JP5921151B2

JP5921151B2 - ヒアルロニダーゼ活性阻害剤

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Publication number: JP5921151B2
Application number: JP2011244375A
Authority: JP
Inventors: 宏三沢; 光政鈴木
Original assignee: NIHON BIO CORPORATION
Current assignee: NIHON BIO CORPORATION
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2016-05-24
Anticipated expiration: 2031-11-08
Also published as: JP2013100243A

Description

本発明は、ブドウの乳酸発酵物を有効成分として含有するヒアルロニダーゼ活性阻害剤に関する。

ヒアルロン酸は、皮膚、関節液やじん帯などに広く分布し、保水性や柔軟性等の維持等、様々な機能を有している。

しかしながら、加齢や紫外線の照射などに伴い、ヒアルロン酸の分解酵素であるヒアルロニダーゼの活性が亢進すると、生体内におけるヒアルロン酸が減少して、組織の柔軟性や潤滑性が失われ、皮膚の老化であるしわやたるみが起きたり、関節痛などが発症する。

ヒアルロニダーゼの活性を阻害できれば、加齢等に伴う皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できることが期待でき、天然成分を利用したヒアルロニダーゼ活性阻害剤が近年種々検討されている。

特許文献１には、ブドウ種子及び／又はブドウ搾汁粕の抽出物を有効成分として含有してなるヒアルロニダーゼ活性阻害剤が開示されている。

特開２０００−２６３０６号公報

しかしながら、上記特許文献１のヒアルロニダーゼ活性阻害剤では、その効果は十分ではなかった。

したがって、本発明の目的は、日常的に手軽かつ安全に摂取でき、ヒアルロニダーゼ活性阻害に優れたヒアルロニダーゼ活性阻害剤を提供することにある。

本発明者は、種々の検討の結果、ブドウの乳酸発酵物を経口摂取することで、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できることを見出し、上記目的を達成するに至った。

すなわち、本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの乳酸発酵物及び／又はその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、天然成分を利用したものであり、安全性が高く、日常的に手軽かつ安全に摂取できる。また、これを経口摂取することにより、ブドウやその抽出物をそのまま経口摂取した場合よりもヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できる。この理由は、詳細は明らかではないが、ブドウに含まれるポリフェノール類が、乳酸発酵により増加すると共に、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合する等の要因により体内への吸収性が向上してポリフェノール類による生理活性効果が高まり、更には、ポリフェノール類と乳酸菌とが相乗的に作用しているのではないかと考えられる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の前記乳酸発酵物は、ブドウを、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含む乳酸菌で発酵して得られたものであることが好ましく、ラクトバチルス・プランタルム及びラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含む乳酸菌で発酵して得られたものであることがより好ましい。ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスで、ブドウを発酵することにより、ブドウに含まれるポリフェノール類の体内への吸収性が高まり、更には、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとの相乗作用により、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害できる。そして、ブドウを、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとで混合発酵することで、ヒアルロニダーゼ活性をより効果的に阻害できる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、前記抽出物が、水抽出物及び／又はアルコール抽出物であることが好ましい。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの種子及び／又は果皮を原料とすることが好ましい。ブドウの種子や果皮には、アントシアニンやプロアントシアニジンなどが多量に含まれているので、より優れた効果が得られ、更には、安価な原料素材なので、製造コストを抑えることができる。また、ブドウの種子や果皮は、渋みが強く、飲食し難いものであるが、乳酸発酵することにより、渋みなどが改善されて、風味が向上し、飲食し易くなる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、天然素材由来であることから、安全性が高く、日常的に手軽かつ安全に摂取できる。また、これを経口摂取することにより、ヒアルロニダーゼ活性を効果的に阻害でき、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少を抑制して、皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤によるヒアルロニダーゼ活性阻害を示す図表である。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ブドウの乳酸発酵物及び／又はその抽出物を有効成分として含有してなるものである。

本発明において、原料となるブドウとしては、特に限定はなく、白系ブドウ、赤系ブドウ等のいずれでもよい。白系ブドウとしては、シャルドネ種、リースリング種、マスカット種などが挙げられる。赤系ブドウとしては、甲州種、巨峰種、ピオーネ種、カベルネ・フラン種、カベルネ・ソービニヨン種、メルロ種、ピノ・ノアール種、ピノ・ムニエ種、マスカット・ベリーＡ種、シラー種、ガメイ種、グルナッシュ種、ムールヴェードル種、サンソー種、グロロー種などが挙げられる。なかでも、赤系ブドウの果皮には、アントシアニンやフラボノイドなどが比較的多量に含まれているので、赤系ブドウが好ましく用いられる。原料ブドウの使用部位は、果皮、果肉、果汁、種子のいずれでも良いが、ポリフェノール類の含有量が高く、安価な原料素材であるという理由から、種子、果皮を用いることが好ましい。

本発明において、原料ブドウの乳酸発酵に用いる乳酸菌としては、食品として利用可能なものであればいずれも好ましく用いることができる。例えば、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・アビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・マラドラートス、エンテロコッカス・カセリフラブス、エンテロコッカス・ガリナール、ロイコノストック・クレモリス、ロイコノストック・シトロボラム、ロイコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・セルビシェ、ペディオコッカス・ハロフィルス、ストレプトコッカス・アセトイニカス、ストレプトコッカス・エビウム、ストレプトコッカス・クレモリス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・サングィウス、ストレプトコッカス・ソイエ、ストレプトコッカス・デュランス、ストレプトコッカス・パラシトロボルス、ストレプトコッカス・ラクチス等の乳酸球菌、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティクス等の乳酸桿菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ等のビフィズス菌等が挙げられる。なかでも、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビスが好ましく、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとを併用することがより好ましい。ブドウを、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとを含む乳酸菌で混合発酵することにより、ブドウに含まれるポリフェノール類が増加し、更には、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合してこれらの体内への吸収性が高まり、ヒアルロニダーゼの活性阻害が向上する。また、渋み、苦味、青臭さが低減され、風味が向上する。更にまた、ポリフェノール類と、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスとが相乗的に作用して、ヒアルロニダーゼ活性阻害が相乗的に向上し、更にはこれらの乳酸菌が持つ様々な生理活性効果が得られる。その結果、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少が抑制され、加齢等に伴う皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。

ブドウの乳酸発酵物の抽出に用いる溶媒としては、特に限定は無い。水、メタノールやエタノール等のアルコール等が挙げられる。好ましくは、安全性や抽出効率が高いという理由から、エタノールが適している。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、例えば以下のようにして製造することができる。

まず、原料ブドウを粉砕し、ブドウ粉砕物を得る。好ましくは、粒径が１００μｍ以下となるまで粉砕する。ブドウ粉砕物の粒径が１００μｍ以下であれば、ザラツキ感が無くなり、食感の良いものとなり、更には、乳酸菌による発酵効率も向上する。原料ブドウとしては、ブドウの種子及び果皮を含むものが好ましく、それによって、ポリフェノール成分に富む乳酸発酵物が得られる。なお、ブドウの種子、果皮を原料ブドウとして用いる場合、種子や果皮を含むブドウの果実そのものを用いてもよく、ブドウの果実から果肉や果汁を回収して残った種子や果皮を含む残渣を用いてもよい。

原料ブドウの粉砕方法は、湿式粉砕が好ましい。湿式粉砕は、例えば、磨砕機、カッター等を用いて行うことができる。

次に、得られたブドウ粉砕物に適当量の水を加え、加熱殺菌して培地を調製する。

培地中のブドウ粉砕物の濃度は、１０〜４０質量％が好ましく、２５〜３５質量％がより好ましい。ブドウ粉砕物の濃度が１０質量％未満であると、乾燥コストがかさんだり、嵩比重が小さくなり製剤化に不都合が生じる。また、ブドウ粉砕物の濃度が４０質量％を超えると、粘度が上昇して攪拌し難くなり、乳酸発酵が不均一に行われる傾向にあり、更には、乳酸菌の増殖に時間がかかって生産性が低下する。

加熱殺菌は、１１０〜１２５℃で、１０〜３０分間行うことが好ましく、１１５〜１２０℃で、１０〜２０分間行うことがより好ましい。上記条件で加熱殺菌を行うことにより、ポリフェノール類を破壊することなく、雑菌などの繁殖を抑制できる。

次に、上記培地に、乳酸菌を添加して乳酸発酵を行う。乳酸菌としては、前述したように、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスを少なくとも含むものが好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルムとラクトバチルス・ブレビスとを少なくとも含むものを用いる。

乳酸菌の添加量は特に限定されないが、培地１リットルに対して、１×１０^９〜１×１０^１０個となるように添加することが好ましく、ラクトバチルス・プランタルムの菌体数が１×１０^９〜５×１０^９個、ラクトバチルス・ブレビスの菌体数が１×１０^９〜５×１０^９個となるように添加することがより好ましい。

乳酸発酵は、温度２７〜３７℃、ｐＨ３〜７、培養時間２４〜７２時間の条件で行うことが好ましく、より好ましくは、温度３０〜３３℃、ｐＨ４．５〜６、培養時間４０〜５０時間の条件で行う。

このようにして乳酸発酵して得られるブドウの乳酸発酵物は、乳酸発酵前の状態に比べてポリフェノール含量が増加し、かつ、ポリフェノール類の体内への吸収性が高められている。この理由としては、乳酸発酵により、ポリフェノール類の配糖体が切断されたり、有機酸が結合したものによると考えられる。また、この乳酸発酵物には、乳酸発酵物の固形分１００ｍｇ中に、乳酸菌が１×１０^８〜１×１０^１０個含まれていることが好ましい。ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ブレビスは、同発酵物の固形分１００ｍｇ中に、ラクトバチルス・プランタルムの菌体数が５×１０^８〜５×１０^９個、ラクトバチルス・ブレビスの菌体数が５×１０^８〜５×１０^９個含まれていることが好ましい。

そして、上記乳酸発酵物を、６０〜８０℃で、５〜１０分間加熱殺菌し、必要に応じて、ガラクトオリゴ糖、ショ糖などの糖類や、果汁などを加えることで、液状のヒアルロニダーゼ活性阻害剤が得られる。

また、加熱殺菌後の上記乳酸発酵物を乾燥、粉末化することで、粉末状のヒアルロニダーゼ活性阻害剤が得られる。加熱殺菌後の乳酸発酵物の乾燥方法としては、例えば熱風乾燥、噴霧乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥などが挙げられるが、ポリフェノール類の破壊が少なく、優れた生理活性を維持し易いという理由から凍結乾燥が好ましい。凍結乾燥は、例えば、発酵物を−６０〜−４０℃で１〜３時間凍結し、圧力０．１ｍｂｒ以下、時間２４〜４８時間、温度２０〜３０℃の条件で行うことが好ましい。

また、粉末化した乳酸発酵物を、水、メタノールやエタノール等のアルコール等の抽出媒体を用いて抽出することで、乳酸発酵物の抽出物が得られる。抽出方法としては、粉末化した乳酸発酵物を抽出媒体に懸濁させ、２０〜４０℃で、２〜４８時間振とうする方法等が挙げられる。

このようにして得られる抽出物を、そのままあるいは固形物を濾過除去したものをヒアルロニダーゼ活性阻害剤として用いてもよく、更に、濃縮あるいは乾燥粉末化したものをヒアルロニダーゼ活性阻害剤として用いてもよい。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤は、ヒアルロニダーゼ活性阻害の点において優れた効果を示し、これを経口摂取することにより、加齢等に伴う生体内のヒアルロン酸の減少を抑制でき、皮膚の老化や関節痛等の疾患を抑制できる。そして、医薬品、食品等の各種分野で用いられ、医薬の有効成分、食品原料等として使用することができる。

例えば、医薬品とする場合には、薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化し、医薬組成物として提供することができる。医薬組成物の形態としては、丸剤、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、ゼリー剤、トローチ剤等の剤型が例示できる。

また、本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤を飲食品に添加して摂取する場合には、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等に配合して用いることができる。

本発明のヒアルロニダーゼ活性阻害剤の有効摂取量は、成人一日当り、固形分換算で１００ｍｇ〜３ｇが好ましい。

以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。

［測定方法］
・総ポリフェノールの測定方法
試料１００ｍｇを８０％メタノール１０ｍｌに溶解させ、振とうしながら３時間、室温で抽出した。抽出液を１／５濃度に希釈した溶液について、没食子酸を標準物質としたＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法で測定した。

・ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定方法
試料１００ｍｇを８０％メタノール１０ｍｌに溶解させ、振とうしながら３時間、室温で抽出した。抽出液を５０〜２００倍に希釈した溶液について、ＤＰＰＨラジカル消去活性を須田らの方法に従い測定した。
すなわち、測定溶液２ｍｌに２００ｍＭＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌ、蒸留水２００μｌ、５０％メタノール８００μｌを順次加えた溶液に、２００μＭＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）メタノール溶液を１ｍｌ添加し、室温で２０分放置した後５２０ｎｍの吸光度を測定した。
標準物質としてＴｒｏｌｏｘを用い、検量線を作成してＴｒｏｌｏｘ相当量で表した。

・ヒアルロニダーゼ活性阻害率の測定方法
試料１００μｌにヒアルロニダーゼ（牛睾丸由来８５０Ｕ／ｍｇ、シグマ社）４０Ｕを、酢酸緩衝液５０μｌに溶解して添加し、３７℃、２０分間反応させた。次に、酢酸緩衝液に０．０１％濃度に溶解したＣｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（ナカライテスク社）溶液１００μｌを添加し、３７℃、２０分間加温した。次に、ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬工業社）を、酢酸緩衝液に０．０８％濃度に溶解し、その２５０μｌを添加して、３７℃、４０分間反応させた。反応後、０．４Ｎ−ＮａＯＨ溶液１００μｌを添加して、反応を停止させた。次に、９．９％濃度に溶解したホウ酸溶液（１Ｎ−ＮａＯＨ溶液でｐＨ９．１に調整）１００μｌを氷冷下で添加した後、沸騰水中で３分間加熱した。次に、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの１０ｇ、１０Ｎ−ＨＣｌの１２．５ｍｌ、酢酸の８７．５ｍｌを混合し、使用直前に酢酸で１０倍に希釈したもの）３ｍｌを添加し、３７℃、２０分間加温した後、５８５ｎｍの吸光度を測定した。
ヒアルロニダーゼを添加しないものをブランクとし、試料を添加しないものをコントロールとし、下式によりヒアルロニダーゼ活性阻害率を求めた。
ヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）
＝〔（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）〕／（Ａ−Ｂ）×１００
Ａ；コントロールの吸光度
Ｂ；コントロールのブランクの吸光度
Ｃ；試料の吸光度
Ｄ；試料のブランクの吸光度

（実施例１）
甲州種のブドウ果皮及び種子を１ｋｇに、１Ｌの水を加え、微粒磨砕機を用いて湿式粉砕し、粒径１００μｍ以下のブドウ粉砕物を得た。このブドウ粉砕物の総ポリフェノール含有量は、没食子酸相当量で１０ｍｇであり、ＤＰＰＨラジカル消去活性は、Ｔｒｏｌｏｘ相当量で６７μｍｏｌであった。
上記ブドウ粉砕物２ｋｇに、水１Ｌを加え、ｐＨを６とし、１２０℃、２０分間加熱殺菌して培地を調製した。
上記培地に、ラクトバチルス・プランタルムを５ｍｌ（菌体数５×１０^９個）、ラクトバチルス・ブレビスを５ｍｌ（菌体数５×１０^９個）を加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した。
発酵終了後、７０℃で１０分間加熱殺菌し、−４０℃に凍結させた後、圧力０．１ｍｂｒ以下、２４時間、３０℃の条件で凍結乾燥して、粉末状のブドウの乳酸発酵物を２５０ｇ得た。このブドウの乳酸発酵物１００ｍｇ中には、ラクトバチルス・プランタルムの死菌体が５×１０^８個、ラクトバチルス・ブレビスの死菌体が５×１０^８個含まれていた。また、総ポリフェノール含有量は、没食子酸相当量で２３ｍｇであり、ＤＰＰＨラジカル消去活性は、Ｔｒｏｌｏｘ相当量で２４２μｍｏｌであった。
上記粉末状のブドウの乳酸発酵物の１００ｍｇを、含水メタノール（水２０％、メタノール８０％）の１０ｍｌに懸濁させ、室温（２５℃）で４時間振とうして抽出を行った。抽出後、懸濁液を濾過処理して固形物が除去された抽出液を得た。この抽出液を、エバポレーターを使ってメタノールを除去し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で全量を１０ｍｌに調整して、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．２ｍｇ／ｍｌ濃度のもので４６％であり、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので６８％であり、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のもので８７％であった。

（実施例２）
実施例１において、培地に、ラクトバチルス・ブレビスを５ｍｌ（菌体数５×１０^９個）加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した以外は、実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので６２％であった。

（実施例３）
実施例１において、培地に、ラクトバチルス・プランタルムを５ｍｌ（菌体数５×１０^９個）加え、培養温度を３３±１℃に維持し、４８時間発酵した以外は、実施例１と同様にしてヒアルロニダーゼ活性阻害剤（ブドウの乳酸発酵物のメタノール抽出物）を得た。
このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので５８％であった。

（比較例１）
実施例１で用いたブドウ粉砕物２ｋｇに、水１Ｌを加え、ｐＨを６とし、１２０℃、２０分間加熱殺菌して培地を調製した。この培地を−４０℃に凍結させた後、圧力０．１ｍｂｒ以下、２４時間、３０℃の条件で凍結乾燥して凍結乾燥物を得た。得られた凍結乾燥物１００ｍｇを、含水メタノール（水２０％、メタノール８０％）の１０ｍｌに懸濁させ、室温（２５℃）で４時間振とうして抽出を行った。抽出後、懸濁液を濾過処理して固形物が除去された抽出液を得た。この抽出液を、エバポレーターを使ってメタノールを除去し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で全量を１０ｍｌに調整してヒアルロニダーゼ活性阻害剤を得た。このヒアルロニダーゼ活性阻害剤のヒアルロニダーゼ活性阻害率は、０．２ｍｇ／ｍｌ濃度のもので２２％であり、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度のもので３５％、０．８ｍｇ／ｍｌ濃度のもので３５％であった。

実施例１〜３及び比較例１の試験結果を図１にまとめて記す。

Claims

ブドウの乳酸発酵物及び／又はその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする関節痛改善剤。
前記乳酸発酵物は、ブドウの、ラクトバチルス・プランタルム及び／又はラクトバチルス・ブレビスによる発酵物である、請求項１に記載の関節痛改善剤。
前記乳酸発酵物は、ブドウの、ラクトバチルス・プランタルム及びラクトバチルス・ブレビスによる発酵物である、請求項２に記載の関節痛改善剤。
前記抽出物が、水抽出物及び／又はアルコール抽出物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節痛改善剤。
ブドウの種子及び／又は果皮を原料とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の関節痛改善剤。