JP5963037B2 - 多孔質膜のウィルス除去率評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、浄水処理や再生水処理等に用いる多孔質膜のウィルス除去率評価方法に関するものである。本発明により、ＭＳ２ファージなどのウィルスを除去率を簡便に推測することが可能である。

近年、上下水の除濁や高次処理、工業排水の清澄化などの浄水分野において多孔質膜を使用した多孔質膜モジュールが導入されるようになっている。これらの多孔質膜モジュールには、使用される多孔質膜には、限外ろ過膜が特に高いウィルス除去性能が要求性能を満たすとして好ましく用いられる（例えば、非特許文献１）。

従来、ウィルス除去性能が要求される多孔質膜の性能評価手法としては、ＭＳ２ファージを用いた除去率測定が知られている（非特許文献２）。ＭＳ２ファージを用いた除去率測定より、ウィルス除去率の性能としては対数除去係数（Ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｖａｌｕｅ：ＬＲＶ）が用いられることが多く、例えば多孔質膜のウィルス除去性能としてＬＲＶが４以上というようなウィルス除去性能が要求される。しかしながら、ＭＳ２ファージを用いたウィルス除去率測定はウィルスの培養が難しく、取扱いも極めて困難であるといった問題がある（特許文献１）。

一方、ウィルス除去性能を有する多孔質膜においては、既に代替粒子を用いた膜のインテグリティ試験方法が開示されている。インテグリティ試験とは、タンパクや生理活性物質等を含む溶液の中からウィルスを除去する目的で使用されるウィルス除去膜の使用後（場合によっては、使用前の）の性能確認のために行われる試験のことである。インテグリティ試験として、（ａ）バブルポイント法、（ｂ）膜が有する孔径分布の大きい孔の割合を測定する方法（例えば、液体−液体の低い界面張力を利用する方法）、（ｃ）代替粒子の濾過による方法がすでに知られている（特許文献２）。

特許文献２にも記載のとおり、（ａ）バブルポイント方法の測定原理は、気体−液体の表面張力差を利用し、気体圧力かけ最初に気泡が発生した圧力をバブルポイント値と定義するものである。従って、膜の孔のうち一番大きな孔を検出するものであり、孔数の割合など孔の分布に対しては考慮されておらず、ウィルス除去率との対応が必ずしも良好でなく、膜によってはバブルポイントまで圧を上昇する前に膜が物理的に破損するといった欠点がある。

一方、（ｂ）膜が有する孔径分布の大きい孔の割合を測定する方法（例えば、液体−液体の低い界面張力を利用する方法）も種々知られているが、前述のバブルポイント圧を用いて、下式（１）を用いて孔径を算出する方法が知られている（非特許文献１）。

式１

（ここで、Ｄ：細孔径［ｍ］、Ｐ：バブルポイント圧［Ｐａ］、γ：液体の表面圧力［Ｎ／ｍ］、θ：接触角［ｒａｄ］である。）

ここで、気泡が放出される瞬間はθ＝０となるため、式（１）は、式（２）のようになる。

式２

すなわち、式（１）及び式（２）によれば、微細な孔からの気泡を放出するには、高い圧力をかけなければならないという問題が生じる。特に、ウィルス除去性能を有する膜の場合必要な平均孔径は数十ｎｍオーダーとなる（例えば、ＭＳ２ファージの直径は約３０ｎｍ程度であることが知られている。）。してみると、その測定に必要なバブルポイント圧で少なくとも１０ＭＰａ以上となることから、多孔質膜の素材によっては、このような圧力に耐えることができず、バブルポイントを測定するまでに膜が破壊あるいは破裂することで計測できないという問題がある。

さらにまた、（ｃ）代替粒子の濾過による方法としては、金コロイドを利用したインテグリティテスト方法が知られている。当該方法は、ウィルス粒子のかわりに金コロイド粒子を含む溶液でフィルターを濾過し、その除去性能を測定することを特徴とするものである（特許文献２）。しかしながら、当該金コロイド従来の金コロイド溶液を用いた方法では、限られたｐＨのみでしか使用できないため、膜中のｐＨを厳密に制御する洗浄処理が必要となり操作が非常に煩雑であった（特許文献３）。また、金コロイド溶液自体が高価で入手が困難という問題があった。

特表平９−５０９８３１号公報 特許第３３２８８５７号公報 特開平７−１３２２１５号公報

「膜ろ過技術」（株式会社工業調査会）、２００６年発行、ｐ１０−１３、ｐ５６−５８ Ｊ．ｏｆ Ｍｅｍｂ．ｓｃｉ．，３２６（２００９）ｐ１１１−１１６

本発明は、上述のような課題を解決するものであり、ウィルス除去性能を有する多孔質膜のウィルス除去性能を評価するに際し、膜素材等の条件に限定されることなく、かつ、簡便にウィルス除去性能をより正確に検査することを目的とする多孔質膜の評価手法を提供することを目的とする。

かかる課題を解決しうる本願発明は、下記の工程（１）〜（３）からなり、下記工程（１）で作製するデキストラン標準溶液が、分子量１，０００，０００〜５，０００，０００Ｄａのデキストランを用いたものであり、かつ、濃度が０．０５〜０．５質量％であり、かつ、前記溶媒が、非イオン界面活性剤又はその水溶液である、多孔質膜のウィルス除去率評価方法である。
工程（１）：分子量既知の有色デキストランを溶媒に分散しデキストラン標準溶液を作製する溶液調整工程
工程（２）：評価される多孔質膜を用いて前記デキストラン標準溶液をろ過し、該デキストラン溶液を透過したろ液を採取するろ過工程
工程（３）：前記標準溶液及びろ液それぞれの吸光度を測定することにより、多孔質膜のデキストラン除去率を求め、さらにその値からウイルス除去率を換算する測定工程

本発明のウィルス除去率評価方法によれば、ウィルスサイズ相当の分子量既知の有色デキストランを用いることより、ウィルス除去膜のウィルス除去性能が簡便に予測できる。また、有色デキストランであることで、吸光度測定のみでろ液濃度の測定が可能となる。以上により、培養と取り扱いとその除去率評価の難しいウィルスの代替粒子として毒性の低い親水性多糖類であるデキストランを用いてウィルス除去膜の評価が可能であるとの格別な効果を奏する。

本発明の多孔質膜の評価に使用可能なデッドエンドろ過装置である。 実施例１のＭＳ２除去率とデキストラン除去率の良好な相関性を示すグラフである。

以下、本発明の多孔質膜のウィルス除去率評価方法の一例を示して詳細に説明する。なお、本発明は以下の例示に必ずしも限定されない。

本発明の評価方法が対象とする多孔質膜は、ウィルス除去性能を有する膜である。平均孔径としては、数十〜数百ｎｍの孔径分布を有する膜である、一般的にこのような多孔質膜は限外ろ過膜、精密ろ過膜と呼ばれている。膜の形状は平膜・中空糸膜等のいずれでも好適に用いることができる。さらに、膜基材も、通常膜基材に用いることができるいかなるものであっても用いることができ、例えば、ポリスルホン、セルロース、ポリフッ化ビニリデンなどからなる熱可塑性高分子である中空糸膜であってもよい。

（有色デキストラン）
本発明の評価方法に用いるデキストランは、分子量が既知のものを用いる。ここで、デキストランの分子量は、一般的に、ＧＰＣ（ゲルパーミネーションクロマトグラフィー）法等の公知のクロマト法という方法で分子量は測定できる。本発明においても、これらに準拠して測定したデキストランの分子量の値を用いてもよい。
本発明においては、多孔質膜のデキストラン除去率は、分散液の吸光度を用いて測定することから、有色デキストランを用いる。有色デキストランとしては、ブルーデキストラン、ビオチン化デキストラン、蛍光標識等が知られている。

本発明においてデキストランの分子量は、１，０００，０００〜５，０００，０００Ｄａのものを用いることが好ましい。かかる範囲の分子量を有するデキストランを用いることにより、多孔質膜のデキストラン除去率と当該多孔質膜とのウィルスの阻止率とにより高い良好な相関性があることが見出せる。
分子量が５，０００，０００Ｄａより大きい場合は、デキストランの分子径サイズが大きすぎて、両条件ではウィルス阻止率との相関性が著しく低下するおそれがある。一方、デキストランの分子量が１，０００，０００Ｄａより小さい場合は、分子径サイズが小さすぎ、また線状高分子であるデキストランに関しては、限外濾過膜の分離特性を明らかにするマーカー粒子としては適さないおそれもある。より好ましくは、分子量が１，５００，０００〜３，０００，０００Ｄａ、さらには２，０００，０００〜２，５００，０００Ｄａであることが好ましい。

作製するデキストラン溶液の濃度は、デキストラン標準溶液の濃度が０．００１質量％より小さい場合は吸光度測定の際に濃度が低く検出が困難となる恐れがあり、デキストラン標準溶液の濃度が１質量％より大きい場合は次工程のろ過において多孔質膜の目詰まりの問題が懸念されることから。０．００１〜１質量％であると好ましい。０．０１〜１質量％より好ましい。さらにウィルス除去率との相関の厳密性の観点から、さらに好ましくは０．０５〜０．５質量％である。

（溶液調整工程）
本発明の溶液調整工程（工程（１））は、上述の有色デキストランを溶媒中に分散させた標準溶液を調製する。標準溶液の調整方法としては、有色デキストランを攪拌、等の公知の方法を溶媒中に分散させる。
本発明で用いることができる溶媒は、有色デキストランが好適に分散する常温で無色の液体であれば特に限定なく選択でき、例えば、多価アルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニールアルコール、ポリビニルピロリドン界面活性剤若しくは、これらの混合溶液又はこれらの水溶液等を用いることができる。中でも、デキストランの溶液中分散安定性を向上させる、膜素材への吸着を抑制させる効果が付与されるという点で、界面活性剤又はその水溶液が好適である。

界面活性剤としては、アルカリ性物質が接触したときに結晶が析出しない点で陰イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤はより好適に用いることができる。陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸又はその塩が挙げられる。塩のカウンターカチオンは、界面活性剤と高い反応性を有しない限り特に限定されず、市販で入手可能なリチウム塩、ナトリウム塩が挙げられる。好ましくはドデシル硫酸ナトリウムが例示される。非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルが挙げられ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等を用いることができる。

（ろ過工程）
本発明のろ過工程（工程（２））は、前述の溶液調整工程（工程（１））で作製したデキストラン標準溶液をろ過する工程である。本発明用いることができるろ過手段には、デッドエンドろ過、クロスフローろ過などがあるが、測定時間短縮、デキストラン液少量化、測定設備と工程の簡略化の理由からデッドエンドろ過であることが好ましい。
デッドエンドろ過は供給液を全液ろ過する方法である。図１を用いて簡便に説明すると、符号６の位置に多孔質膜モジュールをセットし、供給液タンク５または６から液を加圧供給し、供給液を全て膜ろ過したろ液が７から出てくる。これにより、ろ過する前のデキストラン溶液と多孔質膜でろ過されたデキストラン溶液を、各々採取する。
ろ過するためにデキストラン溶液は加圧されるが、加圧ろ過圧力は、多孔質膜の構造に影響しないような圧力以下であればよい。具体的には６０ｋＰａ〜７０ｋＰａであることが好ましい。
ろ過する多孔質膜を用いて多孔質膜モジュールを作製し、評価に供する。多孔質膜モジュールの構造としては、多孔質中空糸膜を用いた場合には、膜端をウレタン樹脂、エポキシ樹脂等のポッティング樹脂を用いて枠体に固定した形状の膜モジュールが例示される。

（測定工程）
次に、測定工程を以下に説明する。
まず、有色デキストランは種類ごとに極大吸収波長が異なることから、分光光度計であらかじめ種々の濃度のデキストラン溶液で測定して吸収スペクトルが極大となる波長を決定する。決定した吸収波長にてデキストラン標準溶液及び多孔質膜でろ過した後ろ液の吸光を測定する。
次に、ろ過前のデキストラン標準溶液の吸光度をＣｏ、多孔質膜でろ過した後の吸光度をＣｆとすると、評価対象とする多孔質膜のデキストラン溶液の除去率（％）は、Beerの法則を用いて,入射光が溶質によって吸収される割合は濃度に比例する原理を用いて、式（３）より求められる。

式３

そして、かかる方法により測定したデキストラン除去率とあらかじめ作成した検量線とを用いてウィルス除去率を換算する。

以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。

（有色デキストラン標準溶液の調製）
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の分子量が２，０００，０００Ｄａ（カタログ値）のブルーデキストラン２０００を用い、これをポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを溶媒として、０．１質量％のデキストラン溶液を作製し、多孔質膜の評価に用いた。

（ろ過工程）
図１に示すデッドエンドろ過装置を用い、以下の手順にてデキストラン溶液のろ過試験を行った。膜モジュールをろ過試験装置に取り付け、膜モジュール内を和光純薬製のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを用いて作製した０．１質量％水溶液（通水液）で満たした。次いで、デキストラン溶液をフィルターに対し７０ｋＰａで加圧して１０ｍｌろ過した。その後膜モジュールに通水液を７０ｋＰａで加圧して流し、１０ｍｌづつろ液を採取した。
各ろ液の吸光度と原液の吸光度を測定し、吸光度からろ液に残存するブルーデキストランの濃度を算出し、以下の式から除去率を求めた。

式４

ここで、ろ過前のデキストラン溶液の吸光度をＣｏ、多孔質膜でろ過した後の吸光度をＣｆとした。

（ＭＳ２阻止率試験）
本実施例においては、デキストラン除去率とウィルス除去率の良好な相関性を示すために中空糸膜モジュールのＭＳ２ウィルス除去率（対数除去率：ＬＲＶ）を測定した。対数除去率は下記の式により求められる。

式５

ろ過前のＭＳ２原液及びろ過液１ｍｌ中のMS2の定量は、宿主と混釈した平板培地に形成されるプラーク(ｐｆｕ)を計数してＭＳ２の値とした。定量は設定した希釈段階の10倍きざみで原倍から１０ ^６ 倍までの６段階とし、３０〜２００個のプラークが形成されたプレートの計数値からそのプレートの希釈倍数を掛けた値とした。
（培養条件:培地Ｐｅｐｔｏｎｅ １０ｇ，Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ,ＭｇＳ０４
・７Ｈ２Ｏ ｌｇ,精製水１L，Agar下層１５ｇ(上層６ｇ)；ｐＨ７．０ ３６± １℃ で約１日培養）

（デキストラン除去率からＭＳ２ウィルス阻止率の換算）
デキストラン除去率を横軸に、前記ＭＳ２ウィルス阻止率を縦軸に相関図をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ上でプロットした。

［実施例１］

（中空糸膜）
多孔質膜は、ポリエステル製編紐を支持体とし、その上に膜基材ポリマーとしてポリフッ化ビニリデン、添加剤ポリマーとしてポリビニルピロリドンを用い非溶媒誘起相分離法による乾湿式賦形にて、製造された複合中空糸膜（商品名ＳＡＤＦ（登録商標））を使用し、有効膜面積０．００３６ｍ²となるように多孔質中空糸膜モジュール作成した。
このモジュールを用いて上記のＭＳ２阻止率試験、及びデキストラン除去率測定を行い、その結果を表１と図２に示す。デキストラン除去率とＭＳ２阻止率（ＬＲＶ）に相関が見られ、例えば、限外ろ過膜に求められるウィルス除去性能ＬＲＶ４以上を満たす多孔質膜のデキストラン除去率は以下の式から９６％以上となることが推測される。
[ＭＳ２ファージの阻止率（ＬＲＶ）＝０．７１４３×デキストラン溶液除去率（％）−６４．５８３]

［比較例１］
有色デキストランの代わりに、ＭＳ２ウィルス相当の大きさを有する直径３３ｎｍのラテックス粒子（マグスフェア社製）を用い、吸光度の測定波長を当該ラテックスの極大吸収波長である３２０ｎｍとした以外は、実施例１と同様に多孔質膜のろ過試験を行った。しかし、ラテックス粒子では吸光度の値が安定しなかったため吸光度測定が困難であり、ラテックス粒子の除去率（濃度）を決定することができなかった。

［比較例２］
デキストランの代わりにＭＳ２ウィルス相当の大きさを有する直径３５ｎｍの酸化亜鉛粒子（堺化学社製）を用い、吸光度の測定波長を当該粒子の極大吸収波長である３８０ｎｍとした以外は実施例１と同様に多孔質膜のろ過試験を行った。しかし、酸化亜鉛は凝集体での存在確率が高く、分散が困難であったため、ＭＳ２阻止率との相関を見出せなかった。

［比較例３］
デキストランの代わりにＭＳ２ウィルス相当の大きさを有する直径２５ｎｍのコロイダルシリカ粒子（扶桑化学社製）を用い、吸光度の測定波長を当該粒子の極大吸収波長である３２０ｎｍとした以外は実施例１と同様に多孔質膜のろ過試験を行った。しかし、コロイダルシリカは化学結合した２次粒子径での存在確率が高く、ＭＳ２阻止率との相関を見出せなかった。

１：原液投入口
２：通液側三方コック（ボールバルブ）
３：デキストラン溶液タンク
４：通水液タンク
５：吐出側三方コック
６：多孔質膜モジュール
７：ろ液吐出口

Claims (4)

1. 下記の工程（１）〜（３）からなり、下記工程（１）で作製するデキストラン標準溶液が、分子量１，０００，０００〜５，０００，０００Ｄａのデキストランを用いたものであり、かつ、濃度が０．０５〜０．５質量％であり、かつ、前記溶媒が、非イオン界面活性剤又はその水溶液である、多孔質膜のウィルス除去率評価方法。
   工程（１）：分子量が既知の有色デキストランを溶媒に分散しデキストラン標準溶液を作製する溶液調整工程
   工程（２）：評価される多孔質膜を用いて前記デキストラン標準溶液をろ過し、該デキストラン溶液を透過したろ液を採取するろ過工程
   工程（３）：前記標準溶液及びろ液それぞれの吸光度を測定することにより、多孔質膜のデキストラン除去率を求め、さらにその値からウィルス除去率を換算する測定工程
2. 前記工程（２）におけるろ過がデッドエンドろ過である請求項１に記載の多孔質膜のウィルス除去率評価方法。
3. 前記多孔質膜が中空糸膜である請求項１又は２に記載の多孔質膜のウィルス除去率評価方法。
4. 中空糸膜がポリフッ化ビニリデンからなる限外ろ過膜又は精密ろ過膜である請求項３に記載の多孔質膜のウィルス除去率評価方法。