JP5943432B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロレンズアレイディスクおよびニポウディスクを用いたマルチビーム方式の共焦点スキャナユニットを有する共焦点顕微鏡に関する。

蛍光顕微鏡は、生体内のタンパク質や分子などを観察するための必要不可欠のツールとして、生命科学分野の研究で使用されてきた。特に、共焦点（蛍光）顕微鏡は、厚みのある生体サンプルについて一連の断層像を得ることができるため、生体機能の解明に必須のツールとなっている。従来の共焦点顕微鏡では、光源としてレーザを使用していた（共焦点レーザ顕微鏡）。

共焦点顕微鏡では、励起光の焦点をスキャンする必要がある。共焦点顕微鏡のスキャン方式は、ガルバノミラー方式とニポウ（Nipkow）ディスク方式とに大別される。ガルバノミラー方式では、試料中の１点にビームを集光して、このビームをラスタースキャンする（シングルビームスキャン）。この方式では、１枚の共焦点画像（１０００×１０００ピクセル）を得るのに１秒程度の時間がかかってしまう。一方、ニポウディスク方式では、ニポウディスクと称される、複数のピンホールが形成された円板を使用する。ニポウディスク方式では、回転しているニポウディスクに励起光を面照射して、多数（例えば、１０００本）のビームを生成する。そして、生成された多数のビームで、並行して試料をスキャンする（マルチビームスキャン）。この方式では、例えば１／２０００秒で１枚の共焦点画像（１０００×１０００ピクセル）を得ることができる。

ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡において、ニポウディスクに励起光を直接照射すると、ピンホールを通過できる励起光の割合は１％程度となってしまい、明るい共焦点画像を得ることができない。この問題を解決するため、マイクロレンズアレイディスクとニポウディスクとを組み合わせて使用する共焦点スキャナユニットが開発されている。

図１は、従来の共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。図１に示されるように、従来の共焦点顕微鏡１０は、レーザ光源２０、シングルモード光ファイバ３０、従来の共焦点スキャナユニット４０、第１の結像レンズ５０、対物レンズ６０およびＣＣＤカメラ７０を有する。共焦点スキャナユニット４０は、コリメータレンズ４１、ミラー４２、マイクロレンズアレイディスク４３、ダイクロイックミラー４４、ニポウディスク４５および第２の結像レンズ４６を有する。

図１に示されるように、従来の共焦点顕微鏡１０では、レーザ光源２０から出射された励起光は、シングルモード光ファイバ３０内を伝播し、コリメータレンズ４１によりコリメートされる。コリメートされた励起光は、マイクロレンズアレイディスク４３のマイクロレンズにより集光され、ニポウディスク４５のピンホールを通過する。ピンホールを通過した励起光は、第１の結像レンズ５０および対物レンズ６０を通過して試料８０の焦点面に照射される。試料８０から放出された蛍光は、再度ニポウディスク４５のピンホールを通過して、ダイクロイックミラー４４で反射される。反射した蛍光は、第２の結像レンズ４６を通過して、ＣＣＤカメラ７０により検出される。

図１に示されるような従来の共焦点顕微鏡では、光源としてレーザを使用するため、選択できる励起光の波長が限られている。このため、従来の共焦点顕微鏡には、使用するレーザの波長に合わせて蛍光プローブを選択しなければならないという問題がある。また、従来の共焦点顕微鏡には、光源としてレーザを使用するため、セットアップやメンテナンスに要する時間、労力および金銭での負担が非常に大きいという問題もある。これらの問題を解決するために、光源として白色光源（例えば、水銀アークランプやハロゲンランプなど）を使用することが提案されている（例えば、非特許文献１，２参照）。

たとえば、非特許文献１には、光源としてレーザおよび白色光源（水銀アークランプまたはハロゲンランプ）の両方を備えた共焦点顕微鏡が記載されている。非特許文献１に記載の共焦点顕微鏡では、光源としてレーザを使用する場合には、ニポウディスクを使用して励起光を試料に照射する（共焦点観察）。一方で、光源として水銀アークランプまたはハロゲンランプする場合には、蛍光画像が暗くなることを回避するために、ニポウディスクを使用しないで励起光を試料に照射している（非共焦点観察）。したがって、非特許文献１に記載の共焦点顕微鏡では、白色光源を使用する場合は、ニポウディスクを使用した高速観察を行うことができない。

非特許文献２には、光源として水銀アークランプを使用した共焦点顕微鏡が記載されている。図２は、非特許文献２に記載されている従来の共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。図２に示されるように、非特許文献２に記載の共焦点顕微鏡１０’は、レーザ光源２０（図１参照）の代わりに白色光源２０’（水銀アークランプ）を有する。また、共焦点顕微鏡１０’は、白色光の光強度のムラを解消するために、シングルモード光ファイバ３０（図１参照）の代わりにマルチモード光ファイバ３０’を有する。さらに、共焦点顕微鏡１０’は、特定波長の蛍光のみを検出するためにフィルタホイール９０を有する。非特許文献２に記載の共焦点顕微鏡では、光源として水銀アークランプを使用する場合も、ニポウディスクを使用して励起光を試料に照射する（共焦点観察）。

非特許文献２に記載の共焦点顕微鏡を使用することで、使用できる蛍光プローブの種類が制限されることなく、高速で蛍光観察を行うことができる。しかしながら、非特許文献２に記載の共焦点顕微鏡では、励起効率が低くなってしまい、高速観察において十分なシグナルが得られないことがある（後述）。

蛭川英男,外３名,「機能向上を実現した共焦点スキャナＣＳＵ−Ｘ１を支える新技術（New technologies for CSU-X1 confocal scanner unit）」，横河技報（Yokogawa technical report），Vol.52，No.1，pp.13-18. Saito K, et al., "A mercury arc lamp-based multi-color confocal real time imaging system for cellular structure and function", Cell Struct. Funct., Vol.33, No.1, pp.133-141.

以上のように、ニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットにおいて、光源として白色光源を使用する場合、試料に光を十分に照射することができず、高速観察において十分なシグナルが得られないという問題がある。

本発明の目的は、光源として白色光源を使用する場合であっても、高速観察において十分なシグナルを得られるニポウディスク方式の共焦点スキャナユニットを有する共焦点顕微鏡を提供することである。

本発明者は、マルチモード光ファイバのコアの半径、コリメータレンズの焦点距離、マイクロレンズアレイディスクとニポウディスクとの中心間距離、およびニポウディスクにおけるピンホール間の中心間距離が所定の条件を満たすようにコリメータレンズを選択することで、上記課題を解決できることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下の共焦点顕微鏡に関する。
［１］共焦点スキャナユニットと、励起光を出射する光源と、前記励起光を前記共焦点スキャナユニットに伝播するマルチモード光ファイバと、を有する共焦点顕微鏡であって：前記共焦点スキャナユニットは、前記マルチモード光ファイバから出射された光をコリメートするコリメータレンズと；前記コリメータレンズによりコリメートされた光を集光する複数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイディスクと；前記マイクロレンズアレイディスクに対して平行に配置され、かつ前記複数のマイクロレンズの集光点に対応する位置に複数のピンホールを有するニポウディスクとを有し；前記コリメータレンズは、前記マルチモード光ファイバの出射端の中心部と前記コリメータレンズの中心部との距離が前記コリメータレンズの焦点距離ｆとなるように配置されており；前記コリメータレンズの焦点距離をｆ（ｍｍ）とし、前記マルチモード光ファイバのコアの半径をｙ_１（ｍｍ）とし、前記マイクロレンズアレイディスクと前記ニポウディスクとの中心間距離をＤ１（ｍｍ）とし、前記ニポウディスクにおける前記ピンホール間の中心間距離をＤ２（ｍｍ）としたときに、以下の式（１）が満たされる、共焦点顕微鏡。

また、本発明は、以下の共焦点顕微鏡に関する。
［２］前記光源は、白色光源である、［１］に記載の共焦点顕微鏡。
［３］前記光源は、ＬＥＤ光源、水銀アークランプ、キセノンアークランプまたはハロゲンランプである、［２］に記載の共焦点顕微鏡。

本発明の共焦点顕微鏡は、光源として白色光源を使用する場合であっても、高速観察において十分なシグナルを得ることができる。

市販されている従来の共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。 非特許文献２に記載されている従来の共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。 本発明の一実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。 図４Ａ，Ｂは、式（１）の内容を説明するための模式図である。 図２に示される従来の共焦点顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。 図３に示される本発明の共焦点顕微鏡の光学系の構成を示す模式図である。 実施例で構築した光学系の構成を示す模式図である。 励起光強度の測定結果を示すグラフである。 蛍光ビーズの蛍光強度の測定結果を示すグラフである。 図１０Ａ〜Ｆは、ＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光画像の撮影結果である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。以下の説明では、本発明の共焦点スキャナユニットを有する共焦点顕微鏡について説明する。

図３は、本発明の一実施の形態に係る共焦点顕微鏡の構成を示す模式図である。図３に示されるように、本実施の形態に係る共焦点顕微鏡１００は、光源１１０、マルチモード光ファイバ１２０、本発明の共焦点スキャナユニット１３０、第１の結像レンズ１４０、対物レンズ１５０、フィルタホイール１６０およびＣＣＤカメラ１７０を有する。

光源１１０は、励起光をマルチモード光ファイバ１２０に出射する。光源１１０の種類は、特に限定されず、従来から使用されているレーザ光源だけでなく、白色光源などを使用することもできる。白色光源の例には、ＬＥＤ光源、水銀アークランプ、キセノンアークランプ、ハロゲンランプが含まれる。

マルチモード光ファイバ１２０は、光源１１０から出射された励起光を共焦点スキャナユニット１３０に伝播する。本発明の共焦点顕微鏡では、励起光の光強度のムラを解消するために、シングルモード光ファイバではなくマルチモード光ファイバを使用する（非特許文献２参照）。

共焦点スキャナユニット１３０は、コリメータレンズ１３１、マイクロレンズアレイディスク１３２、ダイクロイックミラー１３３、ニポウディスク１３４および第２の結像レンズ１３５を有する。

コリメータレンズ１３１は、マルチモード光ファイバ１２０から出射された励起光をコリメートする。コリメータレンズ１３１は、マルチモード光ファイバ１２０の出射端の中心部とコリメータレンズの中心部との距離がコリメータレンズの焦点距離ｆとなるように配置されている（図６参照）。

マイクロレンズアレイディスク１３２は、複数のマイクロレンズが配置された円形状の基板である。複数のマイクロレンズは、ニポウディスク１３４のピンホールと同じパターンで配置されている。マイクロレンズアレイディスク１３２およびニポウディスク１３４は、互いに平行になるように連結ドラムで連結されており、回転軸を中心として一体となって回転することができる。

ニポウディスク１３４は、複数のピンホールを有する円形状の遮光基板（ピンホールアレイディスク）である。ニポウディスク１３４は、マイクロレンズアレイディスク１３２のマイクロレンズの集光点に対応する位置にピンホールを有する。遮光基板の種類は、特に限定されない。たとえば、遮光基板は、その表面に遮光膜を形成されたガラス基板である。ピンホールの配置方式は、特に限定されないが、照度むらおよびスキャンむらを防ぐ観点から等ピッチ螺旋配置が好ましい。等ピッチ螺旋配置でピンホールを配置した場合、互いに隣接するピンホール間の中心間距離が、同一距離となる（後述する「中心間距離Ｄ２」）。

ダイクロイックミラー１３３は、マイクロレンズアレイディスク１３２とニポウディスク１３４との間に配置されている。ダイクロイックミラー１３３は、マイクロレンズアレイディスク１３２側から入射する励起光をニポウディスク１３４側に通過させる。一方、ダイクロイックミラー１３３は、ニポウディスク１３４側から入射する蛍光を第２の結像レンズ１３５側に反射させる。

第２の結像レンズ１３５は、ダイクロイックミラー１３３で反射された蛍光をＣＣＤカメラ１７０に結像させる。

第１の結像レンズ１４０および対物レンズ１５０は、無限補正光学系を構成する。第１の結像レンズ１４０および対物レンズ１５０は、ニポウディスク１３４のピンホールを通過した励起光を試料１８０の焦点面に集光させる。また、第１の結像レンズ１４０および対物レンズ１５０は、試料１８０から放出された蛍光をニポウディスク１３４のピンホールに集光させる。

フィルタホイール１６０は、各種フィルタを有しており、試料１８０からの蛍光のうち、特定波長の蛍光のみを通過させる。

ＣＣＤカメラ１７０は、フィルタホイール１６０のフィルタを通過してきた蛍光を検出する。

次に、図３を参照して、共焦点顕微鏡１００の動作について説明する。

光源１１０から出射された励起光は、マルチモード光ファイバ１２０内を伝播し、マルチモード光ファイバ１２０の出射端から出射される。共焦点スキャナユニット１３０内において、励起光は、コリメータレンズ１３１によりコリメートされ、マイクロレンズアレイディスク１３２に照射される。励起光は、マイクロレンズアレイディスク１３２の各マイクロレンズの作用により、ニポウディスク１３４の対応するピンホールにおいて焦点を結ぶ。ピンホールを通過した励起光は、第１の結像レンズ１４０および対物レンズ１５０を通過して試料１８０の焦点面に焦点を結ぶ。

励起光を受けた試料１８０は、蛍光を放出する。試料１８０から放出された蛍光は、第１の結像レンズ１４０および対物レンズ１５０を通過して共焦点スキャナユニット１３０内に戻る。蛍光は、再度ニポウディスク１３４のピンホールを通過して、ダイクロイックミラー１３３で反射される。反射した蛍光は、第２の結像レンズ１３５およびフィルタホイール１６０を通過して、ＣＣＤカメラ１７０により検出される。

ここで、マイクロレンズアレイディスク１３２およびニポウディスク１３４を回転させると、ピンホールを通過した複数のビーム（励起光）が、試料１８０の焦点面を並行してスキャンする（マルチビームスキャン）。また、試料１８０から放出された蛍光は、同じピンホールを通過した後に、ＣＣＤカメラ１７０の撮像面をスキャンする。これにより、試料１８０の焦点面の蛍光が、ＣＣＤカメラ１７０により検出される。焦点面以外の光は、ピンホールをほとんど通過できないため、ＣＣＤカメラ１７０に到達することができない。したがって、ＣＣＤカメラ１７０は、試料１８０の焦点面の蛍光のみからなる共焦点画像を撮影することができる。

本発明の共焦点スキャナユニット１３０は、コリメータレンズ１３１の焦点距離をｆ（ｍｍ）とし、マルチモード光ファイバ１２０のコアの半径をｙ_１（ｍｍ）とし、マイクロレンズアレイディスク１３２とニポウディスク１３４との中心間距離をＤ１（ｍｍ）とし、ニポウディスク１３４におけるピンホール間の中心間距離をＤ２（ｍｍ）としたときに、以下の式（１）が満たされることを特徴とする。

上記式（１）において、左辺の「ｙ_１（ｍｍ）／ｆ（ｍｍ）」は、コリメータレンズ１３１によりコリメートされた励起光の拡散角θ_１（ｒａｄ）を意味する。図４Ａに示されるように、コリメータレンズ１３１の焦点面に半径ｙ_１（ｍｍ）の光源を置いた場合、拡散角θ_１はｙ_１／ｆ（ｒａｄ）となる。

一方、上記式（１）において、右辺の「Ｄ２（ｍｍ）／Ｄ１（ｍｍ）」は、図４Ｂに示される角度θ_２（ｒａｄ）を意味する。図４Ｂに示されるように、角度θ_２（ｒａｄ）は、マイクロレンズの中心と対応するピンホールの中心とを結ぶ線（光軸）に対する、マイクロレンズの中心と対応するピンホールに隣接するピンホールの中心とを結ぶ線の角度である。

したがって、上記式（１）は、以下の式（２）と同じ意味である。前述の通り、θ_１は、コリメートされた励起光の拡散角θ_１（ｒａｄ）である。また、θ_２は、マイクロレンズを通過した励起光が、対応するピンホールに隣接するピンホールを通過するための角度である。

図５は、図２に示される従来の共焦点顕微鏡１０’の光学系の構成を示す模式図である。図５に示されるように、従来の共焦点スキャナユニット４０にマルチモード光ファイバ３０’を用いて励起光を導入した場合、マルチモード光ファイバ３０’のコアの端部（外周近傍）から出射された光Ａは、コリメータレンズ４１を通過した後、光軸に対して斜めに進むため、ニポウディスク４５のピンホールを通過することができない。すなわち、コアの端部から出射された光Ａは、励起光として利用できない。これは、従来の共焦点スキャナユニット４０の光学系が、理想的な点光源であるレーザ用に設計されているためである。従来の共焦点スキャナユニット４０では、コリメータレンズ４１として、焦点距離が長く（例えば、１００ｍｍ）、開口数の小さい（例えば、０.１以下）レンズを使用していた。このように焦点距離が長いコリメータレンズを使用した場合、上記式（１）を満たすことは困難である。

本発明者は、このマルチモード光ファイバのコアの端部から出射された光も励起光として利用することができれば、励起効率を高めることができるのではないかと考えた。そこで、本発明者は、鋭意検討した結果、上記式（１）を満たすように光学系を構築すれば、マルチモード光ファイバのコアの端部から出射された光も励起光として利用できることを見出したのである。

図６は、図３に示される本発明の共焦点顕微鏡１００の光学系の構成を示す模式図である。図６に示されるように、上記式（１）を満たすように光学系を構築すれば（例えば、焦点距離の短いコリメータレンズ１３１を選択すれば）、マルチモード光ファイバ１２０のコアの端部から出射された光Ａも、コリメータレンズ１３１を通過した後、ニポウディスク１３４のピンホールを通過することができる。このとき、コアの端部から出射された光Ａは、マイクロレンズを通過した後、当該マイクロレンズに対応するピンホールに隣接するピンホールを斜めに通過する。ピンホールを斜めに通過した光は、ピンホールを真っ直ぐに通過した光と同様に、試料１８０の焦点面に焦点を結ぶ。したがって、コアの端部から出射された光Ａも、励起光として寄与することができる。

以上のように、本発明の共焦点スキャナユニットは、マルチモード光ファイバのコアの端部から出射された光も励起光として利用することができるため、従来の共焦点スキャナユニットよりも励起効率に優れている。

なお、上記の説明では、本発明の共焦点スキャナユニットを共焦点顕微鏡に適用する例について説明したが、本発明の共焦点スキャナユニットの用途は共焦点顕微鏡に限定されるものではない。たとえば、本発明の共焦点スキャナユニットは、共焦点内視鏡や光干渉断層撮影（optical coherence tomography；ＯＣＴ）装置などに適用することができる。

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

本実施例では、本発明の共焦点スキャナユニットを有する共焦点顕微鏡の性能を評価した結果を示す。

１．光学系の構築
白色光源、マルチモード光ファイバ（ＡＰＣＨ１０００；コアの直径１ｍｍ、開口数０.３９、長さ２ｍ；Fiberguide industries Inc.）、コリメータレンズ、共焦点スキャナユニット（ＣＳＵ１０；横河電機株式会社）、電動倒立顕微鏡（エクリプスＴｉ−Ｅ；株式会社ニコン）、フィルタホイール（Ludl Electronic Products Ltd.）およびＥＭ−ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ；浜松ホトニクス株式会社）を用いて、光学系を構築した。

図７は、構築した光学系の構成を示す模式図である。図７において、符号１１０は光源（白色光源）、符号１２０はマルチモード光ファイバ、符号１３１はコリメータレンズ、符号４０は市販の共焦点スキャナユニット（図１参照）、符号１４０は第１の結像レンズ、符号１５０は対物レンズ、符号１６０はフィルタホイール、符号１７０はＣＣＤカメラ、符号１８０は試料を示す。

図７に示されるように、本実施例では、市販の共焦点スキャナユニット４０に含まれるコリメータレンズ４１（焦点距離１００ｍｍ以上）の代わりに、倍率４〜２０倍（焦点距離１０〜５０ｍｍ）のレンズをコリメータレンズ１３１として使用した。図１と図７とを比較するとわかるように、共焦点スキャナユニット４０のミラー４２を外して、別途設置されたコリメータレンズ１３１を通過した励起光が共焦点スキャナユニット４０のマイクロレンズアレイディスク４３に照射されるように、光学系を調整した。いずれのレンズを使用する場合であっても、マルチモード光ファイバ１２０の出射端は、コリメータレンズ１３１（またはコリメータレンズ４１）の焦点位置に設置した。

コリメータレンズ１３１は、倍率４倍のレンズ（Plan Apo 4x；焦点距離５０ｍｍ、開口数０.２０；株式会社ニコン）、倍率１０倍のレンズ（Plan Apo 10x；焦点距離２０ｍｍ、開口数０.４５；株式会社ニコン）または倍率２０倍のレンズ（Plan Fluor 20x；焦点距離１０ｍｍ、開口数０.５０；株式会社ニコン）を使用した。また、顕微鏡の対物レンズ１５０は、倍率４０倍の油浸レンズ（Plan Fluor 40x；開口数１.３０；株式会社ニコン）を使用した。

前述の通り、本実施例ではコアの直径が１ｍｍのマルチモード光ファイバを使用している。したがって、倍率４倍のレンズ（焦点距離５０ｍｍ）を使用した場合、拡散角θ_１は０.０１０ｒａｄとなる。同様に、倍率１０倍のレンズ（焦点距離２０ｍｍ）を使用した場合、拡散角θ_１は０.０２５ｒａｄとなり、倍率２０倍のレンズ（焦点距離１０ｍｍ）を使用した場合、拡散角θ_１は０.０５０ｒａｄとなる。また、共焦点スキャナユニット４０に含まれるコリメータレンズ４１（焦点距離１００ｍｍ以上）を使用した場合、拡散角θ_１は０.００５ｒａｄ以下となる。

一方、共焦点スキャナユニット４０に含まれるマイクロレンズアレイディスク４３とニポウディスク４５との中心間距離Ｄ１は、１０ｍｍである。また、ニポウディスク４５の隣接するピンホールの中心間距離Ｄ２は、０.２５ｍｍである。したがって、図４Ｂに示される角度θ_２（＝Ｄ２／Ｄ１）は、０.０２５ｒａｄとなる。

２．励起光の強度の評価
本発明の共焦点顕微鏡について励起光量を評価するために、対物レンズ１５０の先端における励起光の強度を測定した。光源は、白色光源（SPECTRA7 Light Engine；Lumencor, Inc.）を使用した。光源１１０からの波長４７５／２８ｎｍ（透過中心波長／半値幅）の励起光をマルチモード光ファイバ１２０に導入した。マルチモード光ファイバ１２０を伝播した励起光を、倍率４〜２０倍（焦点距離１０〜５０ｍｍ）のコリメータレンズ１３１、または共焦点スキャナユニットのレーザ用ファイバーポート（図７において「Ｂ」で示す）に導入した。励起光の強度は、光パワーメータ（３６６４；日置電機株式会社）を用いて測定した。

図８は、励起光の強度の測定結果を示すグラフである。図８に示されるように、レーザ用ファイバーポート（コリメータレンズの焦点距離１００ｍｍ以上）に励起光を導入した場合に比べて、倍率１０倍（焦点距離２０ｍｍ）または倍率２０倍（焦点距離１０ｍｍ）のコリメータレンズを使用した場合、それぞれ励起光の強度が３.７倍、３.６倍と顕著に向上した。一方、倍率４倍（焦点距離５０ｍｍ）のコリメータレンズを使用した場合は励起光の強度はほとんど向上しなかった（１.３倍）。この結果から、θ_１≧θ_２を満たすコリメータレンズを使用することで、励起光の強度が顕著に高くなることがわかる。

３．空間分解能の評価
本発明の共焦点顕微鏡について空間分解能を評価するために、蛍光ビーズからの蛍光強度を測定した。試料は、直径０.２μｍの蛍光ビーズ（Tetraspeck；Invitrogen Corporation）を使用した。励起光は、白色光源（SPECTRA7 Light Engine；Lumencor, Inc.）からの波長４７５／２８ｎｍの光、１００Ｗ水銀アークランプ（OSRAM GmbH）からの波長４７０／４０ｎｍの光、またはアルゴンイオンレーザ（Sapphire 488 LP；Coherent, Inc）からの波長４８８ｎｍの光を使用した。白色光源からの波長４７５／２８ｎｍの光は、倍率１０倍のコリメータレンズ（焦点距離２０ｍｍ）に導入した。一方、水銀アークランプからの波長４７０／４０ｎｍの光、またはアルゴンイオンレーザからの波長４８８ｎｍは、共焦点スキャナユニットのレーザ用ファイバーポート（コリメータレンズの焦点距離１００ｍｍ以上）に導入した。

各条件で励起光を照射した蛍光ビーズからの蛍光強度の分布（ｘ軸、ｙ軸およびｚ軸方向）を測定し、１０個のビーズの平均値を求めた。

図９は、各条件における蛍光強度の分布を示すグラフである。白色光源からの光を照射した場合、ｘ軸方向の半値全幅は０.３１μｍ、ｙ軸方向の半値全幅は０.３１μｍ、ｚ軸方向の半値全幅は０.６３μｍであった。また、水銀アークランプからの光を照射した場合、ｘ軸方向の半値全幅は０.３２μｍ、ｙ軸方向の半値全幅は０.３３μｍ、ｚ軸方向の半値全幅は０.８４μｍであった。また、アルゴンイオンレーザからの光を照射した場合、ｘ軸方向の半値全幅は０.２８μｍ、ｙ軸方向の半値全幅は０.２９μｍ、ｚ軸方向の半値全幅は０.６１μｍであった。

これらの結果から、本発明の共焦点顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡の空間分解能と同程度の空間分解能を有していることがわかる。

４．共焦点蛍光画像の撮影
本発明の共焦点顕微鏡（図７参照）および従来の共焦点顕微鏡（図２参照）を用いて、イエローカメレオン（ＣＦＰおよびＹＦＰを有するＣａ^２＋プローブ）を発現させたＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光画像をリアルタイムで撮影した。

本発明の共焦点顕微鏡では、白色光源（SPECTRA7 Light Engine）からの波長４４０ｎｍの光をマルチモード光ファイバに導入し、倍率１０倍のコリメータレンズ（焦点距離２０ｍｍ）によりコリメートした（図７参照）。一方、従来の共焦点顕微鏡では、１００Ｗ水銀アークランプからの波長４４０ｎｍの光をマルチモード光ファイバを通して、共焦点スキャナユニットのレーザ用ファイバーポート（コリメータレンズの焦点距離１００ｍｍ以上）に導入した（図２参照）。

図１０Ａは、本発明の共焦点顕微鏡を用いて撮影されたレシオ画像（ＹＦＰ／ＣＦＰ；ヒスタミン刺激後１〜３秒）である。図１０Ｄは、従来の共焦点顕微鏡を用いて撮影されたレシオ画像（ＹＦＰ／ＣＦＰ；ヒスタミン刺激後１〜３秒）である。図１０Ａおよび図１０Ｄは、同一の細胞について撮影した画像である。レシオ画像は、取得したＹＦＰ画像（５３５ｎｍ）およびＣＦＰ画像（４８０ｎｍ）を用いて、各ピクセルについてＹＦＰの蛍光強度をＣＦＰの蛍光強度で割ることにより作成した。

図１０Ｂは、図１０Ａに示される興味領域（四角で囲まれた領域）における平均レシオ値の経時変化を示すグラフである。図１０Ｅは、図１０Ｄに示される興味領域における平均レシオ値の経時変化を示すグラフである。また、図１０Ｃは、図１０Ａに示される興味領域におけるＹＦＰおよびＣＦＰの平均蛍光強度の経時変化を示すグラフである。図１０Ｆは、図１０Ｄに示される興味領域におけるＹＦＰおよびＣＦＰの平均蛍光強度の経時変化を示すグラフである。図１０Ｆの内挿図は、図１０Ｆのグラフの縦軸を拡大したグラフである。

従来の共焦点顕微鏡を用いた場合、図１０Ｄ〜Ｆに示されるように、励起光の強度が不十分なため、鮮明な画像を取得することができなかった。その結果、Ｃａ^２＋の濃度変化を詳細に観察することはできなかった。一方、本発明の共焦点顕微鏡を用いた場合、図１０Ａ〜Ｃに示されるように、十分な強度の励起光を照射することができたため、鮮明な画像を取得することができた。その結果、Ｃａ^２＋の濃度変化を詳細に観察することができた。

本出願は、２０１１年６月１日出願の特願２０１１−１２３０４１に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

本発明の共焦点スキャナユニットは、例えば、共焦点顕微鏡、共焦点内視鏡、光干渉断層撮影装置などに適用することができる。

１０，１０’ 共焦点顕微鏡
２０ レーザ光源
２０’ 白色光源
３０ シングルモード光ファイバ
３０’ マルチモード光ファイバ
４０ 共焦点スキャナユニット
４１ コリメータレンズ
４２ ミラー
４３ マイクロレンズアレイディスク
４４ ダイクロイックミラー
４５ ニポウディスク
４６ 第２の結像レンズ
５０ 第１の結像レンズ
６０ 対物レンズ
７０ ＣＣＤカメラ
８０ 試料
９０ フィルタホイール
１００ 共焦点顕微鏡
１１０ 光源
１２０ マルチモード光ファイバ
１３０ 共焦点スキャナユニット
１３１ コリメータレンズ
１３２ マイクロレンズアレイディスク
１３３ ダイクロイックミラー
１３４ ニポウディスク
１３５ 第２の結像レンズ
１４０ 第１の結像レンズ
１５０ 対物レンズ
１６０ フィルタホイール
１７０ ＣＣＤカメラ
１８０ 試料

Claims (3)

1. 共焦点スキャナユニットと、
   励起光を出射する光源と、
   前記励起光を前記共焦点スキャナユニットに伝播するマルチモード光ファイバと、
   を有する共焦点顕微鏡であって、
   前記共焦点スキャナユニットは、
   前記マルチモード光ファイバから出射された光をコリメートするコリメータレンズと、
   前記コリメータレンズによりコリメートされた光を集光する複数のマイクロレンズを有するマイクロレンズアレイディスクと、
   前記マイクロレンズアレイディスクに対して平行に配置され、かつ前記複数のマイクロレンズの集光点に対応する位置に複数のピンホールを有するニポウディスクと、
   を有し、
   前記コリメータレンズは、前記マルチモード光ファイバの出射端の中心部と前記コリメータレンズの中心部との距離が前記コリメータレンズの焦点距離ｆとなるように配置されており、
   前記コリメータレンズの焦点距離をｆ（ｍｍ）とし、前記マルチモード光ファイバのコアの半径をｙ_１（ｍｍ）とし、前記マイクロレンズアレイディスクと前記ニポウディスクとの中心間距離をＤ１（ｍｍ）とし、前記ニポウディスクにおける前記ピンホール間の中心間距離をＤ２（ｍｍ）としたときに、以下の式（１）が満たされる、
   共焦点顕微鏡。
2. 前記光源は、白色光源である、請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記光源は、ＬＥＤ光源、水銀アークランプ、キセノンアークランプまたはハロゲンランプである、請求項２に記載の共焦点顕微鏡。