KR20150067135A

KR20150067135A - 친수성 포스페이트기 함유 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질

Info

Publication number: KR20150067135A
Application number: KR1020157005214A
Authority: KR
Inventors: 코르넬 임호프; 로타르 슐뢰써; 비르기트 쉐퍼; 미하엘 부플러
Original assignee: 가이스틀리히 파마 아게
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2013-07-29
Publication date: 2015-06-17
Also published as: CN104640577A; HK1206285A1; EP2879726B1; CA2880745C; JP5879459B2; JP2015527125A; BR112015002121B1; AU2013298956B2; PT2879726E; US20150182556A1; RU2015106808A; RU2642250C2; WO2014019672A1; CN104640577B; AU2013298956A1; CA2880745A1; EP2879726A1; PL2879726T3; DK2879726T3; BR112015002121A2

Abstract

본 발명은 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되며, 상기 뼈 대체 물질이 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w %, 및 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스페이트기를 0.7 내지 5.6 w/w % 함유하고, 이 포스페이트기가 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 것을 특징으로 하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질, 및 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 제조 방법을 제공한다.

Description

친수성 포스페이트기 함유 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질 {HYDROPHILIC PHOSPHATE GROUP CONTAINING DEHYDRATED PARTIALLY PURIFIED BONE REPLACEMENT MATERIAL}

본 발명은 한정된 등장액 흡인 능력을 갖고 히드록시아파타이트의 전구체로서 작용하는 경향이 있는 포스페이트기를 함유하는 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질, 및 상기 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 제조 방법에 관한 것이다.

골 결함 부위는 감염, 질병, 트라우마, 발달중인 기형, 악성 종양, 수술 또는 기타 요인에 의해 생성될 수 있다. 종종, 예컨대 병에 걸린 턱을 증대시키기 위해, 특정 크기의 뼈 부피를 생성할 필요가 있다. 이러한 경우에, 추가적으로 안정화될 수 있는 고체 이식편이 사용되는 것이 바람직하다. 신연 (distracted) 분절과 주위 뼈 사이에서 움직임이 없거나 매우 제한되는 경우에 한해서만 치유가 자연적으로 이루어지기 때문에 미립자 형태의 충전 재료는 작은 공동에 한정된다.

천연 또는 합성 기원의 충전 재료 또는 이식편의 이용 등, 병에 걸리거나 없어진 부분을 대체하기 위한 여러 기법이 알려져 있다. 뼈는 그의 본연의 구조로 인해 매우 다공성이다. 대체로, 뼈 대체 물질은 인간 뼈의 화학물질 및 미세구조를 모방하려 한다. 물질의 결정성, 용해성, 입자 크기, 다공성, 세공 구조 및 세공 크기 등 특정 물리화학적 파라미터는 중요한 핵심이며, 뼈 상용성 및 뼈 통합에 큰 영향을 미칠 수 있다. 상기 파라미터의 부적절한 조합은 뼈 치유 실패를 유발한다. 세공 크기는 세포 성장 및 증식, 혈관신생, 및/또는 세포-접착 과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이러한 발견과 관련하여, 천연 기원의 뼈 대체 물질이 합성 물질에 비해 일부 중요한 이점을 갖는 점이 부각될 수 있다. 자생 뼈가 대표적인 것으로서 널리 고려되고 있지만, 이의 응용은 여러 결점을 지니며 자생 및 타생 뼈 모두 제한된 양으로만 이용가능하다.

최근에는, 동물 뼈의 생체역학적 특성을 보존하면서 동시에 동물 기원의 뼈 대체 물질의 개발에 대한 엄격한 규제의 생물학적 및 화학적-물리적 요건을 만족시키는데 관심이 집중되고 있다.

시판되는 뼈 대체 물질은 소의 해면질 뼈 블록인 TUTOBONE® (Tutogen Medical 에서 판매중) 이다. 이것은 천연의 기계적 강도가 크게 유지되는 탈수화된 부분 정제 뼈 이식조직이다.

미국 특허 제 6,942,961 호에는 TUTOBONE® 등 뼈 구조가 보존되어 있는 이식조직을 제조하기 위한 생물 조직의 2-단계 탈수 방법이 기재되어 있다. 첫번째 단계에서는, 유기, 수-혼화성 용매를 이용해 조직을 부분 탈수한다. 두번째 단계에서는, 그 조직을 냉동 건조함으로써 추가 탈수한다.

TUTOBONE® 는, 보존된 뼈 구조 및 기계적 강도를 갖는 기타 시판되는 동물 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질과 마찬가지로, 친수성 및 뼈 통합 특성을 만족시키지 않는다. 친수성이 낮은 시판되는 동물 기원의 뼈 블록을 극복하기 위해, 수술의는 수술 중에 또는 수술 전에 뼈 블록을 생리 식염수로 헹구어야 한다. 이와 같은 뼈 블록은 예컨대 빈 시린지 안에 넣어 적셔지고 생리 식염수로 수회 헹구어져야 한다. 이것은 시간 소모성이며 수술 또는 병원 환경에서 실용적이지 않다. 그 외에도, 이렇게 처리된 뼈 블록이 완전히 적셔지고 공기 방울을 함유하지 않는다는 것이 보장될 수 없다. 그러한 공기 방울은 뼈 대체 물질의 신속한 통합을 막을 수 있다. 공기-뼈 계면에서는, 성장이나 재생이 가능하지 않다. 주위의 살아있는 조직과 뼈 대체 물질 간의 직접적인 구조적 및 기능적 연결이 충분하지 않다. 환자의 혈액, 혈액 성분, 및 세포가 이식 후 신속하게 이식편 물질을 통합시켜야만 한다.

따라서, 용이하게 적셔지고 재수화될 정도로 충분한 친수성을 갖는 보존된 뼈 구조 및 기계적 강도를 갖는 동물 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질에 대한 요구가 존재한다.

미국 특허 제 6,293,970 호 및 US2010/0030340 에는 하나 이상의 가소제로 함침되는 세정된 (즉, 부분 정제된) 비-탈염된 하중-지지성 (load-bearing) 뼈 이식편을 포함하는 가소화된 하중-지지성 뼈 이식편이 개시되어 있으며, 상기 가소제는 특히 당류, 예컨대 글루코오스, 수크로오스 및 D-갈락토오스, 및 C₂ 내지 C₇ 폴리올, 예컨대 글리세롤, 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, 만니톨 및 자일리톨이고, 뼈 이식편은 "공여자, 예컨대 인간 또는 동물 및/또는 시체 공여자로부터 얻어진 임의의 뼈 또는 그 조각" 이다. 용어 "가소화된" 란 본원에서 뼈 조직 내의 자유롭고 느슨하게 결합된 수화 수가 콜라겐 섬유의 배향 및 연관된 미네랄 상을 변경하지 않으면서 가소제로 대체되고, 이에 의해 천연 뼈의 구조적 및 기계적 특성을 보존하는 것을 의미한다. 상기 가소제는 뼈 이식편을 안정화하여 따라서 보관 도중, 이식 도중 또는 이식 후에 골절 또는 미세골절 발생 또는 증식을 방지하고 질병 전이 위험을 방지하는데 이용되는 것이 교시되어 있다. 습윤제로서 가소제를 이용하는 것에 대해서는 언급이 없으며, 뼈 이식편의 친수성의 문제는 상기 문헌에서는 전혀 다루고 있지 않다. 미국 특허 제 6,293,970 호에는, 가소제는 뼈의 3 w/w % 내지 30 w/w % 로 이용되며, "이식편의 즉석 표면과 회합된 가소제" 를 제거하기 위해 멸균 등장 식염수 중에서 간단히 세척하거나, 또는 "가능한 많은 가소제" 를 제거하기 위해 등장 식염수로 광범위 세정 (약 1 시간) 함에 따라, 뼈 이식편을 환자에 직접 이식하는 것이 가능하다고 개시되어 있다 (특히 칼럼 8, 라인 14-62 및 칼럼 12, 라인 10-27 참조). US2010/0030340 에는, 재수화 없이 가소화된 이식편을 이식하거나, 또는 이식 전 멸균 등장 식염수 중에서 이식조직편을 재빨리 헹구어 (특히 [0035] 및 [0126] 참조), 이에 의해 미국 특허 제 6293970 호에서와 같이 이식편의 외부 표면과 회합된 가소제만을 제거하는 것 중 하나를 선택하여, 70% (v/v) 초과의 가소제를 함유하는 가소화 조성물을 이용하여, 가소제가 "최소량" (여기서는 뼈 조직 내 수화 수를 대체하는 최소량을 의미함) 으로 이용되는 것이 개시되어 있다.

상기 미국 특허 문헌들에서는, 가소제가 콜라겐 섬유의 배향 및 연관된 미네랄 상을 변화시키지 않으면서 천연 수화 수를 대체한다: 즉 뼈 이식편의 구조 내에 매립되어, 따라서 이식 전에 멸균 등장 식염수로 헹굼으로써 제거하는 것은 곤란하다. 등장 식염수로 재빨리 헹군 후, 가소화된 부분 정제 물질에 잔존하는 유효량의 가소제는 평가가 곤란하다: 아마도, 가소제는 대체된 천연 수화 수에 비해 과량이 아닌 경우, 대부분의 존재하는 가소제는 가소화된 부분 정제 물질에 잔존한다. 생체내에서, 가소제는 오직 생리체액에 의해서만 천천히 세정해 버릴 수 있다.

자신의 체내에 도입된 외부 몸체인, 뼈 대체 물질을 용인하지 못할 가능성이 있는 환자는, 특히 뼈 대체 물질이 비생리학적 물질인 가소제 또는 습윤제 등 첨가제를 대량 함유하고 있을 경우, 언제나 임상적 이식에 있어 잠재적인 문제가 존재한다.

본 발명의 목적은 용이하게 적셔지고 수화되는 경향이 있는 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 종래 기술의 뼈 대체 물질, 특히 미국 특허 제 6,942,961 호의 것 (TUTOBONE®) 및 미국 특허 제 6,293,970 호 및 US2010/0030340 의 것의 결점을 갖지 않고, 뼈 대체 물질의 뼈대 내부에서 새로운 뼈 형성 능력의 향상을 보이는 뼈 대체 물질을 제공하는 것이다.

상기 목적은 첨부된 청구범위에 한정된 바와 같은 본 발명에 의해 달성된다.

발명의 개요

본 발명은 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되는, 친수성 및 뼈 통합이 증가된 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w %, 및 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기를 0.7 내지 5.6 w/w % 함유하고, 이 포스페이트기가 인산나트륨 버퍼인 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 제공한다.

본 발명은 또한 증가된 친수성 및 뼈 통합을 갖는 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 제조 방법을 제공한다.

등장액 흡인 시험에 의해 나타난 바와 같이 (특히 실시예 3 및 도 1a 및 1b 참조), 본 발명의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 친수성이며 따라서 공기 방울 형성 위험 없이 주위 조직 내로 즉시 통합되는 경향이 있다. 저 함량의 당류 또는 당 알코올, 비-생리학적 물질 덕분에, 인체 기능을 최소한으로 교란시키며 따라서 환자에 의해 최적으로 용인될 것이다.

칼슘 이온을 함유하는 생리체액과 유사한 배지 중에서 본 발명의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 블록을 인큐베이션하는 시험관내 실험에 의해 나타난 바와 같이 (특히 실시예 4 및 도 2 참조), 포스페이트기는 칼슘 이온과 반응하여 블록의 콜라겐 피브릴 상에 인산칼슘의 백색 침전물을 형성하며, 이들 인산칼슘은 히드록시아파타이트의 전구체이다. 이것은 생체내에서, 자연계에서와 같이 (S. Gajjeraman et al. 2007 The Journal of Biological Chemistry 282, 2, pp. 1 193-1204 및 S. Bodhak et al. 2009 Acta Biomaterialia 5, pp. 2178-2188 참조), 뼈 미네랄 생성물의 핵형성 및 성장이 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 콜라겐 매트릭스 상에서 일어나며, 이때 포스페이트기가 이 과정에서 역할을 담당한다는 것을 보여준다.

따라서 포스페이트기는 뼈 형성 촉진에 있어 중요한 역할을 담당한다. 각종 동물, 특히 래트 및 개에서의 이식시, 본 발명의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 부정적인 조직병리학적 사건 (염증 또는 이물 반응) 이 없거나 매우 드문 우수한 새로운 뼈 형성 능력을 나타낸다.

도 1a 는 본 발명에 따른 0.35 % w/w 소르비톨 및 1.4 % w/w 의 (HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^-) 를 함유하는 말 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 8 개의 상이한 블록, 종래 기술에 따른 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 3 개의 상이한 블록, 및 시판되는 소 뼈 대용 물질 TUTOBONE® (Tutogen Medical GmbH) 에 대하여 시간에 따른 등장액 흡인 능력 (액체 흡수, mg) 의 비교를 나타낸다.
도 1b 는 본 발명에 따른 0.35 % w/w 소르비톨 및 1.4 % w/w 의 (HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^-) 를 함유하는 말 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 8 개의 상이한 블록에 대하여 시간에 따른 상대적인 등장액 흡인 능력 (액체 흡수와 탈수화된 블록 간의 w/w 비, % 로 나타냄) 을, 종래 기술에 따른 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 3 개의 상이한 블록, 및 시판되는 소 뼈 대용 물질 TUTOBONE® (Tutogen Medical GmbH) 과 비교하여 나타낸다.
도 2 는 10% FCS (소 태아 혈청) 를 함유하는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지) 중에서의 인큐베이션 후, 본 발명에 따른 0.35 % w/w 소르비톨 및 1.4 % w/w 의 (HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^-) 를 함유하는 말 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 블록 표면의 SEM (주사 전자 현미경) 사진을 나타낸다.
도 3 은 한 구현예에 따른 뼈 블록을 개략적으로 예시한 것이다.
도 4 는 한 구현예에 따른 뼈 핀 (pin) 을 개략적으로 예시한 것이다.
도 5 는 한 구현예에 따른 뼈 플레이트를 개략적으로 예시한 것이다.
도 6 은 한 구현예에 따른 뼈 테이퍼 키 (tapered key) 를 개략적으로 예시한 것이다.
도 7 은 한 구현예에 따른 뼈 바 (bar) 를 개략적으로 예시한 것이다.
도 8 은 한 구현예에 따른 뼈 과립을 개략적으로 예시한 것이다.

본 발명은 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되며, 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w %, 및 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기를 0.7 내지 5.6 w/w % 함유하고, 이 포스페이트기가 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 제공한다.

본 발명에 따르면, "천연 기원" 이라는 용어는 임의의 뼈 대체 물질, 즉 인간, 소, 말, 돼지 등과 같은 모든 종류의 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 척추 동물로부터 유래된 뼈 또는 뼈-유사 물질, 및 산호 등 무척추 동물로부터 유래된 임의의 뼈 또는 뼈-유사 물질을 말한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 목적을 위해서는 소, 돼지 또는 말의 뼈가 사용된다.

용어 "부분 정제 뼈 대체 물질" 이란 실질적으로 모든 유기 비-콜라겐성 물질이 제거되는 한편 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되는 임의의 뼈 대체 물질을 말한다.

용어 "친수성" 이란 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질이 물에 의해 적셔질 수 있어서, 따라서 등장액 또는 생리체액을 흡수시킴으로써 용이하게 재수화될 수 있으며, 즉 이식시에 공기 방울 형성 위험을 나타내지 않는 것을 의미한다.

용어 "당류" 는 특히 헥소오스, 예컨대 글루코오스, 만노오스 또는 갈락토오스; 펜토오스, 예컨대 리보오스 또는 아라비노오스; 케토오스, 예컨대 리불로오소 또는 프럭토오스; 이당류, 예컨대 수크로오스, 락토오스 또는 말토오스, 올리고당류, 예컨대 시클로덱스트린을 포함한다. 상기 당류는 D-형 또는 L-형으로 제시될 수 있다. 특정 구현예는 글루코오스를 이용한다.

본 발명에 포함되는 당 알코올은 특히 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 만니톨 및 자일리톨이다. 특정 구현예는 소르비톨을 이용한다.

용어 "생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기" 란 생리체액의 칼슘 이온과의 반응에 의해 인체 내에서, 특히 혈액에서, 바람직하게는 6.0 내지 8.0 의 pH 및 36 내지 38 ℃ 의 온도에서, 열역학적으로 가장 안정적이고 가용성이 덜한 뼈의 필수 성분인 인산칼슘 염, 히드록시아파타이트 Ca₁₀(P0₄)₆(OH)₂ 의 전구체를 생성하기 쉬운 임의의 포스페이트기를 의미한다.

이와 같은 포스페이트기의 예는 P0₄ ^3-, HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 이다.

포스페이트기는 바람직하게는 포스페이트 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택된다.

포스페이트기를 함유하는 생리학적으로 허용가능한 염은 일반적으로 생리체액의 pH 밸런스를 실질적으로 교란시키기 않는 Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ 및 Sr²⁺ 등의 생리학적으로 허용가능한 양이온을 갖는 포스페이트 염이다.

이와 같은 생리학적으로 허용가능함 염의 예로는 다음을 들 수 있다:

Na₃P0₄, Na₂HP0₄, K₂HP0₄, NaH₂P0₄, KH₂P0₄, Ca₃(P0₄)₂, CaHP0₄

Ca₈(HP0₄)₂(P0₄)₄, 그 수화물, 및 그 혼합물.

통상적으로, 생리학적으로 허용가능함 염 포스페이트 염은 Na⁺, K⁺, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 의 군으로부터 선택되는 양이온을 포함한다.

한 구현예에서 인산나트륨 버퍼가 생리학적으로 허용가능한 염으로서 사용되면, 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기는 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 이 된다.

상기 물질에 포함된 포스페이트기는, 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있으며 바람직하게는 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로서, 뼈 형성을 촉진하는데 있어 중요한 역할을 담당한다.

시험관 내에서, 본 발명의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 블록을 칼슘 이온을 함유한 생리체액과 유사한 배지, 소위 10% FCS (소 태아 혈청) 를 함유하는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지) 중에서 인큐베이션 후, 포스페이트기는 칼슘 이온과 반응하여 SEM 분석에 의해 보여질 수 있는 콜라겐 피브릴 상의 탄산칼슘의 백색 침전물을 형성하는 것으로 나타났다 (도 2 참조). 상기 침전물은 상이한 모폴로지의 2 가지 유형의 인산칼슘을 함유하는 것으로 나타났으며, 그 둘 모두 히드록시아파타이트의 전구체로서 설명될 수 있다.

이들은 시험관내 실험 (실시예 4 참조) 에 있어서, 생체내에서, 자연계에서와 같이 (S. Gajjeraman et al. 2007 The Journal of Biological Chemistry 282, 2, pp. 1 193-1204 및 S. Bodhak et al. 2009 Acta Biomaterialia 5, pp. 2178-2188 참조), 뼈 미네랄 생성물의 핵형성 및 성장은 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 콜라겐 매트릭스 상에서 일어날 것이며, 그에 함유된 포스페이트기 (생리체액에 방출됨) 가 상기 반응에서 역할을 한다는 것을 강하게 시사한다. 저함량의 비생리학적 물질을 고려할 때, 본 발명의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 따라서 이식시에 자연계를 모방하는 입장일 것이며, 상기 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로부터 방출된 포스페이트는 미네랄 생성물의 핵형성 및 성장 과정을 시작함으로써 뼈 형성에 대한 초기 상승을 제공할 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 칼슘 이온을 함유하는 생리체액과 유사한 배지 중에서 인큐베이션할 때, 포스페이트기와 칼슘 이온과의 반응에 의해 콜라겐 매트릭스 상에서 인산칼슘의 침전물을 생성하는 것을 포함하며, 상기 인산칼슘이 히드록시아파타이트의 전구체의 특징을 갖는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질에 관한 것이다.

각종 동물, 특히 래트 및 개에서 이식시에, 본 발명의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 부정적인 조직병리학적 사건 (염증 또는 이물 반응) 이 없거나 매우 드문 우수한 새로운 뼈 형성 능력을 나타내었다.

이 새로운 뼈 형성 능력은 특히 [Chai YC et al., 2011, Tissue Engineering Part A, 17, 1083-97 "Probing the osteoinductive effect of calcium phosphate by using an in vitro biomimetic model"] 의 교시내용과 일맥 상통한다. 상기 저자는 특히 인산칼슘이 간엽 줄기 세포를 골아세포 혈통으로 이끄는 것을 제시하였는데, 아마도 이것이 골 형성을 개선시키는 것으로 생각된다. 또한, [Sogo Y et al., 2007, 2, 116-23] 은 과포화된 인산칼슘 용액 중의 콜라겐과의 인산칼슘의 공동침전 및 그의 간엽 줄기 세포에 대한 영향, 즉 뼈형성 분화를 증강시키는 영향을 교시하고 있다.

본 발명자는 예기치 않게 하기 내용을 발견하였다.

골 형성을 촉진시키는 역할을 하는 입장에서, 포스페이트기는 충분량으로, 통상 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 적어도 0.7 w/w %, 바람직하게는 적어도 1.0 w/w % 로 함유되어야 한다.

포스페이트기는 생리체액 중에 과잉으로 방출될 때 인산칼슘의 대량 침전을 야기하여, 부정적인 염증 반응을 일으킬 가능성이 있다. 이와 같은 반응은 포스페이트기가 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 5.6 w/w %, 바람직하게는 2.8 w/w % 이하인 경우에는 일어나지 않는다.

본 발명의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 따라서 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기를 0.7 내지 5.6 w/w %, 바람직하게는 1.0 내지 2.8 w/w % 함유한다.

본 발명은 또한, 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질의 새로운 뼈 형성 능력을 증강시키기 위한, 바람직하게는 포스페이트 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 0.7 내지 5.6 w/w % 의 포스페이트기의 용도로서, 이때 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되고, 부정적인 조직병리학적 사건 (염증 또는 이물 반응) 이 없거나 매우 드문 포스페이트기의 용도에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 글루코오스 및 인산나트륨 버퍼로 코팅된다.

특정 구현예에서, 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 소르비톨 및 인산나트륨 버퍼로 코팅된다.

특정 구현예에서, 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 하나 이상의 약학적 활성제를 추가로 함유한다.

적합한 약학적 활성제의 예는 타우롤리딘, 살바이러스제, 살균제, 항생제, 아미노산, 펩티드, 단백질, 비타민, 단백질 합성의 공동 인자, 호르몬, 줄기 세포 포함 살아있는 세포, 효소, 항원 제제, 항종양제, 면역억제약 및 성장 인자이다.

탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은, 비제한적으로 블록 (10) (도 3), 핀 (볼트) (12) (도 4), 플레이트 (14) (도 5), 테이퍼 키 또는 스트립 (16) (U.K. 에서는 "코터 (cotter)" 라고 함, 도 6), 바 (18) (도 7), 또는 뼈 과립 (20) (도 8) 등을 포함하는 임의 형상을 가질 수 있다.

제 1 구현예에서, 구조는 도 3 에 제시된 바와 같은 블록 (10) 이고, 제 2 구현예에서는, 도 6 에 제시된 바와 같은 스트립이고, 제 3 구현예에서는 도 8 에 제시된 바와 같은 과립이다.

본 발명은 추가로 리모델링 이식조직으로서의 본원에 기재된 바와 같은 뼈 대체 물질의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질에 친수성 특성을 부여하는 0.05 내지 1.5, 바람직하게는 0.05 내지 0.8, 특히 0.05 내지 0.5 w/w % 의 당류 또는 당 알코올 중 적어도 하나의 용도로서, 이때 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되는 용도에 관한 것이다.

친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 제조

본 발명의 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 하기를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

(a) 우선 지질을 유기 용매로 추출하고, 탈지 물질을 카오트로픽제 (chaotropic agent) 를 함유하는 용액으로 처리하고, 광범위한 물 세정을 실시함으로써, 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질을 제공하는 것,

(b) 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 0.85 w/w % - 이에 의해 부분 정제 뼈 대체 물질에 친수성을 제공함 -, 및 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 포스페이트기를 10 내지 1000 mM 함유하는 용액에 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질을 침지시키는 것으로서, 이 포스페이트기가 Na₃P0₄, Na₂HP0₄, K₂HP0₄, NaH₂P0₄, KH₂P0₄, Ca₃(P0₄)₂, CaHP0₄ Ca₈(HP0₄)₂(P0₄)₄, 그 수화물, 및 그 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 것,

(c) 침지된 친수성의 부분 정제 뼈 대체 물질을 냉동 건조하며, 이에 의해 탈수를 실시하는 것, 및

(d) 친수성의 탈수화된 부분 정제된 냉동 건조 뼈 대체 물질을 멸균시키는 것.

단계 (a) 에서의 지질 추출에 사용되는 유기 용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 헥산, 시클로헥산, 아세톤 및/또는 톨루엔을 들 수 있다.

상기 단계 (a) 에서 사용된 카오트로픽제는, 예를 들어, 우레아, 티오우레아, 구아니딘 HCl, 구아니딘 티오시아네이트, 아미노구아니딘 HCl, 아미노구아니딘 바이카르보네이트, 구아니딘 카르보네이트, 구아니딘 포스페이트, 또는 그 혼합물을 포함한다.

한 구현예에서, 천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질은 이하의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:

(a) 우선 지질을 유기 용매로 추출하고, 탈지 물질을 카오트로픽제를 함유하는 용액으로 처리하고, 광범위한 물 세정을 실시함으로써, 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질을 제공하는 것,

(b) 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 0.85 w/w % - 이에 의해 부분 정제 뼈 대체 물질에 친수성을 제공함 -, 및 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스페이트기를 10 내지 1000 mM 함유하는 용액에 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 침지시키는 것으로서, 이 포스페이트기가 Na⁺, K⁺, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 의 군으로부터 선택되는 양이온을 포함하는 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 것,

(d) 친수성의 부분 정제된 냉동 건조 뼈 대체 물질을 멸균시키는 것.

한 구현예에서, 단계 (b) 에서 사용된 용액은 pH 7.0 의 인산나트륨 버퍼를 75 - 600 mM, 특히 100 - 200 mM 함유한다.

상기 방법은 또한, 콜라겐 구조를 파괴하고 콜라겐 섬유의 배향의 변경을 야기하기 위한 것 등의, 단계 (a) 도중에서 수득된 천연 기원의 탈지된 뼈 대체 물질, 또는 단계 (a) 의 종료시 수득된 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질 중 하나에 대해 실시된 추가의 중간 탈수 단계를 포함할 수 있다.

상기 중간 탈수 단계는 통상 0 ℃ 초과, 예컨대 5 내지 50 ℃, 특히 10 내지 40 ℃ 의 온도에서 진공-건조함으로써, 또는 물질에 질소 등의 불활성 기체를 격렬히 불어 넣음으로써 수행된다. 냉동 건조는, 냉동에 의한 뼈 연조직의 고정이 콜라겐 구조의 현저한 파괴 없이 천연 뼈의 폐쇄 구조를 본질적으로 유지시키기 때문에 여기서는 적절하지 않다.

탈수 단계 전후 물질의 주사 전자 현미경 사진을 찍어, 물질이 그 단계 후, 콜라겐 섬유의 배향 변경에 상응하는, 이전보다 더 개방되고 파괴되고 불규칙한 구조의 콜라겐을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다. 상기 콜라겐 구조의 파괴는 단계 (a) 의 종료시 수득된 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질에 대해 중간 탈수 단계를 수행하는 경우에 있어서 특히 자명하다.

바람직하게는 추가의 중간 탈수 단계는, 콜라겐 구조를 파괴하고 콜라겐 섬유의 배향의 변경을 야기하기 위한 것 등의, 단계 (a) 의 종료시에 수득된 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질에 대하여 0 ℃ 초과의 온도에서 수행된 진공-건조 단계이다.

본 발명은 추가로 상기 방법에 의해 제조된 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질에 관한 것이다.

탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 친수성 및 뼈 통합

뼈 통합, 즉 주위의 살아있는 숙주 조직과 이식 물질의 직접적인 물리적 연결은, 뼈 치유의 성공을 크게 높일 수 있다. 친수성은 동물 기원의 뼈 대체 물질의 경우 뼈 통합에 영향을 미치는 주요 요인이다. 물질의 친수성이 높을 수록, 주위 조직과 이식 물질의 물리적 연결은 더 양호하고 더 빠르다. 친수성 및 뼈 통합의 측정 또는 정량화에 대하여 일반적으로 허용되는 방법은 존재하지 않는다. 뼈 통합의 간접 측정은 이식편의 등장액 흡인 능력을 검출하는 것이다.

탈수화된 부분 정제 뼈 물질의 등장액 흡인 능력은 물질이 그 내부 구조에 등장액을 흡수시키는 특성이다. 상기 특성은 뼈 물질의 세공 구조, 습윤성 및 모세관현상에 따라 달라지며, 뼈 통합, 즉 이식 물질과 주위 살아있는 숙주 조직의 직접적인 물리적 연결의 좋은 지표가 되며, 뼈 치유 성공에 있어서 중요한 역할을 한다.

고체 뼈 대체 물질의 블록의 등장액 흡인 능력을 측정하기 위해, 이하의 방법이 이용되었다: 실험실 정밀 측정 저울 위에서, 한정량의 등장성 PBS (인산 완충 식염수) 용액을 디쉬 안에 넣었다. 탈수화된 뼈 대체 물질의 한 블록의 한정량을 저울 옆의 높이 조절가능한 고정 장치에서 클램핑하였다. 이후, 뼈 대체 물질 블록이 디쉬 안의 수성액 표면과 바로 접하도록 장치의 높이를 조절하였다. 측정 전반에 걸쳐 액체의 표면과의 거리가 일정하게 유지되도록 장치 높이를 고정하였다. 친수성의 뼈 대체 물질의 블록 안에, 액체를 흡수시키고, 액체 흡수량은 시간에 따라 저울을 이용해 검지하였다.

탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 등장액 흡인 능력을 흡수된 등장액의 질량으로서 정의하였다. 상대적 등장성 흡인 능력은 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 질량 단위 당 등장액 흡인 능력으로서 정의하였다.

놀랍게도, 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상으로, 및 생리학적으로 허용되는 염으로 코팅하여, 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w % 함유하도록 하면, 등장액 흡인 능력을 엄청나게 향상시킨다는 것이 발견되었다.

이와 같이 처리된 뼈 대체 물질의 상대적 등장액 흡인 능력은 5 분 이내 50% 이상이지만, 5 분 이내 100% 이상 또는 심지어 5 분 이내 200% 이상일 수도 있다.

특정 구현예에서는, 전체 액체 흡수의 50% 가 약 2 분 미만 이내에 또는 심지어 약 1 분 미만 이내에 도달되는 것이 발견되었다.

특정 구현예에서, 이와 같이 유익한 등장액 흡인 능력은 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 소량의 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상으로 코팅하여, 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 0.8 w/w %, 또는 심지어 0.05 내지 0.5 w/w % 함유하도록 함으로써 달성될 수 있다.

이러한 발견은 특히 다음과 같은 기본적인 이점과 연관된다:

- 주위 조직과 이식편의 실질적으로 즉각적인 통합;

- 수술의는 뼈 대체 물질을 사용 전에 전처리할 필요가 없으며, 따라서 물질 오염 위험성의 감소가 도모됨;

- 생리체액으로 세정해 버려지도록 고안된 비생리학적 물질인, 당류 또는 당 알코올이 최소로 유지되며, 따라서 신체 기능이 최소한으로 교란되고 이식된 친수성의 뼈 물질이 환자에 의해 최적으로 용인될 것임;

- 종래 기법보다 더 개선되고 더 빠른 치유 결과.

이하의 실시예는 본 발명을 예시하지만 그 범위를 제한하지는 않는다.

실시예 1 1.5 w/w % 의 글루코오스 및 1.4 w/w % 의 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 말 기원의 해면질 뼈의 탈수화된 부분 정제 블록의 제조

말 기원의 해면질 뼈를 12 X 12 X 5 mm 블록으로 절단하였다.

상기 블록에 대해 이하의 단계를 수행하였다: 물 및/또는 유기 용매, 예컨대 아세톤 또는 알코올 (예컨대 에탄올) 을 이용한 선택적인 세정 단계, 수산화나트륨 및/또는 과산화수소를 이용한 바이러스 탈활성화 단계, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 헥산, 시클로헥산, 아세톤, 또는 톨루엔 등의 유기 용매에 의한 탈지질화, 및 이후 4 ℃ 내지 35 ℃ 의 온도에서 카오트로픽 염, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 용액을 이용한 세정 단계. 수득한 블록을 물로 철저히 헹구고, 최종적으로 진공 건조하였다.

주사 전자 현미경에 의한 상기 블록의 관찰에 의해, 고유의 콜라겐 구조가 실질적으로 보존됨을 확인하였다. 반정량적 2D SDS-PAGE 를 비롯한 상기 블록의 각종 기법에 의한 분석에 의해, 콜라겐 이외의 추출가능한 단백질이 1% 미만 존재함을 확인하였다.

이후, 상기 블록을 3 시간 동안 실온에서 (탈염수 중에 NaH₂PO₄ 를 용해시키고 수산화나트륨을 이용해 pH 를 조절함으로써 제조된) pH 7.0 의 인산나트륨 버퍼를 200 mM 함유하는 0.86 w/w % 글루코오스 용액에 침지시키고, 핀셋으로 수용액에서 빼내고, 이후 냉동 건조하고 감마 조사를 이용해 멸균시켰다. 수득한 블록은 약 1.5 w/w % 의 글루코오스 및 1.87 w/w % 의 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 것으로 나타났다.

실시예 2 0.35 w/w % 의 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 말 기원의 해면질 뼈의 탈수화된 부분 정제 블록의 제조

말 기원의 해면질 뼈를 10 X 10 X 5 mm 블록으로 절단하였다.

이후, 상기 블록을 2 시간 동안 실온에서 (탈염수 중에 NaH₂PO₄ 를 용해시키고 수산화나트륨을 이용해 pH 를 조절함으로써 제조된) pH 7.0 의 인산나트륨 버퍼를 150 mM 함유하는 0.2 w/w % 소르비톨 수용액에 침지시키고, 핀셋으로 수용액에서 빼내고, 이후 냉동 건조하고 감마 조사를 이용해 멸균시켰다. 수득한 블록은 약 0.35 w/w % 의 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 것으로 나타났다.

실시예 2bis 0.35 w/w % 의 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 말 기원의 해면질 뼈의 "비-가소화된" 탈수화된 부분 정제 블록의 제조

말 기원의 해면질 뼈를 10 X 10 X 5 mm 블록으로 절단하였다.

상기 블록에 대해 이하의 단계를 수행하였다: 물 및/또는 유기 용매, 예컨대 아세톤 또는 알코올 (예컨대 에탄올) 을 이용한 선택적인 세정 단계, 수산화나트륨 및/또는 과산화수소를 이용한 바이러스 탈활성화 단계, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 헥산, 시클로헥산, 아세톤, 또는 톨루엔 등의 유기 용매에 의한 탈지질화, 및 이후 4 ℃ 내지 35 ℃ 의 온도에서 카오트로픽 염, 예컨대 우레아 또는 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 용액을 이용한 세정 단계. 수득한 블록을 물로 철저히 헹구고, 이후 20,000 Pascal 미만의 압력에서 240 분 동안 실온에서 진공 건조 단계를 실시하였다.

진공 건조 (냉동 건조에 의한 건조) 단계 이전 및 그 단계 이후에서의 주사 전자 현미경에 의한 상기 블록의 관찰에 의해, 콜라겐 구조에서의 실질적인 차이가 확인되었다: 진공 건조 단계 이후 콜라겐 구조는 콜라겐 섬유의 배향 변경에 따라 더 개방되고, 파괴되고 불규칙해졌다.

상기 블록은 따라서 "비-가소화된" 것이며, 즉 미국 특허 제 6,293,970 호 및 US2010/0030340 (앞 페이지 참조) 에서의 "가소화된" 의 정의에 해당하지 않는다.

반정량적 2D SDS-PAGE 를 비롯한 각종 기법에 의한 진공 건조 단계 이후 수득된 블록의 분석에 의해, 콜라겐 이외의 추출가능한 단백질이 1% 미만 존재함을 확인하였다.

실시예 3 본 발명에 따른 탈수화된 부분 정제 뼈 물질에 대하여 시간에 따른 등장액 흡인 능력의 측정

고체 뼈 대체 물질 블록의 등장액 흡인 능력을 측정하기 위해, 하기 방법을 이용하였다:

실험실 정밀 측정 저울 위에서, 한정량의 등장성 PBS 용액을 디쉬 안에 넣었다. 탈수화된 뼈 대체 물질의 한 블록의 한정량을 저울 옆의 높이 조절가능한 고정 장치에서 클램핑하였다. 이후, 뼈 대체 물질 블록이 디쉬 안의 수성액 표면과 바로 접하도록 장치의 높이를 조절하였다. 측정 전반에 걸쳐 액체의 표면과의 거리가 일정하게 유지되도록 장치 높이를 고정하였다. 친수성의 뼈 대체 물질의 블록 안에, 액체를 흡수시키고, 액체 흡수를 시간에 따라 저울을 이용해 검지하였다.

상기 방법을 이용하여 이하의 등장액 흡수 능력을 측정하였다:

- 실시예 2 에 기재된 바와 같이 제조한 0.35 w/w % 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는, 본 발명에 따른 말 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 8 개의 상이한 블록 (0.230 내지 0.500 g/cm³ 의 밀도를 가짐)

- 실시예 2 두번째 단락에 기재된 바와 같이 제조한 말 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 3 개의 상이한 블록 (소르비톨 또는 포스페이트 없음), 및

- 시판되는 소 대용 물질 블록 TUTOBONE® (Tutogen Medical GmbH).

그 결과는 도 1a 및 1b 에 제시되어 있다.

도 1a 는 상기 블록에 대하여 시간에 따른 등장액 흡인 능력 (액체 흡수, mg) 을 나타낸다.

도 1b 는 상기 블록에 대하여 시간에 따른 상대적 등장액 흡인 능력 (액체 흡수 및 탈수화 블록 간의 w/w 비, % 로 나타냄) 을 나타낸다.

도 1a 로부터 자명한 바와 같이:

- 0.35 % 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 의 존재는 등장액 흡인 능력을 크게 증가시키고,

- 전체 액체 흡수의 50% 초과가 2 분 미만 이내, 또는 심지어 1 분 미만 이내에 도달한다.

도 1b 로부터 자명한 바와 같이:

- 5 분에서의 상대적인 등장액 흡인 능력은 모든 블록에 대해 100% 이상이고,

- 그러나 150% 이상 (5 개 블록) 또는 심지어 200% 이상 (1 개 블록) 일 수 있다.

상기 실험을 통해 0.35 w/w % 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 를 함유하는 본 발명에 따른 탈수화된 부분 정제 뼈 물질의 블록의 높은 친수성이 확인되었다.

일련의 유사 실험에 있어서, 0.05, 0.2, 0.46, 1.14 또는 1.50 w/w % 의 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 포스페이트 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 를 함유하는 본 발명에 따른 탈수화된 부분 정제 뼈 물질의 블록들은 동일하게 높은 친수성을 가지는 것이 확인되었다 (측정된 상대적 등장액 흡수 능력은 각종 소르비톨 함량에 대해 크게 다르지 않았다).

실시예 4 본 발명에 따른 탈수화된 부분 정제 뼈 물질 표면 상의 히드록시아파타이트의 전구체일 가능성이 있는 침전물의 생리체액과 유사한 배지 중에 존재하는 칼슘 이온과의 반응에 의한 형성

- 실시예 2 에 기재된 바와 같이 제조한 0.35 w/w % 의 소르비톨 및 1.4 w/w % 의 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 를 함유하는, 본 발명에 따른 말 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질 약 150 mg 의 블록, 및

- 어떠한 블록도 포함하지 않는 (상기 블록과 동량의 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 를 함유하는) 150 mM 인산나트륨 버퍼 3 ml

를, 10% FCS (소 태아 혈청) 를 함유하는 DMEM (둘베코 변형 이글 배지) (약 65 mg/l 의 칼슘 이온의 농도를 함유하는 생리체액과 유사한 배지) 3 ml 중에서 37 ℃ 에서 72 시간 동안 인큐베이션하였다.

인산나트륨 버퍼를 인큐베이션하여 수득한 배지는 모든 인큐베이션 기간 동안 불투명하게 유지된 반면, 상기 각 블록을 인큐베이션함으로써 수득한 배지는 모든 인큐베이션 기간 동안 투명하게 유지되었다.

상기 블록을 인큐베이션 배지에서 꺼내고, 4% PFA (파라포름알데히드) 로 고정시키고, 건조하여 SEM (주사 전자 현미경) 으로 분석하였다.

상기 블록의 현미경 사진을 나타내는 도 2 를 참조한다: 침전물은 물질의 표면 위에 백색으로 도시되어 있으며, 콜라겐 피브릴은 침전물 아래의 회색조의 망상조직으로 보여질 수 있다.

배지에 존재하는 칼슘 이온과 블록의 반응을 추가로 특성화하기 위해, 배지의 Ca 농도를 블록에 의한 인큐베이션 24h 전후에 측정하였다. 인큐베이션 24h 이후 용액 중의 칼슘 이온의 양은 칼슘 이온의 초기량보다 더 낮게 측정되었으며 (약 50 mg/ml), 이는 칼슘 이온과 포스페이트기의 반응을 입증한다.

조성 분석을 위해 상기 블록으로부터 침전물을 제거하는 것이 가능하지 않기 때문에, 어떠한 블록도 갖지 않는 150 mM 인산나트륨 버퍼 3 ml 를 인큐베이션함으로써 유사한 조건 하에서 불투명한 배지로부터 형성된 침전물을, 세정하고, 건조하고, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 에너지 분산성 X 선 분광분석 (EDX) 을 통해 분석하였다. 침전물은 칼슘, 포스페이트 및 산소를 함유하였고, 상이한 모폴로지의 2 가지 유형의 인산칼슘을 포함하였으며, 그 중 하나는 칼슘:포스페이트 1:1 의 몰비를 갖는 결정성 (날카로운 모서리를 갖는 라멜라) 이고, 다른 하나는 4:3 의 비를 갖는 은미정질 또는 무정형 (미세 입자 집합체) 임을 확인하였다. 두 구조 유형은 히드록시아파타이트와 동일하지 않은 Ca:P 몰비를 나타내는데, 이는 두 상 모두 히드록시아파타이트의 전구체로서 설명될 수 있음을 시사한다. 실제로, 모든 칼슘 오르토포스페이트 기재의 염은, 인체 내에서 발견되는 보통의 조건인 약 37 ℃ 의 온도의 pH 약 7 의 수용액 중에서 모든 칼슘 오르토-포스페이트 염의 열역학적으로 가장 안정적인 형태인, 히드록시아파타이트로 변형되어야 한다.

상기 실험에 의해, 종래 기술의 공지된 친수성의 뼈 대체 물질에 비해 실질적으로 보다 적은 양의 습윤제를 함유하는, 본 발명에 따른 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질에서, 포스페이트기 HP0₄ ^2- 및 H₂P0₄ ^- 는 체액의 칼슘 이온과 반응하여 생체물질의 표면 상에 침전물을 형성하며, 이 침전물은 히드록시아파타이트의 전구체의 특징을 갖는 것이 확인된다.

상기 시험관내 실험은, 생체내에서, 자연계에서와 같이, 뼈 미네랄 생성물의 핵형성 및 성장이 콜라겐 매트릭스 상에서 일어날 것이며, 생리체액 중에 방출된 포스페이트기가 이러한 반응에 있어서 역할을 담당한다는 것을 강하게 시사한다.

Claims

천연 기원의 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질로서, 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되며, 상기 뼈 대체 물질이 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w %, 및 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스페이트기를 0.7 내지 5.6 w/w % 함유하고, 이 포스페이트기가 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 것을 특징으로 하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항에 있어서, 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스페이트기를 1.0 내지 2.8 w/w % 함유하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 염 포스페이트 염이 Na⁺, K⁺, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 의 군으로부터 선택되는 양이온을 포함하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생리학적으로 허용가능한 염이 인산나트륨 버퍼 염인 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 당 알코올이 소르비톨인 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 당류가 글루코오스인 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 소르비톨 및 인산나트륨 버퍼 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 소, 돼지 또는 말 기원인 것을 특징으로 하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 활성제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 블록 형태인 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 이온을 함유하는 생리체액과 유사한 배지 중에서 인큐베이션할 때, 포스페이트기와 칼슘 이온과의 반응에 의해 콜라겐 매트릭스 상에 인산칼슘의 침전물을 생성하는 것을 포함하며, 상기 인산칼슘이 히드록시아파타이트의 전구체의 특징을 갖는 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질.
이하의 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 친수성의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질의 제조 방법:
(a) 우선 지질을 유기 용매로 추출하고, 탈지된 물질을 카오트로픽제 (chaotropic agent) 를 함유하는 용액으로 처리하고, 광범위한 물 세정을 실시함으로써, 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질을 제공하는 것,
(b) 당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 0.85 w/w % - 이에 의해 부분 정제 뼈 대체 물질에 친수성을 제공함 -, 및 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 포스페이트기를 10 내지 1000 mM 함유하는 용액에 천연 기원의 탈수화된 부분 정제 뼈 대체 물질을 침지시키는 것으로서, 이 포스페이트기가 Na⁺, K⁺, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 의 군으로부터 선택되는 양이온을 포함하는 생리학적으로 허용가능한 염의 일부인 것,
(c) 침지된 친수성의 부분 정제 뼈 대체 물질을 냉동 건조하며, 이에 의해 탈수를 실시하는 것, 및
(d) 친수성의 부분 정제된 냉동 건조 뼈 대체 물질을 멸균시키는 것.
제 12 항에 있어서, 단계 (b) 에서 사용된 용액이 pH 7.0 의 인산나트륨 버퍼를 75 내지 600 mM, 바람직하게는 100 내지 200 mM 함유하는 방법.
제 12 항에 있어서, 콜라겐 구조를 파괴하고 콜라겐 섬유의 배향의 변경을 야기하기 위한 것 등의, 단계 (a) 의 종료시에 수득된 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질에 대해 수행된 추가의 중간 탈수 단계를 포함하는 방법.
당류 또는 당 알코올 중 하나 이상을 0.05 내지 1.5 w/w % 함유하는, 실질적으로 모든 비-콜라겐성 유기 물질이 제거되는 한편 천연 뼈의 무기 다공성 뼈 구조 및 콜라겐성 구조가 실질적으로 보존되는, 천연 기원의 부분 정제 뼈 대체 물질의 새로운 뼈 형성 능력을 증강시키기 위한, 생리체액의 칼슘 이온과 반응하여 포스페이트 HPO₄ ^2- 및 H₂PO₄ ^- 로 이루어진 군으로부터 선택되는 히드록시아파타이트의 전구체를 생성하는 경향이 있는 0.7 내지 5.6 w/w % 의 포스페이트기의 용도.