JP5879459B2

JP5879459B2 - 親水性のホスフェートグループを含有する脱水された部分的に精製された骨置換材料

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Publication number: JP5879459B2
Application number: JP2015524665A
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Inventors: インホフ，コルネル; シュレッサー，ロタール; シェーファー，ビルギット; ブフラー，ミヒャエル
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Current assignee: Geistlich Pharma AG
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2016-03-08
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Description

この発明は、規定された等張液吸引能力を有し、ハイドロキシアパタイトの前駆体として作用し易いホスフェートグループを含有する、天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料、およびその親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料を調製するためのプロセスに関する。

骨欠損部位は、感染、疾患、外傷、発達奇形、悪性腫瘍、手術または他の要因に起因する。多くの場合、特定のサイズの骨量を、たとえば、疾患のある顎を補強するために、生成させる必要がある。このような場合、さらに安定化させることができる堅固な移植組織が、好ましくは、使用される。粒状の充填材は、小さな空洞に限られており、なぜならば、治癒が自然に現れるのは、伸延された部分（distracted segment）と周囲の骨との間で生じる移動が全くないかまたは非常に限られている場合にのみ限られるからである。

患部または欠損部を置換するために、天然または合成由来の充填材料または移植組織を使用するなど、いくつかの技術が知られている。骨は、その自然の構造のため、非常に多孔質である。一般的に、骨置換材料は、ヒトの骨の化学的性質および微細構造を模倣しようとする。このような材料の結晶化度、溶解度、粒子サイズ、空孔率、細孔構造および細孔サイズなどの特定の物理化学的パラメータは、極めて中枢的に重要であり、骨適合性および骨結合に非常に影響を及ぼし得る。これらのパラメータの不適切な組み合わせは、骨修復の失敗につながる。細孔サイズは細胞内部成長および増殖、血管新生、ならびに／または細胞接着過程に影響を与えることが知られている。これらの知見を考慮すると、天然由来の骨置換材料は、合成材料に対していくつかの重要な利点を有していることを強調することができる。自家骨が広くゴールドスタンダードであると考えられているが、その適用はいくつかの欠点があり、自家骨および同種骨の両方は限られた量でのみ利用可能である。

近年、動物由来の骨置換材料の開発のための厳しい規制的な生物学的および物理化学的要件を並行して満たしながら、動物の骨の生体力学的特性の維持に大きな注目が集められている。

市販の骨置換材料はTUTOBONE(R)であるが、これはウシ海綿骨ブロック（Tutogen Medicalから入手可能）である。これは、生来の機械的強度が大きく維持される、脱水された部分的に精製された骨移植物である。

米国特許６，９４２，９６１は、TUTOBONE(R)などのような、維持される骨構造の移植物を製造するために生物学的組織を脱水するための２ステップ法を記載している。第１のステップでは、組織は、有機の水混和性溶媒で部分的に脱水される。第２のステップでは、組織は、凍結乾燥によってさらに脱水される。

TUTOBONE(R)は、維持された骨構造および機械的強度を有する動物起源の他の市販の脱水された部分的に精製された骨置換材料と同様、満足のゆく親水性および骨結合特性を提供しない。動物由来の市販の骨ブロックの低い親水性を克服するために、外科医は手術前または手術中に骨ブロックを生理食塩水ですすぐ必要がある。そのような骨ブロックは、それらをたとえば空のシリンジに配置することによって濡らされ、生理的食塩水で数回すすがれなければならない。これは時間がかかり、手術または病院環境において実用的ではない。また、そのような処理された骨のブロックが完全に濡れており、気泡を含まないことを保証することはできない。このような気泡は、骨置換材料の迅速な結合を妨害し得る。空気対血液界面では、成長または再生がないことが考えられる。周囲の生体組織と骨置換材料との間の直接的な構造的および機能的な接続は不十分である。血液、血液成分、および患者の細胞は、移植後に速やかに移植材料を結合する必要がある。

したがって、容易に濡らされ再水和されるよう十分な親水性を有する、維持された骨構造および機械的強度を伴う、動物由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料が必要とされている。

米国特許６，２９３，９７０およびＵＳ２０１０／００３０３４０は、１つ以上の可塑剤を含浸させたクリーンな（すなわち、部分的に精製された）非脱灰耐荷骨移植組織を含む可塑化された耐荷骨移植組織を開示し、可塑剤は特に、グルコース、スクロースおよびＤガラクトースのような糖類、ならびにグリセロール、アドニトール、ソルビトール、リビトール、ガラクチトール、マンニトールおよびキシリトールのようなＣ_２〜Ｃ_７ポリオールであり、骨移植組織は、「ドナー、たとえばヒトまたは動物および／または死体ドナーから得られた任意の骨またはその断片」である。ここでは「可塑化」という用語は、骨組織中の自由な緩く結合した水和水は、コラーゲン繊維および関連するミネラル相の向きを変更することなく、可塑剤と置き換えられ、それによって自然骨の構造および機械的特性を維持することを意味する。可塑剤は、骨移植組織を安定化させ、したがって保存中、移植中または移植後に生ずるかまたは伝搬する骨折または微細骨折を防止するため、および疾患の伝染の危険を防止するために用いられることが教示されており：可塑剤を湿潤剤として用いることに対する言及はなく、骨移植組織の親水性の問題はそれらの文書では全く対処されていない。米国特許６，２９３，９７０においては、可塑剤を、骨の３ｗ／ｗ％〜３０ｗ／ｗ％で使用して、無菌等張食塩水でのほんの簡単に洗浄して「移植組織の隣接表面に付随した可塑剤」を除去した後、または等張食塩水で（約１時間）さらに洗浄して「できるだけ多くの可塑剤」を除去した後に、骨移植組織の患者へ直接移植することが開示されている（特に８欄、１４〜６２行、および１２欄１０〜２７行参照）。ＵＳ２０１０／００３０３４０では、可塑剤は「最小量」で用いられるよう開示されるが、それはここでは７０％（ｖ／ｖ）より多い可塑剤を含有する可塑化組成物を用いて、可塑化された移植組織を再水和なしに移植する、または移植物を移植に先立って無菌等張生理食塩水において素早くすすぐ、という選択肢を伴って、骨組織において水和水を置換する最少量を意味し（特に［００３５］および［０１２６］を参照）、それによって、米国特許６２９３９７０におけるように、移植組織の外表面と関連付けられる可塑剤のみを除去する。

上記米国特許文献においては、可塑剤は、コラーゲン線維および関連するミネラル相の向きを変更することなく、天然の水和水を置換する。それは、したがって骨移植組織の構造に埋め込まれ、したがって、移植前に無菌等張生理食塩水で洗浄することにより除去することは困難である。等張生理食塩水で素早くすすいだ後、可塑化された部分的に精製された材料中に残存する可塑剤の有効量を評価することは困難であり：おそらく、可塑剤が置換された天然の水和水に関して過剰でないときに、存在する可塑剤の大部分が可塑化された部分的に精製された材料に残る。生体内では可塑剤は生理学的流体によってゆっくりとしか洗い流されない。

特に、骨置換材料が、非生理的な物質である可塑剤または湿潤剤等の添加剤を多量に含有する場合には、体内に導入される異物である骨置換材料に耐性のない可能性のある患者は、常に、臨床移植における潜在的な問題である。

この発明の目的は、先行技術の骨置換材料、特に米国特許６，９４２，９６１のもの（TUTOBONE(R)）および米国特許６，２９３，９７０およびＵＳ２０１０／００３０３４０のものの欠点を有しておらず、骨置換材料の骨組み内における改善された骨新形成能力を呈する、容易に湿らせられ水和され易い天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料を提供することである。

その目的は特許請求の範囲において規定されるこの発明によって達成される。
この発明は、増大された親水性および骨結合を伴う天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料であって、自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去され、０．０５〜１．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、０．７〜５．６ｗ／ｗ％のホスフェートグループとを含み、このホスフェートグループは生理学的に許容可能な塩の一部である骨置換材料を提供する。

この発明はさらに、増大した親水性および骨結合を伴う天然由来の上記親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料を製造する方法を提供する。

等張液吸引試験により示されるように（特に実施例３ならびに図１Ａおよび図１Ｂを参照）、この発明の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、親水性であり、したがって、気泡を形成する危険性なしに周囲の組織にすぐに結合されやすい。糖または糖アルコールの非生理的物質のその低い含有量のおかげで、それは、人体の機能の撹乱が最小限であり、したがって、患者によって最適に許容される。

カルシウムイオンを含有する生理学的流体と同様の培地においてこの発明の脱水された部分的に精製された骨置換材料のブロックをインキュベートするin vitro実験において示されるように（特に実施例４および図２を参照）、放出されたホスフェートグループは、カルシウムイオンと反応してブロックのコラーゲン繊維上に、ヒドロキシアパタイトの前駆体であるリン酸カルシウムの白色析出物を形成する。これは、in vivoでは、自然系のように、（S. Gajjeraman et al. 2007 The Journal of Biological Chemistry 282, 2, pp. 1193-1204およびS. Bodhak et al. 2009 Acta Biomaterialia 5, pp. 2178-2188参照）、骨ミネラル生成物の核形成および成長は、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料のコラーゲン基質上で生じ、ホスフェートグループはこれらのプロセスにおいて役割を果たすことを示す。

ホスフェートグループは、したがって、骨形成を促進することにおいて重要な役割を果たす。各種動物、特にラットおよびイヌにおける移植時に、この発明の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、有害な組織病理学的事象（炎症または異物反応）がないかまたは非常に少ない、優れた骨新形成能力を示す。

この発明に従って０．３５％ｗ／ｗのソルビトールおよび１．４％ｗ／ｗの（ＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻）を含有するウマ起源の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料の８つの異なるブロック、先行技術に従う天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料の３つの異なるブロック、ならびに市販のウシの骨代替材料TUTOBONE(R)（Tutogen Medical GmbH）についての、時間と相関しての等張液吸引能力（ｍｇ単位の液体取り込み）の比較を示す。先行技術に従う天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料の３つの異なるブロック、および市販のウシの骨代替材料TUTOBONE(R)(Tutogen Medical GmbH)と比較した、この発明に従って０．３５％ｗ／ｗソルビトールおよび１．４％ｗ／ｗの（ＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻）を含有するウマ起源の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料の８つの異なるブロックについての、時間と相関しての等張液吸引能力（％で示された、液体取り込みと脱水されたブロックとの間のｗ／ｗ比）の比較を示す。１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏの修飾されたイーグル培地）におけるインキュベーションの後における、この発明に従って０．３５％ｗ／ｗソルビトールおよび１．４％ｗ／ｗの（ＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻）を含有するウマ起源の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料のブロックの表面のＳＥＭ（走査電子顕微鏡）顕微鏡写真を示す。一実施形態に従う骨ブロックを概略的に示す。一実施形態に従う骨ピンを概略的に示す。一実施形態に従う骨プレートを概略的に示す。一実施形態に従う骨テーパキーを概略的に示す。一実施形態に従う骨バーを概略的に示す。一実施形態に従う骨顆粒を概略的に示す。

この発明は、天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料であって、自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去され、０．０５〜１．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、０．７〜５．６ｗ／ｗ％のホスフェートグループとを含み、このホスフェートグループは生理学的に許容可能な塩の一部であることにおいて特徴付けられる骨置換材料を提供する。

この発明によれば、「天然由来」という用語によって意図されるのは、任意の骨置換材料であり、つまりヒト、雌ウシ、ウマ、ブタなどのようなすべての種類の哺乳類を含むがこれらに限定されない脊椎動物に由来する骨または骨様材料、および珊瑚のような無脊椎動物に由来する任意の骨または骨様材料である。特定の実施形態では、ウシ、ブタまたはウマの骨が、この発明の目的のために使用される。

用語「部分的に精製された骨置換材料」とは、無機多孔質骨構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての有機非コラーゲン性材料が除去される、任意の骨置換材料を意図している。

「親水性」という用語は、脱水された部分的に精製された骨置換材料は、水により濡らされることが可能であり、したがって、容易に等張液または生理学的流体を吸収して再水和されることが可能であり、従って、移植されたときに気泡を形成する危険性を呈しないことを意味する。

用語「糖」は、特に、グルコース、マンノースまたはガラクトースなどのヘキソース；リボースまたはアラビノースのようなペントース；リブロースまたはフルクトースのようなケトース；スクロース、ラクトースまたはマルトースのような二糖類、シクロデキストリンのようなオリゴ糖を含む。糖は、Ｄ-又はＬ-形態で存在してもよい。ある実施形態はグルコースを利用する。

この発明に含まれる糖アルコールは特にソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マンニトールおよびキシリトールである。ある実施形態はソルビトールを利用する。

「ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易いホスフェートグループ」とは、人体における、好ましくは６．０〜８．０のｐＨおよび３６℃〜３８℃の温度での、生理学的流体の、特に血液における、カルシウムイオンとの反応によって、骨の必須の成分であるリン酸カルシウム塩類のうち、熱力学的に最も安定していて、可溶性がより低い、ハイドロキシアパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２の前駆体を与え易い任意のホスフェートグループを意味する。

そのようなホスフェートグループの例は、ＰＯ_４ ^３−、ＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻である。

ホスフェートグループは、好ましくは、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される。

ホスフェートグループを含有する生理学的に許容可能な塩は、一般的に、生理学的流体のｐＨバランスを著しく乱さない、たとえばＮａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｓｒ^２＋のような、生理学的に許容可能なカチオンを伴うリン酸塩である。

そのような生理学的に許容可能な塩の例は、
Ｎａ_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、ＣａＨＰＯ_４、Ｃａ_８（ＨＰＯ_４）_２（ＰＯ_４）_４、それらの水和物、およびそれらの混合物を含む。

通常、生理学的に許容可能な塩のリン酸塩は、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋の群から選択されるカチオンを含む。

一実施形態では、リン酸ナトリウム緩衝剤が生理学的に許容可能な塩として用いられ、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与え易い、生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易いホスフェートグループは、ＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻である。

ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易く、好ましくはホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される、その材料に含有されるホスフェートグループは、骨形成を促進することにおいて重要な役割を果たす。

カルシウムイオンを含有した生理学的流体と同様の培地、すなわち１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有するＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏの修飾されたイーグル培地）において、７２時間の間、この発明の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料のブロックをインキュベートした後、ホスフェートグループは、カルシウムイオンと反応して、コラーゲン細繊維上に、ＳＥＭ分析によって可視である、リン酸カルシウムの白色析出物を形成することがin vitroで示された（図２を参照）。その析出物は、異なる形態の２つのタイプのリン酸カルシウムを含有すると示され、両方ともハイドロキシアパタイトの前駆体として記載することが可能である。

それらのin vitro実験（実施例４参照）は、in vivoでは、自然系におけるように（S. Gajjeraman et al. 2007 The Journal of Biological Chemistry 282, 2, pp. 1193-1204およびS. Bodhak et al. 2009 Acta Biomaterialia 5, pp. 2178-2188参照）、骨ミネラル生成物の核形成および成長は、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料のコラーゲン基質上で生じ、生理学的流体において放出される、後者に含有されるホスフェートグループは、そのような反応において或る役割を果たすことを強く示す。非生理学的な物質の含有量が低いので、この発明の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、したがって、移植されたとき、自然系を模倣するに位置にあり、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料から放出されたホスフェートは、ミネラル生成物の核生成および成長過程を開始することによって、骨形成に最初の弾みを与える。

この発明はさらに上に規定されるような親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料に関係があり、それは、カルシウムイオンを含有する生理学的流体と同様の培地においてインキュベートされると、ホスフェートグループとそれらのカルシウムイオンとの反応を伴って、コラーゲン基質上にリン酸カルシウムの析出を与え、それらのリン酸カルシウムはハイドロキシアパタイトの前駆体の特徴を有する。

各種動物、特にラットおよびイヌにおける移植時に、この発明の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、有害な組織病理学的事象（炎症または異物反応）がないかまたは非常に少ない、優れた骨新形成能力を示した。

この骨新形成能力は、特に、Chai YC et al., 2011 , Tissue Engineering Part A, 17, 1083-97 "Probing the osteoinductive effect of calcium phosphate by using an in vitro biomimetic model（「生体外の生体模倣モデルを用いることによるリン酸カルシウムの骨誘導性効果の調査」）"の教示に従う。それらの著者は、特に、リン酸カルシウムが間充織幹細胞を骨芽細胞系に駆動し、それにより、おそらくは骨形成を改善することを示した。さらに、Sogo Y et al. 2007, 2, 116-23は、過飽和されたリン酸カルシウム溶液における、コラーゲンを伴うリン酸カルシウムの共析出、および間充織幹細胞に対するその効果、すなわち骨形成の分化を高めることを教示する。

以下は、本発明者らによって予期せず見出された：
骨形成を促進することにおいて役割を果たす位置にあるために、ホスフェートグループは、十分な量、通常は少なくとも０．７ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも１．０ｗ／ｗ％の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料に含有されるべきである。

生理学的流体において過剰に放出されると、ホスフェートグループはリン酸カルシウムの大きな析出を引起し、有害な炎症反応の可能性に至るかもしれない。ホスフェートグループが、５．６ｗ／ｗ％より高くない、好ましくは２．８ｗ／ｗ％より高くない親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料であるとき、そのような反応は生じない。

この発明の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、したがって、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、０．７〜５．６ｗ／ｗ％、好ましくは１．０〜２．８ｗ／ｗ％のホスフェートグループを含有する。

この発明は、さらに、自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去された、天然由来の部分的に精製された骨置換材料の骨新形成能力を、有害な組織病理学的事象（炎症性反応または異物反応）はまったくまたはほとんどなしに高めるための、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、好ましくはホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される、０．７〜５．６ｗ／ｗ％のホスフェートグループの使用に関係する。

ある実施形態では、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料はグルコースおよびリン酸ナトリウム緩衝剤でコーティングされる。

ある実施形態では、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料はソルビトールおよびリン酸ナトリウム緩衝剤でコーティングされる。

ある実施形態では、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、さらに、１つ以上の薬学的に活性な作用剤を含む。

好適な薬学的に活性な作用剤の例は、タウロリジン、殺ウイルス剤、殺菌剤、抗生物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、蛋白質合成のための補因子、ホルモン、幹細胞を含む生体細胞、酵素、抗原性作用剤、抗癌剤、免疫抑制剤および成長因子である。

脱水された部分的に精製された骨置換材料は、ブロック１０（図３）、ピン（ボルト）１２（図４）、プレート１４（図５）、テーパされたキーもしくは条片１６（図６（英国では「横くさび」と呼ばれる））、バー１８（図７）または骨顆粒２０（図８）などを含むが、それらに限定されない任意の形状を有してよい。

第１の実施形態では、構造は図３に示されるようなブロック１０であり、第２の実施形態では、図６に示されるような条片であり、第３の実施形態では、図８に示されるような顆粒である。

この発明は、さらに移植物をリモデルするとしてここに記載されるような骨置換材料の使用に関する。

この発明は、さらに、自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去された、天然由来の部分的に精製された骨置換材料に親水性を与えるための、０．０５〜１．５ｗ／ｗ％、好ましくは０．０５〜０．８ｗ／ｗ％、特に０．０５〜０．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つの使用に関する。

親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料の調製
この発明の天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、
（ａ）まず有機溶媒で脂質を抽出し、そこで脱脂された材料をカオトロピック試薬を含有する溶液で処理し、水で広範な洗浄を実行することによって、天然由来の部分的に精製された骨置換材料を与えることと、
（ｂ）天然由来の部分的に精製された骨置換材料を、部分的に精製された骨置換材料に親水性を与える、０．０５〜０．８５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、Ｎａ_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、ＣａＨＰＯ_４、Ｃａ_８（ＨＰＯ_４）_２（ＰＯ_４）_４、それらの水和物、およびそれらの混合物からなる群から選択される生理学的に許容可能な塩の一部である１０〜１０００ｍＭのホスフェートグループとを含有する溶液に浸すことと、
（ｃ）浸された親水性の部分的に精製された骨置換材料を凍結乾燥し、それによって脱水を実行することと、
（ｄ）親水性の脱水された部分的に精製された骨の凍結乾燥された骨置換材料を滅菌することとを含むプロセスによって製造されてもよい。

ステップ（ａ）において脂質を抽出するために用いられた有機溶媒はメタノール、エタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトン、および／またはトルエンを含んでもよい。

ステップ（ａ）において用いられる前記カオトロピック試薬はたとえば、尿素、チオ尿素、グアニジンＨＣｌ、グアニジンチオシアナート、アミノグアニジンＨＣｌ、アミノグアニジン、重炭酸塩、炭酸グアニジン、リン酸グアニジンまたはそれらの混合物を含む。

一実施形態では、天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料は、
（ａ）まず有機溶媒で脂質を抽出し、そこで脱脂された材料をカオトロピック試薬を含有する溶液で処理し、水で広範な洗浄を実行することによって、天然由来の部分的に精製された骨置換材料を与えるステップと、
（ｂ）天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料を、部分的に精製された骨置換材料に親水性を与える、０．０５〜０．８５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択され、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋の群から選択されるカチオンを含む生理学的に許容可能な塩の一部である１０〜１０００ｍＭのホスフェートグループとを含有する溶液に浸すステップと、
（ｃ）浸された親水性の部分的に精製された骨置換材料を凍結乾燥し、それによって脱水を実行するステップと、
（ｄ）親水性の部分的に精製された骨の凍結乾燥された骨置換材料を滅菌するステップとを含むプロセスによって製造されてもよい。

一実施形態では、ステップ（ｂ）において用いられる溶液は、７５〜６００ｍＭ、特に１００〜２００ｍＭのｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝剤を含有する。

上記のプロセスは、さらに、ステップ（ａ）の間に得られた天然由来の脱脂された骨置換材料上、またはステップ（ａ）の終りで得られた天然由来の部分的に精製された骨置換材料上のいずれかにおいて実行される、さらなる中間脱水ステップを含んで、コラーゲン構造を破壊してコラーゲン繊維の向きの変更を引起すなどしてもよい。

中間脱水ステップは、通常、０℃より上の温度、たとえば５〜５０℃、特に１０〜４０℃で減圧乾燥することによって、または窒素のような不活性ガスを材料を通して活発に吹きつけることによって、実行される。凍結乾燥はここで適切ではなく、なぜならば、凍結による骨軟組織の固定の結果、自然骨の閉じた構造が、コラーゲン構造のいかなる著しい破壊もなく本質的に同じまま残るからである。

その脱水ステップ前後に材料の走査電子顕微鏡写真をとることによって、材料は、そのステップの前よりも後に、コラーゲン繊維の向きの変更に対応する、より開いた、破壊された不規則なコラーゲンの構造を呈することが示され得る。中間脱水ステップがステップ（ａ）の終わりで得られた天然由来の部分的に精製された骨置換材料上で実行されるとき、コラーゲン構造のその破壊は特に明らかである。

好ましくは、さらなる中間脱水ステップは、ステップ（ａ）の終りで得られた天然由来の部分的に精製された骨置換材料上で０℃より上の温度で実行される減圧乾燥ステップであり、コラーゲン構造を破壊してコラーゲン繊維の向きの変更を引起すなどする。

この発明は、さらに上記のプロセスによって調製された、脱水された部分的に精製された骨置換材料に関する。

脱水された部分的に精製された骨置換材料の親水性および骨結合
骨結合、つまり周囲の生体宿主組織に対する移植物材料の直接的な物理的接続は、骨修復の成功を大幅に増大させ得る。親水性は、動物由来の骨置換材料の場合における骨結合に影響を及ぼす大きな要因である。材料がより親水性であればあるほど、周囲の組織に対する移植物材料の物理的接続は、よりよく、およびより迅速である。親水性および骨結合を測定または定量化する一般的に受入れられた方法は存在しない。骨結合の間接測定は移植組織の等張液吸引能力を検出することである。

脱水された部分的に精製された骨材料の等張液吸引能力は、その材料の、その内部構造において等張液を吸収する特性である。その特性は、骨材料の孔隙構造、濡れ性および毛細管作用に依存し、骨結合、つまり周囲の生体宿主組織に対する移植物材料の直接的な物理接続の十分な指標であり、骨修復の成功における重要な役割を果たす。

固体の骨置換材料のブロックの等張液吸引能力を測定するために、以下の方法が用いられた：実験室精度天秤で、規定された量の等張ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液が、皿に配置された。規定された重量の脱水された骨置換材料の１つのブロックが、天秤のそばで高さ調整可能保持装置でクランプされた。次いで、骨置換材料ブロックが皿において水様液の表面にちょうど接触するように、装置の高さが調整された。液体の表面までの距離が測定の全体にわたって同じままであるように、装置の高さが固定された。親水性の骨置換材料のブロックでは、液体が吸収され、液体の取り込みは時間の関数として天秤で検出された。

脱水された部分的に精製された骨置換材料の等張液吸引能力は、吸収された等張液の質量として定義される。相対的な等張吸引能力は、脱水された部分的に精製された骨置換材料の質量単位当たりの等張液吸引能力として定義される。

驚いたことに、天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料を糖類または糖アルコールの少なくとも１つおよび生理学的に許容可能な塩でコーティングして、それが０．０５〜１．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つを含有するようにすることは、等張液吸引能力を非常に高めることがわかった。

そのような処理された骨置換材料の相対的な等張液吸引能力は、５分内で少なくとも５０％であるが、５分内で少なくとも１００％、または５分内に少なくとも２００％でさえあり得る。

ある実施形態では、全体の液体取り込みの約５０％が約２分未満以内で、または約１分未満以内でさえ、到達されることが分かった。

ある実施形態では、そのような有益な等張液吸引能力は、天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料を少量の糖類または糖アルコールの少なくとも１つで被覆して、それが０．０５〜０．８ｗ／ｗ％またはさらには０．０５〜０．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つを含有するようにすることによって、達成することが可能であることが分かった。

これらの知見は基本的な利点、特に：
−移植組織の周囲の組織との実質的に即時の結合；
−外科医は骨置換材料をその使用に先立って前処理する必要はなく、したがって、材料の汚染の危険性が減少し得る；
−糖類または糖アルコールは、生理学的流体によって洗い流されるように設計される非生理学的な物質であり、最小限に抑えられ、したがって、人体の機能の撹乱は最小限であり、移植された親水性の骨材料は、患者によって最適に許容される；
−先行技術より改善され、より迅速な治癒結果、に関連付けられる。

以下の実施例は、この発明を、その範囲を制限せずに、説明する。
実施例１１．５ｗ／ｗ％のグルコースならびに１．４ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有するウマ由来の海綿状の骨の脱水された部分的に精製されたブロックの調製
ウマ由来の海綿状の骨を、１２×１２×５ｍｍのブロックに切断した。

以下のステップがそれらのブロック上で実行された：水および／またはアセトンもしくはアルコール（たとえばエタノール）のような有機溶媒での選択的な洗浄ステップ、水酸化ナトリウムおよび／または過酸化水素を用いるウィルス不活性化ステップ、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトンまたはトルエンのような有機溶媒での脱脂、ならびに尿素または塩酸グアニジンのようなカオトロピック塩を含有する溶液での、４℃〜３５℃間の温度での洗浄ステップが続いた。結果として生じたブロックは、水で入念にすすがれ、最後に減圧乾燥された。

走査電子顕微鏡によるそれらのブロックの観察は、未変性コラーゲン構造が実質的に維持されていたことを示した。半定量的な２ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むさまざまな技術によるそれらのブロックの分析は、コラーゲン以外の抽出可能なタンパク質の１％未満の存在を示した。

次いで、ブロックは、３時間、室温で、（ＮａＨ_２ＰＯ_４を脱塩された水に溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウムで調整することによって調製された）ｐＨ７．０の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤を含有する０．８６ｗ／ｗ％のグルコース溶液に浸され、ピンセットで水溶液から取出され、次いで、凍結乾燥され、ガンマ線照射を用いて滅菌された。得られたブロックは約１．５ｗ／ｗ％のグルコースならびに１．８７ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有すると示された。

実施例２０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有するウマ由来の海綿状の骨の脱水された部分的に精製されたブロックの調製
ウマ由来の海綿状の骨を、１０×１０×５ｍｍのブロックに切断した。

次いで、ブロックは、２時間、室温で、（ＮａＨ_２ＰＯ_４を脱塩された水に溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウムで調整することによって調製された）ｐＨ７．０の１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤を含有する０．２ｗ／ｗ％ソルビトール水溶液に浸され、ピンセットで水溶液から取出され、次いで、凍結乾燥され、ガンマ線照射を用いて滅菌された。得られたブロックは約０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有すると示された。

実施例２−２０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有するウマ由来の海綿状の骨の「非可塑化された」脱水された部分的に精製されたブロックの調製
ウマ由来の海綿状の骨を、１０×１０×５ｍｍのブロックに切断した。

以下のステップがそれらのブロック上で実行された：水および／またはアセトンもしくはアルコール（たとえばエタノール）のような有機溶媒での選択的な洗浄ステップ、水酸化ナトリウムおよび／または過酸化水素を用いるウィルス不活性化ステップ、メタノール、エタノール、プロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトンまたはトルエンのような有機溶媒での脱脂、ならびに尿素または塩酸グアニジンのようなカオトロピック塩を含有する溶液での、４℃〜３５℃間の温度での洗浄ステップが続いた。結果として生じたブロックは、水で入念にすすがれ、次いで、２０’０００パスカルより下の圧力で２４０分間室温で減圧乾燥するステップを受けた。

（凍結乾燥によって乾燥される）減圧乾燥ステップの前および後の走査電子顕微鏡によるそれらのブロックの観察は、コラーゲン構造において実質的な差を示した：減圧乾燥ステップの後、コラーゲン構造は、より開いており、破壊され、不規則であり、コラーゲン繊維の向きの変更に対応した。

それらのブロックはしたがって「可塑化されていない」、つまり、米国特許６，２９３，９７０およびＵＳ２０１０／００３０３４０（上記３頁、１０〜１３９行参照）の「可塑化された」の定義に対応しない。

減圧乾燥ステップ後に得られたブロックの、半定量的な２ＤＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むさまざまな技術による分析は、コラーゲン以外の抽出可能なタンパク質の１％未満の存在を示した。

実施例３この発明に従う脱水された部分的に精製された骨材料に対する、時間との相関における等張液吸引能力の測定
固体の骨置換材料のブロックの等張液吸引能力を測定するために、以下の方法が用いられた：
実験室精度天秤で、規定された量の等張ＰＢＳ溶液が、皿に配置された。規定された重量の脱水された骨置換材料の１つのブロックが、天秤のそばで高さ調整可能保持装置でクランプされた。次いで、骨置換材料ブロックが皿において水様液の表面にちょうど接触するように、装置の高さが調整された。液体の表面までの距離が測定の全体にわたって同じままであるように、装置の高さが固定された。親水性の骨置換材料のブロックでは、液体が吸収され、液体の取り込みは時間の関数として天秤で検出された。

上記の方法は以下の等張液吸収能力を測定するために用いられた：
−実施例２に記載されているように調製された０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有する、この発明に従うウマ由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料の（０．２３０〜０．５００ｇ／ｃｍ^３の間の密度を有する）８つの異なるブロック
−（ソルビトールまたはホスフェートなしに）実施例２の第２段落に記載されているように調製されたウマ由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料の３つの異なるブロック、ならびに
−ウシの骨代替材料TUTOBONE(R)（Tutogen Medical GmbH）の市販のブロック。

結果は図１Ａおよび図１Ｂに表される。
図１Ａは上記のブロックに対する時間との相関での等張液吸引能力（ｍｇにおける液体の取り込み）を示す。

図１Ｂは、上記のブロックについての、時間と相関しての相対的な等張液吸引能力（％で示された、液体取り込みと脱水されたブロックとの間のｗ／ｗ比）を示す。

図１Ａから明らかなように：
−０．３５％ソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻の存在は等張液吸引能力を劇的に増大させ、
−全体の液体取り込みの５０％より多くが２分未満以内で、または１分未満以内でさえ、到達された。

図１Ｂから明らかなように：
−５分での相対的な等張液吸引能力はすべてのブロックに関して少なくとも１００％であるが、
−少なくとも１５０％（５つのブロック）、または少なくとも２００％（１つのブロック）でさえあってもよい。

上記の実験は、０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有する、この発明に従う脱水された部分的に精製された骨材料のブロックの高親水性を示す。

一連の同様の実験では、０．０５、０．２、０．４６、１．１４または１．５０ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有する、この発明に従う脱水された部分的に精製された骨材料のブロックは、同じ高親水性を有する（測定された相対的な等張液吸収能力は、それらのさまざまなソルビトール含有量に対して著しく異ならなかった）ことが示された。

実施例４生理学的流体と同様の培地に存在するカルシウムイオンとの反応による、この発明に従う脱水された部分的に精製された骨材料の表面上におけるハイドロキシアパタイトの前駆体となりそうな析出の形成
−実施例２に記載されているように調製された０．３５ｗ／ｗ％のソルビトールならびに１．４ｗ／ｗ％のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有する、この発明に従うウマ由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料の約１５０ｍｇのブロックと、
−どのようなブロックも伴わない、（上記のブロックと同じ量のＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻を含有する）３ｍｌの１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤とを、
７２時間の間、３７℃で、１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含有する３ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏの修飾されたイーグル培地）（約６５ｍｇ／ｌの濃度のカルシウムイオンを含有する生理学的流体と同様の培地）でインキュベートした。

リン酸ナトリウム緩衝剤のインキュベートによって得られた培地は、すべてのインキュベーション時間中において混濁状になり、そしてそのままであった一方、各上記のブロックのインキュベートによって得られた培地は、すべてのインキュベーション時間中において澄んだままだった。

上記のブロックはインキュベーション培地から取出され、４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で固定され、乾燥され、ＳＥＭ（走査電子顕微鏡）によって分析された。

そのブロックの顕微鏡写真を表す図２を参照されたい：析出は材料の表面上で白色で示され、コラーゲン繊維は析出の下に灰色がかった網様構造として可視である。

培地に存在するカルシウムイオンとのブロックの反応をさらに特徴付けるために、培地のＣａ濃度が、ブロックとの２４ｈのインキュベートに先立って、およびそのインキュベートの後に測定された。２４時間のインキュベートの後の溶液におけるカルシウムイオンの量は、最初のカルシウムイオンの量（約５０ｍｇ／ｍｌ）よりはるかに低く（約２．０ｍｇ／ｍｌ）測定され、カルシウムイオンのホスフェートグループとの反応を実証した。

析出物をそれらのブロックから除去してその組成物を分析することは可能ではなかったので、混濁状の培地から、同様の条件下で、どのようなブロックもなしに３ｍｌの１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤をインキュベートすることによって形成された析出物を、洗浄し、乾燥させ、走査電子顕微鏡（ＲＥＭ）およびエネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）を介して分析した。析出物はカルシウム、ホスフェートおよび酸素を含有し、異なる形態の２つのタイプのリン酸カルシウムを含み、一方はカルシウム：ホスフェートのモル比が１：１の結晶質（鋭い縁部のラメラ）であり、他方は、４：３の比の陰微晶質または非晶質（微粒子塊）であることが分かった。両方の構造的なタイプはハイドロキシアパタイトに等しくないＣａ：Ｐモル比を表し、それは、両方の相をハイドロキシアパタイトの前駆体と記載することが可能であることを示す。実際、すべてのオルトリン酸カルシウムに基づいた塩類は、人体内において見出される正常条件である約３７℃の温度で約７のｐＨの水様培地においてすべてのオルトリン酸カルシウム塩類のうちで熱力学的に最も安定した形態であるハイドロキシアパタイトに変換されるはずである。

それらの実験は、先行技術の公知の親水性の骨置換材料より実質的に低い量の湿潤剤を含有する、この発明に従う親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料においては、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻は体液のカルシウムイオンと反応して、生体材料の表面上に析出を形成し、この析出はハイドロキシアパタイトの前駆体の特徴を有することを示す。

上記のin vitro実験は、in vivoにおいて、自然系におけるように、骨ミネラル生成物の核生成および成長がコラーゲン基質上で起こり、生理学的流体において放出されたホスフェートグループは、そのような反応において役割を果たすことを強く示す。

Claims

天然由来の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料であって、自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去され、前記骨置換材料は、０．０５〜１．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される、０．７〜５．６ｗ／ｗ％のホスフェートグループとを含有し、このホスフェートグループはリン酸ナトリウム緩衝剤である生理学的に許容可能な塩の一部であることにおいて特徴付けられる、親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される、１．０〜２．８ｗ／ｗ％のホスフェートグループを含む、請求項１に記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
前記糖アルコールはソルビトールである、請求項１または２に記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
前記糖類はグルコースである、請求項１〜３のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
ウシ、ブタ、またはウマ由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
薬学的に活性な作用剤をさらに含むことにおいて特徴付けられる、請求項１〜５のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
ブロックの形態にある、請求項１〜６のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
カルシウムイオンを含有する生理学的流体と同様の培地においてインキュベートされると、前記ホスフェートグループとそれらのカルシウムイオンとの反応を伴って、コラーゲン基質上にリン酸カルシウムの析出を与え、それらのリン酸カルシウムはハイドロキシアパタイトの前駆体の特徴を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料。
請求項１〜８のいずれかに記載の親水性の脱水された部分的に精製された骨置換材料を調製するためのプロセスであって：
（ａ）まず有機溶媒で脂質を抽出し、そこで脱脂された材料をカオトロピック試薬を含有する溶液で処理し、水で広範な洗浄を実行することによって、天然由来の部分的に精製された骨置換材料を与えるステップと、
（ｂ）前記天然由来の脱水された部分的に精製された骨置換材料を、前記部分的に精製された骨置換材料に親水性を与える、０．０５〜０．８５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つと、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択され、リン酸ナトリウム緩衝剤の一部である１０〜１０００ｍＭのホスフェートグループとを含有する溶液に浸すステップと、
（ｃ）浸された前記親水性の部分的に精製された骨置換材料を凍結乾燥し、それによって脱水を実行するステップと、
（ｄ）前記親水性の部分的に精製された骨の凍結乾燥された骨置換材料を滅菌するステップとを含む、プロセス。
ステップ（ｂ）において用いられる前記溶液は、７５〜６００ｍＭ、好ましくは１００〜２００ｍＭの、ｐＨ７．０のリン酸ナトリウム緩衝剤を含有する、請求項９に記載のプロセス。
ステップ（ａ）の終りで得られた前記天然由来の部分的に精製された骨置換材料上で実行されて、コラーゲン構造を破壊してコラーゲン繊維の向きの変更を引起すなどする、さらなる中間脱水ステップを含む、請求項９または１０に記載のプロセス。
自然骨の無機の多孔質の骨の構造およびコラーゲンの構造が実質的に維持される一方で、実質的にすべての非コラーゲンの有機材料は除去され、０．０５〜１．５ｗ／ｗ％の糖類または糖アルコールの少なくとも１つを含有する、天然由来の部分的に精製された骨置換材料からの、高められた骨新形成能力を有する骨置換材料の調製における、ハイドロキシアパタイトの前駆体を与えるよう生理学的流体のカルシウムイオンと反応し易い、リン酸ナトリウム緩衝剤の一部である、ホスフェートＨＰＯ_４ ^２−およびＨ_２ＰＯ_４ ⁻からなる群から選択される、０．７〜５．６ｗ／ｗ％のホスフェートグループの使用。