CN110887892B - 一种针对少量样品的质谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于质谱检测技术领域，具体为一种针对少量样品的质谱检测方法。本发明方法包括：设计质谱检测靶板，即对质谱检测靶板加以改进：检测孔的中心位置加刻十字刻线，以便定位；在检测孔内设置多个直径为微米级别的样品槽，用于重复检测，样品槽的直径不超过200µm，高度不超过10μm，以利于高精度检测；将少量样品精准富集到检测靶板的微米级的范围内，缩小体积提高浓度使其单位面积上的样品浓度满足质谱检测的条件；然后精准定位在微米级范围内实现高精度精准检测。本发明方法针对少量样品检测，可大大的缩短检测时间，提高检测的灵敏度，尤其适用于微生物等的检测，可免除大量的培养时间，打破传统意义上的少量样品无法及时检测的问题。

Description

一种针对少量样品的质谱检测方法
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及一种针对少量样品的质谱检测方法。
背景技术
质谱分析法(Mass Spectroscope, MS)是用激光将未知化合物轰击成离子或碎片离子，按质荷比(m/z)飞行时间的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定性和定量分析，生物大分子的结构分析，同位素的测定及固体表面的结构和组成分析。
由于生物分子大多数以其高相对分子质量区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小分子，因而生物质谱要求测定上万甚至几十万的分子质量。对于少量样品质谱主要用于解决两个生物分子的分析问题：其一是精确测定生物分子，如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子量，并提供它们的分子结构信息；其二是对存在于生命复杂体系中相互作用的质谱数据分析，质谱可提供快速、易解的多组分的分析方法，且具有灵敏度高、选择性强、准确性好等特点，其适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围，在生物医学领域应用广泛。
目前用质谱检测样品面临一些问题，第一个问题，目前对于少量样品无法实时进行质谱检测进而无法分析，因为质谱检测不仅需要纯净物，而且需要足够的上样量，即质谱分析仪在检测样品时需要电离出足够的分子片段才能达到检测限。据统计目前90%以上的微生物都是不可培养的，无法用质谱直接去检测，即便少量微生物可培养，也需过夜培养甚至更长时间（肺结核的鉴定需要培养两周以上），对于混合颗粒物样品以及少量微生物都需要大量时间后续处理才能达到质谱检测的条件，不满足疾控、临床等需要及时快速响应的要求；第二个问题，质谱测试过程是在较大区域范围内随机检测几个位置上的样品，其余范围的样品均是无效的；第三个问题，在现有的测试条件下，对少量样品富集的精准度到不到，对于少量样品的检测目前质谱的灵敏度与准确度有待提高。针对现有的情况，如何才能进一步提高检测的灵敏度，打破传统质谱检测瓶颈，是困扰研发人员许久的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对少量样品的高灵敏度质谱检测方法，以解决少量样品无法检测的问题。
本发明提供的针对少量样品的高灵敏度质谱检测方法，包括：包括设计样品的高度富集以及精准检测靶板，将少量样品高度富集到检测靶板的微米级的范围内，缩小范围体积提高浓度使其单位面积上的样品浓度满足质谱检测的条件，然后精准定位在微米级范围内实现高灵敏度快速检测。本发明可大大的缩短质谱检测的周期，降低对于样品检测的要求，扩宽质谱应用范围。具体步骤如下：
（1）设计质谱检测靶板，即对质谱检测靶板加以改进：原有检测靶板有八行十二列检测孔，每个检测孔尺寸为2.5cm。在原有检测靶板上检测孔的中心位置加刻十字刻线，以方便后续样品槽定位；在检测靶板上检测大孔设置多个直径为微米级别样品槽（例如为5个），样品槽的直径不超过200µm，样品槽高度不超过10μm，并且底面整洁平整，以利于高精度检测；见图1所示；
（2）富集样品于检测靶板上：将少量样品富集于检测靶板的检测槽内，利用基质喷雾仪通过精准地喷涂的方式对微量样品裂解，裂解液厚度不宜超过10μm；也可以用点样的方式，点样的体积不超过10μl,根据样品的不同可重复点样；
其中：
所述富集的方式为激光分选、微流控分选、液滴包裹等方式，但不限于此；
所述少量样品的大小尺寸适宜于1-10µm，其个数不少于50个；
所述样品，包括环境、能源、医学、药学、刑事科学、生命科学、材料科学等各个领域所涉及到需要检测的样品，例如，血液、尿液、眼泪等临床样品；又如，土壤颗粒物，海洋微生物等环境样品，以及其他具有研究价值的颗粒物样品等等；
（3）将样品送入质谱检测仪，逐步从高浓度到低浓度，建立标准物质的特征峰位；然后获取少量的质谱检测数据得到特征峰位，通过与标准物质的特征峰位进行对比，结合相应的数据分析，鉴定出被检测样品的特定属性，即得到所检测样品的信息。
本发明中，检测靶板定位孔的个数、大小、尺寸，以及样品槽的个数不限。
本发明方法对于少量样品检测，可大大的缩短质谱检测周期，提高检测的灵敏度，尤其适合不可培养微生物等少量样品的检测，打破传统意义上的少量样品无法直接及时检测的问题，满足疾控以及临床等快速响应的要求。
附图说明
图1为少量样品精准检测靶板。
图2为少量样品高度富集图示。
图3为实施例质谱检测分析图示。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细说明。
高精度定位检测靶板设计：原有检测靶板有八行十二列，每个检测大孔尺寸为2.5cm，在检测大孔内分别加刻十字定位线；每个大孔里面设置5个微米级的样品槽，可用于重复检测；样品槽的形状为圆柱状，直径为200μm，可以满足样品高精度可控定位，使质谱定位与检测一体化；并保证裂解液与少量样品充分裂解，不会外溢并且高密度聚集在一起，从而实现在200μm内少量样品高度集中精准质谱检测分析，参见图1所示。
将样品富集于检测靶板上，富集的方式不限于激光分选，微流控分选，液滴包裹等方式。样品富集于检测槽内，利用HTX公司的基质喷雾仪采用精准地喷涂的方式对微量样品裂解，其中样品的大小尺寸适宜于1-10μm，少量样品的个数不少于50个，参见图2所示。
然后，把样品送入质谱检测仪，逐步从高浓度到低浓度，建立标准物质的特征峰位，然后获取少量的质谱检测数据得到特征峰位，通过与标准物质的特征峰位进行对比，结合相应的数据分析从而鉴定少量样品的特定属性，即得到所检测样品的特定信息。
以无致病性大肠杆菌为例，在直径为2.5cm检测孔内的检测区域面积约为5mm2，标准样品检测密度为密度ρ=5.68x105个/mm，在直径为200μm样品槽内需要454个单细胞大肠杆菌，在直径为200μm的范围内逐步稀释检测浓度致29个时，依然可以得到大肠杆菌的标准峰。实验重复三次，与标准峰进行对比，在直径为200μm的范围内有至少50个大肠杆菌，就可以进行精准鉴定分析。如图3所示。
计算方法：
测OD值，得C=2.84x105个/µL，S2.5≈5mm2，体积=1µL，N=2.84x105个，密度ρ=5.68x105个/mm2；
C=2.84x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=454个；
C1/4=0.71x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=114个；
C1/8=0.355x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=57个；
C1/16=0.1775x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=29个；
C1/32=0.0887x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=15个测不出结果；
C1/64=0.0443 x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=8个测不出结果。
本发明提供一种少量样品质谱检测的方法，包括如下步骤：
步骤1：对检测板进行清洗以及灭菌，排除外界影响因素的干扰；
步骤2：打开质谱仪，打开电离装置，调整电离装置的位置，使信号达到最强；
步骤3：富集少量样品于检测靶板上，富集的方式不限于激光分选，微流控分选，液滴包裹等方式。样品富集于检测槽内，微量样品裂解样品不低于50个，少量样品收集在高精度富集以及精准检测的系统，即富集在200µm范围内；
步骤4：利用基质喷雾仪采用精准地喷涂的方式，在高精度富集以及精准检测的系统上喷涂一层裂解液，裂解液厚度不宜超过10μm；也可以用点样的方式，点样的体积不超过10μl,根据样品的不同可重复点样；
步骤5：通过质谱法鉴定少量样品的特定信息。
其中：
步骤1中少量样品检测靶板，是在测试范围内表面整洁平整，测试外围高于测试位置10μm以内；直径为200μm；样品定位与质谱检测一体化设计。所述质谱检测靶板同种样品有五个重复检测孔，可精准定位便于直接找到测试位置。
步骤2少量样品的收集：让少量样品收集在检测板上指定的位置，方法包括激光分选，数字微流控分选，液滴包裹等分选方式。
步骤4中测试仪器使用的是德国布鲁克MicroFlex LRF，利用HTX公司的基质喷雾仪采用喷涂的方式精准地对微量样品裂解在200μm，人肉不可操作的情况下，用液体喷基质的方法使其与少量的样品充分混合，由于靶板设计的是凹槽的形状，可以保证裂解液不会溢出，使其裂解液与少量样品集中在检测板上指定的位置。
所述待测少量样品可以为存在或可能存在微生物的临床样品、非临床样品，以及对微生物的存在和/或种属进行常规或不定期检测的物质样品。
通过质谱法鉴定少量样品的特定信息，包括逐步从高稀释到低浓度，建立标准物质的特征峰位，然后获取少量的质谱检测数据得到固定的特征峰位，通过与标准物质的特征峰位进行对比，得到所检测样品的特定信息。
实施例1
本发明优选实施例1为一种微生物快速鉴定方法，即检测的目标少量样品为微生物，包括如下步骤：
步骤1：利用数字微流控分选获得50个大肠杆菌单细胞待测样品；
步骤2：将待测样品富集于高精度富集以及精准检测样品槽内；
步骤3：利用基质喷雾仪对样品进行充分裂解3mins，送入质谱检测，具体步骤包括：
（1）利用数字微流控操控移动50个大肠单细胞样品到高精度富集以及精准检测系统的样品槽里面，重复五个孔；
（2）在室温下用基质喷涂仪喷涂的方式进行裂解样品；
（3）送入质谱，获取待测微生物的质谱图；
（4）通过与标准参比质谱图进行比较，得到所检测微生物的特定信息。
计算方法：
测OD值，得C=2.84x105个/µL，S2.5≈5mm2，体积=1µL，N=2.84x105个，密度ρ=5.68x105个/mm2；
C=2.84x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=454个；
C1/4=0.71x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=114个；
C1/8=0.355x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=57个；
C1/16=0.1775x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=29个；
C1/32=0.0887x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=15个；
C1/64=0.0443 x105个/µL → S100µm=7.85x10-3 → N=8个；
以无致病性大肠杆菌为例，在直径为2.5cm的检测区域面积约为5mm2，标准样品检测密度为密度ρ=5.68x105个/mm，在直径为200μm 的范围内需要454个单细胞大肠杆菌，在直径为200μm的范围内逐步稀释检测浓度致29个时，依然可以得到大肠杆菌的标准峰。实验重复三次，均可得到准确的检测结果。如图3所示。

Claims (2)

1.一种针对少量样品的质谱检测方法，其特征在于，包括设计样品的高度富集以及精准检测靶板；将少量样品富集到检测靶板微米级的范围内，缩小范围体积提高浓度使其单位面积上的样品浓度满足质谱检测的条件；然后精准定位在微米级范围内实现高灵敏度快速检测，具体步骤如下：
（1）高精度靶板的设计，即对质谱检测靶板加以改进：质谱检测靶板的检测孔直径为2.5cm，在原有检测靶板上检测孔的中心位置加刻十字刻线，以方便后续样品槽定位；在靶板检测的孔内设置多个直径为微米级别的样品槽，用于重复检测，样品槽的直径不超过200µm，样品槽的高度不超过10μm，并且底面整洁平整，以利于高精度检测；
（2）少量样品的裂解：将少量样品富集于检测靶板的样品槽内，利用基质喷雾仪通过精准地喷涂的方式对少量样品裂解，裂解液厚度不超过10μm，保证裂解液与少量样品充分裂解并且有效地集中在一起；
（3）将样品送入质谱检测仪，逐步从高浓度到低浓度，建立标准物质的特征峰位；然后获取少量样品的质谱检测数据得到特征峰位，通过与标准物质的特征峰位进行对比，结合相应的数据分析，鉴定少量样品的特定属性，即得到所检测样品的特定信息；
步骤（2）中所述富集的方式为激光分选、微流控分选或液滴包裹方式；所述少量样品的大小尺寸适宜于1-10μm，其个数不少于50个。
2.根据权利要求1所述的针对少量样品的质谱检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述样品，包括环境、能源、医学、药学、刑事科学、生命科学、材料科学各个领域所涉及到需要检测的样品，包括：血液、尿液、眼泪临床样品，土壤颗粒物、海洋微生物环境样品，以及其他具有研究价值的颗粒物样品。
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