JP5852110B2 - 生物学的物質のサンプルのサンプリング及び/又は沈着方法及び該方法を実施する装置 - Google Patents
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Description
このために、本発明の目的は、終端部を備えたプローブを使用し、未精製で、濃縮され、又は培養培地、おそらくは寒天との接触を通して培養された生物学的物質のサンプルの全て又は一部をサンプリングする方法であって、プローブの終端部を冷却し、生物学的物質のサンプルへの終端部の接触を通して、又は生物学的物質のサンプルに終端部により作用する圧力を適用することにより、サンプリングされる生物学的物質のサンプルの全て又は一部を付着させ、生物学的物質のサンプルをその支持体、例えば培養培地から分離させるように、生物学的物質のサンプルの全て又は一部をサンプリングする工程を含む方法にある。
産業上の応用例を以下に示唆する。
この第1の実施例では、氷のチップ(先端)が、未知の微生物コロニーをサンプリングし、以下のプロトコルに従い、質量分析計を使用して、未知の微生物コロニーを同定するために、質量分析計標的にそれを沈着させるために使用される:
−氷針を用い、血液寒天培地(ビオメリュー製)のコロニーをサンプリングする。
−氷チップを用い、384位質量分析計標的(Bruker)にコロニーを沈着させる。沈着物は、周囲温度で標的上に氷チップを簡単に適用することより得られる。微生物と水の薄膜がこのようにして標的の表面に沈着される。
−サンプルの表面に2μlのマトリックスを沈着させる(α−シアノ酸をアセトンと水の50/50溶液に10mg/mlまで溶解させたもの)。
−MALDI−TOF(Ultraflex II,Bruker)質量分析計中に標的を導入する。
−2000〜20000Daの質量の獲得を最適化するように質量分析計を調節する。当業者であれば、機器のテンション及びレーザ出力の調節には特に慣れているであろう。
−ベンチマークタンパク質(ProteinMixte,Bruker)を用い、質量分析計を較正する。
−50レーザショットの20シリーズを使用してサンプルを分析する。各シリーズから得られる質量スペクトルを合計して微生物の質量スペクトルを得る。可能な限り最も情報の豊富なスペクトル、すなわち最も可能で良好に定められた質量ピークが得られるように、ショット数は当業者により調節可能である。
−Flex Analysisソフトウェア(Bruker)を使用し、微生物の質量スペクトルで観察される質量を測定する。
−データベースに含まれる質量と微生物の質量スペクトルで観察される質量を比較する。この目的のためにいくつかのデータベースが存在する:本出願人は自身のデータベースを有しているが、Bruker社(Biotype)又はAnagnostec(Saramis)社のデータベースも使用可能である。
−未知の微生物の質量スペクトルで観察されるものに最も近い質量を有する微生物を同定する。
第2の例では、実施例1と同じプロトコルが実施されるが、違いは、工程2ではあ、沈着物が質量分析計標的の表面に氷チップを擦りつけることにより得られる点である。
このプロトコルは、実施例1と同じ利点を有する。さらに、より広い表面に対して沈着させることが可能であり、同じサンプルのいくつかの逐次的獲得の達成、又は異なるパラメーターを有するいくつかの質量スペクトルの逐次的獲得のために有用である。
第3の実施例では、既知の種の25の菌株が、以下の表1に示す指示に従い、COS(コロンビアヒツジの血液の培地、ビオメリュー,照会番号43041又はSDA(サブローグルコース培地,ビオメリュー,照会番号43555)培養培地を伴うペトリ皿において培養される。
− テーパー状の基部を有する円筒状の金属製チップ(終端部)を、ペルチェ効果により−10℃に保持した(図5に従い、金属製チップは2のペルチェ素子と接触)。ついで、9℃に保持された水の容器中に15秒それを浸す。
− 金属製チップを水から取り出す。水滴は自然と金属製チップに付着する。この水滴を、−10℃で金属製チップから冷所に移動させることにより15秒で凍結させる。このようにして氷針が形成される。
− 針を微生物のコロニーに配し、すぐに引き抜く。即座に、微生物のコロニーは氷針に付着し、氷針に付着したままである。このようにして、氷針により微生物のコロニーがサンプリングされる。逆に、培養培地の寒天は取り上げられない。
− 微生物のコロニーを、Shimadzu社の使い捨て48位のFleximass DS標的に沈着させる。各沈着位置は直径3mmの円形である。らせん状の動きをしつつ、標的の48の沈着位置の一つの表面に、氷突部を擦りつけることにより、沈着を実施する。この動きは沈着位置の中心で開始し、水及び微生物の薄膜で、全沈着位置がカバーされるように4巡回後に完了した。
− 微生物のサンプルを数分、外気で乾燥させる。
− 1μLのマトリックス(溶液で使用準備が整ったα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(ビオメリュー,照会番号411071))をサンプルの表面に沈着させる。
− マトリックス及び微生物のサンプルを数分、外気で乾燥させる。
− 標的を、FLEXIMASS DS標的支持体(Shimadzu)を具備するMALDI−TOF質量分析計(Axima Assurance,Shimadzu)に導入する。
− 質量分析計を調節し、2000〜20000Daの質量の獲得を最適化する。当業者であれば、機器のテンション及びレーザー出力の調節には特に慣れているであろう。
− E.coli(ATCC8739菌株)の沈着物を用い、質量分析計を較正する。
− 5レーザーショットの100シリーズを使用し、サンプルを分析する。各シリーズから得られる質量スペクトルを合計し、微生物の質量スペクトルを得る。可能な限り最も情報の豊富なスペクトル、すなわち最も可能で良好に定められた質量ピークが得られるように、ショット数は当業者により調節可能である。
− LaunchPad バージョン2.8ソフトウェア(Shimadzu)を使用し、微生物の質量スペクトルにおいて観察される質量を測定する。
− 微生物の質量スペクトルで観察される質量を、Spectral IDバージョン1.1.0インターフェイス(ビオメリュー)を使用する、Saramis(ビオメリュー)データベースに含まれる質量と比較し、データベースに存在する微生物の質量スペクトルと比較することにより、微生物を同定する。
− スペクトルIDは種の略語名を提供する。当業者はこれらの略語名に慣れている。例えば、G.capitatumは、Geotrichum capitatumを意味し、Entero.casseliflavusは、Enterococcus casseliflavusを意味していることは明らかである。
− Micrococcus luteusは、Mic.luteus/lylaeとして、すなわちMicrococcus luteus又はMicrococcus lylaeの可能性があるとして同定されている。MALDI−TOF分析及びSaramisデータベースを使用しても、これら2つの種の間を差別化することはできない。
− Shigella flexneriはEsch.coli、すなわちEscherichia coliとして同定されている。上述したように、Shigella flexneri及びEscherichia coliは、あまりに近すぎて、MALDI−TOFで区別することができない2つの種である。スペクトルID及びSaramisは、これら2つの種をEscherichia coliと分類している。
− Aeromonas hydrophiliaは、Aer.salm.salmonicida又はAerhydro./caviae.として同定されている。3つの種は非常に近く、MALDI−TOFで差別化することは困難である。
− Salmonella ser.Gallinarum(pullovorum)は、Salmonella群として同定されている。MALDI−TOF分析は、他の血清型から、血清型Gallinarum(pullovorum)を明白に区別するための、十分な解析度を有していない。よって、スペクトルIDソフトウェア及びSaramisは、Salmonella genusのレベルで、一つのみを同定する。
Claims (32)
- 終端部(4)を備えたプローブ(3)を使用し、未精製で、濃縮され、又は培養培地(8)との接触を通して培養された生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部をサンプリングする方法であって、
− プローブ(3)の終端部(4)を冷却して終端部(4)に氷の層を形成し、
− 生物学的物質(7)のサンプル(11)への終端部(4)の接触を通して、又は生物学的物質(7)のサンプル(11)に終端部(4)により作用する圧力をかけることにより、サンプリングされる生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部を付着させ、
− 生物学的物質(7)のサンプル(11)を培養培地(8)から分離させるように、生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部をサンプリングする
工程を含む方法。 - 付着工程の前に、プローブ(3)の終端部(4)に氷の層(13)を形成させるために、溶液(12)で前記終端部(4)を湿らせる工程が実施される、請求項1に記載のサンプリング方法。
- 付着工程の前に、プローブ(3)の終端部(4)へのサンプル(11)の全て又は一部の付着工程中において、サンプル(11)の周囲に氷の層(13)を形成するために、サンプリングされる生物学的物質(7)のサンプル(11)を溶液(12)で覆う、請求項1又は2に記載のサンプリング方法。
- 質量分析計等の測定装置を使用して分析することを目的に、溶液(12)が、水、生理食塩水、バッファー、液体培養培地又は生物学的物質(7)のサンプル(11)をイオン化するために一般的に使用されるマトリックスを含む群から選ばれる、請求項2又は3に記載のサンプリング方法。
- 溶液(12)でプローブ(3)の終端部(4)又はサンプリングされる生物学的物質(7)のサンプル(11)を湿らせる工程が、氷の被覆層(13)を形成するために少なくとも2回、連続的に繰り返される、請求項2から4の何れか一項に記載のサンプリング方法。
- 終端部(4)が取外し可能である、請求項1から5の何れか一項に記載のサンプル方法。
- 終端部(4)が強磁性を有する、請求項6に記載のサンプリング方法。
- 生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部をサンプリングする工程が、終端部(4)を誘引し、よってそれを回収するように、強磁性終端部(4)に隣接して磁場を印加することからなる、請求項7に記載のサンプリング方法。
- 磁場が電磁石を使用して印加される、請求項8に記載のサンプリング方法。
- 請求項1から9の何れか一項に記載のサンプリング方法であって、
前記サンプリング工程後、前記プローブ(3)の急速冷凍された終端部(4)に付着された生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部を容器(9)中に又は分析用プレート(14)上に沈着させるために、前記終端部(4)に付着された生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部から、プローブ(3)の終端部(4)を分離する工程が実施される、方法。 - 分離工程が、急速冷凍された終端部(4)に付着された生物学的物質(7)のサンプル(11)を容器(9)又は分析用プレート(14)と接触させることなく実施される、請求項10に記載のサンプリング方法。
- 終端部(4)に付着された生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部から終端部(4)を分離させる工程が、終端部(4)に機械的衝撃を加えることにより実施される、請求項10に記載のサンプリング方法。
- 急速凍結された終端部(4)に付着された生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部から終端部(4)を分離させる工程が、加熱手段(10)により、又は周囲空気で実施される、請求項11に記載のサンプリング方法。
- 分離工程が、生物学的物質(7)のサンプル(11)を容器(9)又は分析用プレート(14)と逐次接触させることにより達成され、これにより、氷の表層(13)が溶解し、生物学的物質(7)が沈着される、請求項10に記載のサンプリング方法。
- 生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部が、終端部(4)に付着した、生物学的物質(7)の同じサンプル(11)の一部の、いくつかの明確な沈着が達成されるように、分析用プレート(14)に分配される、請求項14に記載のサンプリング方法。
- 沈着が、容器(9)又は分析用プレート(14)との、終端部(4)が付着した生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部の、連続的接触を通してなされる、請求項10に記載のサンプリング方法。
- 前記連続的接触が線状である、請求項16に記載のサンプリング方法。
- 培養培地(8)が寒天培養培地である、請求項1から17の何れか一項に記載のサンプリング方法。
- 未精製で、濃縮され、又は培養培地(8)との接触を通して培養され、容器(9)又は分析用プレート(14)に沈着されることが意図された、生物学的物質(7)のサンプル(11)の全て又は一部をサンプリングし沈着させるための装置(2)であって、
− 尖った終端部(4)を備えたプローブ(3)、
− 尖った終端部(4)を急速冷凍することを意図した冷却手段、
− 駆動手段(5)であって、
・終端部(4)を付着させるために、サンプル(11)に含まれる水分の全て又は一部が凍結するように、プローブ(3)からサンプル(11)に圧力をかけ、
・サンプル(11)の全て又は一部を、培養培地(8)から分離させ、
・サンプル(11)の全て又は一部を容器(9)又は分析用プレート(14)にもたらすことを意図した駆動手段(5)、及び
− プローブ(3)を介して駆動手段(5)により加えられる圧力を制御し、培養培地(8)の貫通を停止させる少なくとも一つのセンサ
を有することを特徴とする装置。 - 終端部(4)からサンプル(11)を取り外すことを意図した加熱手段(10)を含む、請求項19に記載の装置(2)。
- 加熱手段(10)が終端部(4)の滅菌を更に意図している、請求項20に記載の装置(2)。
- 冷却手段及び加熱手段が少なくとも一つのペルチェ素子からなる、請求項19から21の何れか一項に記載の装置(2)。
- 終端部(4)が金属製又は鉱物製である、請求項19から22の何れか一項に記載の装置(2)。
- 終端部(4)が疎水性コーティング又は処理により、少なくとも部分的に被覆されている、請求項19から23の何れか一項に記載の装置(2)。
- 終端部(4)が取外し可能である、請求項19から24の何れか一項に記載の装置(2)。
- 終端部がサンプリングされる生物学的物質(7)のサンプル(11)又は溶液(12)の全て又は一部の付着を最適にする形状を有する、請求項19から25の何れか一項に記載の装置(2)。
- センサが圧力又は力センサである、請求項19から26の何れか一項に記載の装置(2)。
- 任意の圧力を回避するために、終端部(4)と生物学的物質(7)の間の接触を検出するセンサを含む、請求項19から27の何れか一項に記載の装置(2)。
- センサが電気バイナリセンサである、請求項19から28の何れか一項に記載の装置(2)。
- 培養培地(8)が寒天培養培地である、請求項19から29の何れか一項に記載の装置(2)。
- 複数の交換可能な終端部(4)を有する、請求項19から30の何れか一項に記載の装置を含むキット。
- 請求項19から30の何れか一項に記載の装置又は請求項31に記載のキットを含む医療分析装置(1)。
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