JP5955274B2 - プローブの完全性を検証するための方法、装置、およびコンピュータプログラム - Google Patents
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Description
核酸を増幅する方法は、ヒト病原体の検出、ヒト遺伝的多型の検出、RNAおよびDNA配列の検出、分子クローニング、核酸の塩基配列決定等のために有用なツールを提供する。特に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNA配列のクローニング、法医学、親子鑑定、病原体同定、疾患診断および核酸配列の増幅が望ましいその他の有用な方法における重要なツールとなってきた。例えば、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(Erlich編、1992)(非特許文献1);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら編、1990)(非特許文献2)を参照。
(a)核酸に結合することのできる、少なくとも1つのプローブを含む混合物を提供する段階;
(b)1つまたは複数の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
(c)1つまたは複数の時点におけるプローブのシグナルを、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階、を含む。
(a)核酸に結合することのできる、少なくとも1つのプローブを含む混合物を提供する段階;
(b)2つまたはそれ以上の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
(c)2つまたはそれ以上の時点におけるプローブのシグナルの差を、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階、を含む。一部の態様では、混合物の温度は2つまたはそれ以上の時点で異なる。
(a)水性混合物中において、
(i)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブ;
(ii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、ならびに第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および標的プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む標的テンプレート;
(iii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および第1の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第1の対照テンプレート;ならびに
(iv)第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、ならびに第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、標的プローブ、および第2の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第2の対照テンプレート
を混合する段階;
(b)増幅産物を作製するために増幅反応を実施する段階;ならびに
(c)標的プローブ、第1の対照プローブおよび第2の対照プローブの、増幅産物への結合を定量する段階。
a)混合物の温度を変化させるための温度制御システム;
b)少なくとも1つのプローブのシグナルを測定するための、少なくとも1つの検出機構;ならびに
c)温度制御システムおよび検出機構と連絡している制御装置であって、
i)1つまたは複数の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
ii)1つまたは複数の時点におけるプローブのシグナルを、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階
を実施するようにプログラムされる制御装置。
a)混合物の温度を変化させるための温度制御システム;
b)少なくとも1つのプローブのシグナルを測定するための、少なくとも1つの検出機構;ならびに
c)温度制御システムおよび検出機構と連絡している制御装置であって、
i)2つまたはそれ以上の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
ii)2つまたはそれ以上の時点におけるプローブのシグナルの差を、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階
を実施するようにプログラムされる制御装置。
a)混合物の温度を変化させ;かつ
b)2つの異なる温度でプローブのシグナルを測定するように、さらにプログラムされる。
第1、第2および第3の時点からなる群より選択される、2つまたはそれ以上の時点でプローブの蛍光を測定し、ここで第1の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度またはそれ未満であり、第2の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度を超えており、そして第3の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度またはそれ未満であり;
2つまたはそれ以上の時点の間で混合物の温度を変化させ;かつ
2つまたはそれ以上の時点におけるプローブの蛍光を、少なくとも1つの閾値と比較するようにプログラムされる。
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度からプローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させ;
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度からプローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度へ低下させ;かつ
プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度へ低下させる段階の後に、プローブの蛍光を測定するようにプログラムされる。
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度からプローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させ;かつ
プローブの蛍光をプローブの自己アニーリング温度を超える温度で測定するようにプログラムされる。
(a)蛍光体および消光剤を含み、標的核酸分子とハイブリダイズすることのできる少なくとも1つのプローブを含む混合物を提供する段階;
(b)第1の温度でプローブの第1の蛍光値を測定する段階;
(c)第2の温度でプローブの第2の蛍光値を測定する段階;
(d)プローブが標的核酸に結合しているときに、プローブの標的蛍光値を測定する段階;および
(e)標的蛍光値を、第2の蛍光値と第1の蛍光値との差へ標準化する段階であって、それにより標準化された蛍光値が、試料中の標的核酸の存在または量を示す段階
を含む。
(a)水性混合物中において、
(i)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブ;
(ii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、ならびに第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および標的プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む標的テンプレート;
(iii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および第1の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第1の対照テンプレート;ならびに
(iv)第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、ならびに第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、標的プローブ、および第2の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第2の対照テンプレート
を混合する段階;
(b)増幅産物を作製するために増幅反応を実施する段階;ならびに
(c)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブの、増幅産物への結合を定量する段階。
a)プローブの蛍光を測定するための少なくとも1つの検出機構;および
b)検出機構と連絡している制御装置であって、
(i)1)第1の温度におけるプローブの第1の蛍光値;
2)第1の温度とは異なる第2の温度におけるプローブの第2の蛍光値;および
3)プローブが標的核酸に結合しているときの、プローブの標的蛍光値
を測定する段階;ならびに
(ii)標的蛍光値を第2の蛍光値と第1の蛍光値との差へ標準化する段階
を実施するようにプログラムされる制御装置。
(a)核酸に結合することのできる少なくとも1つのプローブを含む混合物を提供する段階;
(b)プローブの少なくとも1つの試験シグナル値を測定する段階;
(c)プローブが標的核酸に結合しているときに、プローブの標的シグナル値を測定する段階;および
(d)標的シグナル値を、プローブの少なくとも1つの試験シグナル値へ標準化する段階であって、それにより標準化されたシグナル値が、試料中の標的核酸の存在または量を示す段階
を含む。
(a)水性混合物中において、
(i)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブ;
(ii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、ならびに第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および標的プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む標的テンプレート;
(iii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および第1の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第1の対照テンプレート;ならびに
(iv)第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、ならびに第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、標的プローブ、および第2の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第2の対照テンプレート
を混合する段階;
(b)増幅産物を作製するために増幅反応を実施する段階;ならびに
(c)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブの、増幅産物への結合を定量する段階。
a)プローブのシグナルを測定するための少なくとも1つの検出機構;ならびに
b)検出機構と連絡している制御装置であって、
(i)プローブの少なくとも1つの試験シグナル値を測定する段階;
(ii)プローブが標的核酸に結合しているときに、プローブの標的シグナル値を測定する段階;および
(iii)標的シグナル値を、プローブの少なくとも1つの試験シグナル値へ標準化する段階
を実施するようにプログラムされる制御装置。
装置は、混合物の温度をプローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させ、かつ混合物の温度をプローブの自己アニーリング温度未満またはそれに等しい温度へ低下させるための、温度制御システムを含む。
(a)1つまたは複数の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
(b)1つまたは複数の時点におけるプローブのシグナルを、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階
を実施するために、機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する。
(a)2つまたはそれ以上の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および
(b)2つまたはそれ以上の時点におけるプローブのシグナルの差を少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階
を実施するために、機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する。
(a)第1、第2、および第3の時点からなる群より選択される、2つまたはそれ以上の時点でプローブの蛍光を測定する段階であって、ここで第1の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度またはそれ未満であり、第2の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度を超えており、そして第3の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度またはそれ未満であり;ならびに
(b)2つまたはそれ以上の時点におけるプローブの蛍光を、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブの完全性を決定する段階
をさらに含む。
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階;
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度から、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度へ低下させる段階;および
プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度へ低下させる段階の後に、プローブの蛍光を測定する段階
をさらに含む。
混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階;および
プローブの蛍光を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度で測定する段階
をさらに含む。
色素からのシグナルを測定する段階;および
プローブからのシグナルを色素からのシグナルへ標準化する段階
をさらに含む。
(a)プローブの第1の蛍光値を、プローブの自己アニーリング温度またはそれ未満の温度で測定する段階と;
(b)プローブの第2の蛍光値を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度で測定する段階と;
(c)プローブが標的核酸に結合しているときに、プローブの標的蛍光値を測定する段階と;および
(d)標的蛍光値を、第2の蛍光値と第1の蛍光値との差へ標準化する段階
を実施するために、機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する。
(a)プローブの1つの試験シグナル値を測定する段階;
(b)プローブが標的核酸に結合しているときに、プローブの標的シグナル値を測定する段階;および
(c)標的シグナル値を、プローブの試験シグナル値へ標準化する段階
を含む段階を実施するために、機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する。
「増幅反応」とは、テンプレート核酸配列のコピーの増加を生じさせる、酵素反応を含むあらゆる化学反応を意味する。増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)(米国特許第4,683,195号および第4,683,202号;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら編、1990))、鎖置換型増幅(SDA)(Walkerら、Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6(1992);Walker PCR Methods Appl 3(1)1-6(1993))、転写媒介型増幅(Phyfferら、J. Clin. Microbiol. 34:834-841(1996);Vuorinenら,J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859(1995))、核酸配列ベース増幅(NASBA)(Compton、Nature 350(6313):91-2(1991)、ローリングサークル型増幅(RCA)(Lisby、Mol. Biotechnol. 12(l):75-99(1999));Hatchら、Genet. Anal. 15(2)35-40(1999))、および分岐DNAシグナル増幅(bDNA)(例えば、Iqbalら、Mol Cell Probes 13(4)315-320(1999)を参照)が含まれる。
I. はじめに
本発明は、プローブのシグナルを閾値と比較することによってプローブの完全性を検証するための方法、装置およびコンピュータプログラムを提供する。本明細書において一般に「プローブチェックアッセイ法」と呼ばれる本発明の方法は、それによって、プローブの完全性を確証するための外部陽性対照を使用する必要性を排除する。本発明の方法は、1つまたは複数の温度での蛍光プローブの蛍光を、無傷プローブの蛍光または所定の値もしくは範囲と比較する段階を伴う。例えば、図1は本発明の一般的なプローブチェック法を示す流れ図である。比較値からのプローブ蛍光の変動は、プローブが機能しなくなった可能性を示す。当然ながら、当業者であれば複数のプローブが混合物中に存在する場合に、このプローブチェックアッセイ法が各プローブの完全性を検出するために有用であることを認識すると考えられる。
多数のタイプの分子プローブは、プローブがその核酸標的に結合すると、典型的には蛍光の形状でシグナルを生成するが、結合しない場合はシグナルを生成しない。これらのプローブは、標的に結合しないときに蛍光体および消光剤を互いの近傍へ運び、それによって蛍光体からのシグナルを消光するために、ヘアピンループ、またはいくつかの他の構造の形成に依存する。
このプローブチェックアッセイ法は、さらに線形プローブの完全性を評価するためにも使用できる。付着した消光体によって消光される線形蛍光プローブは、固有の「バックグラウンド」蛍光を有している。例示的な線形プローブには、例えば増幅された核酸にプローブがハイブリダイズし、それにより蛍光を発したときに、DNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって切断されるように、蛍光体および消光剤で標識されたオリゴヌクレオチドを含むプローブが含まれる(例えばTaqmanプローブ)。バックグラウンド蛍光はプローブの完全性の指標として使用することができ、かつ相関によって、リアルタイムPCRアッセイ法におけるプローブの性能についての指標として使用できる。プローブへの改変の例および結果として生じる蛍光への作用は以下の表2に示した。
上述のように、無傷プローブを試料プローブと一緒に試験(run)し、試料プローブのシグナルと比較することができる。しかし、便宜性および経済性のために、一部の好ましい態様では、閾値は所定の値または範囲である。所定の値または値の範囲は、無傷プローブの典型的なシグナルを規定するための一連の対照実験から決定される。このような解析に引き続いて、標準値の範囲を決定することができる。その後、これらの数値を使用して、プローブチェックアッセイ法において試料プローブシグナルと比較することができる。
本明細書に記載したプローブチェックアッセイ法は、共通プライマーを有するPCR内部対照と組み合わせて、アッセイ法の外部陽性対照に取って代わることができる。増幅に基づくアッセイ法を含むほとんどのアッセイ法は、アッセイ法の妥当性を確認するために対照反応を使用する。典型的には、試験反応とともに別個の陽性対照および陰性対照が試験される。陰性対照は、アッセイ法の汚染の可能性についての試験である一方、陽性対照は反応成分の完全性および機能的性能についての試験である。
反応を使用したRNAまたはDNAテンプレートの増幅については周知である(米国特許第4,683,195号および第4,683,202号;PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innisら編、1990)を参照)。熱安定性酵素を使用したPCRにより核酸を増幅および検出するための方法は、米国特許第4,965,188号に開示され、参照として本明細書に組み入れられる。DNAのPCR増幅は、DNAを熱変性させる段階、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅されるDNAセグメントに隣接する配列へアニールする段階、およびアニールしたプライマーをDNAポリメラーゼで伸長する段階の反復サイクルを伴う。これらのプライマーは、標的配列の対向鎖へハイブリダイズし、かつポリメラーゼによるDNA合成がプライマー間の領域にわたって進行し、DNAセグメントの量を効果的に2倍にするように、方向付けられる。さらに、伸長産物はプライマーにとって相補的であり、それらに結合することができるので、各連続サイクルは、前サイクルにおいて合成されたDNAの量を本質的に2倍にする。これは1サイクル当たり約2nの速度で、特定の標的フラグメントの対数的集積を生じる(このときnはサイクル数である)。
本発明のプローブは、特定のポリヌクレオチド配列へハイブリダイズすることができる。したがって、本発明のプローブは検出される配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むことができる。一部の態様では、プローブは下記に記載するように蛍光体または酵素をさらに含み、これによりプローブのその相補物への結合の検出を可能にする。
プローブのその相補的ハイブリダイゼーション配列への結合により、使用者は反応槽から内容物を必ずしも除去する必要なく、特定配列の集積を定量することができる。一般に、異なるプローブの検出および弁別を可能にする、あらゆるタイプの標識が、本発明の方法によって使用できる。
本発明はまた、例えばリアルタイム増幅中の示度を含むハイブリダイゼーションシグナルを標準化するための、プローブチェックアッセイ法の使用も提供する。混合物中または混合物間の示度間の変動を減少させるために、プローブのシグナル出力が標準化される。例えば、リアルタイムPCRシステムを含むすべての光学システムは、部位間の結果の比較を複雑にする反応部位毎の変動を有する。以前に記載されたこれらの差を補正するために使用する方法には、反応混合物中に受動標準色素を含めることによって各部位について示度を「標準化する」段階が含まれる。例えば米国特許第5,736,333号を参照。
本発明は、本発明の方法を実施するために有用である装置を提供する。一部の態様によると、本発明は核酸を検出するための少なくとも1つのプローブの完全性を試験する装置を提供し、ここでプローブは、増幅反応に導入されたときに、シグナルを発することによって核酸の集積を検出する。本装置は、少なくとも(a)反応混合物の温度を変化させるための温度制御システム;(b)少なくとも1つのプローブの蛍光を測定するための少なくとも1つの検出機構;ならびに(c)温度制御システムおよび検出機構と連絡している制御装置を備えている。一部の態様では、制御装置は、(i)1つまたは複数の時点でプローブのシグナルを測定する段階;および(ii)1つまたは複数の時点におけるプローブのシグナルを少なくとも1つの閾値と比較することによってプローブの完全性を決定する段階を実施するようにプログラムされる。
本発明は、本発明の方法を実施するために有用であるコンピュータプログラム製品を提供する。一部の態様では、本発明は、核酸配列を検出するための少なくとも1つのプローブのシグナルを、1つまたは複数の時点で測定するための少なくとも1つの検出機構を含み、かつプローブを含有する反応混合物の温度を変化させるための温度制御システムを含む機械によって読み取ることのできるコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品は、1つまたは複数の時点でプローブのシグナルを測定する段階、および1つまたは複数の時点におけるプローブの蛍光を、少なくとも1つの閾値と比較することによってプローブの完全性を決定する段階を含む段階を実行するために、機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する。一部の態様では、プローブによって生成されるシグナルは蛍光である。
本実施例は、プローブの蛍光強度を所定の値と比較することによって、自己アニーリングしたときに消光される蛍光プローブの完全性を評価するための方法を例示する。
本実施例は、変性プローブと無傷プローブの混合物からの結果に基づく閾値の決定を例示する。
本実施例は、蛍光示度の精度を向上させるためのプローブチェック法の有益性を例示する。
Claims (40)
- プローブが標的核酸配列を検出するために十分に無傷であるか否かを決定する方法であって、
(a)前記標的核酸にハイブリダイズすることのできる前記プローブを含む混合物を提供する段階であって、該プローブが、蛍光体および消光剤を含み、ここで該プローブを加熱すると、該プローブが第1のアニーリング構造から第2の構造へと構造を変化させ、それによって前記蛍光体の蛍光が、前記第2の構造における蛍光体の蛍光と比較して、前記第1の構造において消光または変化するように、前記蛍光体と消光剤との間の距離が変化する、前記段階;
(b)混合物中のテンプレート核酸を増幅させる前に、1つまたは複数の時点でプローブの蛍光シグナルを測定する段階;および
(c)1つまたは複数の時点におけるプローブの蛍光シグナルを、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブが十分に無傷であるか否かを決定する段階
を含む方法。 - プローブの蛍光シグナルが、プローブが標的に結合していないときに測定される、請求項1記載の方法。
- プローブの蛍光が、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度で測定される、請求項1記載の方法。
- プローブの蛍光が、プローブの自己アニーリング温度を超える温度で測定される、請求項1記載の方法。
- 測定する段階が、第1、第2および第3の時点からなる群より選択される、2つまたはそれ以上の時点でプローブの蛍光を測定する段階を含み、ここで第1の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満であり、第2の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度を超えており、かつ第3の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満であり;かつ
方法が、混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階、および混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度から、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 決定する段階が、第1および第3の時点におけるプローブの蛍光を、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項5記載の方法。
- 決定する段階が、第2および第3の時点におけるプローブの蛍光を、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項5記載の方法。
- 決定する段階が、第1および第2の時点におけるプローブの蛍光の差を、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項5記載の方法。
- 決定する段階が、第2および第3の時点におけるプローブの蛍光の差を、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項5記載の方法。
- 混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階、および混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度からプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階を含み;かつ
測定する段階が、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階の後に、プローブの蛍光を測定する段階を含む、請求項1記載の方法。 - 混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階を含み;かつ
測定する段階が、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階の後に、プローブの蛍光を測定する段階を含む、請求項1記載の方法。 - 測定する段階が、温度を上昇させる段階の前に、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度でプローブの蛍光を測定する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 決定する段階が、2つまたはそれ以上の時点における蛍光シグナルを、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す2つまたはそれ以上の閾値と比較する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 増幅された核酸にプローブがハイブリダイズするとDNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、それにより蛍光を発するように、プローブが蛍光体および消光剤で標識されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- プローブが分子ビーコンである、請求項1記載の方法。
- 混合物中の少なくとも2つの異なるプローブに対して実施され、ここでプローブは異なる核酸配列へハイブリダイズするように設計されている、請求項1記載の方法。
- 混合物が色素をさらに含み、方法が、色素からのシグナルを測定する段階、およびプローブからのシグナルを色素からのシグナルに対して標準化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- プローブが標的核酸配列を検出するために十分に無傷であるか否かを決定する方法であって、
(a)前記標的核酸にハイブリダイズすることのできる前記プローブを含む混合物を提供する段階であって、該プローブが、蛍光体および消光剤を含み、ここで該プローブを加熱すると、該プローブが第1のアニーリング構造から第2の構造へと構造を変化させ、それによって前記蛍光体の蛍光が、前記第2の構造における蛍光体の蛍光と比較して、前記第1の構造において消光または変化するように、前記蛍光体と消光剤との間の距離が変化する、前記段階;
(b)増幅反応の前に、1つまたは複数の時点でプローブの蛍光シグナルを測定する段階;および
(c)1つまたは複数の時点におけるプローブの蛍光シグナルを、少なくとも1つの閾値と比較することによって、プローブが十分に無傷であるか否かを決定する段階であって、閾値が、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルである、段階
を含む方法。 - プローブの蛍光シグナルが、プローブが標的にハイブリダイズされていないときに測定される、請求項18記載の方法。
- プローブの蛍光が、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度で測定される、請求項18記載の方法。
- プローブの蛍光が、プローブの自己アニーリング温度を超える温度で測定される、請求項18記載の方法。
- 測定する段階が、第1、第2および第3の時点からなる群より選択される、2つまたはそれ以上の時点でプローブの蛍光を測定する段階を含み、ここで第1の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満であり、第2の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度を超えており、かつ第3の時点では、混合物の温度はプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満であり;かつ
方法が、混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階、および混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度から、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階をさらに含む、請求項18記載の方法。 - 決定する段階が、第1および第3の時点におけるプローブの蛍光を、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項22記載の方法。
- 決定する段階が、第2および第3の時点におけるプローブの蛍光を、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項22記載の方法。
- 決定する段階が、第1および第2の時点におけるプローブの蛍光の差を、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項22記載の方法。
- 決定する段階が、第2および第3の時点におけるプローブの蛍光の差を、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較する段階を含む、請求項22記載の方法。
- 混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階、および混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度を超える温度からプローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階を含み;かつ
測定する段階が、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度へ低下させる段階の後に、プローブの蛍光を測定する段階を含む、請求項18記載の方法。 - 混合物の温度を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度から、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階を含み;かつ
測定する段階が、プローブの自己アニーリング温度を超える温度へ上昇させる段階の後に、プローブの蛍光を測定する段階を含む、請求項18記載の方法。 - 測定する段階が、温度を上昇させる段階の前に、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度でプローブの蛍光を測定する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
- 決定する段階が、2つまたはそれ以上の時点における蛍光シグナルを、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルを示す2つまたはそれ以上の閾値と比較する段階を含む、請求項18記載の方法。
- 増幅された核酸にプローブがハイブリダイズするとDNAポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、それにより蛍光を発するように、プローブが蛍光体および消光剤で標識されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項18記載の方法。
- プローブが分子ビーコンである、請求項18記載の方法。
- 方法の少なくとも一部は増幅反応中に実施され、増幅反応が、
(a)水性混合物中において、
(i)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブ;
(ii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、ならびに第1の5'プライマー、第1の3'プライマーおよび標的プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む標的テンプレート;
(iii)第1の5'プライマー、第1の3'プライマー、および第1の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第1の対照テンプレート;ならびに
(iv)第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、ならびに第2の5'プライマー、第2の3'プライマー、標的プローブ、および第2の対照プローブに対するハイブリダイゼーション部位を含む第2の対照テンプレート
を混合する段階;
(b)増幅産物を作製するために増幅反応を実施する段階;ならびに
(c)標的プローブ、第1の対照プローブ、および第2の対照プローブの、増幅産物への結合を定量する段階
を含む、請求項18記載の方法。 - 混合物中の少なくとも2つの異なるプローブに対して実施され、ここでプローブは異なる核酸配列へハイブリダイズするように設計されている、請求項18記載の方法。
- 混合物が色素をさらに含み、方法が、色素からのシグナルを測定する段階、およびプローブからのシグナルを色素からのシグナルに対して標準化する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
- 閾値が、許容可能なPCR性能を示すシグナルの上限および下限を含む範囲である、請求項18記載の方法。
- 下記(1)〜(3):
(1)コンピュータプログラム;
(2)標的核酸配列を検出するための少なくとも1つのプローブの蛍光シグナルを、1つまたは複数の時点で測定するための少なくとも1つの検出機構;および
(3)標的核酸にハイブリダイズすることができるプローブを含有する混合物の温度を変化させるための温度制御システムであって、該プローブが、蛍光体および消光剤を含み、ここで該プローブを加熱すると、該プローブが第1のアニーリング構造から第2の構造へと構造を変化させ、それによって前記蛍光体の蛍光が、前記第2の構造における蛍光体の蛍光と比較して、前記第1の構造において消光または変化するように、前記蛍光体と消光剤との間の距離が変化する、前記温度制御システム、
を含む機械であって、
前記コンピュータプログラムが、下記段階(a)および(b):
(a)混合物中のテンプレート核酸を増幅させる前に、1つまたは複数の時点で、前記検出機構によってプローブの蛍光シグナルを測定する段階;および
(b)1つまたは複数の時点におけるプローブの蛍光シグナルを、プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値と比較することによって、前記プローブが標的核酸配列を検出するために十分に無傷であるか否かを前記コンピュータプログラムにより決定する段階
を含む段階を実施するために、前記機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する、
前記機械。 - 下記(1)〜(3):
(1)コンピュータプログラム;
(2)標的核酸配列を検出するための少なくとも1つのプローブの蛍光シグナルを、1つまたは複数の時点で測定するための少なくとも1つの検出機構;、および
(3)標的核酸にハイブリダイズすることができるプローブを含有する混合物の温度を変化させるための温度制御システムであって、該プローブが、蛍光体および消光剤を含み、ここで該プローブを加熱すると、該プローブが第1のアニーリング構造から第2の構造へと構造を変化させ、それによって前記蛍光体の蛍光が、前記第2の構造における蛍光体の蛍光と比較して、前記第1の構造において消光または変化するように、前記蛍光体と消光剤との間の距離が変化する、前記温度制御システム、
を含む機械であって、
前記コンピュータプログラムが、下記段階(a)および(b):
(a)1つまたは複数の時点で前記検出機構によってプローブの蛍光シグナルを測定する段階;および
(b)1つまたは複数の時点におけるプローブの蛍光シグナルを、少なくとも1つの閾値と比較することによって、前記プローブが標的核酸配列を検出するために十分に無傷であるか否かを決定する段階であって、閾値が、PCR性能を保持する最高比率の劣化したプローブによって生じるシグナルである、段階
を含む段階を実施するために、前記機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する、
前記機械。 - 閾値が、許容可能なPCR性能を示すシグナルの上限および下限を含む範囲である、請求項38記載の機械。
- 下記(1)〜(3):
(1)コンピュータプログラム;
(2)標的核酸配列を検出するための少なくとも1つのプローブの蛍光シグナルを、1つまたは複数の時点で測定するための少なくとも1つの検出機構;および
(3)標的核酸にハイブリダイズすることができるプローブを含有する混合物の温度を変化させるための温度制御システムであって、前記プローブが蛍光体および消光剤を含み、ここで該プローブを加熱すると、該プローブは第1のアニーリング構造から第2の構造へと構造を変化させ、それによって前記蛍光体の蛍光が、前記第2の構造における蛍光体の蛍光と比較して、前記第1の構造において消光または変化するように、前記蛍光体と消光剤との間の距離が変化する、前記温度制御システム、
を含む機械であって、
前記コンピュータプログラムが、下記段階(a)および(b):
(a)プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度で、前記検出機構によってプローブの蛍光を測定する段階、およびプローブの自己アニーリング温度を超える温度で、前記検出機構によってプローブの蛍光を測定する段階;ならびに
(b)プローブが無傷である場合の該無傷プローブの蛍光シグナルを示す少なくとも1つの閾値を、プローブの自己アニーリング温度と等しいかまたはそれ未満の温度でのプローブの蛍光およびプローブの自己アニーリング温度を超える温度でのプローブの蛍光と比較することによって、前記プローブが標的核酸配列を検出するために十分に無傷であるか否かを前記コンピュータプログラムにより決定する段階
を含む段階を実施するために、前記機械によって実行可能な命令のプログラムを具現化する、
前記機械。
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