出し方法は異なってもよく、それによって、例えば、異なるベイズ先行値に依存するという点で一意であってもよい。
(b)それぞれの該X個のサブゲノム間隔の事前選択されたヌクレオチド位置のために、以下を取得することと、
(i)腫瘍型Xにおける該事前選択されたヌクレオチド位置で事前選択されたバリアント、例えば、変異を示す読み取りを観察する先行(例えば、文献)予想であるか、またはそれを表す第1の値、
(ii)バリアントがある頻度で(例えば、1%、5%、10%等)試料中に存在する場合、および/またはバリアントが不在である(例えば、塩基呼び出しエラーのみによる読み取りにおいて観察される)場合、該事前選択されたヌクレオチド位置で該事前選択されたバリアントを示す読み取りを観察する確率を表す第2の一組の値、
(c)該値に応答して、例えば、本明細書に記載のベイズ方法によって、第1の値を用いて第2の組の値の比較を検討する(例えば、変異の存在の事後確率を算出する)ことによって、該事前選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こととを含んでもよく、それによって、該試料を分析する。
(i)少なくとも10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく)、
(ii)(i)の方法の割り当て(その割り当ての少なくとも10、20、30、もしくは40個は、例えば、事前選択された腫瘍型における細胞の5、10、または20%未満で存在する事前選択されたバリアントの確率の関数である第1の値で作成される)、
(iii)少なくともX個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(X個の事前選択されたヌクレオチド位置のそれぞれは、事前選択された腫瘍型、例えば、該試料の腫瘍型に存在する(他のX−1個の割り当てとは対照的に)一意の確率を有する事前選択されたバリアントに関連し、任意で、該X個の割り当てのそれぞれは、(他のX−1個の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく(X=23、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100))、
(iv)ヌクレオチド値を第1および第2のヌクレオチド位置で割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(事前選択された腫瘍型(例えば、該試料の腫瘍型)に存在する該第1のヌクレオチド位置での第1の事前選択されたバリアントの可能性は、存在する該第2のヌクレオチド位置での第2の事前選択されたバリアントの可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30、もしくは40倍大きく、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく)、
(v)ヌクレオチド値を複数の事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(該複数は、以下の確率範囲のうちの1つ以上の、例えば、少なくとも3、4、5、6、7個、もしくはすべてに分類されるバリアントの割り当てを含む:
0.01未満、0.01〜0.2、
0.02より大きく、0.03以下、
0.03より大きく、0.04以下、
0.04より大きく、0.05以下、
0.05より大きく、0.1以下、
0.1より大きく、0.2以下、
0.2より大きく、0.5以下、
0.5より大きく、1.0以下、
1.0より大きく、2.0以下、
2.0より大きく、5.0以下、
5.0より大きく、10.0以下、
10.0より大きく、20.0以下、
20.0より大きく、50.0以下、および
50より大きく、100.0%以下、
ここで確率範囲は、事前選択されたヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントが事前選択された腫瘍型(例えば、該試料の腫瘍型)に存在する確率、または事前選択されたヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントが事前選択された型の腫瘍試料(例えば、該試料の腫瘍型)、腫瘍試料由来のライブラリ、もしくはそのライブラリからのライブラリ捕獲物中の細胞の列挙された%に存在する確率の範囲であり、
任意で、それぞれの割り当ては、一意の第1および/もしくは第2の値に基づく(例えば、列挙された確率範囲の他の割り当てではなく、一意であるか、または他の列記された確率範囲のうちの1つ以上もしくはすべての第1および/もしくは第2の値ではなく、一意である))、
(vi)少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100個の事前選択されたヌクレオチド位置に対するヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(事前選択されたヌクレオチド位置はそれぞれ、独立して、該試料中のDNAの50、40、25、20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.3、0.2、もしくは0.1%未満に存在する事前選択されたバリアントを有し、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく)、
(vii)ヌクレオチド値を第1および第2のヌクレオチド位置で割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(該試料のDNAにおける第1の位置での事前選択されたバリアントの可能性は、該試料のDNAにおける該第2のヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントの可能性よりも少なくとも2、5、10、20、30、もしくは40倍大きく、任意で、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく)、
(viii)ヌクレオチド値を以下のうちの1つ以上もしくはすべてにおいて割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと、
(1)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の1.0%未満に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(2)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の1.0〜2.0%に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(3)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の2.0%より大きく3%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(4)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の3.0%より大きく4%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(5)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の4.0%より大きく5%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(6)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の5.0%より大きく10%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(7)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の10.0%より大きく20%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(8)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の20.0%より大きく40%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
(9)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の40.0%より大きく50%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、または
(10)該試料由来のライブラリにおける核酸、またはそのライブラリ由来のライブラリ捕獲物における核酸の該試料の細胞の50.0%より大きく100%以下に存在する事前選択されたバリアントを有する少なくとも1、2、3、4、もしくは5個の事前選択されたヌクレオチド位置、
ここで、任意で、それぞれの割り当ては、一意の第1および/もしくは第2の値に基づく(例えば、列挙された範囲(例えば、(i)の1%未満の範囲)の他の割り当てではなく、一意であるか、または他の列記された範囲のうちの1つ以上もしくはすべてにおける決定のために第1および/もしくは第2の値ではなく、一意である))、あるいは
(ix)ヌクレオチド値をX個のヌクレオチド位置のそれぞれで割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(それぞれのヌクレオチド位置は、独立して、他のX−1個のヌクレオチド位置での事前選択されたバリアントの可能性と比較して一意である(該試料のDNAに存在する事前選択されたバリアントの)可能性を有し、Xは、1、23、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100以上であり、それぞれの割り当ては、(他の割り当てではなく)一意の第1および/もしくは第2の値に基づく)。
一意の第1および/または第2の値をX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、点変異であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100より大きく、例えば、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
一意の第1および/または第2の値をX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、または100より大きく、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
(i)第1および/もしくは第2の値に応答して、例えば、比較的低頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために最深の対象範囲が要求される第1の事前選択されたヌクレオチド位置に対する読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(例として、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%以下の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異が挙げられる。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、500倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、事前選択された癌において頻繁に変異するエクソンである)、
(ii)第1および/もしくは第2の値に応答して、例えば、高対象範囲(実施形態において、上記の(i)の対象範囲未満であるが)が、比較的高い頻度で、例えば、上記の(i)における変異よりも高い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために要求される第2の事前選択されたヌクレオチド位置に対する読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(例として、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%より大きく、最大10、15、もしくは20%の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異が挙げられる。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、200倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、癌に関連した遺伝子においてである)、
(iii)第1および/もしくは第2の値に応答して、例えば、低〜中間の対象範囲(実施形態において、上述の(i)もしくは(ii)の対象範囲未満である)が、ヘテロ接合体対立遺伝子に対する高レベルの感度を可能にするために要求される第3の事前選択されたヌクレオチド位置に対する読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(例として、バリアント、例えば、(1)薬物に応答するか、またはそれを代謝する患者の能力に関連し得る薬理ゲノムSNP、(2)患者を一意に特定する(フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、あるいは(3)ゲノムDNAおよびLOHのコピー数獲得/喪失を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座が挙げられる)、
(iv)第1および/もしくは第2の値に応答して、第4の事前選択されたヌクレオチド位置、例えば、再編成、例えば、転座またはインデルにおける、例えば、構造ブレークポイントに対する読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(実施形態において、対象範囲は、(i)、(ii)、もしくは(iii)のうちの1つの対象範囲未満である。例として、実施形態において、高い検出信頼性を確保するために、5〜50倍の配列対スパン深度を必要とするイントロンブレークポイントが挙げられる。例となる適用は、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子である)、
(v)第1および/もしくは第2の値に応答して、例えば、わずかな対象範囲がコピー数の変化を検出する能力を改善し得る第5の事前選択されたヌクレオチド位置に対する読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こと(実施形態において、対象範囲は、(i)、(ii)(iii)、もしくは(iv)のうちの1つの対象範囲未満である。例として、例えば、高い検出信頼性を確保するために0.1〜10倍の対象範囲を必要とするいくつかの末端エクソンの1コピー欠失がある。例となる適用は、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子に対する)。
(a)X個のサブゲノム間隔のそれぞれについての1つまたは複数の読み取りを該試料由来の核酸から取得することと、
(b)該X個のサブゲノム間隔のそれぞれのために、閾値を取得し(該取得されたX個の閾値のそれぞれは、他のX−1個の閾値と比較して一意である)、それによって、X個の一意の閾値を提供することと、
(c)該X個のサブゲノム間隔のそれぞれのために、事前選択されたヌクレオチド位置で事前選択されたヌクレオチド値を有する読み取りの数の関数である観察された値をその一意の閾値と比較し、それによって、その一意の閾値を該X個のサブゲノム間隔のそれぞれに適用することと、
(d)任意で、該比較の結果に応答して、ヌクレオチド値を事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てることとを含み、
Xは、2以上であり、
それによって、該試料を分析する。
一意の閾値を取得し、それをX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、点変異であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100より大きく、例えば、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
一意の閾値を取得し、それをX個のゲノム間隔のそれぞれに適用することを含み、該ゲノム間隔はそれぞれ、腫瘍表現型に関連したバリアントを有し、例えば、バリアントは、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座であり、Xは、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100より大きく、該サブゲノム間隔はそれぞれ、異なる遺伝子に位置する。
一意の閾値が、ヌクレオチド値を表4の少なくとも10、20、30、40、50、75、100、150、もしくは200個のバリアント、例えば、変異に対応する事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てるために、サブゲノム間隔に適用される。
適用される該一意の閾値のうちのX個は、試験で使用される別の閾値よりも高い、例えば、50%高い閾値、例えば、使用される最低の閾値、使用される平均もしくは中央閾値、または表9に列記される閾値等の一般的な臨床的に関連する変異の閾値を有し、Xは、1、2、3、4、5、10、15、20、もしくは30以上である。
一意の閾値は、ヌクレオチド値を少なくとも10、20、30、40、50、75、100、150、もしくは200個のバリアントに対応する事前選択されたヌクレオチド位置に割り当てるために、サブゲノム間隔に適用され、
適用される該一意の閾値のX個は、試験で使用される別の閾値よりも低い、例えば、50%低い閾値、例えば、使用される最高閾値、使用される平均もしくは中央閾値、または以前は癌において変異するように見られなかったゲノム位置の閾値を有し、Xは、1、2、3、4、5、10、15、20、もしくは30以上である。
一意の閾値が、表11の大腸癌の遺伝子に列記される遺伝子のうちの少なくとも2、3、5、7、もしくは8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値のうちの3つずつのX個の組み合わせ(すなわち、対での組み合わせ)について、対での組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、大腸癌の分析において、一意の閾値が、APC、SMAD4、およびCDNK2aのサブゲノム間隔に(低い閾値から高い閾値の順に)適用される。したがって、3つの対での組み合わせ、APC/SMAD4、APC/CDNK2a、およびSMAD4/CDNK2aのそれぞれにおいて、対での組み合わせのそれぞれの両方のメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する(例えば、実施形態および表11の両方において、APCはSMAD4よりも低い)。
一意の閾値が、表11の大腸癌の遺伝子に列記される遺伝子のうちの少なくとも3、5、7、もしくは8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値のうちの3つずつのX個の組み合わせ(すなわち、3元の組み合わせ)について、3元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、大腸癌の分析において、一意の閾値が、APC、SMAD4、CDNK2a、およびVHLのサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、3元の組み合わせ、APC/SMAD4/CDNK2aにおいて、3元の組み合わせの3つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。同様に、3元の組み合わせ、APC/CDNK2a/VHLにおいて、3元の組み合わせの3つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、表11の大腸癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも4、5、7、もしくは8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の4つずつのX個の組み合わせ(すなわち、4元の組み合わせ)について、4元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、大腸癌の分析において、一意の閾値が、APC、SMAD4、CDNK2a、VHL、MSH6、およびMSH2におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、APC/SMAD4/CDNK2a/MSH2の4元の組み合わせにおいて、4元の組み合わせの4つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、表11の肺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも2、3、5、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の2つずつのX個の組み合わせ(すなわち、対での組み合わせ)について、対での組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、肺癌の分析において、一意の閾値が、CDNK2a、STK11、RB1、APC、およびSMAD4におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、3つの対での組み合わせ、CDNK2a/STK11、STK11/APC、およびRB1/SMAD4のそれぞれにおいて、対での組み合わせのそれぞれの両方のメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する(例えば、実施形態および表11の両方において、STK11はSMAD4よりも低い)。
一意の閾値は、表11の肺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも3、5、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の3つずつのX個の組み合わせ(すなわち、3元の組み合わせ)について、3元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、肺癌の分析において、一意の閾値は、CDNK2a、STK11、RB1、APC、およびSMAD4におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、3元の組み合わせ、CDNK2/APC/SMAD4において、3元の組み合わせの3つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値は、表11の肺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも4、5、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の4つずつのX個の組み合わせ(すなわち、4元の組み合わせ)について、4元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、肺癌の分析において、一意の閾値が、CDNK2a、STK11、RB1、APC、およびSMAD4におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、4元の組み合わせ、CDNK2a/STK11/APC/SMAD4において、4元の組み合わせの4つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、表11の前立腺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも2、3、4、5、6、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の2つずつのX個の組み合わせ(すなわち、対での組み合わせ)について、対での組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、前立腺癌の分析において、一意の閾値が、CEBPA、MSH2、CDKN2A、APC、RB1、NF1におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、3つの対での組み合わせ、STK11/CEBPA、RB1/NF1、およびCEBPA/CDKN2Aのそれぞれにおいて、対での組み合わせのそれぞれの両方のメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する(例えば、実施形態および表11の両方において、STK11はCEBPAよりも低い)。
一意の閾値が、表11の前立腺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも3、4、5、6、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の3つずつのX個の組み合わせ(すなわち、3元の組み合わせ)について、3元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、もしくは5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、前立腺癌の分析において、一意の閾値が、STK11、CEBPA、MSH2、CDKN2A、APC、およびRB1におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、3元の組み合わせ、CDNK2/APC/RB1において、3元の組み合わせの3つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、表11の前立腺癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも4、5、6、もしくは7個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の4つずつのX個の組み合わせ(すなわち、4元の組み合わせ)について、4元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、前立腺癌の分析において、一意の閾値が、STK11、CEBPA、MSH2、CDKN2A、APC、RB1、およびNF1におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、4元の組み合わせ、STK11/APC/RB1/NF1において、4元の組み合わせの4つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値は、表11の乳癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも2、3、5、7、もしくは8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の2つずつのX個の組み合わせ(すなわち、対での組み合わせ)について、対での組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、乳癌の分析において、一意の閾値が、CDH1、CDKN2A、APC、RB1、SMAD4、NF2、STK11、MSH2におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、3つの対での組み合わせ、APC/SMAD4、APC/NF2、およびSMAD4/MSH2のそれぞれにおいて、対での組み合わせのそれぞれの両方のメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する(例えば、実施形態および表11の両方において、APCはSMAD4よりも低い)。
一意の閾値が、表11の乳癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも3、5、7、または8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の3つずつのX個の組み合わせ(すなわち、3元の組み合わせ)について、3元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、5、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、乳癌の分析において、一意の閾値が、CDH1、CDKN2A、RB1、SMAD4、NF2、STK11、MSH2におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、3元の組み合わせ、CDH1/RB1/STK11において、3元の組み合わせの3つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、表11の乳癌の遺伝子に列記された遺伝子のうちの少なくとも4、5、7、または8個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の4つずつのX個の組み合わせ(すなわち、4元の組み合わせ)について、4元の組み合わせのメンバーは、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有し、Xは、1、2、3、4、10、もしくは20以上である。例として、ある実施形態では、乳癌の分析において、一意の閾値が、CDH1、CDKN2A、APC、RB1、SMAD4、NF2、STK11、MSH2におけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、例えば、4元の組み合わせ、CDH1/SMAD4/STK11/MSH2において、4元の組み合わせの4つのメンバーはすべて、表11のそれらの遺伝子が相互に対して有する相対順位と同一の相対順位を相互に対して有する。
一意の閾値が、遺伝子APC、SMAD4、およびATMのうちの少なくとも2個もしくは3個のそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、
適用される一意の閾値の2つずつのX個の組み合わせ(すなわち、対での組み合わせ)について、対での組み合わせのメンバーは、APC、SMAD4、およびATMの相対順位であり、Xは、1、2、もしくは3以上である。例として、ある実施形態では、大腸癌の分析において、一意の閾値が、APC、SMAD4、およびATMにおけるサブゲノム間隔に適用される(低い閾値から高い閾値の順)。したがって、対での組み合わせ、APC/SMAD4およびAPC/ATMのそれぞれにおいて、対での組み合わせのそれぞれの両方のメンバーは、APC、SMAD4、およびATMにおける相対順位と同一の相対順位を有する。
一意の閾値が、遺伝子APC、SMAD4、およびATMのそれぞれのサブゲノム間隔に適用され、低い閾値から高い閾値の順位は、APC、SMAD4、およびATMである。
(表11は、それらの遺伝子のいくつかまたはすべてのコード塩基対、例えば、表9の塩基等のより速い速度で変異することで特に知られている塩基の別の廃止リストによって別様に特定されない塩基対の閾値が増加する順に遺伝子の順序を列挙する。)
第1の一意の閾値が、第1の事前選択されたヌクレオチド位置に適用され、そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し、
第2の一意の閾値が、該第1の事前選択されたヌクレオチド位置以外の事前選択されたヌクレオチド、例えば、腫瘍表現型に関連したバリアントを有しない位置に適用され、該第1の閾値は、第2の閾値よりも高い。
a)第1の一意の閾値を取得し、それを第1のゲノム間隔に適用することと(そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントは、点変異、例えば、表6の変異である)、
b)第2の一意の閾値を取得し、それを第2のゲノム間隔に適用することと(そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントは、再編成、例えば、欠失、挿入、または転座、例えば、表5の変異である)、
c)第3の一意の閾値を取得し、それを第3のゲノム間隔、例えば、バリアントが腫瘍表現型または該試料の腫瘍型に関連しないゲノム間隔に適用することとを含む。
(i)例えば、最深の対象範囲が比較的低い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするように要求される、第1の閾値を第1の事前選択されたヌクレオチド位置についての読み取りに適用すること(例として、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%以下の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異が挙げられる。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、500倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、事前選択された癌において頻繁に変異するエクソンである)、
(ii)例えば、高い対象範囲(実施形態において、上記の(i)未満であるが)が、比較的高い頻度、例えば、上記の(i)における変異よりも高い頻度で出現する変異に対する高レベルの感度を可能にするために要求される、第2の閾値を第2の事前選択されたヌクレオチド位置についての読み取りに適用すること(例として、試料中の細胞、ライブラリの核酸、またはライブラリ捕獲物の核酸において5%より大きく、最大10、15、もしくは20%の頻度で出現するバリアント、例えば、点変異が挙げられる。典型的には、これらのバリアントは、高い検出信頼性を確保するために、200倍を超える配列決定深度を必要とする。例となる適用は、癌に関連した遺伝子においてである)、
(iii)例えば、低〜中程度の対象範囲(実施形態において、上述の(i)または(ii)の対象範囲未満)が、ヘテロ接合体対立遺伝子に対する高レベルの感度を可能にするために要求される、第3の閾値を第3の事前選択されたヌクレオチド位置についての読み取りに適用すること(例として、バリアント、例えば、(1)薬物に応答するか、またはそれを代謝する患者の能力に関連し得る薬理ゲノムSNP、(2)患者を一意に特定する(フィンガープリントする)ために使用され得るゲノムSNP、あるいは(3)ゲノムDNAおよびLOHのコピー数獲得/喪失を評価するために使用され得るゲノムSNP/遺伝子座が挙げられる)、
(iv)第4の閾値を第4の事前選択されたヌクレオチド位置、例えば、再編成、例えば、転座またはインデルにおける、例えば、構造ブレークポイントについての読み取りに適用すること(実施形態において、対象範囲は、(i)、(ii)、もしくは(iii)のうちの1つの対象範囲未満である。例として、実施形態において、高い検出信頼性を確保するために5〜50倍の配列対スパン深度を必要とするイントロンブレークポイントが挙げられる。例となる適用は、転座/インデルの傾向のある癌遺伝子である)、
(v)例えば、わずかな対象範囲がコピー数の変化を検出する能力を改善し得る、第5の閾値を第5の事前選択されたヌクレオチド位置についての読み取りに適用すること(実施形態において、対象範囲は、(i)、(ii)(iii)、もしくは(iv)のうちの1つの対象範囲未満である。例として、例えば、高い検出信頼性を確保するために0.1〜10倍の対象範囲を必要とするいくつかの末端エクソンの1コピー欠失がある。例となる適用は、増幅/欠失の傾向のある癌遺伝子に対する)。
第1の閾値は、第2の閾値よりも大きく、
第2の閾値は、第3の閾値よりも大きく、
第3の閾値は、第4の閾値よりも大きく、
第4の閾値は、第5の閾値よりも大きい。
a)変異予想、
b)変異確率値、
c)ベイズ先行、
d)変異頻度、
e)事前選択されたヌクレオチド位置に関連したバリアント型、例えば、腫瘍表現型、例えば、点変異または再編成、例えば、欠失、挿入、または転座に関連したバリアント、
f)コピー数、
g)サブゲノム間隔の腫瘍型、あるいは
h)サブゲノム間隔、
のうちの1、2、3、4個以上、もしくはすべての関数であるか、あるいはそれらに基づいて選択され、Xは、少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100である。
年齢、性別、事前環境暴露、例えば、変異原もしくは発癌物質への事前環境暴露、薬物もしくは治療への事前暴露、例えば、抗腫瘍剤での事前治療、患者が現在喫煙しているか、または過去に喫煙していたか、腫瘍型、あるいはサブゲノム間隔における生殖細胞系変化のうちの1、2、3、4個以上、もしくはすべての関数であるか、またはそれらに基づいて選択され、
Xは、少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100である。
腫瘍型、部位特異的腫瘍倍数性(例えば、SNP分析に基づいて)、腫瘍接合性、試料純度、腫瘍試料中の細胞充実度(例えば、試料中の腫瘍細胞の割合)、対象の腫瘍と対照SNP遺伝子型が適合するか、あるいは予測または観察されるDNA損傷のレベルのうちの1、2、3、4個以上、もしくはすべての関数であるか、またはそれに基づいて選択され、
Xは、少なくとも1、2、3、5、10、20、40、50、60、70、80、90、もしくは100である。
該事前選択された組は、
第1の遺伝子におけるヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
第1の遺伝子のイントロンのヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
第1の遺伝子のエクソンのヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
第1の遺伝子におけるヌクレオチド位置、例えば、バリアントが腫瘍表現型に関連するヌクレオチド位置を含む、事前選択された範囲内のヌクレオチド位置のすべてを含むか、あるいはそれらに限定され、例えば、バリアントは、点変異または再編成、例えば、欠失、挿入、または転座である。
該それに続く遺伝子におけるヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
該それに続く遺伝子のイントロンのヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
該それに続く遺伝子のエクソンのヌクレオチド位置のすべて、またはその事前選択された部分、
該それに続く遺伝子におけるヌクレオチド位置を含む、事前選択された範囲内のヌクレオチド位置のすべてを含むか、あるいはそれに限定され、そのバリアントは、腫瘍表現型に関連し、例えば、バリアントは、点変異または再編成、例えば、欠失、挿入、または転座である。
例えば、バックグラウンド変異率の関数である第1の一意の閾値を、サブゲノム間隔、例えば、遺伝子の第1の事前選択された位置または第1の事前選択された組の位置に適用すること、および
例えば、本明細書に開示の要因、例えば、腫瘍表現型に関連したバリアントの予想頻度に応答して選択される、それに続く、例えば、第2、第3、第4、第5、もしくは第6の一意の閾値を、該サブゲノム間隔のそれに続く、例えば、第2、第3、第4、第5、もしくは第6の事前選択された位置または事前選択された組の位置に適用することを含む。
そのバリアントが腫瘍表現型に関連するヌクレオチド位置以外のヌクレオチド位置、または
遺伝子におけるヌクレオチド位置の大部分を含み得るか、あるいはそれに限定され得る。
そのバリアントが腫瘍表現型に関連するヌクレオチド位置、
該遺伝子のイントロンの第1の事前選択された部分のヌクレオチド位置、
該遺伝子のエクソンの第1の事前選択された部分のヌクレオチド位置、
そのバリアントが腫瘍表現型に関連するヌクレオチド位置を含む、事前選択された範囲内のヌクレオチド位置のすべて(例えば、バリアントは、点変異または再編成、例えば、欠失、挿入、または転座である)、
遺伝子におけるヌクレオチド位置の小さな一部、あるいは
遺伝子の1、2、3、3、5、10、もしくは20個を超えないヌクレオチド位置を含むか、またはそれに限定される。
そのバリアントが腫瘍表現型に関連する該ヌクレオチド位置以外のヌクレオチド位置、
該遺伝子のイントロンの第1の事前選択された部分の該ヌクレオチド位置以外のヌクレオチド位置、
該遺伝子のエクソンの第1の事前選択された部分の該ヌクレオチド位置以外のヌクレオチド位置、
そのバリアントが腫瘍表現型に関連するヌクレオチド位置を含む、事前選択された範囲内の該ヌクレオチド位置以外のヌクレオチド位置(例えば、バリアントは、点変異または再編成、例えば、欠失、挿入、または転座である)を含み得るか、あるいはそれに限定され得る。
臨床癌検体の次世代の配列決定からの体細胞のゲノム変化の高感度検出のためのベイズ手法
(aaa)X個のサブゲノム間隔のそれぞれについての1つまたは複数の読み取りを該試料由来の核酸から取得することと、
(bbb)該X個のサブゲノム間隔のそれぞれの事前選択されたヌクレオチド位置のために、以下を取得することと、
(i)腫瘍型Xの該事前選択されたヌクレオチド位置で事前選択されたバリアント、例えば、変異を示す読み取りを観察する先行(例えば、文献)予想であるか、またはそれを表す第1の値、および
(ii)バリアントがある頻度(例えば、1%、5%、10%等)で試料に存在する場合、および/またはバリアントが不在である(例えば、塩基呼び出しエラーのみにより読み取りで観察される)場合、該事前選択されたヌクレオチド位置で該事前選択されたバリアントを示す読み取りを観察する確率を表す第2の組の値、
(ccc)該値に応答して、第1の値を用いて第2の組の値の間の比較を検討する(例えば、変異の存在の事後確率を算出する)ことによって、該事前選択されたヌクレオチド位置のそれぞれに対する該読み取りからのヌクレオチド値を割り当てる(例えば、変異を呼び出す)こととを含んでもよく、それによって、該試料を分析する。
P(変異存在|読み取りデータ「R」)=P(変異の頻度「F」>0|R)=1−P(F=0|R)
等式A:
重複読み取り
コンセンサス読み取りを導き出す例:
読み取り1: CCAAAACTAAACTGCTCTTTAAATATCTTAGACACT(配列番号2)
読み取り2: CCAAAACTAAACTGCTCTTTAAATATCTTAGACACT(配列番号3)
読み取り3: CCAACACTAAACTGCTCTTTAAATATCTTAGACACT(配列番号4)
コンセンサス: CCAAAACTAAACTGCTCTTTAAATATCTTAGACACT(配列番号5)
(a)任意で、(例えば、該サブゲノム間隔の最初のコピーの増幅によって形成された)サブゲノム間隔の複数の重複を取得することと、
(b)該複数の重複のそれぞれについての読み取りを取得して、複数の重複読み取りを提供することと、
(c)該複数の重複読み取りのそれぞれにおける第1のヌクレオチド位置でのヌクレオチド値を比較することと(典型的には、1個の重複読み取りにおけるヌクレオチド位置は、第2の読み取りにおける対応するヌクレオチド位置と比較される)、
(d)任意で、該複数の重複読み取りのそれぞれにおける第2のヌクレオチド位置でのヌクレオチド値を比較することと、
(この場合において、ヌクレオチド位置のうちの一方では、該複数の読み取りのそれぞれは、同一のヌクレオチド値を有さず、任意で、該ヌクレオチド位置の他方では、該複数の読み取りのそれぞれは、同一のヌクレオチド値を有する)
(e)第1の分類子、例えば、品質スコアまたは重複調節されたヌクレオチド値を、該複数の読み取りのすべてにおいて同一のヌクレオチド値を有しない位置でのヌクレオチド値に割り当てることと、
(f)任意で、第2の分類子、例えば、品質スコアまたは重複調節されたヌクレオチド値を、複数の読み取りのそれぞれにおいて同一のヌクレオチド値を有する位置でのヌクレオチド値に割り当てることとを含む、腫瘍試料由来の核酸の配列を分析する方法を含み、
該第1の分類子は、それが割り当てられるヌクレオチド値が正しいという第1のレベルの品質または信頼度を示し、該第2の分類子は、それが割り当てられるヌクレオチド値が正しいという第2のレベルの品質または信頼度を示し、該第1のレベルは、事前選択された基準以下である。
他の実施形態
複数のベイトを選択することをさらに含み、該選択は、1)患者の特性、例えば、年齢、腫瘍の病期、前治療、または抵抗力、2)腫瘍型、3)腫瘍試料の特性、4)対照試料の特性、5)対照の存在または種類、6)単離された腫瘍(または対照)核酸試料の特性、7)ライブラリの特性、8)腫瘍試料の腫瘍型に関連することが知られている変異、9)腫瘍試料の腫瘍型に関連することが知られていない変異、10)事前選択された配列を配列決定する(またはハイブリダイズもしくは回収する)か、または事前選択された変異、例えば、高GC領域の配列決定もしくは再編成に関連した困難性を同定する能力、あるいは11)配列決定される遺伝子に応答する。
該TGAが事前選択されたデータベース、例えば、有効なTGAのデータベースに存在するかを決定すること、
所定のデータベースからのTGAの情報を該対象の該TGAと関連付ける(アノテートする)こと、および
任意で、該対象の第2またはその後のTGAが該事前選択されたデータベースに存在するかを決定し、かつ存在する場合、所定のデータベースからの第2またはその後のTGAの情報を該患者に存在する該第2のTGAと関連付けることを含む。
該TGAが事前選択されたデータベース、例えば、有効なTGAのデータベースに存在するかを決定すること、
該事前選択されたデータベースに存在しないTGAが既知の臨床的に関連性のあるGまたはAを有するかを決定し、有する場合、該事前選択されたデータベースにおける該TGAの入力を提供することを含む。
例証
実施例1:腫瘍試料からの核酸単離
実施例2A:DNAの剪断
実施例2B:DNA剪断の代替案
実施例3:ライブラリ調製
末端修復反応
3’A−塩基添加
マルチプレックスアダプターのライゲーション
PCR濃縮
1サイクル 98℃ 30秒間
18サイクル 98℃ 10秒間
65℃ 30秒間
72℃ 30秒間
1サイクル 72℃ 5分間
4℃ 保持
実施例4:ハイブリッド選択
プールインデックス試料ライブラリ
プールされたDNAライブラリをビオチン化RNAベイトにハイブリダイズする
a. ハイブリダイゼーション緩衝混合液(1反応当たり13μL):
i. ハイブリダイゼーション緩衝液1番(Agilent)−25μL
ii. ハイブリダイゼーション緩衝液2番(Agilent)−1μL
iii. ハイブリダイゼーション緩衝液3番(Agilent)−10μL
iv. ハイブリダイゼーション緩衝液4番(Agilent)−13μL
b. ブロッキング混合物(1反応当たり8μL):
i. SureSelectブロック1番(Agilent)−2.5μL
ii. SureSelectブロック2番(Agilent)−2.5μL
iii. 対合末端プライマー1.0ブロック(IDT、H2Oで200uMに再懸濁した)−1.5μL
iv. インデックスプライマー1−12ブロック(IDT、H2Oで200uMに再懸濁した)−1.5μL
c. RNaseブロックの希釈
i. 3Mb未満のテリトリーを有するカスタムビオチン化RNAベイトの場合:1μLのRNaseブロック(Agilent)を9μLの水中に希釈した。
ii. 3Mbを超えるベイトテリトリーを有するカスタムベイトの場合:1μLのRNaseブロックを3μLの水中に希釈した(7uLの捕捉反応につき依然として0.5μLのRNaseブロック)
d. ベイト混合物:(1反応当たり7μL)
i. RNAベイト−2μL(3Mbを超えるベイトテリトリーを有するベイトの場合、5μLのベイトを使用した)
ii. 希釈されたRNaseブロック−5μL(3Mbを超えるベイトテリトリーを有するベイトの場合、上述のように希釈された2μLのRNaseブロックを使用した)
磁気ビーズの調製
ハイブリッド捕捉DNAの選択
捕捉DNAのPCR濃縮
QPCRプライマー1.1(IDTからHPLC精製した):
5’AATGATACGGCGACCACCGAGAT3’(配列番号48)
QPCRプライマー2.1(IDTからHPLC精製した):
5’CAAGCAGAAGACGGCATACGA3’(配列番号49)
60μLのマスターミックスを96ウェルPCRプレート中の40μLのそれぞれ精製した捕捉DNA試料に添加した。反応物を以下のように熱循環機内でインキュベートした:
1サイクル 98℃ 30秒間
12サイクル 98℃ 10秒間
65℃ 30秒間
72℃ 30秒間
1サイクル 72℃ 5分間
4℃ 保持
実施例5:方法
ゲノムDNA配列決定
cDNA配列決定
実施例6:マルチプレックス分析用の例となる選択された遺伝子およびバリアント
転移性結腸癌におけるKRAS G13D
乳癌におけるERBB2増幅
非小細胞肺癌におけるEGFR L858R
カテゴリーB:特定の実験的治療の対象基準または除外基準である変化
結腸癌、肺癌、または乳癌におけるKRAS G13D
黒色腫、結腸癌、または肺癌におけるBRAF V600E
黒色腫におけるNRAS Q61K
乳癌におけるPIK3CA H1047R
乳癌におけるFGFR1増幅
乳癌におけるPTEN両アレル不活性化
乳癌または膵臓癌におけるBRCA1両アレル不活性化
カテゴリーC:標準治療もしくは実験的治療に対する感度または抵抗を予測する限られた証拠(早期臨床データ、相反する臨床データ、臨床前データ、理論的データ)を有する変化
結腸癌におけるKRAS Q61H(早期臨床)
乳癌におけるPIK3CA H1047R(相反する臨床)
結腸癌におけるBRAF V600E(相反する臨床)
肺癌におけるERBB2変異または増幅(ケース報告)
肺癌におけるBRAF D594G(臨床前)
乳癌におけるFGFR1増幅(臨床前)
乳癌におけるATM両アレル不活性化(臨床前)
結腸癌におけるTSC1両アレル不活性化(臨床前)
乳癌におけるATR二対立遺伝子不活性化(理論的)
肉腫におけるBRAF V600E変異(理論的)
カテゴリーD:特定の癌のサブタイプの予後または診断的有用性を有する変化
結腸癌におけるMSH2両アレル不活性化(強力な臨床的証拠)
結腸癌におけるBRAF V600E(強力な臨床的証拠)
肺癌におけるKRAS G13D(強力な臨床的証拠)
乳癌におけるBRCA1不活性化(強力な臨床的証拠)
カテゴリーE:明確な臨床的意義を有しない、癌における明確な生物学的意義を有する変化(すなわち、ドライバ変異)
結腸癌におけるAPC両アレル不活性化
乳癌におけるTP53両アレル不活性化
黒色腫におけるMITF増幅
卵巣癌におけるARID1A
カテゴリーF:癌における既知の生物学的意義を有しない変化
既知の癌遺伝子における新規の変化
治療の標的
既知の癌遺伝子のオルソログ
実施例7:ハイブリッド捕捉のための例となるベイト配列
表7:例となるベイト
1.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477013〜67477132
CCATTGTGTGTGAGCAAAGGCACCCTGTCCAGTCTAACCTGAATCTCTGTAGGAAGAGGCGTGCGGCTCTACTACATCGGAGGGGAGGTCTTCGCAGAGTGCCTCAGTGACAGCGCTATT(配列番号6)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.2)
2.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477037〜67477156
CTGTCCAGTCTAACCTGAATCTCTGTAGGAAGAGGCGTGCGGCTCTACTACATCGGAGGGGAGGTCTTCGCAGAGTGCCTCAGTGACAGCGCTATTTTTGTCCAGTCTCCCAACTGTAAC(配列番号7)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.4)
3.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477061〜67477180
GTAGGAAGAGGCGTGCGGCTCTACTACATCGGAGGGGAGGTCTTCGCAGAGTGCCTCAGTGACAGCGCTATTTTTGTCCAGTCTCCCAACTGTAACCAGCGCTATGGCTGGCACCCGGCC(配列番号8)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.6)
4.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477085〜67477204
TACATCGGAGGGGAGGTCTTCGCAGAGTGCCTCAGTGACAGCGCTATTTTTGTCCAGTCTCCCAACTGTAACCAGCGCTATGGCTGGCACCCGGCCACCGTCTGCAAGATCCCACCAGGT(配列番号9)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.1)
5.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477109〜67477228
GAGTGCCTCAGTGACAGCGCTATTTTTGTCCAGTCTCCCAACTGTAACCAGCGCTATGGCTGGCACCCGGCCACCGTCTGCAAGATCCCACCAGGTAAACGAGCCGCACAGGCACCCCTG(配列番号10)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.5)
6.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_10 染色体15:67477133〜67477252
TTTGTCCAGTCTCCCAACTGTAACCAGCGCTATGGCTGGCACCCGGCCACCGTCTGCAAGATCCCACCAGGTAAACGAGCCGCACAGGCACCCCTGCCTTGAGGTCCCTCTCCGAGTGCA(配列番号11)
(ベイトID: SMAD3_標的_10.3)
7.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479655〜67479774
GACCTGGCCACTTCCATCCCCACAGCCCTGTTTCTGTGTTTTTGGCAGGATGCAACCTGAAGATCTTCAACAACCAGGAGTTCGCTGCCCTCCTGGCCCAGTCGGTCAACCAGGGCTTTG(配列番号12)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.1)
8.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479679〜67479798
GCCCTGTTTCTGTGTTTTTGGCAGGATGCAACCTGAAGATCTTCAACAACCAGGAGTTCGCTGCCCTCCTGGCCCAGTCGGTCAACCAGGGCTTTGAGGCTGTCTACCAGTTGACCCGAA(配列番号13)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.5)
9.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479703〜67479822
GATGCAACCTGAAGATCTTCAACAACCAGGAGTTCGCTGCCCTCCTGGCCCAGTCGGTCAACCAGGGCTTTGAGGCTGTCTACCAGTTGACCCGAATGTGCACCATCCGCATGAGCTTCG(配列番号14)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.3)
10.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479727〜67479846
ACCAGGAGTTCGCTGCCCTCCTGGCCCAGTCGGTCAACCAGGGCTTTGAGGCTGTCTACCAGTTGACCCGAATGTGCACCATCCGCATGAGCTTCGTCAAAGGCTGGGGAGCGGAGTACA(配列番号15)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.4)
11.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479751〜67479870
CCCAGTCGGTCAACCAGGGCTTTGAGGCTGTCTACCAGTTGACCCGAATGTGCACCATCCGCATGAGCTTCGTCAAAGGCTGGGGAGCGGAGTACAGGTCAGTTATGGGTGCTGCCTACA(配列番号16)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.2)
12.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_11 染色体15:67479775〜67479894
AGGCTGTCTACCAGTTGACCCGAATGTGCACCATCCGCATGAGCTTCGTCAAAGGCTGGGGAGCGGAGTACAGGTCAGTTATGGGTGCTGCCTACATCAGGGGACCCAACTCCAGGTGAC(配列番号17)
(ベイトID: SMAD3_標的_11.6)
13.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482692〜67482811
TGTAACCCCCTGGAGATTTTTTAAGTCCCCCACCCCACCCCTTTCCCTATTTCTTACAGGAGACAGACTGTGACCAGTACCCCCTGCTGGATTGAGCTGCACCTGAATGGGCCTTTGCAG(配列番号18)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.5)
14.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482716〜67482835
GTCCCCCACCCCACCCCTTTCCCTATTTCTTACAGGAGACAGACTGTGACCAGTACCCCCTGCTGGATTGAGCTGCACCTGAATGGGCCTTTGCAGTGGCTTGACAAGGTCCTCACCCAG(配列番号19)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.3)
15.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482740〜67482859
ATTTCTTACAGGAGACAGACTGTGACCAGTACCCCCTGCTGGATTGAGCTGCACCTGAATGGGCCTTTGCAGTGGCTTGACAAGGTCCTCACCCAGATGGGCTCCCCAAGCATCCGCTGT(配列番号20)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.2)
16.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482764〜67482883
ACCAGTACCCCCTGCTGGATTGAGCTGCACCTGAATGGGCCTTTGCAGTGGCTTGACAAGGTCCTCACCCAGATGGGCTCCCCAAGCATCCGCTGTTCCAGTGTGTCTTAGAGACATCAA(配列番号21)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.4)
17.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482788〜67482907
CTGCACCTGAATGGGCCTTTGCAGTGGCTTGACAAGGTCCTCACCCAGATGGGCTCCCCAAGCATCCGCTGTTCCAGTGTGTCTTAGAGACATCAAGTATGGTAGGGGAGGGCAGGCTTG(配列番号22)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.6)
18.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
SMAD3 SMAD3_標的_12 染色体15:67482812〜67482931
TGGCTTGACAAGGTCCTCACCCAGATGGGCTCCCCAAGCATCCGCTGTTCCAGTGTGTCTTAGAGACATCAAGTATGGTAGGGGAGGGCAGGCTTGGGGAAAATGGCCATGCAGGAGGTG(配列番号23)
(ベイトID: SMAD3_標的_12.1)
表8:例となるベイト
1.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674626〜28674745
元の配列
CGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCCGGCCCAGCCCTGCGATGCCGCCTGGAGCGGCGCGCCTCGCGCTGCAGGTGGCTCTCTTAAGGATG(配列番号24)
修飾された配列
CGTCTCACGCCAACGCAAGCATGTCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCCGGCCCAGCCCTGCGATGCCGCCTGGAGCGGCGCGCCTCGCACTGCAGATGGCTCTCTTAAGGATG(配列番号25)
(ベイトID: FLT3_標的_24.1)
2.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674602〜28674721
元の配列
TACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCCGGCCCAGCCCTGCGATGCCGCCTGGAGCGGCGCGCCTCGCG(配列番号26)
修飾された配列
TACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCATGCCCAGCCCTGCGATGCCGCCTTGAGCAACGCGCCTCACG(配列番号27)
(ベイトID: FLT3_標的_24.2)
3.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674578〜28674697
元の配列
GCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCCGGCCCAGCCCTGCGATG(配列番号28)
修飾された配列
GCTTCGAGAGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCAGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGGCCGCGCCAGCCCAGCCCTGAGATG(配列番号29)
(ベイトID: FLT3_標的_24.3)
4.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674554〜28674673
元の配列
GTGGGGGCTGAGGGACCGCGAGGGGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGGCCTCCGGAGCCCGGGGTCCCCAGG(配列番号30)
修飾された配列
GAGGTGGCTGAGAGACCGCGAGGAGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCAGGCATGGCCTCCGGAGCCCAGGGTCCCCAGG(配列番号31)
(ベイトID: FLT3_標的_24.4)
5.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674506〜28674625
元の配列
CGAGGCGGCTGGGCCGGAGGAGGCGCGCGCCCGGGTCCACACTGCGGGGTGGGGGCTGAGGGACCGCGAGGGGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGC(配列番号32)
修飾された配列
CGAGGCGGCTGGGCCGGAGGAGGCGCGCGCCCGGATCCACACTGCGGGGTGGGGGCTGAGGGACCGCGAGGGGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGACTTACCGAGCAGCGGCAACTGGACGC(配列番号33)
(ベイトID: FLT3_標的_24.5)
6.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT3 FLT3_標的_24 染色体13:28674530〜28674649
元の配列
GCGCGCCCGGGTCCACACTGCGGGGTGGGGGCTGAGGGACCGCGAGGGGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCCGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGG(配列番号34)
修飾された配列
GCACGCACGGATCCACACTGCGGGGTGGGGGCTGAGGGACCGCGAGGAGCTGCGAGCGAGCGAGCGGGGCCTTACCGAGCAGCGGCAGCTGGCAGCCGTCGCGCGCCAACGCCGGCATGG(配列番号35)
(ベイトID: FLT3_標的_24.6)
7.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076516〜180076635
元の配列
TCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCGGCCGCGGCTCGGGGCTGAAAGTGTCCGCGCGGGCGCCGGCTGGCCTGGGGCGGGGCG(配列番号36)
修飾された配列
CACACACACAAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCGGCCGCGGCTCGGGGCTGAAAGTGTCCGCGCGGGCGCCGGCTGGCCTGCACACACACA(配列番号37)
(ベイトID: FLT4_標的_31.1)
8.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076396〜180076515
元の配列
GGCGGAGCGGTCTCAGCGCCCGCCCCAGGTGCGCGGTACCCCCTCCCCGGCCAGCCCCACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAG(配列番号38)
修飾された配列
CACACACACATCTCAGCGCCCGCCCCAGGTGCGCGGTACCCCCTCCCCGGCCAGCCCCACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCCACACACACA(配列番号39)
(ベイトID: FLT4_標的_31.2)
9.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076420〜180076539
元の配列
CCAGGTGCGCGGTACCCCCTCCCCGGCCAGCCCCACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCG(配列番号40)
修飾された配列
CACACACACAGGTACCCCCTCCCCGGCCAGCCCCACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCACACACACA(配列番号41)
(ベイトID: FLT4_標的_31.3)
10.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076468〜180076587
元の配列
GGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCGGCCGCGGCT(配列番号42)
修飾された配列
CACACACACACCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCCACACACACA(配列番号43)
(ベイトID: FLT4_標的_31.4)
11.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076444〜180076563
元の配列
GGCCAGCCCCACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTG(配列番号44)
修飾された配列
CACACACACAACGCTCGGGCGGGTGGCCCGTTCGCCGCGCTCACCGTCCAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCCACACACACA(配列番号45)
(ベイトID: FLT4_標的_31.5)
12.遺伝子 標的 ベイトゲノム位置
FLT4 FLT4_標的_31 染色体5:180076492〜180076611
元の配列
CAGGAGTCCCAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCGGCCGCGGCTCGGGGCTGAAAGTGTCCGCGCGGG(配列番号46)
修飾された配列
CACACACACAAGGCAGAGCCACAGTCGCAGGCACAGCGCGGCGCCCCGCTGCATCTCCGGCCGCTGCGCGTGGGTCCGACCCGAGCGGCCGCGGCTCGGGGCTGAAAGTGCACACACACA(配列番号47)
(ベイトID: FLT4_標的_31.6)
実施例8:次世代の配列決定臨床癌検体由来の体細胞ゲノム変化の高感度検出のためのベイズ手法
実施例9:ベイズ手法:構成された低純度多クローン性試料への適用
実施例10:ベイズ手法:肺および結腸腫瘍試料への適用
実施例11:ベイズ手法:乳癌試料への適用
実施例12:ベイズ手法:低頻度変異の検出
実施例13A.個別に合成されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを用いた高性能の溶液ベースの標的選択
実施例13B:ベイトの捕捉を最適化する方法
ベイトセット1は、個別に合成された5’−ビオチン化DNAオリゴヌクレオチドベイトのみからなる。
ベイトセット2は、個別に合成された5’−ビオチン化DNAオリゴヌクレオチドベイトでスパイクされたアレイ由来のビオチン化RNAベイトを含む。
ベイトセット3は、アレイ由来のビオチン化RNAベイトのみからなる。
実施例13C:ベイトセットを評価するための例となる実験条件
実施例14.低入力のホルマリン固定組織由来のDNAを用いた敏感な腫瘍プロファイリングのための日常の超深度配列決定
実施例15.循環腫瘍細胞を用いた腫瘍ゲノムのプロファイリング
実施例16.FFPE腫瘍試料の標的化DNAおよびRNA深度配列決定の統合を介する遺伝子発現における癌関連変異、転座、および変化の検出
結果:
方法:
実施例17.臨床腫瘍試料の超深度配列決定による高感度かつ正確な変異呼び出し
実施例18.切除縁における癌変異の検出
増分的に試験した過形成性結腸ポリープの縁から単離された正常な結腸試料由来の6個の切片において、ポリープから最も遠位の切片(切片1)ではKRAS変異は観察されなかった。ポリープから2番目に遠位の切片(切片2)の細胞の1%、ポリープから3番目に遠位の切片(切片3)の細胞の2%、ポリープから4番目に遠位の切片(切片4)の細胞の3%、ポリープから5番目に遠位の切片(切片5)の細胞の4%、およびポリープに最も近い切片(切片6)の細胞の5%においてKRAS p.G13D変異が観察された。ポリープの縁由来の切片から単離された細胞の6%において変異が観察された。
参照による組み込み
等価物
Claims (24)
- 体細胞変異について試料を分析する方法であって、
(a)複数の核酸分子を含むライブラリを試料から取得することと、
(b)前記ライブラリを複数のベイトセットと接触させることによって事前選択された配列の前記ライブラリを濃縮して、選択された核酸分子を提供し、それによって、ライブラリ捕獲物を産生することと、
(c)体細胞変異を含むサブゲノム間隔についての読み取りを次世代配列決定方法を用いて前記ライブラリ捕獲物からの核酸分子から取得することと、
(d)前記読み取りをアライメント方法を用いてアライメントすることと、
(e)事前選択されたヌクレオチド位置に対する前記読み取りからのヌクレオチド値を割り当てることと、を含み、
それによって、前記試料を分析し、
前記アライメント方法が事前選択された再編成とアライメントするために事前選択された再編成アライメント配列と前記読み取りをアライメントすることを含み、
少なくともX個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれからの読み取りが、一意のアライメント方法でアライメントされ、Xは、少なくとも2、10、15、20、30、50、100、500または1000であり、
一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意のアライメント方法とは、他のX−1個のアライメント方法とは異なることを意味し、
前記少なくともX個の一意のサブゲノム間隔からの読み取りが少なくともX個の一意の事前選択された再編成アライメント配列を用いて分析され、ここで、一意とは、他のX−1個とは異なることを意味する、
方法。 - 前記の事前選択された再編成が、事前選択されたインデル(indel)である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、
(i) 事前選択された再編成アライメント配列が、前記事前選択された再編成に相当する配列またはその相補体のいずれかの配列を含むか、
(ii) 事前選択された再編成アライメント配列が、事前選択された再編成の配列またはその相補体以外の配列である模擬配列であって、前記の事前選択された再編成配列の読み取りとアライメントするために選択された模擬配列を含むか、あるいは
(iii) 事前選択された再編成アライメント配列が、事前選択された再編成とは同一ではないことを特徴とする、方法。 - 表1もしくは表1Aにおいて優先順位が1のアノテーションを有する少なくともX個の遺伝子由来のサブゲノム間隔は、一意のアライメント方法でアライメントされ、Xは、10、15、20、または30に相当する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- a)第1の一意のアライメント方法を第1のサブゲノム間隔に適用することであって、前記第1のゲノムのバリアントが腫瘍表現型に関連し、前記バリアントが表6の点変異であることと、
b)第2の一意のアライメント方法を第2のサブゲノム間隔に適用することであって、前記第2のサブゲノムのバリアントが腫瘍表現型に関連し、前記バリアントが、表5の欠失、挿入、または転座から選択される再編成であることと、
c)バリアントが前記試料の腫瘍表現型または前記腫瘍型に関連しないサブゲノム間隔を含む第3のサブゲノム間隔に第3の一意のアライメント方法を適用することと、
を更に含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 試料が腫瘍試料である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サブゲノム間隔は、単一ヌクレオチド位置;遺伝子内領域もしくは遺伝子間領域;エクソンもしくはイントロン、またはそれらの断片、エクソン配列またはその断片;コード領域もしくは非コード領域、プロモーター、エンハンサー、5’非翻訳領域(5’UTR)もしくは3’非翻訳領域(3’UTR)、またはそれらの断片;cDNAまたはその断片;SNP;体細胞変異、生殖細胞変異、もしくはそれら両方;変化、点変異もしくは単一変異;欠失変異;インフレーム欠失、遺伝子内欠失、全遺伝子欠失;挿入変異;遺伝子内挿入;逆位変異;染色体内逆位;連鎖変異;連鎖された挿入変異;逆位重複変異;タンデム重複;染色体内タンデム重複;転座;染色体転座、非相反転座;再編成;ゲノム再編成;1つ以上のイントロンもしくはその断片の再編成;5’−もしくは3’−UTRを含む再編成されたイントロン;あるいはそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含むか、またはそれらからなる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子は、癌に関連付けられるか、または抗癌治療に対する応答性を予測する1つ以上の変化を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記変化は、正常かつ健康な組織または細胞と比較して、癌組織または癌細胞におけるヌクレオチド配列の変化、アミノ酸配列の変化、染色体転座、染色体内逆位、コピー数の変化、発現レベルの変化、タンパク質レベルの変化、タンパク質活性の変化、またはメチル化状態の変化を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記変化は、癌の危険性、癌進行、癌治療、もしくは癌治療に対する耐性;癌の遺伝的危険因子;正の治療応答予測因子;負の治療応答予測因子;正の予後因子;負の予後因子;または診断因子のうちの1つ以上に関連するか、または関連しない、請求項8に記載の方法。
- 前記試料は、1つ以上の前悪性もしくは悪性細胞;固形腫瘍、軟組織腫瘍、もしくは転移病巣由来の細胞;切除縁由来の組織もしくは細胞;組織学的に正常な組織;1つ以上の循環腫瘍細胞(CTC);正常な隣接組織(NAT);または前記腫瘍を有するか、もしくは有する危険性のある同一の対象由来の血液試料を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記試料は、FFPE試料である、請求項11に記載の方法。
- 前記次世代配列決定方法は、試料から取得されたRNA由来のcDNAの配列決定を含む、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 次世代配列決定方法がDNA配列決定ステップおよびRNA配列決定ステップを行うことを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- DNA配列決定によって検出された変異または再編成の発現を、RNA配列決定によって確認することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- (i)前記核酸試料をフィンガープリントすること、
(ii)遺伝子もしくは遺伝子産物の存在量を定量化すること、
(iii)前記試料中の転写物の相対存在量を定量化すること、
(iv)特定の対象に属するとして前記核酸試料を特定すること、
(v)対象の遺伝的構成、民族性、人種、もしくは家族性形質のうちの1つ以上を含む前記核酸試料の遺伝形質を特定すること、
(vi)前記核酸試料の倍数性を決定すること、
(vii)前記核酸試料におけるヘテロ接合性の消失を決定すること、
(viii)前記核酸試料における遺伝子重複事象の存在もしくは不在を決定すること、
(ix)前記核酸試料における遺伝子増幅事象の存在もしくは不在を決定すること、または
(x)前記核酸試料中の腫瘍/正常な細胞混合物のレベルを決定すること、
のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。 - 前記試料由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物由来のサブゲノム間隔を配列決定することを含み、前記遺伝子または遺伝子産物は、ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、またはTP53から選択される、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 以下うちの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13個、もしくはすべてから選択されるサブゲノム間隔を配列決定することを含む、請求項1〜17のいずれかに記載の方法:
A)ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、BRAF、CCND1、CDK4、CDKN2A、CEBPA、CTNNB1、EGFR、ERBB2、ESR1、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HRAS、JAK2、KIT、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MET、MLL、MYC、NF1、NOTCH1、NPM1、NRAS、NTRK3、PDGFRA、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1、PTCH1、PTCH2、PTEN、RB1、RET、SMO、STK11、SUFU、もしくはTP53のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
B)ABL2、ARAF、ARFRP1、ARID1A、ATM、ATR、AURKA、AURKB、BAP1、BCL2、BCL2A1、BCL2L1、BCL2L2、BCL6、BRCA1、BRCA2、CBL、CARD11、CBL、CCND2、CCND3、CCNE1、CD79A、CD79B、CDH1、CDH2、CDH20、CDH5、CDK6、CDK8、CDKN2B、CDKN2C、CHEK1、CHEK2、CRKL、CRLF2、DNMT3A、DOT1L、EPHA3、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHB1、EPHB4、EPHB6、ERBB3、ERBB4、ERG、ETV1、ETV4、ETV5、ETV6、EWSR1、EZH2、FANCA、FBXW7、FGFR4、FLT1、FLT4、FOXP4、GATA1、GNA11、GNAQ、GNAS、GPR124、GUCY1A2、HOXA3、HSP90AA1、IDH1、IDH2、IGF1R、IGF2R、IKBKE、IKZF1、INHBA、IRS2、JAK1、JAK3、JUN、KDM6A、KDR、LRP1B、LRP6、LTK、MAP2K4、MCL1、MDM2、MDM4、MEN1、MITF、MLH1、MPL、MRE11A、MSH2、MSH6、MTOR、MUTYH、MYCL1、MYCN、NF2、NKX2−1、NTRK1、NTRK2、PAK3、PAX5、PDGFRB、PKHD1、PLCG1、PRKDC、PTPN11、PTPRD、RAF1、RARA、RICTOR、RPTOR、RUNX1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SOX10、SOX2、SRC、TBX22、TET2、TGFBR2、TMPRSS2、TNFAIP3、TNK、TNKS2、TOP1、TSC1、TSC2、USP9X、VHL、もしくはWT1のうちの少なくとも5つ以上から選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
C)表1、1A、2、3、もしくは4に記載の遺伝子または遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
D)ABL1、AKT1、ALK、AR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CEBPA、EGFR、ERBB2、FLT3、JAK2、KIT、KRAS、MET、NPM1、PDGFRA、PIK3CA、RARA、AKT2、AKT3、MAP2K4、NOTCH1、およびTP53のうちの1つ以上から選択される遺伝子または遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
E)前記ABL1遺伝子のコドン315;APCのコドン1114、1338、1450、もしくは1556;BRAFのコドン600;CTNNB1のコドン32、33、34、37、41、もしくは45;EGFRのコドン719、746〜750、768、790、858、もしくは861;FLT3のコドン835;HRASのコドン12、13、もしくは61;JAK2のコドン617;KITのコドン816;KRASのコドン12、13、もしくは61;PIK3CAのコドン88、542、545、546、1047、もしくは1049;PTENのコドン130、173、233、もしくは267;RETのコドン918;TP53のコドン175、245、248、273、もしくは306のうちの1つ以上から選択される変異コドンまたは野生型コドンを含む少なくとも5、6、7、8、9、10個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
F)ABCB1、BCC2、ABCC4、ABCG2、C1orf144、CYP1B1、CYP2C19、CYP2C8、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5、DPYD、ERCC2、ESR2、FCGR3A、GSTP1、ITPA、LRP2、MAN1B1、MTHFR、NQO1、NRP2、SLC19A1、SLC22A2、SLCO1B3、SOD2、SULT1A1、TPMT、TYMS、UGT1A1、もしくはUMPSから選択される変異または野生型遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
G)(i)薬物で治療された癌患者のより良好な生存率、(ii)パクリタキセル代謝、(iii)薬物毒性、もしくは(iv)薬物の副作用のうちの1つ以上に関連した変異または野生型PGx遺伝子もしくは遺伝子産物由来の少なくとも5、6、7、8、9、10、15、20、25、30個、もしくはそれ以上のサブゲノム間隔、
H)表3に記載の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化、
I)表3に明記される前記癌型由来の固形腫瘍試料における、表3に記載の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、110個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化、
J)表4に記載の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化、
K)表4に明記される前記癌型由来のヘム腫瘍試料における、表4に記載の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200個、もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座変化、
L)対立遺伝子変異が事前選択された腫瘍型に関連し、前記対立遺伝子変異が前記腫瘍型の前記細胞の5%未満に存在する、表1、表1A−4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物、
M)GCが豊富な領域に埋め込まれる表1、表1A−4から選択される少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物、あるいは
N)BRCA1、BRCA2、EGFR、HRAS、KIT、MPL、ALK、PTEN、RET、APC、CDKN2A、MLH1、MSH2、MSH6、NF1、NF2、RB1、TP53、VHL、もしくはWT1のうちの1つ以上から選択される癌を発現させる遺伝因子を示す少なくとも5個の遺伝子もしくは遺伝子産物。 - 臨床グレードの質で患者の変異の分析に対応する、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 長さ1〜50塩基のインデル(indel)に対し90%を超える感度を有する、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 一意の呼び出し方法によってX個の一意のサブゲノム間隔のそれぞれの中のヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値が割り当てられ、ここで、一意のサブゲノム間隔とは、他のX−1個のサブゲノム間隔とは異なることを意味し、一意の呼び出し方法とは、他のX−1個の呼び出し方法とは異なることを意味し、Xは少なくとも2であることを特徴とする、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 第一のベイズ先行(Bayesian prior)の関数である第一のヌクレオチド位置に適用される第一の呼び出し方法と第二のベイズ先行の関数である第二のヌクレオチド位置に適用される第二の呼び出し方法から選択される異なるベイズ先行値に依存することにより呼び出し方法が異なっている、請求項21に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド値の割り当てが、
(i) 腫瘍型における前記事前選択されたヌクレオチド位置で事前選択されたバリアントを示す読み取りを観察する先行予想であるか、またはそれを表す値、または
(ii) バリアントが10%未満の頻度で試料中に存在する場合、および/またはバリアントが不在である場合に、前記の事前選択されたヌクレオチド位置で前記の事前選択されたバリアントを示す読み取りを観察する確率を表す一組の値
の関数である、請求項21または22に記載の方法。 - 電子形態、ウェブベース形態、または書面形態で、報告書を、前記患者、または別の人物もしくは事業体、介護人、医師、癌専門医、病院、診療所、第三者支払人、保険会社、または官庁に提供することをさらに含む、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
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