JP5860802B2 - 蛍光観察装置および蛍光観察装置の作動方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光観察装置および蛍光観察装置の作動方法に関するものである。

従来、蛍光画像を反射光画像で除算して、観察距離による蛍光画像の明るさの変動を補正する方法が知られている（例えば、特許文献１〜特許文献３参照。）。

特開昭６２−２４７２３２号公報 特公平３−５８７２９号公報 特開２００６−１７５０５２号公報

しかしながら、蛍光と反射光とでは、撮像される明るさの観察距離に対する依存性が異なるため、単に蛍光画像を反射光画像で除算したのでは、距離の影響を補正しきれないという問題がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、除算した画像に残存する距離に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができる蛍光観察装置および蛍光観察装置の作動方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１の態様は、被写体に照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、該照明部からの励起光の照射により被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、前記照明部からの照明光の照射により被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、該戻り光撮像部と前記被写体との距離情報を取得する距離情報取得部と、前記戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備え、該画像補正部が、前記距離情報取得部により取得された距離情報に基づいて補正係数を設定し、設定された補正係数を指数として用いて前記参照画像または前記蛍光画像の少なくとも一方の光強度情報を累乗演算することにより補正用参照画像または補正用蛍光画像を生成し、生成された前記補正用参照画像を用いて前記補正用蛍光画像を除算する蛍光観察装置を提供する。

本発明の第１の態様によれば、照明部から被写体に励起光が照射されると、被写体内に存在する蛍光物質が励起され蛍光が発生する。発生した蛍光は蛍光撮像部によって撮影され蛍光画像が取得される。一方、照明部から被写体に照明光が照射されると、被写体の表面において反射等されて戻る戻り光が戻り光撮像部によって撮影され参照画像が取得される。取得された蛍光画像は、画像補正部において参照画像を用いて補正される。

ここで、取得された蛍光画像における各画素の強度信号および参照画像における各画素の強度信号は、それぞれ、距離に対して依存性を有しているので、参照画像および蛍光画像の強度信号を何らかの指数で累乗することで、これらの依存性を低減することができる。この場合において、参照画像を構成する照明光の反射光と蛍光画像を構成する蛍光とはそのルートが異なるため、距離に対する依存性も距離に依存して変動する。本発明の第１の態様によれば、画像補正部が距離情報に基づいて設定された補正係数を指数として補正用参照画像または補正用蛍光画像の少なくとも一方を生成するので、観察距離が大きく変動しても、これを精度よく補正した定量性の高い蛍光画像を得ることができ、正確な蛍光観察を行うことができる。

上記発明においては、前記距離情報取得部が、前記戻り光撮像部により取得された参照画像の信号強度により、前記距離情報を取得してもよい。
このようにすることで、特別なセンサを用いることなく距離情報を取得して、定量性の高い蛍光画像を得ることができる。

上記発明においては、前記戻り光撮像部に対して前記被写体を近接または離間する方向に移動させる距離調節部を備え、前記距離情報取得部が、前記距離調節部に備えられた移動量センサであってもよい。
このようにすることで、被写体を移動させる距離調節部に備えられた移動量センサにより、距離情報を直接的に取得して、定量性の高い蛍光画像を得ることができる。

上記発明においては、前記画像補正部が、前記距離情報と前記補正係数とを対応づけて記憶する補正係数記憶部を備え、前記距離情報取得部により取得された距離情報を用いて前記補正係数記憶部に記憶されている補正係数を読み出してもよい。
このようにすることで、距離情報に対して参照光画像および／または蛍光画像を最適に補正可能な補正係数を迅速に設定することができる。

本発明の第２の態様は、蛍光観察装置が、該蛍光観察装置の照明部から導光された励起光により被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得し、前記照明部導光された照明光により被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を戻り光撮像部により取得し、該戻り光撮像部と前記被写体との距離情報を取得し、取得された距離情報に基づいて補正係数を設定し、設定された補正係数を指数として用いて前記参照画像または前記蛍光画像の少なくとも一方の光強度情報を累乗演算することにより補正用参照画像または補正用蛍光画像を生成し、生成された前記補正用参照画像を用いて前記補正用蛍光画像を除算する蛍光観察装置の作動方法を提供する。

除算した画像に残存する距離に対する依存性を十分に除去して定量性の高い蛍光画像によって観察を行うことができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察装置の画像補正部の内部構造を示すブロック図である。 図１の蛍光観察装置において補正係数および境界値を設定する作業を説明する図である。 図３の作業を示すフローチャートである。 図４の作業の内のデータ取得ステップを示すフローチャートである。 図４の作業の内の補正係数等決定ステップを示すフローチャートである。 図４の作業により取得された観察距離と信号強度との関係を示すプロット図である。 図７において累乗近似を行った結果得られたデータベースを示す図である。 図２の画像補正部の変形例を示すブロック図である。 図１の蛍光観察装置に設けられた画像処理部の変形例を示す部分的なブロック図である。 図１の蛍光観察装置に設けられた画像処理部の他の変形例を示す部分的なブロック図である。 図１の蛍光観察装置の変形例を示す全体構成図である。 図１の蛍光観察装置において、図６のフローを実行した結果取得された観察距離と信号強度との関係を示すプロット図である。 図１３での検討結果を用いて、累乗演算処理の効果の結果を示すプロット図である。

以下、本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置１および蛍光観察方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、内視鏡装置であって、図１に示されるように、体内に挿入される細長い挿入部２と、光源（照明部）３と、該光源３からの照明光および励起光を挿入部２の先端から観察対象Ａに向けて照射する照明ユニット（照明部）４と、挿入部２の先端に設けられ、観察対象Ａである生体組織の画像情報を取得する撮像ユニット５と、挿入部２の基端側に配置され、撮像ユニット５により取得された画像情報を処理する画像処理部６と、該画像処理部６により処理された画像Ｇ_４を表示するモニタ７とを備えている。

光源３は、キセノンランプ８と、該キセノンランプ８から発せられた照明光から、励起光および照明光（例えば、波長帯域４００〜７５０ｎｍ）を切り出すフィルタ９と、フィルタ９により切り出された励起光および照明光を集光するカップリングレンズ１０とを備えている。
照明ユニット４は、挿入部２の長手方向のほぼ全長にわたって配置され、カップリングレンズ１０によって集光された励起光および照明光を導光するライトガイドファイバ１１と、挿入部２の先端に設けられ、ライトガイドファイバ１１によって導光されてきた励起光および照明光を拡散させて、挿入部２の先端面２ａに対向する観察対象Ａに照射する照明光学系１２とを備えている。

撮像ユニット５は、観察対象Ａの所定の観察範囲から戻る取り光を集光する対物レンズ１３と、該対物レンズ１３によって集光された戻り光の内、励起波長以上の光（励起光および蛍光）を反射し、励起波長より短い波長の照明光を透過するダイクロイックミラー（分岐部）１４と、ダイクロイックミラー１４を透過した照明光およびダイクロイックミラー１４により反射された蛍光をそれぞれ集光する２つの集光レンズ（撮像光学系）１５，１６と、集光レンズ１５，１６によって集光された蛍光および照明光を撮像するＣＣＤのような２個の撮像素子１７，１８とを備えている。図中、符号１９は、ダイクロイックミラー１４によって反射された光から励起光を遮断する（例えば、波長帯域７６５〜８５０ｎｍの光だけを透過する）励起光カットフィルタである。

画像処理部６は、撮像素子１７により取得された参照画像情報Ｓ_１から参照画像Ｇ_１を生成する参照画像生成部（ＲＩ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｉｍａｇｅ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ)２０と、撮像素子１８により取得された蛍光画像情報Ｓ_２から蛍光画像Ｇ_２を生成する蛍光画像生成部（ＦＩ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ：Ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｉｍａｇｅ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）２１と、これら参照画像生成部２０および蛍光画像生成部２１により生成された参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２に基づいて、撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４を算出し、撮像素子１７，１８の露光調節を行う露光時間調節部（ＥＴ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ：Ｅｘｐｏｓｕｒｅ Ｔｉｍｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）２２，２３と、参照画像Ｇ_１、蛍光画像Ｇ_２および撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４が入力されて、参照画像Ｇ_１を用いて蛍光画像Ｇ_２を補正する画像補正部２４と、該画像補正部２４により補正された補正後蛍光画像Ｇ_３と参照画像Ｇ_１とを合成して画像Ｇ_４を生成する画像合成部２５とを備えている。

ここで、画像補正部２４は、図２に示されるように、参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２から規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’を生成する規格化参照画像生成部（距離情報取得部）２６および規格化蛍光画像生成部２７と、規格化参照画像生成部２６により生成された規格化参照画像Ｇ_１’に基づいて補正係数α，βを設定する補正係数設定部２８と、該補正係数設定部２８により設定された補正係数α，βを指数として用いて、規格化参照画像Ｇ_１’の累乗演算を行う累乗演算処理部２９と、該累乗演算処理部２９において累乗演算された補正用参照画像Ｇ_１”を規格化蛍光画像Ｇ_２’により除算する除算処理部３０とを備えている。

規格化参照画像生成部２６および規格化蛍光画像生成部２７は、参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を露光時間調節部２２，２３により調節された撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４でそれぞれ除算することにより、規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’を生成するようになっている。これにより、撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４に依存した参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２の全体的な信号強度の変動が除去されて規格化された規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’が得られる。

補正係数設定部２８は、例えば、挿入部２の先端面２ａから観察対象Ａ表面までの距離情報（以下、観察距離情報という。）と対応づけて、補正係数としての指数α，βを記憶している。具体的には、規格化参照画像Ｇ_１’の各画素における信号強度と観察距離Ｄとが一対一に対応しているので、信号強度との対応づけて指数α，βを記憶している。

本実施形態においては、信号強度の所定の境界値Ｄ（ｎ）を設定し、その境界値Ｄ（ｎ）の前後において異なる２つの補正係数α_１，α_２および２つの補正係数β_１，β_２を記憶している。そして、補正係数設定部２８は、規格化参照画像生成部２６から送られてきた規格化参照画像Ｇ_１’の各画素における信号強度と境界値Ｄ（ｎ）とを比較し、境界値Ｄ（ｎ）より小さい場合には第１の補正係数α_１，β_１、境界値Ｄ（ｎ）以上の場合には第２の補正係数α_２，β_２を設定するようになっている。

この場合において、２つの補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）は、蛍光観察に先立つ測定によって、以下の通りにして決定されている。
すなわち、補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）の決定に際しては、図３に示されるように、挿入部２を固定するホルダ３１と、該ホルダ３１に固定された挿入部２の先端面２ａに対して観察距離Ｄをあけて対向させられる標準試料３２と、挿入部２の先端面２ａと標準試料３２との間の観察距離Ｄを変更する直動ステージ３３とを準備する。直動ステージ３３には図示しないエンコーダのような移動量センサが設けられている。

標準試料３２としては、観察しようとする生体と同様の散乱や吸収特性を有するファントムを用いてもよいし、ヒトや動物（ブタやマウス等）の切除組織を用いてもよい。
図４〜図６に示されるフローチャートに従って、データ取得ステップＳＴ１と、補正係数等決定ステップＳＴ２とを行う。

まず、データ取得ステップＳＴ１は、図５に示されるように、ｎを初期化し（ＳＴ１１，ＳＴ１２）、直動ステージ３３を動作させて移動量センサにより観察距離Ｄ（ｎ）（ｎは自然数）を精度よく設定し（ＳＴ１３）、そのときの参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を取得し（ＳＴ１４）、規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’を算出し（ＳＴ１５）、予め設定された関心領域における信号強度の平均値を算出し（ＳＴ１６）、観察距離Ｄ（ｎ）に対する信号強度の値としてプロットする（ＳＴ１７）。この作業を繰り返して（ＳＴ１８）、図７に示されるように、複数点（ａ個）のプロットを得る。

ここで、関心領域としては、標準試料３２内の蛍光強度が一定であれば、観察距離Ｄに拘わらず、一定の大きさに設定してもよい。標準試料３２の表面に凹凸がある場合や標準試料３２中の蛍光分布にムラがある場合には、観察距離Ｄが大きくなるに連れて関心領域の大きさを小さくすることにより、常に同じ領域の信号強度を取得することが好ましい。

次いで、補正係数等決定ステップＳＴ２は、図６に示されるように、まず、ｎ＝３として（ＳＴ２１，ＳＴ２２）、ｎ点目の観察距離Ｄ（ｎ）を境界値として設定する（ＳＴ２３）。Ｄ（３）を最初の境界値としたのは、最小二乗法等による累乗近似を使用する場合に３点以上のデータが必要となるからである。

そして、観察距離Ｄ（１）〜Ｄ（ｎ）の領域およびＤ（ｎ）〜Ｄ（ａ）の領域において、累乗近似を行って（ＳＴ２４，ＳＴ２５）、それぞれ指数を算出し、その決定係数Ｒ^２および境界値Ｄ（ｎ）と共に保存する（ＳＴ２６）。
ｎを１つずつインクリメントして（ＳＴ２２）、上記作業をｎ＝ａ−２となるまで繰り返し（ＳＴ２７）、図８に示されるデータテーブルを得る。そして、このデータテーブルの中から、決定係数Ｒ^２の総和が４に最も近い境界値Ｄ（ｎ）と指数α，βとの組み合わせを選択して（ＳＴ２８）、補正係数設定部２８に記憶しておく（ＳＴ２９）。
本実施形態では、蛍光画像Ｇ_２に対して得られた指数αを参照画像に対して得られた指数βで除算することにより、指数α／βを補正係数として記憶しておく。

累乗演算処理部２９は、補正係数設定部２８において設定された補正係数α／βを指数として規格化参照画像Ｇ_１’の各画素における強度信号（光強度情報）に累乗演算処理を施して補正用参照画像Ｇ_１”を生成するようになっている。累乗演算処理部２９において生成された補正用参照画像Ｇ_１”は、除算処理部３０に入力されるようになっている。一方、蛍光画像については規格化蛍光画像Ｇ_２’がそのまま補正用蛍光画像として除算処理部３０に入力されるようになっている。

本明細書においては、規格化蛍光画像が累乗演算処理されずにそのまま補正用蛍光画像として除算処理部３０に入力される場合、その入力された規格化蛍光画像を補正用蛍光画像と呼ぶこととする。同様に、規格化参照画像が累乗演算処理されずにそのまま補正用参照画像として除算処理部３０に入力される場合、その入力された規格化参照画像を補正用参照画像と呼ぶこととする。

除算処理部３０は、補正用蛍光画像Ｇ_２’を補正用参照画像Ｇ_１”によって画素毎に除算処理することにより、補正後蛍光画像Ｇ_３を生成するようになっている。
画像合成部２５は、例えば、参照画像Ｇ_１と補正後蛍光画像Ｇ_３とを並列に配置してモニタ７に同時に表示させるよう画像Ｇ_４を合成し、モニタ７に出力するようになっている。

以下、図１の蛍光観察装置において、図３に示す補正係数および境界値を設定する作業を実行することにより、補正係数の算出および補正の効果を確認した結果を説明する。
なお、観察する標準試料としては、蛍光薬剤の溶液に散乱物質を混ぜたものを用いた。

図１３は、図１の蛍光観察装置において、図６のフローを実行した結果取得された観察距離と信号強度との関係を示すプロット図であり、縦軸が規格化参照画像の信号強度および規格化蛍光画像の信号強度をログスケールで示し、横軸が観察距離をログスケールで示す。 図６に示すフローを実行した結果、図１３に示されるように、ＳＴ２８でＤ＝４ｍｍが境界値として選択された。なお、図１３中に記載の式は、ＳＴ２４およびＳＴ２５において、累乗近似を行った際に求められた近似値である。

図１４は、図１３での検討結果を用いて、累乗演算処理の効果の結果を示すプロット図である。「累乗演算処理なし」の場合は、従来例と同じく、蛍光画像を参照画像で除算した結果を示している。「累乗演算処理あり」の場合は、図６のフローで得られた指数を用いて、画像補正部内で累乗演算処理を実行した結果を示している。
それぞれの場合について、観察距離毎に補正後蛍光画像を生成した。作成した補正後蛍光画像中の中心付近のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ Ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内の平均信号強度を算出し、さらに各条件内（距離を変えた１１点）の平均値で規格化してプロットを行った。これにより、累乗演算処理を加えることで、誤差が小さくなっていることがわかる。

このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いた蛍光観察方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、光源３からの照明光および励起光が、照明ユニット４を介して挿入部２の先端面２ａから観察対象（被写体）Ａに向けて照射され、観察対象Ａの表面における反射光が撮像素子１７により取得されて、参照画像生成部２０により参照画像Ｇ_１が生成される。一方、励起光が照射されることにより観察対象Ａの内部において発生した蛍光が撮像素子１８により取得されて、蛍光画像生成部２１により蛍光画像Ｇ_２が生成される。

参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２が生成されると、生成された参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２に基づいて、露光時間調節部２２，２３が撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４を算出し、撮像素子１７，１８の露光を自動調節する。参照画像Ｇ_１、蛍光画像Ｇ_２およびそれらを撮影した際の各撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４が画像補正部２４に送られる。

画像補正部２４においては、規格化参照画像生成部２６において、参照画像Ｇ_１が撮像素子１７の露光時間Ｓ_３によって除算されることにより規格化参照画像Ｇ_１’が生成され、規格化蛍光画像生成部２７において、蛍光画像Ｇ_２が撮像素子１８の露光時間Ｓ_４によって除算されることにより規格化蛍光画像Ｇ_２’が生成される。
そして、規格化参照画像Ｇ_１’の各画素の信号強度に基づいて、補正係数設定部２８において補正係数α，βが設定され、累乗演算処理部２９において、各画素について設定された補正係数α／βが指数として、該指数で各画素の信号強度を累乗演算することにより、補正用参照画像Ｇ_１”が生成される。

その後、補正用参照画像Ｇ_１”および規格化蛍光画像生成部２７から出力された補正用蛍光画像である規格化蛍光画像Ｇ_２’が除算処理部３０に入力され、補正用蛍光画像Ｇ_２’が補正用参照画像Ｇ_１”によって除算されることにより補正後蛍光画像Ｇ_３が生成される。
生成された補正後蛍光画像Ｇ_３および参照画像Ｇ_１は、画像合成部２５において合成され、モニタ７に並列して表示される。

このように、本実施形態に係る蛍光観察装置１および蛍光観察方法によれば、所定の観察距離Ｄを境界値Ｄ（ｎ）としてその前後で異なる補正係数α_１，β_１，α_２，β_２を指数として累乗演算を行った補正用参照画像Ｇ_１”を用いて補正用蛍光画像Ｇ_２’を除算することにより、観察距離Ｄが大きく変動しても、定量性の高い補正後蛍光画像Ｇ_３を得ることができるという利点がある。

本実施形態においては、規格化蛍光画像Ｇ_２’の信号強度および規格化参照画像Ｇ_１’の信号強度の両方において算出した指数α，βを用いて規格化参照画像Ｇ_１’の信号強度のみに累乗演算を施すこととしたので、規格化蛍光画像Ｇ_２’および規格化参照画像Ｇ_１’の両方に累乗演算を施す場合と比較して演算量を低減し、迅速な演算を行うことができるという利点がある。これに代えて、図９に示されるように、規格化蛍光画像Ｇ_２’側にも累乗演算処理部３４を設け、補正係数設定部２８において設定された指数α，βを用いて、規格化参照画像Ｇ_１’に対して１／βの累乗演算を施すとともに、規格化蛍光画像Ｇ_２’に対して１／αの累乗演算を施し、補正用蛍光画像Ｇ_２”を得ることにしてもよい。

除算処理部３０において補正用蛍光画像Ｇ_２”を補正用参照画像Ｇ_１”によって除算して得られた補正後蛍光画像Ｇ_３の画素毎に、規格化蛍光画像Ｇ_２’に対して得られた指数αで累乗する累乗演算を施すことにしてもよい。これにより、各画素の信号強度と観察対象Ａ内における蛍光の存在量とを比例させることができ、さらに定量的な観察を行うことができる。
これに代えて、補正後蛍光画像Ｇ_３の信号強度と蛍光濃度との対応表（変換テーブル）を備えていて、画像上に特定の領域の蛍光濃度を表示するようにしてもよい。

図１０に示されるように、挿入部２として着脱可能なものを採用する場合には、挿入部２に挿入部情報Ｓ_５を保持する挿入部情報保持部３５を設け、画像処理部６側に、それを読み取る挿入部情報読取部３６および、挿入部情報Ｓ_５に対応づけて補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）を記憶する補正係数記憶部（ＣＣ Ｓｔｏｒａｇｅ：Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｔｏｒａｇｅ）３７を設けておくようにしてもよい。これにより、挿入部２を画像処理部６に取り付けると、挿入部２の挿入部情報保持部（ＩＭＩＨ Ｓｅｃｔｉｏｎ：Ｉｎｓｅｒｔ Ｍｅｍｂｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｓｅｃｔｉｏｎ）３５に記憶されていた挿入部情報Ｓ_５が挿入部情報読出部（ＩＭＩＲ Ｓｅｃｔｉｏｎ：Ｉｎｓｅｒｔ Ｍｅｍｂｅｒ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｓｅｃｔｉｏｎ）３６により読み出され、補正係数記憶部３７に挿入部情報に対応づけて記憶されている補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）が読み出され、補正係数設定部２８に記憶される。

このようにすることで、挿入部２の個体差による補正係数の変動を精度よく較正することができるという利点がある。
また、挿入部情報保持部３５が挿入部情報Ｓ_５を保持し、補正係数記憶部３７に補正係数α，β等を記憶していることに代えて、図１１に示されるように、挿入部情報保持部３５が補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）を直接記憶していて、挿入部情報読出部３６により読み出した補正係数α，βおよび境界値Ｄ（ｎ）を補正係数設定部２８に送ることにしてもよい。

本実施形態においては、単一の境界値Ｄ（ｎ）を設定して、その前後において異なる補正係数を設定することとしたが、これに代えて、２以上の境界値Ｄ（ｎ）を設定して、３以上の補正係数を設定することにしてもよい。境界値Ｄ（ｎ）が２以上存在する場合においても、各補正係数の設定方法は、図４〜図６のフローチャートに準ずればよい。

例えば、３以上の補正係数を設定する場合には、観察距離Ｄ（３）≦Ｄ≦Ｄ（ａ−２）の範囲で２つの境界値Ｄ１，Ｄ２を選択し、Ｄ（１）≦Ｄ≦Ｄ１、Ｄ１≦Ｄ≦Ｄ２、Ｄ２≦Ｄ≦Ｄ（ａ−２）のそれぞれの領域において累乗近似を行って、指数、境界値および決定係数を保存することを全ての境界値Ｄ１，Ｄ２の組み合わせについて行う。これにより得られたデータベースから決定係数の総和が６に最も近くなる指数および境界値Ｄ１，Ｄ２を採用することにすればよい。

さらに多くの境界値によって分割する場合には、例えば、観察距離Ｄ（１）≦Ｄ≦Ｄ（ａ）の範囲で連続する３点以上の観察距離Ｄ毎に累乗近似を行って、補正係数を得ることにしてもよい。

本実施形態においては、撮像素子１７，１８の露光時間Ｓ_３，Ｓ_４によって参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２をそれぞれ規格化することとしたが、これに代えて、参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２の信号強度に基づいて撮像素子１７，１８のゲインを調節し、参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２をゲインに対応するゲイン増倍率によって除算することにより規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’を得ることにしてもよい。

図１２に示されるように、光源３として、Ｘｅランプ８およびレーザ光源３８を有し、それらの出力をＸｅランプ制御部３９およびレーザ制御部４０によって制御することで、調光を行うことができる場合には、照明光調光部（ＩＬＣ Ｓｅｃｔｉｏｎ：Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｃｔｉｏｎ）４１および励起光調光部（ＥＬＣ Ｓｅｃｔｉｏｎ：Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｅｃｔｉｏｎ）４２によって、参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２の信号強度に基づいて算出された照明光の強度Ｓ_３’および励起光の強度Ｓ_４’によって参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２を除算することにより規格化参照画像Ｇ_１’および規格化蛍光画像Ｇ_２’を得ることにしてもよい。符号４３は集光レンズ、符号４４はダイクロイックミラーである。

参照画像Ｇ_１および蛍光画像Ｇ_２の規格化を行う前に、撮像素子１７，１８のノイズ成分を減算することとしてもよい。これにより演算精度を向上することができるという利点がある。
照明光として白色光、蛍光として近赤外蛍光を例示したが、これに限定されるものではなく、参照光としては可視領域の励起光、蛍光としては可視領域の蛍光のようにいかなる蛍光色素に対しても適用することができる。

Ａ 観察対象（被写体）
１ 蛍光観察装置
２ 挿入部
３ 光源
４ 照明ユニット（照明部）
６ 画像補正部
１７ 撮像素子（戻り光撮像部）
１８ 撮像素子（蛍光撮像部）
２８ 補正係数設定部（補正係数記憶部）
３３ 直動ステージ（距離調節部）

Claims (5)

1. 被写体に照明光および励起光を照射する光源を備える照明部と、
   該照明部からの励起光の照射により被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得する蛍光撮像部と、
   前記照明部からの照明光の照射により被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を取得する戻り光撮像部と、
   該戻り光撮像部と前記被写体との距離情報を取得する距離情報取得部と、
   前記戻り光撮像部により取得された参照画像を用いて前記蛍光撮像部により撮像された蛍光画像を補正する画像補正部とを備え、
   該画像補正部が、前記距離情報取得部により取得された距離情報に基づいて補正係数を設定し、設定された補正係数を指数として用いて前記参照画像または前記蛍光画像の少なくとも一方の光強度情報を累乗演算することにより補正用参照画像または補正用蛍光画像を生成し、生成された前記補正用参照画像を用いて前記補正用蛍光画像を除算する蛍光観察装置。
2. 前記距離情報取得部が、前記戻り光取得部により取得された参照画像の信号強度により、前記距離情報を取得する請求項１に記載の蛍光観察装置。
3. 前記戻り光撮像部に対して前記被写体を近接または離間する方向に移動させる距離調節部を備え、
   前記距離情報取得部が、前記距離調節部に備えられた移動量センサである請求項１に記載の蛍光観察装置。
4. 前記画像補正部が、前記距離情報と前記補正係数とを対応づけて記憶する補正係数記憶部を備え、
   前記距離情報取得部により取得された距離情報を用いて前記補正係数記憶部に記憶されている補正係数を読み出す請求項１から請求項３のいずれかに記載の蛍光観察装置。
5. 蛍光観察装置が、
   該蛍光観察装置の照明部から導光された励起光により被写体において発生した蛍光を撮影し蛍光画像を取得し、
   前記照明部から導光された照明光により被写体から戻る戻り光を撮影し参照画像を戻り光撮像部により取得し、
   該戻り光撮像部と前記被写体との距離情報を取得し、
   取得された距離情報に基づいて補正係数を設定し、設定された補正係数を指数として用いて前記参照画像または前記蛍光画像の少なくとも一方の光強度情報を累乗演算することにより補正用参照画像および補正用蛍光画像を生成し、生成された前記補正用参照画像を用いて前記補正用蛍光画像を除算する蛍光観察装置の作動方法。

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