KR101390878B1

KR101390878B1 - 인-시츄 말디-토프 질량분석기를 이용한 포자를 형성하는 바실러스 균의 동정 방법 및 분석시스템

Info

Publication number: KR101390878B1
Application number: KR1020130083347A
Authority: KR
Inventors: 정영수; 이종희; 최선경; 김주현
Original assignee: 국방과학연구소
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2014-04-30
Also published as: US20150024428A1; JP2015021960A

Abstract

본 발명은 포자를 형성하는 균류를 전처리 없이 말디-토프 질량분석기 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)에 직접적으로 도입하여 동정하기 위한 바실러스 균의 동정 방법 및 포자들의 식별을 위한 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 균류의 동정 방법 및 포자의 분석시스템을 통하여, 바실러스 균류를 신속하고 쉽게 검출, 탐지 및 식별할 수 있다.

Description

인-시츄 말디-토프 질량분석기를 이용한 포자를 형성하는 바실러스 균의 동정 방법 및 분석시스템{A method of identification of spores-forming Bacillus using in-situ MALDI-TOF mass spectrometer and analysis system}

본 발명은 포자를 형성하는 균류를 전처리 없이 말디-토프 질량분석기(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS) 기기에 직접적으로 도입하여 동정하기 위한 바실러스 균의 동정 방법 및 포자들의 식별을 위한 분석시스템에 관한 것이다.

바실러스 (Bacillus) 속의 미생물들은 막대 모양의 형태를 지니고 있으며 카탈라제 활성을 나타낸다. 또한 이들은 포자 형성을 하여 극한 상황에 대처하고 통성 혐기성 미생물의 특성을 나타낸다. 이러한 바실러스 속 미생물들은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ) 와 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ) 그룹으로 나뉜다.

바실러스 서브틸리스 그룹은 유전체 연구를 위한 모델 생명체로 이용된다.

한편, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 바실러스 투린지엔시스 (B. thuringiensis ), 바실러스 아트로파에우스(B. atrophaeus ), 바실러스 아밀로리퀴화씨엔스(B. amyloliquefaciens ) 등을 포함하는 바실러스 세레우스 (B. cereus ) 그룹은 그들의 표현형 및 진화적인 관계에 있어서 매우 높은 유사도를 보이며 그로 인하여 이들 사이의 구별이 매우 어렵다.

바실러스 안트라시스(B. anthracis)는 포자를 형성하는 그람 양성 박테리아로서, 탄저균을 야기시키고 인간이나 동물에게 상당히 심각한 영향을 끼칠 수 있기 때문에 생물학전이나 바이오테러에 이용될 수 있다.

상기 균들은 순수 배양된 세균의 생화학적 특성을 이용한 전통적인 방법 또는 화학 독성학적, 생리학적, 유전학적인 방법 등의 다양한 방법을 이용하여 분류하여 왔다. 그러나, 종래 기술과 같은 방법으로는 빠르고 정확한 분류 및 동정이 불가능하기 때문에, 좀더 편리하고 빠르며 정확한 바실러스 균의 동정 방법의 개발에 대한 요구가 있어 왔다.

말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 질량 분석법은 검체를 이온화하여 진공관에서 검출기에 도달하는 시간을 기반으로 특정 구성 물질의 질량을 측정하는 방법으로써, 빠른 시간 내에 물질을 분석할 수 있다.

독일 브루커(Bruker)사에서 최근 개발된 말디 바이오타이퍼(MALDI Biotyper)는 말디-토프 질량 분석법을 이용하여 획득한 세균의 단백질 정보를 이미 구축된 각 균총들의 단백질 정보와 비교 분석하여 식별하는 초고속 분석 방법으로서, 종 단위의 다양한 균총들을 동정한다.

말디-토프 질량 분석 동정 시간은 균주 당 평균 6분 이내이며, 산출된 동정 비용은 상품화 키트를 포함한 전통적 동정 방법의 22~32%에 불과하다. 즉, 미생물 동정에 이용하기에 간편하고 그 소요되는 시간이 매우 짧으며 소모 비용이 적다.

여러 말디-토프 질량분석법을 이용한 미생물 동정 연구에서 특별한 처리 없이 세포 샘플 자체를 직접적으로 질량 분석하는 방법 (direct whole cell mass spectrometry, in - situ analysis)이 영양세포나 콜로니의 분석에 적용되었다. 그러나, 단단한 포자의 특성으로 인하여, 종래 방법은 추출등을 포함하는 다양한 전처리 공정을 적용한 후에나 동정이 가능한 한계점을 갖고 있었다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 다른 연구에서는 포자의 동정을 위하여 고분해능의 말디-토프-토프 질량분석기를 이용하기도 하였다. 하지만 말디-토프-토프 질량분석법은 장비의 크기가 거대하고, 고가이므로 산업적으로 이용하는데 어려운 점이 있었다.

Barbuddhe, S. B.; Maier, T.; Schwarz, G.; Kostrzewa, M.; Hof, H.; Domann, E.; Chakraborty, T.; Hain, T. Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 5402-5407. Fenselau, C.; Demirev, P. A. Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 157-171. He, Y.; Chang, T. C.; Li, H.; Shi, G.; Tang, Y. -W. Can. J. Microbiol. 2011, 57, 533-538. Moura, H.; Woolfitt, A. R.; Carvalho, M. G.; Pavlopoulos, A.; Teixeira, L. M.; Satten, G. A.; Barr, J. R. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2008, 53, 333-342. Lasch, P.; Beyer, W.; Nattermann, H.; Stammler, M.; Siegbrecht, E.; Grunow, R.; Naumann, D. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, 7229-7242. Aemirev, P. A.; Feldman, A. B.; Kowalski, P.; Lin, J. S. Anal. Chem. 2005, 77, 7455-7461.

본 발명의 목적은 말디-토프 질량분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS, 이하 말디-토프 질량분석기라고 함)를 이용하여, 포자를 형성하는 바실러스 균류를 신속하고 용이하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 균류 포자의 분석시스템을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

말디-토프 질량분석기를 이용한 바실러스(Bacillus) 균류의 동정 방법에 있어서, 포자를 형성하는 바실러스 균류를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하는, 바실러스(Bacillus) 균류의 동정 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 특정 질량전하비율(m/z)을 이용한 특정 바실러스 포자의 분석시스템을 제공한다.

본 발명에 따른 바실러스 균류의 동정 방법, 포자의 분석시스템을 통하여, 바실러스 균류를 신속하고 쉽게 검출, 탐지 및 식별할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바실러스 포자들의 질량분석을 위한 in - situ 분석의 개략적인 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 실시예의 시료 준비 방법에 따른 탄저 포자의 말디-토프 질량분석 스펙트럼을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 다섯 종류의 바실러스 포자들의 질량 분석 스펙트럼을 비교하여 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은,

말디-토프 질량분석기를 이용한 균류의 동정 방법에 있어서,

포자를 형성하는 바실러스 균류를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 간단한 공정을 적용하여 바실러스 균류를 동정하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서, 시료의 점적 이후, 메트릭스 용액을 상기 타겟 플레이트에 처리한 후 건조하는 것을 더 포함할 수 있다.

상기 말디-토프 질량분석기는 브루커(Bruker) 사의 오토플렉스 스피드 엘알에프 질량 분석기 (Autoflex Speed LRF mass spectrometer)가 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 질량분석기는 최대 1 kHz의 pulse rate을 가지고 있는 355 nm의 Nd/YAG 레이저를 장착하고 있다.

상기 말디-토프 질량분석기의 적용에 대한 개략적인 모습은 도 1에 나타내었다.

말디 타겟 플레이트(MALDI target plate)란, 분석하고자 하는 시료와 시료의 이온화를 돕는 메트릭스 용액을 점적하여 말디-토프 질량분석기에 적용하기 위한 부품의 하나로서, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 쉽게 이해할 수 있으며, 자세한 사항은 브루커 홈페이지 (http://www.bruker.com/search.html)에서 확인할 수 있다.

본원 발명에서 사용되는 메트릭스 용액은, 바람직하게는, DHB(Dihydroxybenzoic acid), 시나핀산(Sinapinic acid), THAP(Trihydroxy acetophenone), HABA(Hydroxyphenylazo benzoic acid), 디트라놀(Dithranol), CHCA(Cyano-hydroxycinnamic acid), RA(All-trans-retinoic acid), IAA(Indoleacrylic acid)이 좋지만 이에 한정되는 것은 아니다.

포자의 동정을 위한 종래의 말디-토프 질량분석법에서는 일반적인 미생물보다 매우 단단한 구조로 인하여 세포 파쇄 및 추출을 위한 복잡한 단계가 수반된다. 이로 인하여 시료 전처리 과정에서 많은 시간 및 노동력을 소비하게 되는 단점이 있다.

본 발명은 바실러스(Bacillus) 균류의 동정 시, 종래 기술과 같은 전처리를 생략하고 바실러스 포자 시료를 특별한 전처리 없이, 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 한다.

상기 점적 이후, 건조된 시료를 포함한 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate)를 말디-토프 질량분석기에 적용하여 바실러스(Bacillus) 균류를 동정한다.

본원 발명의 바실러스 균류의 동정 방법에서는 일반적인 미생물, 예를 들면 E. coli 등의 분석에 이용되는 레이저 세기에 비하여 높은 강도의 레이저 세기를 가하는 방법을 제공한다.

상기 높은 강도는 E. coli를 대상으로 측정하는 세기에 비하여 약 1.6배 이상, 더 바람직하게는 2.5 내지 2.7배에 해당한다. 상기 강도가 E. coli를 대상으로 측정하는 세기에 비하여 1.6배 이상이 되지 않으면 단단한 포자로 인하여 직접적인 in - situ 질량 분석이 불가능하고, 2.7배를 넘으면 스펙트럼 획득시 노이즈가 커지는 단점이 있다.

상기 높은 강도는 또한, 본원 발명에서 사용한 브루커(Bruker)사의 오토플렉스 스피드 엘알에프 질량 분석기(Autoflex Speed LRF mass spectrometer) 말디-토프 질량분석기의 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)에서 50% 이상이 바람직하고, 70 내지 80%인 레이저 세기가 더 바람직하다. 종래기술과 같이 전처리를 거친 얻어진 바실러스 균류를 동정하는 경우 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)에서 레이저강도는 30%에 해당한다.

상기 강도가 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)에서 50%보다 낮은 경우 단단한 포자로 인하여 직접적인 in - situ 질량분석이 불가능하고, 80%를 넘으면 스펙트럼 획득시 노이즈가 커지는 단점이 있다.

본 발명의 바실러스 균류는 일반적으로 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis), 바실러스 세레우스(Baciilus cereus), 바실러스 글로비지(Baciilus globigii), 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 또는 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis)를 지칭하지만, 포자를 형성하는 바실러스 속의 균류라면 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바실러스 균류의 동정 방법은 포자가 형성된 바실러스 균 자체를 시료로 사용하므로, 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 균류의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하여 특정 바실러스 균류를 동정할 수 있다.

본 발명에 따른 한 구현예에 따르면, 각 바실러스 포자 별로 재현성 있고 유의적으로 검출되는 바이오마커를 확인할 수 있다 (도 3 및 표 1).

즉, 다섯 종류의 바실러스 균류의 포자 모두 2,000에서 20,000 Da 사이의 질량 범위 내에서 서로 다른 패턴의 질량 스펙트럼과 서로 구별이 가능한 특이적 바이오마커가 검출되는 것을 알 수 있다 (도 3). 본원 발명에서는 이러한 바이오마커를 통해 바실러스 포자의 분석시스템을 완성하였다.

상기 바이오마커의 질량전하비율(m/z)과 그에 따른 표준편차 및 각 바이오마커들의 상대적인 검출강도와 각 검출강도에 대한 표준편차는 표 1에서 구체적으로 확인할 수 있다. 바이오마커들 사이에서도 검출세기가 높고 중요한 것들은 붉은색으로 나타내었다.

흥미롭게도 바실러스 글로비지(B. globigii) 포자의 경우 7.9 kDa에서 8.5 kDa 사이에서 상당히 넓고 독특한 패턴의 질량 스펙트럼이 확인되었고, 이는 바실러스 글로비지(B. globigii) 포자의 식별에 상당히 도움을 줄 것으로 기대된다. 바실러스 글로비지(B. globigii)의 매우 특이적인 패턴은 표 1에서 노란색 블록으로 표시되어 있다.

또한 생물학작용제로 이용이 가능한 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis) 포자의 경우 매우 유사한 종인 바실러스 세레우스(Baciilus cereus) 와 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis)와도 쉽게 구별이 되는 것을 확인하였다.

좀 더 구체적으로 살펴 보면, 본 발명의 바실러스 균류 중 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis) 포자의 바이오마커는, 바람직하게는 2196, 2473, 2503, 2786, 3089, 3376, 3594, 6684, 6753, 6840, 9746의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 2080, 2097, 2196, 2446, 2473, 2503, 2518, 2523, 2579, 2786, 3075, 3089, 3150, 3341, 3376, 3576, 3594, 3653, 4031, 4196, 4328, 4383, 4554, 4956, 5263, 5541, 6684, 6699, 6753, 6840, 9746의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 균류 중 바실러스 세레우스(Baciilus cereus) 포자의 바이오마커는, 바람직하게는 3357, 3419, 3709, 4836, 4953, 6714, 6839, 7085의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 2109, 2123, 3079, 3193, 3357, 3419, 3542, 3709, 3807, 4031, 4335, 4425, 4836, 4953, 5173, 6714, 6839, 7085의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 균류 중 바실러스 글로비지(Baciilus globigii) 포자의 바이오마커는, 바람직하게는 2324, 2870, 2886, 2992, 3123, 4447, 7907, 8053, 8199, 8345, 8492, 8895의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 2324, 2870, 2886, 2918, 2934, 2992, 3123, 3430, 3760, 4418, 4447, 4682, 5047, 7072, 7336, 7907, 8053, 8199, 8345, 8492, 8895의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 균류 중 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 포자의 바이오마커는, 바람직하게는 2324, 2720, 2871, 2887, 2935, 3116, 5299, 5948, 7338, 8201, 8347, 8494, 8896, 11898의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 2324, 2720, 2871, 2887, 2919, 2935, 2991, 3116, 3528, 4448, 5048, 5299, 5948, 7073, 7338, 8201, 8347, 8494, 8896, 11056, 11898의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 바실러스 균류 중 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis) 포자의 바이오마커는, 바람직하게는 2109, 2127, 3357, 3419, 3709, 6715, 6840, 7086의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있고, 더 바람직하게는 2109, 2127, 2266, 2380, 2529, 3095, 3357, 3419, 3542, 3709, 4031, 4335, 4425, 4837, 4971, 5173, 6352, 6715, 6840, 7086의 특징적인 질량전하비율(m/z) 값을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 바실러스 균류의 동정 방법 및 바실러스 포자의 분석시스템은 종래 기술에 비하여 현저하게 적은 노력과 시간에도 불구하고 특정 바실러스 균류를 간편하고 정확하게 동정할 수 있다.

이하, 본 발명은 하기 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 바실러스 균류의 배양

본 발명에서는 한국질병관리본부로부터 제공받은 바실러스 안트라시스 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis), 바실러스 세레우스(Baciilus cereus), 바실러스 글로비지(Baciilus globigii), 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 및 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis)를 사용하였다. 각 균주의 단일 콜로니를 포자화를 위하여 nutrient broth sporulation medium에 접종한 후 32℃에서 2~4일 동안 진탕 배양하였다. 배양은 광학현미경으로 99% 이상 포자화가 이루어 졌을 때까지 진행하였다. 이런 과정을 통하여 배양된 포자들은 원심분리를 통하여 상등액 및 세포 잔해를 제거한 정제된 포자를 회수하였다. 포자 형성 및 포자의 순수 정제는 400배 광학 현미경으로 관찰하여 확인하였고, 이때 포자의 순도는 80~90%였다. 수집된 포자들은 증류수에 1×10⁹CFU/ml 농도로 현탁하여 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.

실시예 2

말디-토프 질량분석법을 통한 포자의 분류를 위하여, 도 1에서와 같이 1Χ10^8~9CFU/ml 로 준비된 1 ul의 바실러스 안트라시스(B. anthracis)포자들을 어떠한 전처리 과정도 거치지 않고 MTP 384 target ground steel TF (Bruker Daltonics, 독일)에 직접적으로 점적하고 상온에서 약 5분간 건조시켰다. 이후 100% 아세토니트릴(acetonitrile; ACN, Sigma, USA) 와 0.3% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA, Sigma, USA)를 2:1 (vol/vol)로 혼합한 TA₂에 12 mg/ml 로 준비된 메트릭스 용액 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)) 1 ul를 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에서 건조된 각 포자들 위에 점적한 후 상온에서 5분간 건조시켰다.

포자의 질량 스펙트럼은 브루커(Bruker, Germany) 사의 Autoflex Speed LRF mass spectrometer를 사용하여 측정하였다. 파동 이온 추출(Pulse ion extraction) 시간은 200 ns 였다. 스펙트럼 측정은 ion source 1과 2에서 19.51 kV 와 18.26 kV의 가속 전압을 사용하는 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)의 일반 모드(linear mode)를 이용하였다. 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)에서 레이저 세기를 77%로 설정하였다.

포자 분석의 경우 엠비티_에프씨 파라미터(MBT_FC parameter)에서 레이저 세기를 50% 이하로 설정하면 질량 스펙트럼을 얻을 수 없었다.

렌즈 전압은 7.00 kV 였다. 포자의 질량 스펙트럼은 낮은 질량 범위인 0.5에서 2 kDa, 그리고 중간 질량 범위인 2에서 20 kDa에서 측정하여 저장하였다. 질량 스펙트럼을 보정하기 위한 기준 균주로서 Escherichia coli DH5a (Bruker Daltonics, Germany)를 이용하였다. peak assignment tolerance를 1000 ppm 이내에서 수행하였다. 각각의 포자 스펙트럼을 위해서 최소 200 레이저 샷을 합산하였다. 각 포자들의 질량 스펙스럼 데이터는 Bruker’s Flex Control software package (v. 3.3; Bruker Daltonics)를 이용하여 획득하였다. 각 질량 스펙트럼은 Savitzky Golay 방법을 통한smoothing, TopHat 방법을 통한baseline subtraction, 그리고 intensity normalization을 이용하여 가공하였다. 포자 바이오마커의 비교 분석을 위하여 질량전하비율(m/z)에 각 피크의 강도(intensity) 정보를 Centroid 알고리즘을 이용하여 확인하였다. 바이오마커 분석은 피크 패턴의 재현성을 확인하기 위하여 각 바실러스 포자별로 총 20번 이상의 실험을 수행하였다.

비교예 1

본원 발명에 따른 실시예 2에 의한 처리를 다른 시료 준비 방법과 비교하기 위하여 비활성화 방법 및 비즈 분쇄(bead beating)와 트리플루오로아세테이트(TFA) 추출을 조합한 방법을 도입하여 시료를 말디 플레이트에 처리한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.

비활성화 방법은 P. Lasch, et . al . ,2009에 기재된 바와 같이 수정된 TFA 비활성화 방법을 도입하였다. 비즈 분쇄(Bead beating)와 트리플루오로아세테이트(TFA) 추출을 조합한 방법은 먼저 30ul의 순수한 에탄올 (Merck, Germany)과 5 ul의 포자 샘플을 5분 동안 voltexing하여 혼합 후, 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리 하였다. 이후 상등액을 제거하고 상온에서 2분 동안 에탄올을 증발시켰다. 기계적인 힘에 의하여 포자를 파쇄하고 효율적인 추출을 위하여 적은 양의 비즈(beads) (7 ul)와 7 ul의 아세토니트릴(ACN)을 침전된 포자 샘플에 첨가하고 5분 동안 voltexing 하였다. 그리고 난 후, 7 ul의 70% formic acid (Sigma, USA)를 첨가한 후 10분 동안 voltexing을 수행하였다. 위와 같이 3 가지 방법 (직접적 in - situ 질량분석 방법, 비활성화 방법, 추출 방법)으로 준비된 포자 샘플들은 최소 3번씩 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 에 점적하여 비교 분석하였다.

실시예 2 및 비교예 1에 해당하는 결과는 도 2에서 보는 바와 같다. 즉, 본원 발명에 따른 전처리 없이 포자를 형성하는 바실러스 균류를 직접 말디 타겟 플레이트에 점적하는 방법은 종래 전처리 과정을 거친 방법과 비교했을 때 더욱 풍부한 특이적 피크를 갖는다는 점을 알 수 있다.

실시예 3

바실러스 균류 포자들 간의 식별을 확인하기 위하여 다섯 종류의 바실러스 포자 즉, 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis), 바실러스 세레우스(Baciilus cereus), 바실러스 글로비지(Baciilus globigii), 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 또는 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis)를 말디-토프 질량분석기를 이용하여 상기의 발명 방법으로 질량분석을 수행하여 피크를 분석하였다. 실험방법은 실시예 2와 동일하였다.

상기 결과를 하기 표 1에 도시하였다.

Claims

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말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스(Bacillus) 균류의 동정 방법에 있어서, 포자를 형성하는 바실러스 균류를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 균류의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 방법이며, 상기 바실러스 균류의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 하기 (1) 내지 (5)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 바실러스 균류의 동정 방법.
(1) 2196, 2473, 2503, 2786, 3089, 3376, 3594, 6684, 6753, 6840 및 9746;
(2) 3357, 3419, 3709, 4836, 4953, 6714, 6839 및 7085;
(3) 2324, 2870, 2886, 2992, 3123, 4447, 7907, 8053, 8199, 8345, 8492 및 8895;
(4) 2324, 2720, 2871, 2887, 2935, 3116, 5299, 5948, 7338, 8201, 8347, 8494, 8896 및 11898; 또는
(5) 2109, 2127, 3357, 3419, 3709, 6715, 6840 및 7086
청구항 12에 있어서, 상기 바실러스 균류의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 하기 (1) 내지 (5)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 바실러스 균류의 동정 방법.
(1) 2080, 2097, 2196, 2446, 2473, 2503, 2518, 2523, 2579, 2786, 3075, 3089, 3150, 3341, 3376, 3576, 3594, 3653, 4031, 4196, 4328, 4383, 4554, 4956, 5263, 5541, 6684, 6699, 6753, 6840 및 9746;
(2) 2109, 2123, 3079, 3193, 3357, 3419, 3542, 3709, 3807, 4031, 4335, 4425, 4836, 4953, 5173, 6714, 6839 및 7085;
(3) 2324, 2870, 2886, 2918, 2934, 2992, 3123, 3430, 3760, 4418, 4447, 4682, 5047, 7072, 7336, 7907, 8053, 8199, 8345, 8492 및 8895;
(4) 2324, 2720, 2871, 2887, 2919, 2935, 2991, 3116, 3528, 4448, 5048, 5299, 5948, 7073, 7338, 8201, 8347, 8494, 8896, 11056 및 11898; 또는
(5) 2109, 2127, 2266, 2380, 2529, 3095, 3357, 3419, 3542, 3709, 4031, 4335, 4425, 4837, 4971, 5173, 6352, 6715, 6840 및 7086
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 (1) 그룹과 같은 질량전하비율(m/z) 값을 갖는 시료는 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis)로 판정하는 것을 특징으로 하는 바실러스 균류의 동정 방법.
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 (2) 그룹과 같은 질량전하비율(m/z) 값을 갖는 시료는 바실러스 세레우스(Baciilus cereus)로 판정하는 것을 특징으로 하는 바실러스 균류의 동정 방법.
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 (3) 그룹과 같은 질량전하비율(m/z) 값을 갖는 시료는 바실러스 글로비지(Baciilus globigii)로 판정하는 것을 특징으로 하는 바실러스 균류의 동정 방법.
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 (4) 그룹과 같은 질량전하비율(m/z) 값을 갖는 시료는 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis)로 판정하는 것을 특징으로 하는 바실러스 균류의 동정 방법.
청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 (5) 그룹과 같은 질량전하비율(m/z) 값을 갖는 시료는 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis)로 판정하는 것을 특징으로 하는 바실러스 균류의 동정 방법.
말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 포자의 분석방법에 있어서, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 포자를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 분석방법이며, 상기 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2196, 2473, 2503, 2786, 3089, 3376, 3594, 6684, 6753, 6840 및 9746인 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis) 포자의 분석방법.
청구항 19에 있어서, 상기 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 표준편차를 포함하여 2080, 2097, 2446, 2518, 2523, 2579, 3075, 3150, 3341, 3576, 3653, 4031, 4196, 4328, 4383, 4554, 4956, 5263, 5541 및 6699을 더 포함하는 바실러스 안트라시스(Baciilus anthracis) 포자의 분석방법.
말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자의 분석방법에 있어서, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 분석방법이며, 상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 3357, 3419, 3709, 4836, 4953, 6714, 6839 및 7085인 바실러스 세레우스(Baciilus cereus) 포자의 분석방법.
청구항 21에 있어서, 상기 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2109, 2123, 3079, 3193, 3542, 3807, 4031, 4335, 4425 및 5173를 더 포함하는 바실러스 세레우스(Baciilus cereus) 포자의 분석방법.
말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스 글로비지(Bacillus globigii) 포자의 분석방법에 있어서, 바실러스 글로비지(Bacillus globigii) 포자를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 글로비지(Bacillus globigii) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 분석방법이며, 상기 바실러스 글로비지(Bacillus globigii) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2324, 2870, 2886, 2992, 3123, 4447, 7907, 8053, 8199, 8345, 8492 및 8895인 바실러스 글로비지(Baciilus globigii) 포자의 분석방법.
청구항 23에 있어서, 상기 바실러스 글로비지(Bacillus globigii) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2918, 2934, 3430, 3760, 4418, 4682, 5047, 7072 및 7336를 더 포함하는 바실러스 글로비지(Baciilus globigii) 포자의 분석방법.
말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 포자의 분석방법에 있어서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 포자를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 분석방법이며, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2324, 2720, 2871, 2887, 2935, 3116, 5299, 5948, 7338, 8201, 8347, 8494, 8896 및 11898인 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 포자의 분석방법.
청구항 25에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2919, 2991, 3528, 4448, 5048, 7073 및 11056를 더 포함하는 바실러스 서브틸리스(Baciilus subtilis) 포자의 분석방법.
말디-토프 질량 분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometer; MALDI-TOF MS)를 이용한 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 포자의 분석방법에 있어서, 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 포자를 포함하는 시료를 어떠한 전처리 없이 말디 타겟 플레이트(MALDI target plate) 위에 직접 점적하는 것을 특징으로 하고, 20회를 반복하여 구한 표준 편차 값을 합한 시료의 질량전하비율(m/z) 값을 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값과 상호 비교하는 분석방법이며, 상기 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2109, 2127, 3357, 3419, 3709, 6715, 6840 및 7086인 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis) 포자의 분석방법.
청구항 27에 있어서, 상기 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis) 포자의 바이오마커의 질량전하비율(m/z) 값이 2266, 2380, 2529, 3095, 3542, 4031, 4335, 4425, 4837, 4971, 5173 및 6352를 더 포함하는 바실러스 투린지엔시스(Baciilus thuringiensis) 포자의 분석방법.