CN104640577A - 亲水性的含有磷酸根基团的脱水且部分纯化的骨骼置换材料 - Google Patents
亲水性的含有磷酸根基团的脱水且部分纯化的骨骼置换材料 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供：亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料和制备亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的方法，其中，基本上所有的非胶原有机材料被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，其特征在于，所述骨骼置换材料含有0.05w/w％～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种和0.7w/w％～5.6w/w％的选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团，该磷酸根基团是生理上可接受的盐的一部分。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有限定的等渗溶液吸入能力并含有易于充当羟基磷灰石前体的磷酸根基团的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，以及制备亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的方法。
背景技术
骨骼缺陷部位可能由感染、疾病、创伤、发育畸形、恶性肿瘤、手术或其他因素引起。通常需要产生一定尺寸的骨骼体积，例如，增加患病颌的体积。在这种情况下，优选使用可以额外被稳定化的固体移植物。由于只有在分散部分和周围骨骼之间没有或仅有非常有限的移动时才会自然愈合，颗粒形式的填充物受限于小空腔。
已知有数种技术来置换患病或缺失部分，例如使用天然或合成来源的填充材料或移植物。由于其天然结构，骨骼是非常多孔的。通常，骨骼置换材料试图模仿人骨骼的化学和微观结构。某些物理-化学参数，例如材料的结晶度、溶解度、粒径、孔隙率、孔隙结构和孔隙大小至关重要，并且可以极大地影响骨相容性和骨整合。这些参数的不适当的组合会导致骨骼修复的失败。已知孔隙大小会影响细胞向内生长和增殖、血管化和/或细胞粘附过程。鉴于这些发现，可以强调，天然来源的骨骼置换材料相对于合成材料具有一些重要优势。虽然自体骨骼被广泛认为是黄金标准，但其应用有若干缺点，并且自体和异体骨骼仅以有限量可用。
近年来，大量关注集中于保留动物骨骼的生物力学性质的同时满足开发动物来源的骨骼置换材料的严格控制的生物和化学-物理要求。
市售的骨骼置换材料是，它是牛松质骨块(可从Tutogen Medical购买)。它是很大程度上保持了原生机械强度的脱水且部分纯化的骨骼移植物。
美国专利6,942,961号描述了将生物组织脱水以用于制造具有保留的骨骼结构的移植物(例如)的两步法。第一步中，将组织用有机、水混溶性溶剂部分脱水。第二步中，将组织通过冻干进一步脱水。
，像其它市售的具有保留的骨骼结构和机械强度的动物来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料一样，未提供令人满意的亲水性和骨整合特性。为了克服市售的动物来源的骨块的低亲水性，外科医生必须在手术之中或之前用生理盐水冲洗骨块。此类骨块必须通过将它们放置在例如空的注射器中来润湿并用生理盐水冲洗数次。这是耗时的，并且在手术中或医院环境里不实用。此外，不能保证这种处理过的骨块完全润湿并且不含气泡。这样的气泡可能会阻止骨骼置换材料的快速整合。在空气-血液界面不能进行生长或再生。周围活组织和骨骼置换材料之间的直接的结构和功能联系不足。患者的血液、血液成分和细胞需要在植入后迅速整合移植物材料。
因此，需要具有足够亲水性以容易被润湿和再水化的具有保留的骨骼结构和机械强度的动物来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料。
美国专利6,293,970号和US2010/0030340披露了塑化的承重骨骼移植物，其包括用一种或多种增塑剂浸渍的清洁的(即部分纯化的)未脱矿物质化承重骨骼移植物，所述增塑剂主要是糖，如葡萄糖、蔗糖和D-半乳糖，以及C2至C7多元醇，如丙三醇、阿东糖醇、山梨糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇和木糖醇，并且骨骼移植物是“从供体(例如人或动物和/或尸体供体)获得的任何骨骼或其骨板”。术语“塑化的”在这里是指骨骼组织中的游离和松散结合的水合水被增塑剂置换，且不改变胶原纤维和关联的矿物相的取向，由此保留天然骨骼的结构和力学性质。据教导增塑剂用于稳定骨骼移植物，从而防止储存过程中、植入过程中或植入后裂缝或微裂缝发展或传播，并防止疾病传播的风险：没有提到使用增塑剂作为润湿剂，这些文件中完全没有涉及骨骼移植物的亲水性问题。在美国专利6293970号中，披露了增塑剂以骨骼的3重量％～30重量％使用，并允许骨骼移植物仅在无菌等渗盐水中简单冲洗以除去“与移植物的直接表面相连的增塑剂”之后或在用等渗盐水长时间冲洗(大约一小时)以除去“尽可能多的增塑剂”之后直接植入患者体内(详见第8栏第14-62行和第12栏第10-27行)。在US2010/0030340中，披露了增塑剂的用量为“最小量”，这是指置换骨骼组织中的水合水的最小量，使用含有超过70体积％增塑剂的增塑组合物，选择不经再水合植入塑化移植物或在植入前在无菌等渗盐水中迅速冲洗植入物(具体参见[0035]和[0126])，从而如美国专利6293970号所述，只能除去与移植物的外表面相连的增塑剂。
在上述美国专利文件中，增塑剂置换水合的天然水而不改变胶原纤维和关联的矿物相的取向：因此，它嵌入骨骼移植物的结构中从而难以在植入前通过用无菌等渗盐水洗涤而清除。用等渗盐水快速漂洗后保留在塑化的部分纯化的材料中的塑化剂的有效量难以估计：可能的是，当相对于置换的水合的天然水来说增塑剂没有过量时，存在的大部分的增塑剂保留在塑化的部分纯化的材料中。在体内，增塑剂将仅慢慢地被生理流体洗掉。
可能的不能耐受骨骼置换材料(在体内植入异体)的患者，在临床植入中经常是一个潜在的问题，特别是如果骨骼置换材料含有大量非生理物质的如增塑剂或润湿剂等添加剂。
本发明的一个目的是提供一种容易被润湿和水合的天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其不具有现有技术、特别是美国专利6942961号()和美国专利6293970号和US2010/0030340中的骨骼置换材料的缺点，并提供了骨骼置换材料的支架中改善的新骨骼形成能力。
该目的通过如所附权利要求所限定的发明达到。
发明内容
本发明提供了一种具有提高的亲水性和骨骼整合性的天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，基本上所有的非胶原有机材料被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，其含有0.05w/w％～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种和0.7w/w％～5.6w/w％的易于与生理流体中的钙离子反应产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团，该磷酸根基团是生理上可接受的盐的一部分。
本发明还提供了制造上述具有提高的亲水性和骨整合性的天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的方法。
如通过等渗溶液吸入能力测试显示(主要参见实施例3和图1A和1B)，本发明的脱水且部分纯化的骨骼置换材料是亲水的，并从而易于立刻整合到周围组织中，而没有形成气泡的风险。由于它的糖或糖醇(非生理物质)的含量低，它将最小地扰乱人体功能，从而最大程度被患者耐受。
如通过在与含有钙离子的生理流体类似的介质中温育本发明的脱水且部分纯化的骨骼置换材料块的体外实验显示(特别参见实施例4和图2)，释放的磷酸根基团与钙离子反应，从而在材料块的胶原纤维上产生磷酸钙的白色沉淀，这些磷酸钙是羟基磷灰石的前体。这显示，在体内，如在天然系统中那样(见S.Gajjeraman et al.2007The Journal of Biological Chemistry 282,2,pp.1193-1204and S.Bodhak et al.2009Acta Biomaterialia 5,pp.2178-2188)，骨骼矿物生成物的成核和生长将发生在亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的胶原基质上，磷酸根基团参与了这些过程。
因此磷酸根基团在促进骨骼形成中扮演重要角色。在对各种动物、特别是大鼠和狗的植入时，本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料显示出极佳的新骨骼形成能力，且没有或很少有不良组织病理事件(炎症或异物反应)。
附图说明
图1A显示了根据本发明的8种不同的含有0.35w/w％山梨糖醇和1.4w/w％(HPO4 2-和H2PO4 -)的马来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料块、根据现有技术的3种不同的天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料块和市售牛骨替代材料(Tutogen Medical GmbH)的时间相关的等渗溶液吸入能力(液体吸入以mg计)的比较。
图1B显示了与根据现有技术的3种不同的天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料块，和市售牛骨替代材料(Tutogen Medical GmbH)相比的根据本发明的8种不同的含有0.35重量％山梨糖醇和1.4w/w％(HPO4 2-和H2PO4 -)的马来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料块的时间相关的相对等渗溶液吸入能力(液体吸入和脱水的材料块的重量比以％表示)。
图2显示了在含有10％FCS(胎牛血清)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)中温育后，根据本发明的8种不同的含有0.35w/w％山梨糖醇和1.4w/w％(HPO4 2-和H2PO4 -)的马来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料块的表面的SEM(扫描电子显微镜)显微图像。
图3示意性展示了根据一个实施方式的骨块。
图4示意性展示了根据一个实施方式的骨栓。
图5示意性展示了根据一个实施方式的骨板。
图6示意性展示了根据一个实施方式的骨锥形键(tapered key)。
图7示意性展示了根据一个实施方式的骨棒。
图8示意性展示了根据一个实施方式的骨粒。
具体实施方式
本发明提供了天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，基本上所有的非胶原有机物被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，其特征在于，骨骼置换材料含有0.05w/w％～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种和0.7w/w％～5.6w/w％的易于与生理流体中的钙离子反应产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团，该磷酸根基团是生理上可接受的盐的一部分。
根据本发明，术语“天然来源”指源自脊椎动物(包括但不限于所有种类的哺乳动物如人、牛、马、猪等)的任何骨骼置换材料，即骨骼或骨骼类似材料，和源自如珊瑚等无脊椎动物的骨骼或骨骼类似材料。在某些实施方式中，将牛、猪或马的骨骼用于本发明的目的。
术语“部分纯化的骨骼置换材料”指基本上所有的非胶原有机材料被除去而无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留的任何骨骼置换材料。
术语“亲水性”指脱水且部分纯化的骨骼置换材料能够被水润湿，因此能够通过吸收等渗溶液或生理流体而容易再水化，并由此在植入时没有形成气泡的风险。
术语“糖”特别包括：己糖，如葡萄糖、甘露糖或半乳糖；戊糖，如核糖或阿拉伯糖；酮糖，如核酮糖或果糖；二糖，如蔗糖、乳糖或麦芽糖；寡糖，如环糊精。糖可以以D-或L-型存在。某些实施方式利用葡萄糖。
本发明中包含的糖醇主要为山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇和木糖醇。某些实施方案利用山梨糖醇。
术语“易于与生理流体中的钙离子反应产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团”指在人体中通过与生理流体(特别是血液中)的钙离子优选在pH 6.0～8.0和温度36～38℃的反应而易于产生羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2(其是作为骨骼基本成分的热力学上最稳定且溶解性较小的磷酸钙盐)的前体的任何磷酸根基团，。
这样的磷酸根基团的实例为PO4 3-、HPO4 2-和H2PO4 -。
磷酸根基团优选地选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组。
含有磷酸根基团的生理上可接受的盐通常为具有不会显著扰乱生理流体的pH平衡的生理上可接受的阳离子(如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Sr2+)的磷酸盐。
这样的生理上可接受的盐的实例包括：
Na3PO4、Na2HPO4、K2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、Ca3(PO4)2、CaHPO4、Ca8(HPO4)2(PO4)4、其水合物和其混合物。
通常生理上可接受的盐磷酸盐包含选自由Na+、K+、Ca2+和Mg2+组成的组中的阳离子。
在一个实施方式中，使用磷酸钠缓冲液作为生理上可接受的盐，易于与生理流体中的钙离子反应产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团则为HPO2-和H2PO4 -。
材料中包含的易于与生理流体中的钙离子反应产生羟基磷灰石的前体且优选地选自由磷酸根HPO2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团，在促进骨骼形成中扮演重要角色。
体外显示，在与含有钙离子的生理流体类似的介质(即含有10％FCS(胎牛血清)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基))中将本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料温育72小时后，磷酸根基团与钙离子反应从而在胶原纤维上产生磷酸钙的白色沉淀，其通过SEM分析可见(见图2)。该沉淀显示含有不同形貌的两种类型的磷酸钙，两种类型都可以描述为羟基磷灰石的前体。
体外实验(见实施例4)提供了以下有说服力的迹象：在体内，如在天然系统中(见S.Gajjeraman et al.2007The Journal of Biological Chemistry 282,2,pp.1193-1204and S.Bodhak et al.2009Acta Biomaterialia 5,pp.2178-2188)那样，骨骼矿物生成物的成核和生长将发生在亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的胶原基质上，后者中包含的在生理流体中释放的磷酸根基团在这些反应中起作用。由于非生理物质含量低，因此本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料在植入时将处于模拟天然系统的位置，由亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料释放的磷酸根通过启动矿物生成物的成核和生长过程为骨骼形成提供了起始推动力。
本发明还涉及上述定义的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其在与含有钙离子的生理流体类似的介质中温育时涉及磷酸根基团与那些钙离子反应而在胶原基质上产生磷酸钙沉淀，那些磷酸钙具有羟基磷灰石前体的特征。
在对各种动物、特别是大鼠和狗中植入时，本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料显示出优异的新骨骼形成能力且没有或很少有不良组织病理事件(炎症或异物反应)。
这种新骨骼形成能力符合特别是Chai YC et al.,2011,Tissue Engineering Part A,17,1083-97“Probing the osteoconductive effect of calcium phosphate by using an in vitrobiomimetic model”的教导。这些作者特别展示了磷酸钙驱动间充质干细胞进入成骨细胞谱系，从而据推测促进骨骼形成。此外Sogo Y et al.,2007,2,116-23教导了磷酸钙与胶原在过饱和磷酸钙溶液中共沉淀及其对间充质干细胞的影响，即增强成骨细胞分化。
本发明人已经意外地发现以下：
为了处于在促进骨骼形成中发挥作用的位置，亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料应包含足量、通常为至少0.7w/w％、优选至少1.0w/w％的磷酸根基团。
当在生理流体中过量释放时，磷酸根基团会产生大量磷酸钙的沉淀，导致可能出现不良炎症响应。这种响应在磷酸根基团不高于亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的5.6w/w％，优选2.8w/w％时不会发生。
因此本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料含有0.7w/w％～5.6w/w％、优选1.0w/w％～2.8w/w％的易于与生理流体中的钙离子反应而产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团。
本发明还涉及0.7w/w％～5.6w/w％的磷酸根基团用于提高天然来源的部分纯化的骨骼置换材料的新骨骼形成能力的应用，所述磷酸根基团易于与生理流体中的钙离子反应而产生羟基磷灰石的前体，优选地选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组，其中，基本上所有的非胶原有机材料被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，且没有或很少有不良组织病理事件(炎症或异物反应)。
在某些实施方式中，用葡萄糖和磷酸钠缓冲液涂布亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料。
在某些实施方式中，用山梨糖醇和磷酸钠缓冲液涂布亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料。
在某些实施方式中，亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料还含有一种或多种药用活性剂。
合适的药用活性剂的实例为牛磺罗定、杀病毒剂、杀微生物剂、抗生素、氨基酸、肽、蛋白质、维生素、蛋白质合成的辅因子、激素、包括干细胞在内的活细胞、酶、抗原性试剂、抗肿瘤剂、免疫抑制剂和生长因子。
脱水且部分纯化的骨骼置换材料可具有任何形状，包括但不限于块10(图3)、栓(钉)12(图4)板14(图5)、锥形键或带16(英国称“销”，图6)、棒18(图7)或骨粒20(图8)等。
在第一实施方式中，结构为如图3所示的块10，在第二实施方式中为如图6所示的带，在第三实施方式中为图8所示的粒。
本发明还涉及如本文所述的骨骼置换材料作为重构植入物的应用。
本发明还涉及0.05～1.5w/w％、优选0.05～0.8w/w％、特别是0.05～0.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种对天然来源的部分纯化的骨骼置换材料赋予亲水性性质的应用，其中，基本上所有的非胶原有机物被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留。
制备亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料
本发明的天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料可以通过包括以下步骤的方法制备：
(a)通过首先用有机溶剂提取脂质、然后用含有离液剂的溶液处理脱脂的材料和用水进行彻底洗涤来提供天然来源的部分纯化的骨骼置换材料，
(b)将天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料浸泡在含有向部分纯化的骨骼置换材料提供亲水性的0.05w/w％～0.85w/w％的糖或糖醇中的至少一种和10mM～1000mM的易于与生理流体中的钙离子反应而产生羟基磷灰石的前体的磷酸根基团的溶液中，该磷酸根基团是选自由Na3PO4、Na2HPO4、K2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、Ca3(PO4)2、CaHPO4、Ca8(HPO4)2(PO4)4、其水合物和其混合物组成的组中的生理上可接受的盐的一部分。
(c)将经浸泡的亲水性部分纯化的骨骼置换材料冻干，从而进行脱水，和
(d)将亲水性部分纯化的骨骼冻干的骨骼置换材料灭菌。
步骤(a)中用于提取脂质的有机溶剂可以包括甲醇、乙醇、乙醇、丙醇、己烷、环己烷、丙酮和/或甲苯。
步骤(a)中使用的所述离液剂包括例如尿素、硫脲、盐酸胍、硫氰酸胍、盐酸氨基胍、碳酸氢氨基胍、碳酸胍、磷酸胍或其混合物。
在一个实施方式中，天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料通过包括如下步骤的方法制备：
(a)通过首先用有机溶剂提取脂质、然后用含有离液剂的溶液处理脱脂的材料和用水进行彻底洗涤来提供天然来源的部分纯化的骨骼置换材料，
(b)将天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料浸泡在含有向部分纯化的骨骼置换材料提供亲水性的0.05w/w％～0.85w/w％的糖或糖醇中的至少一种和10mM～1000mM的选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团的溶液中，该磷酸根基团是包含选自Na+、K+、Ca2+和Mg2+的组中的阳离子的生理上可接受的盐的一部分，
(c)将经浸泡的亲水性部分纯化的骨骼置换材料冻干，从而进行脱水，和
(d)将亲水性部分纯化的骨骼冻干的骨骼置换材料灭菌。
在一个实施方式中，步骤(b)中使用的溶液含有75mM～600mM、特别是100mM～200mM的pH 7.0的磷酸钠缓冲液。
上述方法可以还包含对步骤(a)过程中获得的天然来源的脱脂的骨骼置换材料或对步骤(a)结束时获得的天然来源的部分纯化的骨骼置换材料进行的进一步的中间脱水步骤，以破坏胶原结构和引起胶原纤维的取向的改变。
该中间脱水步骤通常通过在高于0℃的温度，例如5～50℃，特别是10～40℃下真空干燥进行，或通过将如氮气等惰性气体剧烈地吹过该材料进行。这里不适合冻干是因为通过冷冻来固定骨骼软组织会导致天然骨骼的封闭结构保持基本上不变而没有显著破坏胶原结构。
通过在脱水步骤之前和之后拍摄材料的扫描电子显微镜显微照片，可以看出材料在步骤之后比步骤之前显示出更为开放的、被破坏的和不规则的胶原结构，这对应于胶原纤维的取向的改变。当对在步骤(a)结束时获得的天然来源的部分纯化的骨骼置换材料进行中间脱水步骤时，胶原结构的破坏特别明显.
优选在高于0℃的温度下对步骤(a)结束时获得的天然来源的部分纯化的骨骼置换材料进行进一步的中间脱水步骤，以破坏胶原结构和引起胶原纤维的取向的改变。
本发明还涉及通过上述方法制备的脱水且部分纯化的骨骼置换材料。
脱水且部分纯化的骨骼置换材料的亲水性和骨整合
骨整合，即，植入材料与周围的活宿主组织的直接物理连接，可以大大增加骨修复的成功度。在动物来源的骨骼置换材料的情况中，亲水性是影响骨整合的主要因素。材料的亲水性越大，植入材料与周围组织的物理连接就越好和越快。目前不存在普遍接受的方法来测量或量化亲水性和骨整合。骨整合的间接测量是检测移植物的等渗溶液吸入能力。
脱水且部分纯化的骨骼材料的等渗溶液吸入能力是材料将等渗溶液吸收到其内部结构中的性质。该性质依赖于骨骼材料的孔隙结构、润湿性和毛细作用，并且是骨整合、即植入材料与周围的活宿主组织的直接物理连接的良好指标，它在骨修复的成功方面扮演重要角色。
为了测量固体骨骼置换材料块的等渗溶液吸入能力，使用下述方法：在实验室精密称重天平上，将规定量的等渗PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液置于盘中。将一块规定重量的脱水且骨骼置换材料夹在天平旁边的高度可调的夹持装置中。然后调整该装置的高度使得骨骼置换材料块刚刚接触盘中的水性液体的表面。固定该装置的高度使得在测量期间到液体的表面的距离保持不变。在亲水性骨骼置换材料块中，液体被吸收并用天平将液体吸入量测定为时间的函数。
将脱水且部分纯化的骨骼置换材料的等渗溶液吸入能力定义为吸收的等渗溶液的质量。将相对等渗吸入能力定义为每质量单位的脱水且部分纯化的骨骼置换材料的等渗溶液吸入能力。
令人惊讶地发现，用糖或糖醇中的至少一种和生理上可接受的盐涂布天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料，以使其含有0.05～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种，可以极大地提高等渗溶液吸入能力。
这样处理的骨骼置换材料的相对等渗溶液吸入能力为5分钟内至少50％，但可以达到5分钟内至少100％或甚至5分钟内至少200％。
在某些实施方式中，发现在小于大约两分钟内达到，或者甚至在不到约一分钟内达到总液体吸收的约50％。
在某些实施方式中，发现可以通过用更少量的糖或糖醇中的至少一种涂布天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料，使其含有0.05～0.8w/w％或者甚至0.05～0.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种，可以来达到这种有益的等渗溶液吸入能力。
这些发现与基本优点相关，特别是：
-移植物与周围组织的基本上立即整合；
-外科医生不需要在使用前预处理骨骼置换材料从而可以获得降低的材料污染的风险；
-作为设计为被生理流体洗掉的非生理物质的糖或糖醇保持最小量，从而最低程度地扰乱人体的运转并且患者最大程度耐受植入的亲水性骨骼材料；
-比现有技术具有更好和更快的愈合效果。
下述实施例举例说明本发明但不限制其范围。
实施例1 含有1.5w/w％的葡萄糖和1.4w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -的马来源的脱水且部分纯化的松质骨块的制备。
将马来源的松质骨切成12×12×5mm的块。
在这些块上进行下述步骤：用水和/或如丙酮或醇(如乙醇)等有机溶剂进行选择性洗涤步骤，使用氢氧化钠和/或过氧化氢进行病毒灭活步骤，用如甲醇、乙醇、丙醇、己烷、环己烷、丙酮或甲苯等有机溶剂进行脱脂，随后用含有如尿素或盐酸胍等离液盐的溶液在4℃～35℃的温度下进行洗涤步骤。将所得的块用水彻底冲洗，最后真空干燥。
通过扫描电子显微镜对这些块进行观察显示基本上保留了原生胶原结构。通过包括半定量2D SDS-PAGE在内的各种技术对这些块进行分析显示存在少于1％的除胶原以外的可提取蛋白质。
然后将块在室温下在含有pH 7.0的200mM钠的磷酸钠缓冲液(通过在去矿物质水中溶解NaH2PO4并用氢氧化钠调整pH来制备)的0.86w/w％的葡萄糖溶液中浸泡3小时，用镊子从水溶液中取出，然后冻干并用伽马辐照灭菌。获得的块显示含有约1.5w/w％的葡萄糖和1.87w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -。
实施例2 含有0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -的马来源的脱水且部分纯化的松质骨块的制备
将马来源的松质骨切成10×10×5mm的块。
在这些块上进行下述步骤：用水和/或如丙酮或醇(如乙醇)等有机溶剂进行选择性洗涤步骤，使用氢氧化钠和/或过氧化氢进行病毒灭活步骤，用如甲醇、乙醇、丙醇、己烷、环己烷、丙酮或甲苯等有机溶剂进行脱脂，随后用含有如尿素或盐酸胍等离液盐的溶液在4℃～35℃的温度下进行洗涤步骤。将所得的块用水彻底冲洗，最后真空干燥。
通过扫描电子显微镜对这些块进行观察显示基本保留了原生胶原结构。通过包括半定量2D SDS-PAGE在内的各种技术对这些块进行分析显示存在少于1％的除胶原以外的可提取蛋白质。
然后将块在室温下在含有150mM pH7.0的磷酸钠缓冲液(通过在去矿物质水中溶解NaH2PO4并用氢氧化钠调整pH制备)的0.2w/w％的山梨糖醇水溶液中浸泡2小时，用镊子从水溶液中取出，然后冻干并用伽马辐照灭菌。获得的块显示含有约0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -。
实施例2bis含有0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -的“未塑化”的马来源的脱水且部分纯化的松质骨块的制备
将马来源的松质骨切成10×10×5mm的块。
在这些块上进行下述步骤：用水和/或如丙酮或醇(如乙醇)等有机溶剂进行选择性洗涤步骤，使用氢氧化钠和/或过氧化氢进行病毒灭活步骤，用如甲醇、乙醇、丙醇、己烷、环己烷、丙酮或甲苯等有机溶剂进行脱脂，随后用含有如尿素或盐酸胍等离液盐的溶液在4℃～35℃的温度下进行洗涤步骤。将所得的块用水彻底冲洗，然后进行在室温下以低于20000帕斯卡的压力真空干燥240分钟的步骤。
在真空干燥(通过冻干干燥)步骤前后通过扫描电子显微镜对这些块进行的观察显示胶原结构有很大不同：在真空干燥步骤之后，胶原结构更为开放、被破坏和不规则，这对应于胶原纤维的取向的改变。
这些块因此是“未塑化”的，即不符合美国专利6,293,970号和US2010/0030340(见上文第3页第10-139行)中“塑化的”的定义。
在真空干燥步骤之后通过包括半定量2D SDS-PAGE在内的各种技术对获得的块进行的分析显示存在少于1％的除胶原以外的可提取蛋白质。
然后将块在室温下在含有150mM pH7.0的磷酸钠缓冲液(通过在去矿物质水中溶解NaH2PO4并用氢氧化钠调整pH制备)的0.2w/w％的山梨糖醇水溶液中浸泡2小时，用镊子从水溶液中取出，然后冻干并用伽马辐照灭菌。获得的块显示含有约0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -。
实施例3 根据本发明的脱水且部分纯化的骨骼材料的时间相关的等渗溶液吸入能力的测量
为了测量固体骨骼置换材料块的等渗溶液吸入能力，使用下述方法：
在实验室精密称重天平上，将规定量的等渗PBS溶液置于盘中。将一块规定重量的脱水的骨骼置换材料夹在天平旁边的高度可调的夹持装置中。然后调整该装置的高度使得骨骼置换材料块刚刚接触盘中的水性液体的表面。固定该装置的高度使得在测量期间到液体的表面的距离保持不变。在亲水性骨骼置换材料块中，液体被吸收并用天平将液体吸入量检测为时间的函数。
上述方法用于测量如下材料的等渗溶液吸入能力：
-如实施例2所述制备的含有0.35w/w％山梨糖醇和1.4w/w％(HPO4 2-和H2PO4 -)的根据本发明的8种不同的马来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料块(密度为0.230～0.500g/cm3)。
-如实施例2第二段中所述制备的3种不同的马来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料块(不含山梨糖醇或磷酸根)，和
-市售的牛替代材料(Tutogen Medical GmbH)的块。
结果展示在图1A和1B中。
图1A显示了上述块的时间相关的等渗溶液吸入能力(液体吸入以mg计)。
图1B显示了上述块的时间相关的相对等渗溶液吸入能力(液体吸入和脱水的材料块的重量比以％表示)。
从图1A可以明显看出：
-0.35％的山梨糖醇和1.4w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -的存在显著提高了等渗溶液吸入能力，
-在小于大约两分钟内或者甚至在不到约一分钟内达到超过总液体吸收的50％。
从图1B可以明显看出：
-所有块在5分钟内的相对等渗溶液吸入能力为至少100％，
-但可以为至少150％(5块)或甚至至少200％(1块)。
上述实验显示了根据本发明的含有0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -的脱水且部分纯化的骨骼材料块的高亲水性。
在一系列类似实验中显示根据本发明的含有0.05、0.2、0.46、1.14或1.50w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -的脱水且部分纯化的骨骼材料块具有相同的高亲水性(测量的各种山梨糖醇含量的相对等渗溶液吸入能力没有显著不同)。
实施例4 在根据本发明的脱水且部分纯化的骨骼材料的表面上通过与生理流体类似的介质中存在的钙离子反应形成可能为羟基磷灰石前体的沉淀。使
-如实施例2所述制备的根据本发明的含有0.35w/w％的山梨糖醇和1.4w/w％的HPO4 2-和H2PO4 -的约150mg的马来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料块，和
-不含任何块的3ml的150mM的磷酸钠缓冲液(含有与上述块相同量的HPO4 2-和H2PO4 -)，
在37℃在3ml含有10％FCS(胎牛血清)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)中温育72小时(与含有约65mg/l的钙离子的生理流体类似的介质)。
通过温育磷酸钠缓冲液得到的介质变得浑浊并在整个温育期间保持浑浊，而通过温育各个上述块得到的介质在整个温育期间保持清澈。
将上述块从温育介质中取出，用4％的PFA(多聚甲醛)固定，干燥并用SEM(扫描电子显微镜)分析。
参见展示该块的显微图像的图2：沉淀描述为材料表面上的白色，胶原纤维作为沉淀下方的灰色网络可见。
为了进一步表征块与存在于介质中的钙离子的反应，在与块温育一起温育24小时之前和之后测量介质中的Ca浓度。测量到温育24小时后的溶液中的钙离子的量(约2.0mg/ml)比钙离子的初始量(约50mg/ml)低得多，表明钙离子与磷酸根基团发生反应。
因为不能将沉淀从那些块中除去来分析其组成，所以洗涤、干燥并经由扫描电子显微镜(SEM)和X射线能谱仪(EDX)分析在相似条件下通过在无任何块的情况下温育3ml的150mM的磷酸钠缓冲液由浑浊介质形成的沉淀。结果发现沉淀包含钙、磷酸根和氧并包括两种不同形貌的磷酸钙，一种为钙：磷酸根的摩尔比为1：1的晶体(边缘尖锐的薄片)，而另一种为比例为4:3的隐晶质或非晶质(微粒凝聚体)。两种结构类型展现出与羟基磷灰石不等的Ca：P摩尔比，这表明两个相都可以被描述为羟基磷灰石的前体。实际上所有基于正磷酸钙的盐都将在人体正常条件的约37℃温度的pH约7的水性介质中转变为在所有正磷酸钙盐中热力学最稳定的羟基磷灰石。
这些实验显示，在根据本发明的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料(其含有比现有技术的已知亲水性骨骼置换材料显著更低量的润湿剂)中，磷酸根基团HPO4 2-和H2PO4 -与体液中的钙离子反应而在生物材料的表面上形成沉淀，该沉淀具有羟基磷灰石前体的特征。
上述体外实验提供了有力指证：在体内，如在天然系统中那样，骨骼矿物生成物的成核和生长将发生在胶原基质上，生理流体中释放的磷酸根基团参与了这些反应。
Claims (15)
1.天然来源的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，基本上所有的非胶原有机材料被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，其特征在于，所述骨骼置换材料含有0.05w/w％～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种和0.7w/w％～5.6w/w％的选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团，该磷酸根基团是生理上可接受的盐的一部分。
2.如权利要求1所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其含有1.0w/w％～2.8w/w％的选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团。
3.如权利要求1或2所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，所述生理上可接受的盐，即磷酸盐，包含选自Na+、K+、Ca2+和Mg2+的组中的阳离子。
4.如权利要求1或2所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，所述生理上可接受的盐是磷酸钠缓冲盐。
5.如权利要求1～4中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，所述糖醇是山梨糖醇。
6.如权利要求1～4中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其中，所述糖是葡萄糖。
7.如权利要求1～6中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其特征在于，其含有山梨糖醇和磷酸钠缓冲盐。
8.如权利要求1～7中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其特征在于，其来源于牛、猪或马。
9.如权利要求1～7中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其特征在于，其还含有药用活性剂。
10.如权利要求1～7中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其为块形式。
11.如权利要求1～10中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料，其在与含有钙离子的生理流体类似的介质中温育时涉及磷酸根基团与那些钙离子的反应从而在胶原基质上产生磷酸钙沉淀，那些磷酸钙具有羟基磷灰石前体的特征。
12.制备权利要求1～10中任一项所述的亲水性脱水且部分纯化的骨骼置换材料的方法，其包括以下步骤：
(a)通过首先用有机溶剂提取脂质、然后用含有离液剂的溶液处理脱脂的材料和用水进行彻底洗涤来提供天然来源的部分纯化的骨骼置换材料，
(b)将天然来源的脱水且部分纯化的骨骼置换材料浸泡在含有向部分纯化的骨骼置换材料提供亲水性的0.05w/w％～0.85w/w％的糖或糖醇中的至少一种和10mM～1000mM的选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组中的磷酸根基团的溶液中，该磷酸根基团是包含选自Na+、K+、Ca2+和Mg2+的组中的阳离子的生理上可接受的盐的一部分，
(c)将经浸泡的亲水性部分纯化的骨骼置换材料冻干，从而进行脱水，和
(d)将亲水性部分纯化的冻干骨骼置换材料灭菌。
13.如权利要求12所述的方法，其中，步骤(b)中使用的溶液含有75mM～600mM、优选100mM～200mM的pH 7.0的磷酸钠缓冲液。
14.如权利要求12所述的方法，其包含对步骤(a)结束时获得的天然来源的部分纯化的骨骼置换材料进行的进一步的中间脱水步骤，以破坏胶原结构和引起胶原纤维的取向的改变。
15.0.7重量％～5.6重量％的磷酸根基团在用于增强天然来源的部分纯化的骨骼置换材料的新骨骼形成能力中的应用，所述磷酸根基团易于与生理流体的钙离子反应而产生羟基磷灰石前体，并且选自由磷酸根HPO4 2-和H2PO4 -组成的组，使所述骨骼置换材料中基本上所有的非胶原有机物被除去，而天然骨骼的无机、多孔骨结构和胶原结构基本上被保留，所述骨骼置换材料含有0.05w/w％～1.5w/w％的糖或糖醇中的至少一种。
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