JP6004149B1 - ピペットチップ及びピペッティング方法 - Google Patents

Abstract

ピペットチップにおいて、本体部と、本体部の先端に配される直管部とを有し、直管部の内径が０．８ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下であり、直管部の長さが５ｍｍ以上かつ１５ｍｍ以下であるように構成する。

Description

本発明は、細胞を培養する際に用いるピペットチップ及びピペットチップを用いるピペッティング方法に関するものである。

細胞の培養においては、薬液を吸引及び搬送及び吐出するためにピペット及びピペット先端部に嵌めたピペットチップを頻繁に使用する。そのため、薬液の搬送時の液だれを防ぐこと及び吐出時の液切れを良化させることを目的としたピペットチップが開発されている。具体的には、チップ先端を２重構造にすることで、搬送時の液だれを防ぐピペットチップがある（例えば、特許文献１参照）。

また、ピペットチップの先端に２種類の表面粗さをつけることで、撥水性を向上し、液切れを良化させているものがある（例えば、特許文献２参照）。

特開２００５−９１１０５号公報 特開２０１２−７３２２７号公報

しかしながら、従来のピペットチップは、薬液のピペットの液切れ及び液だれのみに着目しており、ピペットのもう１つの役割である、薬液の吸引及び吐出を繰り返す行為であるピペッティングによる細胞砕き（細胞塊（コロニー）の大きさを小さくする、もしくは単個細胞にすること）の観点からのチップ形状、言い換えれば、径のバラつきの検討が不十分であるという課題があった。

そこで、本発明は、細胞懸濁液内の細胞を目的のサイズの塊もしくは単個細胞まで、径のバラつきを少なく砕くことができるピペットチップ及びピペッティング方法を実現することを目的とする。

前記目標を達成するために、本発明の１つの態様におけるピペットチップは、本体部と、
前記本体部の先端に配される直管部と、を有し、
前記直管部の内径が０．８ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下であり、
前記直管部の長さが５ｍｍ以上かつ１５ｍｍ以下である。

また、前記目標を達成するために、本発明の別の態様におけるピペッティング方法は、
前記ピペットチップを用いて、細胞を含む液体を吸引し、
前記ピペットチップを用いて前記吸引した液体を吐出する。

以上のように、本発明の前記態様にかかるピペットチップを用いることで、細胞懸濁液内の細胞を目的のサイズの塊もしくは単個細胞まで、径のバラつきを少なく砕くことが可能となる。

ピペットチップの断面図 ピペットチップの斜視図 ピペッティングによるコロニー砕きの様子を説明する図 ピペッティング後のコロニー顕微鏡写真（長さ０ｍｍ、内径０．８ｍｍ）を示す図（図中の２５０μｍは算術平均値、５０〜４００μｍは最小値〜最大値を示す） ピペッティング後のコロニー顕微鏡写真（直管部１１２の長さ５ｍｍ、内径０．７ｍｍ）を示す図（図中の６０μｍは算術平均値、３０〜１５０μｍは最小値〜最大値を示す） ピペッティング後のコロニー顕微鏡写真（直管部１１２の長さ５ｍｍ、内径１．６ｍｍ）を示す図（図中の４００μｍは算術平均値、１００〜６００μｍは最小値〜最大値を示す） 直管部の内径及び長さの値を変化させ、ピペッティングをしたときのコロニー径の結果を示す図 ピペットチップを用いた吸引及び吐出方法の説明図 ピペットチップ先端の断面図

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、同じ構成要素には同じ符号を付しており、説明を省略する場合もある。また、図面は、理解しやすくするためにそれぞれの構成要素を主体として、模式的に示している。

（実施の形態１）
図１Ａは、本発明の実施の形態１におけるピペットチップ１００の概略断面図である。図１Ｂは、ピペットチップの斜視図である。

本実施の形態１のピペットチップ１００は、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、小さな管として形成される。小さな管の一端には、比較的大きな開口（大開口部１１０）を有し、小さな管の他端（先端）には、液体を通すための比較的小さな開口（小開口部１１１）を有する。大開口部１１０と小開口部１１１との間には、貫通路部１０２を備える。小開口部１１１から大開口部１１０に向かっての貫通路部１０２は、ピペットチップ１００の本体部１０１と、本体部１０１の先端に配置された直管部１１２とで構成されている。本体部１０１は、第１テーパー部１１３と、第２テーパー部１１４とで構成されている。よって、ピペットチップ１００は、他端から一端に向けて、直管部１１２と、第１テーパー部１１３と、第２テーパー部１１４とが隣接して一体的に連結されている。直管部１１２は、傾斜することなく、内径が一定の管部分である。第１テーパー部１１３の傾斜角度は、第２テーパー部１１４の傾斜角度に比べて大きくなっている。

ピペットチップ１００の役割の１つには、ピペッティングによる細胞砕きがある。ピペッティングによる細胞砕きについては、図２の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に基づいて説明する。図２の（ａ）は、培養容器１１５内で細胞１１８ａが接着している様子を説明する図である。図２の（ｂ）は、培養容器１１５から細胞１１８ａを剥離及び回収し、遠沈管チューブ１１６の中で細胞懸濁液１１８となっている様子を説明する図である。図２の（ｃ）は、ピペッティングにより細胞懸濁液１１８内のコロニーを砕いている様子を説明する図である。この図２の（ａ）に示す培養容器１１５から、細胞などの固体１１８ａと、培養液と培養容器１１５に接着した細胞を剥がすための薬液である剥離剤などの液体とが混ざった状態の細胞懸濁液１１８をピペットチップ１００により回収して、遠沈管チューブ１１６の中に入れる（図２の（ｂ）参照）。次いで、この遠沈管チューブ１１６の中にピペットチップ１００を挿入した状態でかつ遠沈管チューブ１１６の中でピペットチップ１００を軸方向に動かしながら、遠沈管チューブ１１６とピペットチップ１００との間で細胞懸濁液１１８の吸引及び吐出を１回以上行うことで、細胞懸濁液１１８中の細胞塊（コロニー）の大きさを小さくする、もしくは単個細胞にする。この動作が、ピペッティングによる細胞砕きである。

このようなピペッティングによる細胞砕きは、培養容器１１５内の細胞１１８ａが飽和状態に近づき、細胞株を分ける作業（以降、継代と言う。）が必要になったとき、又は、細胞播種時に細胞密度を正確に制御するために細胞数計測が必要になったときに行う。このとき、一例として、容量１５ｍｌ、外径１８ｍｍ程度、長さ１２０ｍｍ程度の遠沈管チューブ１１６の中でピペットチップ１００を動かしながら、ピペッティング作業を実施することで、細胞を効率的に砕くことができる。なお、遠沈管チューブ１１６内でのピペットチップ１００の先端の小開口部１１１の位置は、細胞懸濁液１１８の液面と同じように、吸引とともに下降し、吐出とともに上昇することが望ましい。これにより、ピペッティング時に不要な泡の発生を抑制することができる。

ピペッティングによる細胞砕きにおいては、他の部分よりも直管部１１２において細胞を含む液体吸引及び吐出時の流速が大きくなることを利用して、細胞塊を所望の大きさまで砕くため、図１Ａ及び図１Ｂの直管部１１２の内径（内側の直径）及び長さの条件が重要である。

ヒトｉＰＳ細胞は、継代を行うときには、約１ｍｍ程度まで成長したコロニー（複数の単細胞が凝集した細胞塊）の直径を１００〜２００μｍまで砕いた上で株分けする必要がある。本発明者は、このようなヒトｉＰＳ細胞を用いて、試行錯誤的に細胞を砕く実験を行うことで、直管部１１２の内径及び長さの最適な範囲を決定した。実験においては、培地にＤＭＥＭ Ｆ−１２を用い、剥離剤にＣＴＫを用いた。ヒトｉＰＳ細胞を砕くときには、直径１００μｍより小さくなった場合には、細胞が死滅しやすく、直径２００μｍより大きい場合には、ｉＰＳ細胞の特徴である未分化状態が失われやすくなる。そこで、ピペッティング後に細胞懸濁液内にある全てのコロニー数に対して、直径１００μｍ以上かつ２００μｍ以下の範囲にあるコロニー数が７０％以上ある場合には、ピペッティングによる細胞砕きを成功として扱い、それ以外のときを失敗として扱い、実験を実施した。この実験におけるピペッティング方法の条件は、細胞懸濁液１０ｍｌに対して、吸引及び吐出量９ｍｌを吸引及び吐出速度４ｍｌ／ｓで３回行うものとした。なお、コロニーの直径は、その投影面積を、幾何学公式を用いて円の粒子に換算して、その円の粒子の粒子径（相当径）として取得した。

直管部１１２（図１Ａ及び図１Ｂ）の内径及び長さの値を試行錯誤的に変化させ、ピペッティングをしたときのコロニー径の結果を図６に示す。図６において、×は失敗、○は成功（径が１００〜２００μｍのコロニーが全体の７０％以上）、◎は成功（径が１００〜２００μｍのコロニーが全体の８０％以上）を示す。

図６の結果から、図１Ａ及び図１Ｂの直管部１１２の内径０．８ｍｍのときにはその長さ５ｍｍ以上１５ｍｍ以下という条件、内径１．０ｍｍのときには長さ５ｍｍ以上２０ｍｍ以下という条件、内径１．５ｍｍのときには長さ５ｍｍ以上２０ｍｍ以下という条件が、それぞれ、成功条件であることがわかった。ただし、直管部１１２を薄肉のまま曲がりなく２０ｍｍの長さに成形することは難しく、ピペットの重要な機能である液体の吸引が十分にできないことがわかったので、長さ２０ｍｍの条件は除外することとした。このため、直管部１１２の長さの上限値は、余裕を考慮して、１５ｍｍとした。

以上より、直管部１１２の最適条件は、内径０．８ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、かつ、長さ５ｍｍ以上１５ｍｍ以下となることがわかった。この最適範囲内の直管部１１２を備えることで、少ないピペッティング回数で、コロニー径のバラつきを少なく砕くことが可能である。

更に、図６の結果より、図１Ａ及び図１Ｂの直管部１１２の内径を、１．０ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下としてもよい。この条件とすると、ピペッティング後のコロニー径が１００〜２００μｍの範囲内でさらに安定する。

なお、直管部１１２の長さが５ｍｍよりも短い場合には、コロニー自体は砕けるが、コロニー径のばらつきが大きくなった。例えば、直管部１１２の長さを０ｍｍ（内径０．８ｍｍ）にしたときのピペッティングの顕微鏡写真を図３に示す。図３のコロニーを計測すると、目標の１００〜２００μｍに対して、算術平均２５０μｍ、５０〜４００μｍとバラつきが大きくなっていることがわかる。このとき、径が１００μｍ以上かつ２００μｍ以下の範囲のコロニーの割合は全体の５０％となった。

また、図１Ａ及び図１Ｂの直管部１１２の内径に関しては、０．８ｍｍ未満の場合には、コロニーが砕けすぎの状態になり、一方で１．５ｍｍより大きい場合にはコロニーが砕けないという問題が発生した。直管部１１２の内径０．７ｍｍ（長さ５ｍｍ）のときのピペッティング後の顕微鏡写真と、直管部１１２の内径１．６ｍｍ（長さ５ｍｍ）のときのピペッティング後の顕微鏡写真とを、図４と図５にそれぞれ示す。図４におけるコロニー径の算術平均６０μｍ、分布は３０〜１５０μｍであり、径が１００μｍ以上かつ２００μｍ以下の範囲のコロニーの割合は全体の３０％となった。また、図５におけるコロニー径の算術平均４００μｍ、分布は１００〜６００μｍであり、径が１００μｍ以上かつ２００μｍ以下の範囲のコロニーの割合は全体の３０％となった。

ここで、図７に、ピペットチップ１００を用いた液体の吸引及び吐出を行うシステムの構成図を示す。システムは、大開口部１１０が嵌め込まれた結合部１２０と、結合部１２０に連結されたチューブ１２１と、チューブ１２１に接続されたシリンジポンプ１２２と、制御部１２３とで構成している。制御部１２３は、シリンジポンプ１２２のピストン１２２ｐの位置を進退移動させるように駆動制御することで、シリンジポンプ１２２の駆動によるピペットチップ１００での液体の吸引及び吐出を行う。制御部１２３は、吸引時には、シリンジポンプ１２２内の気圧が減るように、シリンジポンプ１２２内のピストン１２２ｐを図７のＡ方向に移動させるように制御する。制御部１２３は、吐出時には、シリンジポンプ１２２内の気圧が増えるように、シリンジポンプ１２２内のピストン１２２ｐを図７のＢ方向に移動させるように制御する。

なお、ピペットチップ１００の材料は、ポリプロピレン、又は、プリスチレンなどの樹脂材料である。樹脂材料は、殺菌処理のための電子線滅菌処理、ガンマ線滅菌処理、又は、オートクレープ処理などに耐え得る材料であれば良い。

なお、直管部１１２は、内径が一定の寸法でかつ外径も一定の寸法の円管部分として説明しているが、これに限られず、以下のような構成でもよい。

例えば、図８の（ａ）に示すように、直管部１１２の小開口部１１１の内壁と外壁との間の厚みを、内径は同一のまま、小開口部１１１の先端ほど薄くなるような、最先端部１３１にしてもよい。すなわち、直管部１１２の外径は、先端に向かって縮径するように構成してもよい。これにより、液体の吸引及び吐出時の液切れがよくなる。

また、図８の（ｂ）に示すように、直管部１１２の小開口部１１１の内壁と外壁との間の厚みを、外径は同一のまま、小開口部１１１の先端ほど薄くなるようなテーパー角度１３５を有する逆テーパー部１３２にしてもよい。すなわち、直管部１１２は、内径が先端に向かって拡径する逆テーパー部１３２を有してもよい。テーパー角度１３５は３度以上６０度以下であることが望ましい。これにより、細胞懸濁液の吸引時に細胞を効率的に集めることができ、少ない回数でコロニーを砕くことができる。テーパー角度１３５が３度より小さい場合には、細胞回収を実現することが難しく、６０度より大きい場合には細胞が逆テーパー部１３２に引っかかりやすく、十分な細胞回収が実現できない。

なお、図８の（ｃ）に示すように、直管部１１２の内壁に凹凸１３３を配しても良い。凹凸１３３は、ピーク０．２ｍｍ程度、ピッチ０．２ｍｍ程度の微小な凹凸とし、内壁の表面粗さを粗くする。これにより、ヒトｉＰＳ細胞のコロニー培養を行うときに最適とされるコロニー径である１００〜２００μｍにコロニーを効率的に砕くことができる。

なお、図８の（ｄ）に示すように、直管部１１２の内壁に凸部１３４を設け、凸部１３４により一番内径が細くなる場所の内径が２００μｍとなるようにしてもよい。凸部１３４でヒトｉＰＳ細胞のコロニー培養を行うときに最適とされるコロニー径である１００〜２００μｍに細胞を効率的に砕くことができる。

ここで、図１Ａ及び図１Ｂの直管部１１２に接続される第１テーパー部１１３のテーパー角度１１７は３度以上２０度以下が望ましい。３度より小さいテーパー角度になると、細胞懸濁液の吸引時に第１テーパー部１１３で渦ができにくく、細胞コロニーが均質に混ざりにくくなる。一方、２０度より大きいテーパー角度になると、第１テーパー部１１３と第２テーパー部１１４のつなぎ目に細胞が留まりやすくなり、十分な細胞砕きが実現できない。テーパー角度１１７が前記範囲になるような第１テーパー部１１３を採用することで、ピペッティング時にコロニーを均質に混ぜることができ、コロニー径のバラつきを少なく、すなわち、細胞を均一な径に砕くことができる。

なお、第１テーパー部１１３の長さは、２０ｍｍ以上１００ｍｍ以下であることが望ましい。２０ｍｍより短い場合は、第１テーパー部１１３にできる渦が強くなりすぎるため、細胞ダメージが大きくなってしまう。一方、１００ｍｍより長い場合は、第１テーパー部１１３に渦ができにくくなり、細胞を均質に混ぜることが難しくなる。第１テーパー部１１３の長さが前記範囲になるようなピペットチップ１００を用いることで、ピペッティングにより所望のコロニー径にするときに、コロニー径のバラつきを少なくしながら、細胞ダメージを少なく、均質に混ぜることができる。

なお、第１テーパー部１１３と第２テーパー部１１４との接続部（境界）の外径及び内径は１０ｍｍ以上２０ｍｍの直径であることが望ましい。直管部１１２が細胞塊（コロニー）を砕く役割を有し、第１テーパー部１１３は細胞塊を砕き、均質化する役割を有し、第２テーパー部１１４はピッペティング時の吸引及び吐出量を増やす役割を有している。このため、第１テーパー部１１３と第２テーパー部１１４との接続部の内径が前記範囲より小さい場合には、ピペットチップ１００の全長が長くなりすぎて、ピペッティングの操作が難しくなる。一方、接続部の外径が前記範囲より大きい場合には、容量１５ｍｌの遠沈管チューブ１１６（図２）の内壁に第２テーパー部１１４が接触しやすくなり、ピペッティングが困難となる。加えて、第２テーパー部１１４は、ピッペティング時の吸引及び吐出量を増やす機能を発揮するために、テーパー角度が限りなく小であることが望ましい。これらから、第１テーパー部１１３と第２テーパー部１１４との接続部の径が前記範囲になるようなピペットチップ１００を用いることで、簡易的にピペッティングを実施することができる。

また、第２テーパー部１１４の内径は、１０ｍｍ以上かつ１８ｍｍ以下の範囲で、可能な限り大きい方が良い。第２テーパー部１１４でピペットチップ１００の容量を大きくすることで、ピペット全長を短くすることができる。これにより、ピペットチップ１００を扱う操作者又はロボットが、ピペットの操作を容易に行うことができる。

なお、ピペットチップ１００の全長は、例えば６０ｍｍ以上かつ１７０ｍｍ以下である。これにより、容量１５ｍｌの遠沈管チューブ１１６（図２）内でピペッティングなどの作業を行うときに、作業者もしくは作業を行うロボットへの可動域の観点での負担を少なくすることができる。つまり、作業者の場合には、楽にピペットを遠沈管チューブ１１６に挿入することができ、作業ロボットの場合には、装置全体の全高を低くすることができる。

なお、ヒトｉＰＳ細胞のコロニーをピペッティングにより砕く場合には、ピペットチップ１００を用いて、吸引と吐出とも３．０ｍｌ／ｓ以上７．０ｍｌ／ｓ以下の速度で５ｍｌ以上１２ｍｌ以下の細胞懸濁液を吸引及び吐出することを２回以上５回以下繰り返すことが望ましい。図７の制御部１２３によりピペットチップ１００の吸引量及び速度、吐出量及び速度は制御される。発明者らの実験により前記のピペッティング条件を見出した。詳細には、吸引及び吐出速度が前記より小さいと勢いが弱く細胞塊を砕くことができなかった。また、前記より大きいと砕いた後の細胞へのダメージが大きくなった。また吸引及び吐出量が前記より小さいと細胞塊が均質に混ざらず、前記より大きいとピペットチップ１００の大開口部１１０から液体が溢れて、コンタミネーションを起こしてしまう可能性があった。また、吸引及び吐出の回数は前記より少ないとコロニー径のばらつきが大きくなり、前記より多いと細胞へのダメージが大きくなった。これらにより、前記の条件でピペッティングを実施することにより、コロニー径のバラつきを少なくしながら、細胞懸濁液の吸引及び吐出により生じるせん断力が細胞へ与えるダメージを低減することができ、均質な細胞砕きを実現することができる。

前記実施形態によれば、少なくとも、直管部１１２の内径を０．８ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下とし、直管部１１２の長さを５ｍｍ以上かつ１５ｍｍ以下とするようにピペットチップ１００を構成するようにしている。このような構成により、細胞懸濁液１１８内の細胞１１８ａを目的のサイズの塊もしくは単個細胞まで、コロニー径のバラつきを少なく砕くことができる。

また、ピペットチップ１００を用いて、細胞を含む液体を吸引し、ピペットチップ１００を用いて前記吸引した液体を吐出する、ピペッティング方法を実現することで、前記の効果を奏することができる。

前記ピペッティング方法の実施に際し、５ｍｌ以上１２ｍｌ以下の前記液体を３．０ｍｌ／ｓ以上７．０ｍｌ／ｓ以下の速度で２回以上５回以下の回数だけ、吸引及び吐出することで、前記効果をより顕著に奏することが可能となる。

更に、前記細胞にヒトｉＰＳ細胞を適用し、当該ヒトｉＰＳ細胞を含む液体に対して前記ピペッティング方法を実施することで、前記ヒトｉＰＳ細胞が形成するコロニーの直径を１００μｍ以上２００μｍ以下に砕くことが可能となる。すなわち、細胞懸濁液１１８内のヒトｉＰｓ細胞を目的のサイズの塊もしくは単個細胞まで、コロニー径のバラつきを少なく砕くことができる。

なお、前記様々な実施形態又は変形例のうちの任意の実施形態又は変形例を適宜組み合わせることにより、それぞれの有する効果を奏するようにすることができる。また、実施形態同士の組み合わせ又は実施例同士の組み合わせ又は実施形態と実施例との組み合わせが可能であると共に、異なる実施形態又は実施例の中の特徴同士の組み合わせも可能である。

本発明にかかるピペットチップ及びピペットチップを用いるピペッティング方法は、細胞懸濁液内の細胞を目的のサイズの塊もしくは単個細胞まで、径のバラつきを少なく砕くことができて、細胞を培養する際に用いる再生医療又は創薬分野で有用である。

１００ ピペットチップ
１０１ 本体部
１１０ 大開口部
１１１ 小開口部
１１２ 直管部
１１３ 第１テーパー部
１１４ 第２テーパー部
１１５ 培養容器
１１６ 遠沈管チューブ
１１７ テーパー角度
１１８ 細胞懸濁液
１１８ａ 細胞
１２０ 結合部
１２１ チューブ
１２２ シリンジポンプ
１２２ｐ ピストン
１２３ 制御部
１３１ 最先端部
１３２ 逆テーパー部
１３３ 凹凸
１３４ 凸部
１３５ テーパー角度

Claims (11)

1. 本体部と、
   前記本体部の先端に配される直管部と、を有し、
   前記直管部の内径が１．０ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下であり、
   前記直管部の長さが５ｍｍ以上かつ１５ｍｍ以下である、
   ピペットチップ。
2. 前記本体部は、前記直管部に接続されると共に、前記直管部に向かって縮径する第１テーパー部を有し、
   前記直管部の前記第１テーパー部のテーパー角度は３度以上２０度以下である、
   請求項１に記載のピペットチップ。
3. 前記本体部は、前記第１テーパー部に接続されると共に、前記第１テーパー部よりもテーパー角度が小である第２テーパー部を有する、
   請求項２に記載のピペットチップ。
4. 前記直管部の外径は先端に向かって縮径する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載のピペットチップ。
5. 前記直管部は、内径が先端に向かって拡径する逆テーパー部を有する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載のピペットチップ。
6. 前記直管部の内壁に凹凸を配する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載のピペットチップ。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記ピペットチップを用いて、細胞を含む液体を吸引し、
   前記ピペットチップを用いて前記吸引した液体を吐出する、ピペッティング方法。
8. ５ｍｌ以上１２ｍｌ以下の前記液体を３．０ｍｌ／ｓ以上７．０ｍｌ／ｓ以下の速度で２回以上５回以下の回数だけ、吸引及び吐出する、請求項７に記載のピペッティング方法。
9. 前記細胞はヒトｉＰＳ細胞である、請求項７又は８に記載のピペッティング方法。
10. 前記ピペットチップを用いて、前記ヒトｉＰＳ細胞を含む前記液体を吸引し、
    前記ピペットチップを用いて、前記吸引した液体を吐出することにより、前記ヒトｉＰＳ細胞が形成するコロニーの直径を１００μｍ以上２００μｍ以下に砕く、請求項９に記載のピペッティング方法。
11. 本体部と、
    前記本体部の先端に配される直管部と、を有し、
    前記直管部の内径が０．８ｍｍ以上かつ１．５ｍｍ以下であり、
    前記直管部の長さが５ｍｍ以上かつ１５ｍｍ以下であり、
    前記直管部の内壁に凹凸を配する、ピペットチップ。