KR20100106336A

KR20100106336A - 대기 중 에어로졸의 실시간 에어로졸 질량 분석에 대한 매트릭스 및 실시간 에어로졸 maldi ms 방법

Info

Publication number: KR20100106336A
Application number: KR1020107012400A
Authority: KR
Inventors: 아르얀 라우렌스 웨이케하위스; 찰스 엘리자 키인츠; 카를라 엘리자베스 안나 마리아 디겐하르트-란겔란
Original assignee: 네덜란제 오르가니자티에 포오르 토에게파스트-나투우르베텐샤펠리즈크 온데르조에크 테엔오
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2010-10-01
Also published as: WO2009064180A1; IL205662A0; EP2210110A1; US20120018628A1; EP2060919A1; BRPI0820211A8; JP5209732B2; US8409870B2; CA2705506A1; JP2011503605A; EP2210110B1; BRPI0820211B1; BRPI0820211A2; CN101855556A; CN101855556B; ES2416183T3

Abstract

본 발명은 MALDI 질량 분석에 대한 매트릭스 물질, MALDI 질량 분석, 특히 에어로졸 MALDI 질량 분석에 대한 매트릭스 조성에 관한 것이고, MALDI 질량 분석 방법, 특히 에어로졸 MALDI 질량 분석 방법에 관한 것이고, MALDI 매트릭스 물질로서 특정한 화합물의 사용, 기상 코팅 방법에서 MALDI 매트릭스 성분의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 상기 매트릭스 물질은 화학식(1)로 표시되는 2-머캅토-4, 5-디알킬티아졸을 포함한다.

(1)
여기서 X는 질소(N), 황(S) 또는 산소(O)이고, R¹ 및 R²는 각각 수소, 메틸(methyl), 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy) 및 프로톡시(prothoxy)로부터 선택되거나, R¹ 및 R²는 부분적으로 치환된 부분적으로 하나 이상의 탄소가 아닌 원자(heteroatom)를 포함하는 방향족 고리 또는 그것들의 호변체 형태(tautomeric form)를 형성하도록 서로 합쳐진다. 매트릭스 조성은 상기 매트릭스 물질 및 알코올을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 알코올은 할로겐화될 수 있다. 상기 MALDI MS 방법은 상기 매트릭스 물질 또는 상기 매트릭스 구성으로 상기 분석체의 적어도 일부분에서 이온화 하는 것 및 질량 분석기, 일례로 TOF-MS를 사용하여 상기 이온화된 성분을 분리하는 것과 같이 상기 분석체에 접촉하는 것을 포함한다. 바이오에어로졸은 기상에서 상기 매트릭스 물질과 접촉되는 것이 바람직하다.

Description

ＭＡＬＤＩ 매트릭스 및 ＭＡＬＤＩ 방법 {MALDI MATRIX AND MALDI METHOD}

본 발명은 에어로졸 MALDI 매트릭스 물질로써 특정한 화합물의 사용 및 기상(gas phase) 코팅 방법에서 MALDI 매트릭스 구성(composition)의 사용에 대한 에어로졸 MALDI 질량 분석 방법(aerosol MALDI mass spectrometry)에 관련된 것이다.

질량분석(MS)에서 연성이온화(soft ionization)로써 매트릭지원 레이저탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)의 도입은 생화학적으로 중요한 고분자를 포함하는 다양한 고질량 화합물(high mass compound)의 분석에 대변혁을 일으켜왔다. MALDI는 일반적으로 400 내지 350000Da 사이의 분자량(molecular weight)을 가지는 단백질, 펩타이드(peptide), 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 올리고당류(oligosaccharides) 및 합성 고분자(synthetic polymer)와 같은 크고, 비휘발성(non-volatile)이고 열적으로 불안정한(labile) 화합물로부터 온전한 기상 이온들의 생성하도록 하는 방법이다. 상기 MALDI MS 방법에 따라, 매트릭스는 레이저 빔에 의해 상기 불안정한 분석체 분자가 직접적으로 파괴되는 것을 막기 위하여 사용된다.

실시간 에어로졸 단입자 MALDI의 경우에, 상기 에어로졸들은 상기 기상에서 매트릭스 물질로 코팅될 필요가 있다. 그러므로 상기 매트릭스 물질은 충분히 휘발성이어야 한다. 또한 매트릭스 물질의 충분한 양은 상기 에어로졸들에 증착되어야 한다. 특히 바이오에어로졸에서 일부 시도들은 에어로졸들에서 MALDI 분석을 수행하는 상기 사전 기술에서 만들어져 왔다.

일례로 WO-A-02/052246에서 증발(evaporation)/응결(condendsation) 또는 승화(sublimation)/응결에 의하여 MALDI 매트릭스로 제공되는 에어로졸에 대한 MALDI MS 방법을 설명한다. 이 문서에 따라 MALDI 매트릭스로 코팅된 상기 건조 에어로졸은 펄스 레이저(pulsed laser)로 이온화될 수 있다. 그 뒤에 상기 이온화된 성분은 TOF MS에 의해 분석될 수 있다.

바이오에어로졸에 포함된 미생물을 분석하기 위해, 세균 종뿐만 아니라 세균 균주(bacterial strain) 또는 특정한 발달 형태에 대한 상기 단백질 특성은 분석되어야 한다. 그러나 이런 특성 단백질들(1-20kDa 의 분자 질량 범위에 있는 리보좀 단백질(ribosomal protein)과 같은)의 대부분은 세포막(cell membrane)에 의해 보호되고 있고, 그렇기 때문에 이온화하기에 용이하지 않다. 그러므로 바이오에어로졸은 종종 일례로 이온화하기 전에 상기 세포막의 부분적 분해에 의해서 이온화에 대하여 상기 단백질을 이용 가능하게 하는 작업 중 처리를 필요로 한다. 관행적으로 종래의 MALDI로 그러한 처리는 상기 미생물 분석체의 추가 및 상기 혼합물의 추가 건조가 뒤따르는 물 및 아세톤니트릴(acetonitrile)에 산 및 상기 MALDI 매트릭스 물질의 상기 용액을 포함한다. 상기 산은 부분적으로 상기 세포벽을 약화시키고, 그렇게 함으로써 이온화에 대하여 상기 특성 고분자를 이용 가능하게 한다. 이 방법에서 중요한 파라미터는 분석체에 대한 매트릭스 및 산의 비율 및 건조한 후의 상기 매트릭스의 결정 형성이다. 상기 방법은 상기 분석체의 준비하는 데 많은 단계와 시간이 걸리므로 실시간 샘플링(sampling) 및 분석에 거의 적합하지 않다는 것이 분명하다. 또한 본 발명자들은 매트릭스 증발에 필요한 고온(>80℃)과 결합된 상기 산성조건의 사용은 상기 기상에서 단백질 입자의 MS 탐지 반응에 나쁜 영향을 갖는다는 것을 인식했다. 또한 상기 매트릭스 물질은 산 또는 산 용액 조건의 존재 하에서 더 빠르게 분해된다.

종래의 MALDI 질량 분석 장비는 높은 수행능력을 갖고 있고, 따라서 균주 수준(strain level)에서 박테리아의 식별에 대한 일례에 적합하다. 그러나 온라인(on-line) 에어로졸 MALDI MS의 상기 수행, 특히 1~20kDa의 범위에 있는 상기 분자 질량을 가진 단백질의 작업 중 바이오에어로졸 MALDI MS의 상기 수행은 아직 만족스럽지 않다.

적절한 MALDI 매트릭스 물질로, 미생물 및/또는 단백질을 포함하는 에어로졸 같은 바이오에어로졸의 코팅은 상기 생체 물질(biological material)을 포함하는 상기 바이오 에어로졸의 작업 중 특성 평가를 가능하게 한다. 에어로졸은 WO-A-01/052246에서 설명한 것과 같이 상기 기상으로부터 상기 에어로졸에 상기 매트릭스 물질을 응집시킴으로써 매트릭스 물질로 코팅할 수 있다. 그러나 이 방법은 대부분의 매트릭스 물질들이 대기압에서 매우 휘발성 및/또는 열적으로 안정하기 때문에 대부분의 매트릭스 물질들에 대해 적합하지 않다. 또한 3-니트로벤질 알코올(3-nitrobenzyl alcohol) 및 피콜린산(picolinic acid)과 같은 일부 알려진 휘발성 매트릭스 물질들은 만족스럽지 못한 신호의 질을 나타낸다. 적절한 MALDI 매트릭스 물질이 매우 필요하다. 또한 상기 기상에서 적절한 MALDI 매트릭스로 코팅된 에어로졸을 제공하기 위한 향상된 방법이 매우 필요하다. 또한 특히 1~20kDa의 상기 범위에 있는 상기 특질 단백질의 고응답을 산출하도록 매트릭스 물질의 양이 충분한 에어로졸을 포함하는 기상 미생물을 제공하는 것은 숙제로 남아 있다.

본 발명의 목적은 매트릭스 물질 및 실시간/직접 준비 기술, 즉 사전에 바이오에어로졸의 수집하지 않는 만족스러운 신호의 질을 갖는 에어로졸 MALDI 질량 분석에 대한 상기 요구를 충족시키기 위한 것이다.

더 나아가 본 발명의 목적은 에어로졸, 특히 바이오에어로졸에서 MALDI 질량 분석을 수행하는데 있어서 당면한 문제들을 극복하는 것이다.

더 특히, 본 발명은 매트릭스 물질 층을 가진 MALDI 분석체 에어로졸 표면을 코딩하는 것에 대하여 적절한 방법을 제공하도록 한다.

MALDI MS의 상기 연성이온화 기술은 일반적으로 생체분자의 분석을 가능하게 한다. 일례로 MALDI MS는 상기 분석 및 (일부의) 미생물의 분류에 사용된다.

MALDI MS 분석은 두 단계를 포함한다. 첫 번째 단계는 매트릭스 물질의 과잉 분량과 상기 분석체를 혼합하는 것으로 시료를 준비하는 것을 포함한다. 상기 MALDI 과정의 두 번째 단계는 레이저광의 강하고 짧은 펄스(pulse)에 의해 상기 고체 시료의 대부분의 탈착을 포함한다. 상기 매트릭스는 상기 분석체 서로간의 격리, 상기 분석체를 탈착하도록 상기 레이저광으로부터의 에너지 흡수 및 이온화 활동의 세 가지 목적을 제공한다고 여겨진다. 상기 레이저 광은 상기 매트릭스 및 이온화되는 분석체 시료의 작은 조각을 만들어낸다. 상기 결과로써 생긴 기상 이온의 분자 질량은 일반적으로 전기장에서 상기 이온화된 분자들을 가속하고, 이동시보 탐지기(time-of-flight(TOF) detector)에서 그것들의 질량에 기초하여 상기 분자를 분리하는 것에 의하여 결정된다. MALDI-TOF는 성분의 매우 작은 양도 검출하는 것이 가능한 매우 고감도의 방법이다.

상기 적용된 매트릭스 물질은 일반적으로 작은 유기산이다. 일반적으로 사용되는 매트릭스 물질은 3,5-디메톡시-4-하이드록시신남산(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid)(시나핀산, sinapinic acid), α-시아노-4-하이드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)(α-시아노 또는 α-매트릭스) 및 2, 5-디하이드록시벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid, DHB)을 포함한다. 일반적으로 상기 매트릭스 물질은 고순도수(highly purified water) 및 다른 유기 혼합물(일반적으로 아세토나이트릴(acetonitrile, CAN))의 혼합물에 용해시킨다. 산은 상기 분석체의 질량 스펙트럼에서 염 불순물들(salt imputity)의 불안정한 영향을 억제할 수 있으므로, 일반적으로 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)와 같은 일부의 산은 또한 첨가된다. 또한 상기 매트릭스 용액의 pH를 감소시키는 것은 일반적으로 신호의 수와 강도를 증가시키는 것과 같이 상기 시료의 질을 향상시키는 결과를 가져온다.

다음으로 상기 매트릭스 용액은 조사할 분석체와 섞인다. 상기 물은 친수성 고분자가 용해될 수 있도록 하는 동안 상기 유기 화합물(일례로 ACN)은 상기 시료에 소수성 고분자가 용해될 수 있도록 한다. 종래의 MALDI 방법에서 이 용액은 MALDI 접시(일반적으로 이 목적으로 설계된 금속접시)에 떨어뜨린다. 상기 용매는 상기 재결정화된 매트릭스만 남기고 상기 매트릭스 결정의 전체적으로 분포되어 있는 상기 분석체 단백질은 가지고 증발한다.

일반적으로 에어로졸 MALDI 질량 분석에서 상기 발전은 에어로졸화하기 전에 분석체를 미리 혼합한 매트릭스 또는 에어로졸 입자들의 실시간 공중(in-flight) 코팅이라는 시료 처리의 두 가지 방향을 모두 따른다. 상기 공중 매트릭스 코팅은 대기 중 바이오에어로졸(bioaerosol)의 에어로졸 MALDI 질량 분석을 작업 중에 할 수 있게 한다.

실시예들은 생물체에서 기원한 물질로부터 식별되는 MS 지문들을 발생시키도록 하는 포괄적인 가능성을 나타내었다. 에어로졸 MALDI TOF MS와 결합된 본 발명은 균주 수준까지 용이한 종의 식별을 위한 신속하고 빠른 도구인 것을 입증해 왔다.

본 발명의 시료 매트릭스 조건들을 사용할 때 MALDI 결과는 일반 MALDI과 거의 동일할 것이며, 이것은 데이터베이스를 만들어 내도록 일반 MALDI의 불가피한 지원의 효용성 및 해석에 대하여 이 데이터베이스들의 사용을 나타낸다. 일반 MALDI와 비교된 것과 같이 에어로졸 MALCI TOF MS와 결합된 본 발명은 벌크 물질(bulk material) 대신 단일 입자 수준에서의 분석 때문에 자연적인 무기물 및 생물학적 배경의 존재에 의해 영향을 받지 않거나 영향을 줄이는 매우 큰 장점이 있다.

도 1은 실험적 구성도이다. 범례는 실시예 1에서 설명.
도 2는 생리식염수에서 하룻밤 유지된 비티균(B. thuringiensis) 세포의 매일 행해지는 재현성의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS의 스펙트럼이다.
도 3은 비티균 포자(A) 및 세포(B)의 공중 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.
도 4는 바실루스글로비지균(B.globigii)(A), 바실루스세레우스균(B. cereus)(B) 및 비티균 포자(C)의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.
도 5는 두 바실루스세레우스 균주의 공중 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.
도 6은 한 배양균(culture)에서 각 비티균 영양 세포(vegetative cell)/군생 입자(clustered particle)의 다른 지문의 예를 나타내는 스펙트럼이다.
도 7은 표준화된 매트릭스 조건을 사용하여 세균 배양 접시(agar plate)에서 배양된 비티균 영양 세포의 일반(정지) MALDI에 대한 실시간(실시간) 에어로졸 MALDI의 예를 나타내는 스펙트럼이다.
도 8은 표준화된 매트릭스 조건을 사용하여 세균 배양 접시에서 배양된 에르위니아하이르비콜라(E. herbicola) 및 대장균(E. coli)의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.
도 9는 6000~12000Da의 특성 광대역폭을 가진 AcNPV 바이러스(A) 및 1242~1245~1259Da, 6460 및 8675Da에서 특성 신호 연속발생의 CpGV(B)의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이고, (B-a) 및 (B-b)는 확대도이다.
도 10은 물에서의 참조 콜레라 독소(cholera toxin)(합산된 600샷(shot)/입자) 및 수로용수 600샷/입자로부터 선택된 샷이 포함되어 있는 12개 합산된 콜레라 독소의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.
도 11은 J558 B 림프구 및 불사화 T 림프구 세포주 (Jurkat T lymphocytes cell line)의 실시간 에어로졸 MALDI TOF MS 스펙트럼이다.

첫 번째 측면에서 본 발명은 화학식(1)로 표시되는 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌(2-mercapto-4,5-dialkylheteroarene)을 포함하는 MALDI MS에 대하여 매트릭스 물질과 관련된다.

(1)

여기서 X는 질소(N), 황(S) 또는 산소(O)이고, R¹ 및 R²는 각각 수소, 메틸(methyl), 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy) 및 프로톡시(prothoxy)로부터 선택되거나, R¹ 및 R²는 부분적으로 치환된 부분적으로 하나 이상의 탄소가 아닌 원자(heteroatom)를 포함하는 방향족 고리 또는 그것들의 호변체 형태(tautomeric form)를 형성하도록 서로 합쳐진다.

본 발명자는 화학식 (1)의 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌이 에어로졸 MALDI MS에 대하여 매우 적절한 매트릭스 물질이라는 것을 발견했다. 상기 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌 매트릭스 물질은 탁월한 신호의 질을 제공한다. MALDI 분석에 대하여 분석체의 요구량은 그것에 의해서 현저하게 감소한다. 또한 본 발명의 상기 매트릭스 물질은 가장 종래의 매트릭스 물질보다 매우 더 휘발성이 있기 때문에 에어로졸 MALDI MS에 대하여 더 적합하다.

R¹ 및 R²는 수소, 메틸(methyl), 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy) 및 프로톡시(prothoxy)로부터 선택될 수 있다. 이 작은 곁가지 분자(side group)들은 상기 매트릭스 물질의 상기 희망했던 휘발성을 보장한다. R¹ 및 R²는 또한 하나 이상 부분적으로 치환되고, 부분적으로 하나 이상의 탄소가 아닌 원자를 포함하는 방향족 고리(붙은 고리(fused ring)를 포함하여)를 형성하도록 서로 합쳐진다. 상기 하나 이상의 방향족 고리 구조는 일례로 단일 방향족 5, 6 및 7원 방향족 고리(membered aromatic ring)를 포함할 수 있다.

R¹ 및 R²는 동일한 것이 바람직하고, R¹ 및 R²는 양 쪽 다 메틸기인 것이 더 바람직하다. X는 황인 것이 바람직하다.

R¹ 및 R²는 양 쪽 다 메틸기인 2-머캅토-4, 5-디메틸티아졸(2-mercapo-4, 5-dimethylthiazole)을 가질 때 매우 좋은 결과를 얻을 수 있다.

화학식 (1)인 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌의 두 개의 다른 호변체 형태 중 하나는 양성자(proton)가 티올(thiol)의 황 원자에 붙어있고 다른 하나는 양성자가 방향족 고리의 질소 원자에 붙어있다. 이 두 가지 호변체 형태는 다음과 같다.

실시간 에어로졸 MALDI MS에 대하여, 상기 매트릭스 물질은 에어로졸에 상기 매트릭스 물질을 증착(deposit)시키기 위하여 상기 기상으로 유입되어야 한다. 상기 매트릭스 물질은 대기압에서 상기 분석체에 증착되는 것이 바람직하다. 비록 화학식 (1)의 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌은 상기 기상에 유입될 수 있더라도, 본 발명자는 증발될 수 있는 매트릭스 물질의 양이 상기 적용된 증발열(evaporation heat)에 의해 상기 물질의 분해 때문에 제한된다는 것을 인식하였다. 일반적으로 상기 매트릭스 물질은 약 90℃ 이상의 온도에서 분해하기 시작한다.

상기 분해된 물질의 분석은 화학식 (1)의 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌의 상기 분해 산물(decomposition product)은 두 분자가 상기 티올기를 매개로 하여 붙어있는 상기 원래 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌의 복합 화합물(conjugate)을 포함한다. 상기 결합의 일부는 다른 것들이 -C-S-S-C- 결합을 통하여 연결되어 있는 반면에 -C-S-C- 결합을 통하여 연결된다.

이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 상기 -C-S-C- 결합을 가진 복합 화합물은 H₂S의 방출 하에서 두 개의 다른 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 분자의 상기 티올 기 분자간의 반응에 의해 형성된다고 생각한다. 또한 본 발명자들은 상기 -C-S-S-C- 결합을 가진 상기 복합 화합물은 두 양성자 및 두 전자의 방출 하에서 두 개의 다른 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 분자의 상기 티올 기의 산화반응(oxidation reaction)에 의하여 형성된다.

본 발명자는 상기 매트릭스 용약에 알코올을 첨가함으로써 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 분자의 상기 티올 기를 적어도 부분적으로 보호하는 것이 가능함을 발견하였다. 상기 알코올은 다음과 같이 상기 양성자가 상기 방향족 질소에 붙어있는 상기 호변체 형태의 상기 티올 황 원자의 자유전자쌍(free electron pair)를 가진 수소 결합(hydrogen bond)를 형성할 수 있다.

그 결과, 상기 양성자가 상기 방향족 질소에 붙어있는 상기 호변체 형태는 선호되고, 상기 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌은 이 호변체 형태에 주로 존재한다. 또한 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 분자들과 상기 알코올 분자들 사이의 수소 결함의 형성은 상기 매트릭스 물질의 휘발성을 증가시킬 수 있다.

그래서 다른 측면에서 본 발명은 화학식 (1) 또는 그것들의 호변체 형태 및 알코올에 따라 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌을 포함하는 실시간 에어로졸 MALDI MS에 대하여 매트릭스 구성과 관련된다. 상기 에어로졸에 상기 매트릭스 물질을 증착하기 위하여 상기 기상으로 순조롭게 유입될 수 있기 때문에 이 매트릭스 구성은 특히 에어로졸 MALDI MS에 유리하다.

상기 알코올의 분자 질량은 상대적으로 낮은 것이 바람직하다. 적절한 알코올은 일례로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올(n-butanol), 이차부탄올(sec-butanol), 이소부탄올 및 삼차부탄올(tert-butanol)이다. 또한 하나 이상의 하이드록시 기를 가진 알코올들은 글리콜(glycol), 프로판-1,2-디올(propane-1,2-diol), 프로판-1,3-디올, 글리세롤(glycerol), 부탄-1,2-디올(butane-1,2-diol), 부탄-1,3-디올, 부탄-2,3-디올, 부탄-1,2,3-트리올(butane-1,2,3-triol) 및 부탄-1,2,4-트리올과 같이 적용될 수 있다.

비록 일반적으로 디올 및 트리올과 같은 다가 알코올(polyhydric alcohol)들은 일가 알코올(monohydric alcohol)들 보다 휘발성이 더 낮더라도, 그것들은 수소 결합(hydrogen bridge)의 형성을 할 수 있는 여분의 하이드록실 기(hydroxyl group)를 갖는다는 이점을 갖는다.

또한 상기 알코올(특히 에탄올)은 이온화하는 동안 사용할 수 있게 되도록 관심있는 상기 단백질들에 대하여 충분한 정도로 상기 세포벽을 분해하는 것이 가능하다. 그러므로 그 때 상기 알코올의 존재는 상기 미생물로부터 특성화한 단백질들을 분리하기 위한 이형제(release agent)로써 작용한다.

알코올의 존재의 중요한 이점은 상기 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 매트릭스 물질이 상기 가해진 증발/승화 열에 의하여 분해되지 않거나 적어도 덜 빠르게 분해된다. 알코올과의 조합에서 본 발명의 상기 매트릭스 물질은 적어도 알코올의 농도가 0으로 낮춰질 때 몇 분 또는 몇 시간인 것에 비해, 일례로 150℃의 온도로 가열할 때에도 10개월, 바람직하게는 적어도 12개월의 예와 같이 상당히 증가된 시간 동안 그것의 활동을 유지하는 것을 발견하였다.

100℃ 이상, 바람직하게는 120℃ 이상, 더 바람직하게는 150℃ 이상의 온도와 같이 높은 온도의 사용은 또한 상기 미생물들로부터 특성화한 단백질을 분리하는데 도움이 된다(일례로 Horneffer 등, J. Am. Soc, Mass Spectrom. 2004, 15(10), 1444~1454 참조)

본 발명자들은 할로겐화된 알코올(halogenated alcohol)들을 첨가하는 것이 유익하다는 것을 더 발견했다. 선호되는 할로겐은 염소, 특히 더 선호되는 것은 불소이다. 특히 상기 알코올에 한 개의 할로겐 원자가 치환되는 것은 이미 유익한 효과가 있다.

선호되는 실시예에서 적어도 상기 α-탄소 원자는 한 개 이상의 할로겐 원자로 치환된다. 그런 할로겐화 알코올의 적절한 예는 트리플로로에탄올(trifluoroethanol), 펜타플로로프로판올(pentafluoropropanol) 및 헥사플로로이소프로판올(hexafluoroisopropanol)이다. 더 선호되는 것은 상기 알코올이 완전히 할로겐화 된 것, 즉 모든 탄소에 붙은 수소원자가 할로겐 원자로 치환된 실시예이다. 완전히 할로겐화된 알코올의 일례는 트리클로로메탄올(trichloromethanol), 트리플로로메탄올(trifluoromethanol), 과클로로에탄올(perchloroethanol), 과플로로에탄올(perfluoroethanol), 과클로로프로판올(perchloropropanol), 과플로로프로판올(perfluoropropanol), 과클로로부탄올(perchlorobutanol), 및 과플로로부탄올(perfluorobutanol)이다.

상기 할로겐 치환의 상기 높은 전자 끌기 능력(electron-withdrawing ability)는 상기 알코올 분자의 하이드록실 그룹의 전기음성도(electronegativity)를 증가시킨다. 이것은 상기 알코올과 본 발명의 2-머캅토-4, 5-디메틸티아졸 분자 사이의 더 강한 수소 결합을 야기한다. 그렇기 때문에 상기 양성자가 상기 방향족 질소 원자에 붙어있는 본 발명의 상기 매트릭스 물질의 유익한 호변체 형태는 더 선호된다. 그 결과 실시간 에어로졸 MALDI MA 분석의 수행은 더 향상된다.

상기 알코올은 포화증기압(saturated vapour pressure)이 알코올의 유형에 따라 15~100℃ 범위의 온도에서 달성되는 것과 같은 농도에서 적용되는 것이 바람직하다. 그러나 또한 부분적으로 포화된 알코올 증기도 사용될 것이다.

그런 이유로 본 발명은

- 위에서 설명한 것과 같이 매트릭스 물질로 상기 에어로졸 분석체에 접촉

- 상기 분석체의 적어도 일부분을 이온화 및

- MS 탐지기, 일례로 이동시보탐지기를 이용하여 상기 이온화된 성분을 분리하는 것을 포함하는 분석체를 분석하기 위한 실시간 에어로졸 MALDI MS 방법에 관한 것이다.

상기 매트릭스 물질로 상기 분석체와 접촉하는 동안 상기 매트릭스 물질은 상기 에어로졸에 증착될 수 있고 매트릭스 코팅을 형성할 수 있다.

상기 분석체는 상기 기상에서 상기 매트릭스 물질과 접촉하는 것이 선호된다. 본 발명의 매트릭스 물질의 승화될 수 있는 상기 양은 알코올의 존재 하에서 증가하고 알코올은 상기 매트릭스 물질의 휘발성을 증가시킬 수 있기 때문에 알코올로 구성된 화학식 (1)의 상기 매트릭스 화합물을 사용하는 것이 선호된다.

본 발명자는 이 방법에 따라 상기 에어로졸 분석체는 매트릭스 물질의 균일하고, 동질한 층으로 제공된다는 것을 발견했다. 상기 분석체 표면의 불균일성(inhomogeneity)은 상기 MALDI 분석에 나쁜 영향을 줄 수 있기 때문에 이것은 유익하다. 그런 이유로 이 방법은 에어로졸에서 상기 MALDI 분석의 신호의 질을 상당히 향상시킨다. 이 향상은 특성화 단백질의 섬세한 분석 때문에 바이오에어로졸에 대하여 특히 유용하다. 상기 적어도 부분적으로 포화된 대기는 본문에서 설명한 것과 같이 하나 이상의 알코올로 적어도 부분적으로 포화되는 것이 유익할 수 있다. 에탄올 용액이 들어있는 매트릭스는 상기 장치의 가열 부분에 작은 방울로써 도입되는 것이 바람직하다. 이것의 장점은 상기 질량 분석기에서 단일 액체 흐름이 있고, 상기 매트릭스의 농도는 정확하게 제어될 수 있는 것이다.

상기 온라인 에어로졸 샘플링(sampling)하는 동안 상기 증기압은 높게 유지되는 것이 바람직하며, 이것은 알코올이나 물 같은 액체의 추가적인 증발에 의하여 도달할 것이다.

일부 경우에서 상기 코팅된 에어로졸 흐름에 휘발성 산을 추가하는 것이 선호된다. (상온 내지 100℃의 온도 범위에서 휘발성인)휘발성 유기산이 사용되는 것이 바람직하고, 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)가 가장 바람직하다.

상기 분석체, 바람직하게는 상기 분석체에서 적어도 한 입자는 (세균, 곰팡이류(fungus), 조류(algae), 원생동물(protozoa) 및 바이러스를 포함하는)미생물 및/또는 (독소를 포함하는)단백질 또는 림프구(lymphocyte) 또는 세포조직과 같은 다른 생체물질을 포함한다. 적어도 하나의 에어로졸은 투과전자현미경(transmission electron microscopy)에 의해 측정된 것으로써 평균 입자 크기가 적어도 0.1μm인 것이 바람직하다. 투과전자현미경에 의해 측정된 상기 평균 입자 크기는 가장 커도 20μm를 넘지 않는 것이 선호된다. 그런 이유로 상기 적어도 하나의 에어로졸 입자의 평균 입자 크기는 0.3~20μm의 범위에 있고, 0.5~15μm의 범위에 있는 것이 바람직하다.

선호되는 실시예에서, 상기 분석체는 본 발명의 방법에 앞서 선택되었다. 적절한 선택 방법은 일례로 참조로 포함된 WO-A-2002/052246에서 설명되어 있다. 이 방법에 따르면 바이오에어로졸 입자들은 아미노산(amino acid)와 같은 특정한 물질의 존재는 적절한 파장으로 조사될 때 특성 형광(characteristic fluorescence)을 유발하는 특성에 기초하여 선택된다. 일반적으로 무기물 및 유기물의 대부분은 이런 특성을 보이지 않는다. 그러므로 바이오에어로졸 입자들은 탐지기는 상기 형광 바이오에어로졸 입자를 선택하고 두 번째 레이저는 상기 선택된 바이오에어로졸 입자들을 이온화시키도록 작동된 후, 바이오에어로졸 입자에서 특정한 물질의 형광을 발생시키는 여기 레이저(excitation laser)를 이용하여 선택될 수 있다.

상기 선택은 크기 선택이 바람직하다. 세균 및 바이러스를 포함하는 에어로졸 입자들의 크기는 일반적으로 20μm 미만이다. 상기 에어로졸 입자들은 주어진 속도에서 상기 질량 분석의 중앙 공간에 들어가기 때문에 상기 연속적인 에어로졸 입자들의 크기는 에어로졸 입자에 의해 횡단된 알려진 거리의 지속 시간으로부터 결정될 수 있다. 알려진 상호간 거리(mutual distance)로 연속적인 두 점에 상기 여기 레이저 빔을 향하게 하는 것에 의하여, 상기 지속 및 상기 에어로졸 입자 크기는 에어로졸 입자에 의해 산란되고 탐지된 빛으로부터 결정될 수 있다. 이것은 특정한 크기 창에서 생체물질을 선택적으로 이온화시킨다. 그런 이유로 다른 물질들의 혼합물로부터 (세균과 같은)특정한 크기의 생체물질을 식별하는 것이 가능하다.

본 발명은 (세균, 곰팡이류, 조류, 원생동물 및 바이러스를 포함하는)미생물 및/또는 (독소를 포함하는)단백질 또는 림프구(lymphocyte) 또는 세포조직과 같은 다른 생체물질의 분류를 가능하게 한다. 상기 다른 종들은 그것들의 스펙트럼 특성(spectral characteristic)에 따라 분류될 수 있다. 그러한 분류는 매우 명확할 수 있고, 다른 발달 스타디아(stadia)에서 미생물들을 구별하는 것도 가능하다. 생체물질들의 분류에 대한 방법은 다른 생체물질들(다른 세균, 다른 세포, 다른 바이러스 등과 같은)의 MALDI MS 스팩트럼을 구하는 것, MALDI MS 스펙트럼(spectra)의 자료집으로 상기 구해진 MALDI MS 스펙트럼을 포함하는 것 및 상기 비교에 근거하여 상기 생체 물질을 분류하는 것을 포함한다. 단일 입자에서 하나의 측정에 기초하여 신뢰할만한 분류를 수행하는 것이 가능하다고 보여왔다. 이것은 위에서 설명한 상기 방법이 낮은 농도의 생체 입자로 구성된 공기 시료의 분석에 대하여 사용될 때 특히 유용하다.

또한 본 발명은 공기나 액체, 즉 입자상 물질(particulate matter) 및 미생물들에 대해서 특히 물의 질을 모니터(monitor)할 수 있게 한다.

다른 측면에서 본 발명은 에어로졸 MALDI MS에 대하여 매트릭스 물질로써 화학식 (1)로 표시되는 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌의 사용과 관련된다.

또 다른 측면에서 본 발명은 MALDI MS에 대하여 기상 매트릭스 코팅에서 본문에서 설명한 것과 같이 매트릭스 구성의 사용과 관련된다.

또 다른 측면에서 본 발명은

- 2-머캅토-4,5-디메틸티아졸 매트릭스 물질로 분석체를 접촉하는 것,

- 상기 분석체의 적어도 일부분을 이온화하는 것 및

- MA 탐지기를 사용하여 상기 이온화된 성분을 분리하는 것을 포함하는 분석체의 분석에 대한 MALDI MA 방법에 관련된다.

비록 일반적으로 2-머캅토-4,5-디알킬헤테로아렌 및 유사한 화합물이 MALDI MS에 대하여 매트릭스 물질로서(일례로 Naxing, X 등, 1997, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 8:116-124 및 Domin, M.A. 등, 1999, Rapid Comm. Mass Spectrom. 13:222-226에서 설명한 것과 같은 2-머캅토벤조티아졸(2-mercaptobenzotiazole) 및 그것의 유사체(analogue) 및 Raju, N.P. 등, 2001, Rapid Comm. Mass Spectrom. 15:1879-1884에서 설명한 것과 같은 5-에틸-2-머캅토티아졸(5-ethyl-2-mercaptothiazole))알려져 있지만, 상기 특정한 화합물 2-머캅토-4, 5-디메틸티아졸은 그런 것으로서 노출되지 않았다. 또한 상기 매트릭스 분자에서 작은 변화는 MALDI MS에서 매트릭스로서의 화합물의 적용 가능성에서 큰 효과를 낳을 수 있는 분야에서 알려져 왔다. 기본적으로 어떤 화합물이 매트릭스 분자 및 특정한 적용에 대하여 사용할 수 있는지의 예측 불가능한 여부를 나타내어왔다. 상기 일례에서 보여진 것과 같이 2-머캅토-4,5-디메틸티아졸은 미생물에 구성된 단백질 및 탄소화합물과 같은 생체 거대분자(macromolecule)들의 탐지에 매우 적합한 매트릭스 분자를 발견해왔다. 이 특정한 매트릭스 화합물의 이 유용함은 미생물들의 스펙트럼 파라미터에 기초하여 미생물의 분류도 가능하다.

본 발명은 다음의 한정되지 않은 실시예에 의하여 더 설명될 것이다.

[ 실시예 1] 재현성

비티균을 포함하는 에어로졸을 분석하기 위해 사용된 실험적 기구는 도 1에 나타냈다. 기상의 에어로졸 입자들은 입구실(1)에 있는 MALDI 기구로 들어가고, 액체(알코올과 같은)를 포함하는 부분 가열 튜브(optionally heated tube)(2)로 유도되고, 그 뒤에 상기 매트릭스 물질을 포함하는 튜브(3)를 통과한다. 상기 매트릭스 물질이 두 번째 부분에서 증착되고 상기 에어로졸에 코팅이 형성되도록 이 튜브의 첫 번째 부분은 가열되지만 두 번째 부분은 가열되지 않는다. 상기 코팅된 에어로졸은 건조기(4) 및 에어로졸 빔 발생기(5)를 통과하고 나서 코팅된 에어로졸은 산란 및 UV광에 의해 탐지되는 소스실(source room)에 들어간다. 상기 에어로졸에서 관심 있는 상기 단백질들은 이온화 레이저(ionization-laser)에 의하여 이온화된다. 상기 얻어진 이온들은 TOF 튜브(9)에서 그것들의 질량에 따라 분리되고 탐지기(10)에서 탐지된다. 데이터의 획득 및 처리과정은 PC(personal computer)로 수행된다.

상기 시스템에서의 압력은 입구실(1), 튜브(2) 및 튜브(3)에서 약 100kPa(대기압)의 일련의 펌프에 의하여 소스실(6) 및 TOF 튜브(9)에서 10^-5kPa로 감소된다. 상기 시스템을 통한 상기 흐름은 600~1000ml/min의 범위에 있다.

매트릭스 물질로서 2-머캅토-4,5-디메틸티아졸을 사용하여 비티균을 포함하는 에어로졸의 실시간 MALDI 에어로졸 TOF 스펙트럼은 기록된다.

실시간 시료 준비를 포함하는 상기 온라인 에어로졸 MALDI TOF MS 장치 재현성은 도 2에 나타내었다. 도 2에서 비슷한 특성 피크 패턴(characteristic peak pattern)(즉, MALDI 지문)은 매일 일관된 재현성을 보인다. 도 2에 의해 설명된 상기 결과는 상기 시스템의 재현성 및 안정성이 만족스럽다는 것을 나타내는 비티균 및 바실루스세레우스균 영양세포 및 포자(데이터 표시 없음)로 다수의 동일 실험을 한 것에 의하여 재현되었다.

[ 실시예 2] 가능성의 식별

본 발명의 가능성의 식별은 실시예 1에서 설명된 것과 같이 바실루스세레우스균(두 개의 균주), 비티균 및 바실루스글로비지균과 같은 다양한 바실루스 종을 사용한 것 이외에는 유사한 방법으로 구해진 결과에 의해 보여졌다. 그것들의 16S rRNA 시퀀스(sequence)에 따라, 근접종(closely related species)으로서 바실루스세레우스균 및 비티균을 고려할 것이 제안된다. 상기 실험된 세균 균주 중 하나인 바실루스세레우스 ATCC 14579은 염기쌍(base-pair) 치환에 기초하여 99.6%의 비티균에서의 유사성 및 16S rDNA 뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequence)에서의 유사성을 갖는다. 상기 바실루스 종으로부터의 영양세포 및 포자의 에어로졸은 실시예 1에서 설명한 것과 같이 매트릭스 물질로 실시간 코팅되었고, 에어로졸 MALDI TOF MS에 의해 실시간 분석된다.

(영양세포 vs. 포자)

비티균의 같은 종의 첫 번째 포자 및 영양세포는 측정되었다. 도 3에서 묘사된 비티균의 상기 포자(A) 및 영양세포(B) 사이의 서로 다른 MALDI 지문은 둘 사이에서 분명한 차이를 보인다.

(근접종)

다음, 가능성을 식별하는 상기 에어로졸 MALDI TOF MS는 차이에 따른 차이에 따른 성장을 막도록 같은 성장조건 하에서 배양된 비티균, 바실루스세레우스균 및 바실루스글로비지균의 포자로부터 얻어진 근접종의 결과에 의해 설명되었다. 도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 바실루스글로비지균(A), 바실루스세레우스균(B) 및 비티균(C) 종은 쉽게 그것들을 식별하도록 사용될 수 있는 매우 특성적인 스펙트럼을 보인다.

도 5에서 상기 가능성을 식별하는 것은 차이에 따른 성장을 막도록 같은 성장 조건 하에서 배양된 두 바실루스세레우스균주의 결과에 의해 보여졌다. 또한 상기 두 바실루스세레우스균주는 양 쪽의 스펙트럼에서 다른 MALDI 프로파일(profile)에 의하여 보여진 것과 같이 서로로부터 식별될 수 있다. 상기 결과는 비티균, 바실루스글리비지균 및 바실루스세레우스균(두 균주를 포함하여)과 같은 근접 미생물(closely related micro-organism)들은 에어로졸 MALDI MS와 결합된 본 발명의 사용에 의하여 균주 수준에서도 서로로부터 식별될 수 있다.

(한 세균배양(bacterial culture)내에 단일 입자 수준에서 분리)

단일 세포 또는 입자 수준에서의 분리는 기체역학적 배율(aerodynamic diameter), 형광 또는 질량 스펙트럼 지문(mass spectral fingerprint)에 기초하는 세포 다발 또는 입자 다발에 의해서 가능하다.

본 발명의 사용으로 충분한 질량 스펙트럼 정보는 밀집한 지문(fingerprint clustering)을 적용하도록 단일 샷에서 사용 가능하다. 단일 샷은 개개의 세포, 포자, 밀집된 세포, 포자, 단백질, 펩타이드, 증식배지(growth media) 또는 다른 배경 입자(background particle)일 것이다.

도 6은 비티균의 질량 스펙트럼 지문에서 밀집된 6개의 샷/입자의 데이터를 보여준다.

[ 실시예 3] 에어로졸 MALDI TOF MS vs . 일반 MALDI TOF MS

에어로졸 MALDI TOF MS에 대한 일반 MALDI TOF MS의 지원은 미생물 데이터베이스(microbial database)를 만들어내는 데 있어 필수적이다. 본 발명 매트릭스 레시피(matrix recipe)는 일반 MALDI TOF MS 및 에어로졸 MALDI TOF MS 양쪽에 사용된다면, 양쪽 기술-즉 미지의 매트릭스 형태학 및 공중에서(in the flight)의 이온화- 사이의 뚜렷한 차이에도 불구하고, 비슷한 스펙트럼들은 구해졌다. 도 7은 일주일 동안 세균 배양 접시에서 배양된 비티균의 영양세포로부터 얻어지고 양쪽 기술로 기록된 스펙트럼의 예를 보여준다.

상기 같은 피크 다발(peak cluster)들은 양 쪽 스펙트럼에서 4710, 4816, 7242, 7385 및 8259 Da에서 발견되었다. 일반 MALDI 및 에어로졸 MALDI TOF MS 결과간의 좋은 유사점은 또한 슈도모나즈 스투체리 게노모바(Pseudomonas stutzeri genomovars), 대장균(Escherichia coli), 비브리오콜레라균(Vibrio cholerae) 및 하이르콜라(Erwinia herbicola) 및 바이러스 아우토그라파 칼리포니카 핵다각체 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV) 및 시디아 포모넬라 과립형 바이러스(Cydia pomonella granulosis virus) 및 MS2 박테리오파지(bacteriophage)(데이터 표시 안 함)과 같은 그램 음성(gram negative) 미생물로 확인되었다.

[ 실시예 4] 다른 미생물 종( microbial species )

(그램 음성 미생물)

표시한 그램 양성(gram positive) 바실루스 종 바로 옆에 또한 슈도모나즈 스투체리 게노모바(11 종), 대장균, 비브리오콜레라균 및 에르위니아 하이르콜라와 같은 그램 음성 미생물은 에르위니아하이르콜라와 비교된 대장균의 예를 보여주는 도 8에서 식별 가능한 스펙트럼으로 주어진다.

(바이러스)

다음 바이러스들은 실험되었다 : 박테리오파지 MS2 및 바큘로바이러스(Baculo viruses) 아우토그라파 칼리포니카 핵다각체 바이러스 및 시디아 포모넬라 과립형 바이러스. 상기 박테리오파지 MS2는 RNA형 바이러스를 대표한다. 상기 바큘로바이러스는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 동일한 스펙트럼은 에어로졸 MALDI TOF MS 및 일반 MALDI TOF MS로 얻어졌다. MS2의 경우에 13kDa 캡시드(capsid) 단백질의 [M+H]⁺(m/x 13726) 및 [M+2H]⁺²(m/x 6825) 이온 신호는 검출되었다(데이터 표시 안 함). 다른 박테리아 종에 대하여 박테리오파지 종은 전형적으로 다른 분자량의 캡시드 단백질을 가지며, 따라서 다른 MALDI 신호를 제공한다.

상기 바큘로바이러스 스펙트럼 간의 차이는 증거이다(도 9). AcNPV 바이러스(A)의 에어로졸 MAL TOF MS 스펙트럼은 주요 외피 당단백질(glycoprotein envelope)일 6000~12000Da의 특성 광대역이 포함되어 있다. 상기 CpGV 바이러스(B)는 1242~1257~1279Da 및 6460 및 8657Da에서 특성 신호 다발을 보인다.

[ 실시예 5] 액체 시료 분석

에어로졸 시료에 대한 본 발명의 직접 적용 가능성 다음에 또한 물, 체액(bodily fluid) 및 혈액과 같은 액체 시료는 50~200μl의 낮은 부피로 다뤄질 수 있다. 상기 유체들은 여과된 공기의 수송 기체(carrier gas)로 에어로졸을 제공하는 마인하르트 분무기(Meinhard nebulaizer)를 사용하여 에어로졸화 된다. 상기 발생된 에어로졸은 본 발명의 사용에 의해 실시간 코팅되고 상기 개개의 입자들은 기체역학적 배율 및/또는 형광 및/또는 MALDI TOF MS 지문 중의 선택에 의하여 분석될 수 있다.

(수로용수의 독소)

도 10은 수로용수에 대하여 급증된 콜레라 독서(100μg/ml)의 결과를 보여준다. 상기 수로용수는 미생물 입자를 제거하도록 0.2μm 필터로 여과되었고, 60μl는 에어로졸화되었으며, 온라인(on-line) 분석되었다.

콜레라 독소는 분자 질량 24kDa의 A 서브유닛(subunit) 및 12kDa인 5개의 B 서브유닛으로 구성된다. 물에서 기준이 되는 질량 스펙트럼 및 수로용수의 급증한 질량 스펙트럼은 콜레라 독소의 B 서브유닛의 특성 질량을 보여준다. 상기 수로용수의 경우에서 상기 특성 콜레라 독소 질량 스펙트럼을 포함하는 12개의 합산 단일 샷 스펙트럼은 수로용수의 600 샷/입자의 배경으로부터 선택될 때 콜레라 독소의 존재를 나타내기에 충분하다.

(T 및 B 림프구)

T 및 B 림프구는 적응성 면역 반응의 주요 세포 성분이다. T 세포는 세포 매개성 면역(cell-mediated immunity)에 관련되며, 여기서 B 세포는 주로 (항체와 관련 있는)체액 면역(humoral immunity)을 맡고 있다. 그것들은 향후의 감염의 경우에 더 빠르게 항체를 생산할 수 있도록 병원체를 기억하는 기억 세포(memory cell)를 형성한다. 온전한 B 및 T 림프구를 분석하는 가능성은 불사화 T 림프구 및 J558 B 림프구 세포에서 연구되었다. 약 50μl의 소량은 마인하르트 분무기에 주입되었다. 도 11은 불사화 T 림프구 및 J558 B 림프구의 상기 에어로졸 MALDI TOF MS 평균 합산된 질량 스펙트럼을 보여준다.

Claims

에어로졸(aerosol) 분석체를 분석하기 위한 MALDI 질량 분석 방법으로서,
상기 에어로졸 분석체를 하기 화학식(1)로 표시되는 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌(2-mercapto-4,5-dialkylheteroarene)을 포함하는 MALDI 질량 분석을 위한 매트릭스 물질(matrix material)과 접촉하는 단계;

(1)
상기 분석체의 적어도 일부분을 이온화하는 단계; 및
이동시보 질량분석기(time-of-flight mass spectrometer)를 포함하는 질량분석기를 사용하여 상기 이온화된 성분들을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
(상기 화학식(1)에서 X는 질소(N), 황(S) 또는 산소(O)이고, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 메틸(methyl), 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy) 및 프로톡시(prothoxy)로부터 선택되거나, R¹ 및 R²는 합쳐짐으로써 부분적으로 치환된 방향족 고리구조, 부분적으로 하나 또는 그 이상의 헤테로원자들, 또는 그것들의 호변체 형태(tautomeric form)를 형성한다.)
제1항에 있어서,
상기 R¹ 및 R²는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 R¹ 및 R²는 메틸기(methyl group)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 X는 황(S)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 매트릭스 물질은 알코올을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올(n-butanol), 이차부탄올(sec-butanol), 이소부탄올 및 삼차부탄올(tert-butanol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 알코올은 디올(diol) 또는 트리올(triol)을 포함하는 다가 알코올(polyhydric alcohol)인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알코올은 염화(chlorinated) 또는 불화(fluorinated)를 포함하는 할로겐화(halogenated) 되어있는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알코올의 적어도 하나의 α-탄소 원자는 적어도 하나의 할로겐 원자로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 알코올은 완전히 할로겐화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 접촉하는 단계는 기체 상에서 일어나고, 상기 기체는 적어도 부분적으로 알코올로 포화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 에어로졸은 투과전자현미경(transmission electron microscopy)에 의해 측정된 적어도 0.1μm, 바람직하게는 0.3~20μm 및 더 바람직하게는 0.5~15μm의 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분석체는 미생물(micro-organism) 및/또는 단백질을 포함하는 생물학적 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분석체는 상기 매트릭스 물질과 접촉되기 전에 먼저 입자의 크기가 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나에 따른 방법을 사용하여 다른 생체물질(biomaterial)의 MALDI 질량 스펙트럼들(mass spectra)을 얻는 단계;
얻어진 MALDI MS 스펙트럼들을 MALDI MS 스펙트럼 라이브러리(library)와 비교하는 단계; 및
상기 비교에 근거하는 상기 생체물질을 분류하는 단계를 포함하는 방법.
분석체를 분석하기 위한 MALDI 질량 분석 방법으로서,
2-머캅토-4, 5-디메틸티아졸(2-mercapo-4, 5-dimethylthiazole)을 포함하는 매트릭스 물질을 가진 상기 분석체에 접촉하는 단계;
상기 분석체의 최소한의 부분을 이온화 및;
이동시보 탐지기(time-of-flight detector)를 사용하여 상기 이온화된 성분을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
MALDI 질량 분석을 위한 매트릭스 물질로써 2-머캅토-4, 5-디메틸티아졸을 사용하는 용도.
MALDI 질량 분석을 위한 기상 매트릭스 코팅 방법에서 화학식(1)로 표시되는 2-머캅토-4, 5-디알킬헤테로아렌을 포함하는 매트릭스 구성(matrix composition)을 사용하는 용도.

(1)
(상기 화학식(1)에서 X는 질소(N), 황(S) 또는 산소(O)이고, R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 메틸(methyl), 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy) 및 프로톡시(prothoxy)로부터 선택되거나, R¹ 및 R²는 합쳐짐으로써 부분적으로 치환된 방향족 고리구조, 부분적으로 하나 또는 그 이상의 헤테로원자들, 또는 그것들의 호변체 형태(tautomeric form)를 형성한다.)
제18항에 있어서,
상기 매트릭스 구성은 추가적으로 할로겐화 알코올을 포함하는 알코올을 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.