MX2012014919A - Metodo para muestrear y/o depositar una muestra de material biologica y dispositivo para implementar el metodo. - Google Patents
Metodo para muestrear y/o depositar una muestra de material biologica y dispositivo para implementar el metodo.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona a un método para recolectar la totalidad o una porción de una muestra de materia biológica en contacto con un medio de cultivo, por ejempló gelosa, por ejemplo en una caja de Petri, usando una sonda proporcionada con un extremo terminal, el método de muestreo que incluye las etapas de enfriar el extremo de terminación de la sonda, adherir la totalidad o porción de la muestra de materia biológica a ser recolectada por contacta, o por aplicar una presión ejercida por el extremo de terminación sobre la muestra de materia biológica, y recolectar la totalidad o una porción de la muestra de materia biológica con el fin de separar la muestra de materia biológica a partir del medio de cultivo. La invención también se relaciona a un método para depositar en un contenedor o en una placa de análisis, la totalidad o una porción de una muestra de materia biológica adherida a un extremo de terminación congelado de una sonada, el método de deposición que comprende una etapa para separar el extremo de terminación a partir de la sonda y a partir de la totalidad o o parte de la muestra de materia biológica. La invención se relaciona además a un dispositivo, un kit y un aparato para implementar los métodos.
Description
METODO PARA MUESTREAR Y/O DEPOSITAR UNA MUESTRA DE MATERIA
BIOLOGICA Y DISPOSITIVO PARA IMPLEMENTAR EL METODOi ii i
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El objeto de la presente invención es un método para muestrear y un método para depositar una muestra de materia biológica, cultivada sin purificar o enriquecida a través del contacto con un medio de cultivo, así como también un dispositivo para implementar estos métodos.
El muestreo de una muestra de
(baterías, hongos, levaduras o similares) cultivados en un medio de cultivo de agar en una caja de Petri, o en cualquier otro soporte es actualmente realizado con la ayuda de herramientas de uso simple, como asas, barras, tubos o conos.
Sin embargo, estos consumibles no hacen posible muestrear cierta y eficientemente todos los tipos de i microorganismos ya que los últimos pueden tener diferentes formas, tamaños, consistencias, estructuras o apariencias.
Por otra parte, estos consumibles no hacen posible depositar óptimamente la materia biológica en soportes de análisis como placas, ni resuspender fácilmente la materia biológica. i |
Adicionalmente, es importante ser capaz de permitir el muestreo de una colonia de bacterias o de una fracción de esta colonia sin muestrear el medio de cultivo situado' 'bajo
i ef.: 237920 la colonia: esto puede viciar los resultados del análisis.
La calidad de los resultados de análisis también depende de la concentración del depósito de materia biológica formada a partir de la muestra muestreada, y en su homogeneidad en el soporte en el cual se deposita.
La presente invención tiene por objeto remediar todas o algunas de las desventajas mencionadas anteriormente.
Para este fin, el objeto de la presente invención es un método para muestrear todo o parte de una muestra de materia biológica, sin purificar, enriquecida o cultivada a través del contacto con un medio de cultivo, posiblemente agar, usando una sonda equipada con un extremo terminal, el método de muestreo que comprende las etapas de enfriar el
f extremo terminal de la sonda, pegar todo o parte de la muestra de materia biológica a ser muestreada a través del contacto del extremo terminal en la muestra de materia biológica, o por aplicar una presión ejercida por el extremo terminal en la muestra de materia biológica, y muestrear todo o parte de la muestra de materia biológica como para separar la muestra de materia biológica a partir de su soporte, como un medio de cultivo.
Este método hace posible muestrear cualquier tipo de muestra de materia biológica cultivada in vitro independientemente de la forma y consistencia. Adicionalmente, con este método de muestreo no hay contaminación posible de la sonda ya que su extremo, en contacto con la muestra, puede ser esterilizado después de cada uso, o nunca está en contacto directo con la muestra.
Adicionalmente, con este método de muestreo, no hay necesariamente ninguna necesidad de usar un extremo terminal de uso único, lo cual reduce el costo de uso mientras permite ciclos de uso más rápidos (mejor productividad del dispositivo) .
De acuerdo a un medio de implementación, la sonda es una sonda criogénica que comprende medio para ser enfriada.
De acuerdo a una implementación del método de muestreo, antes a la etapa de pegado, se realiza una et pa de humectación del extremo terminal de la sonda en una solución líquida como agua destilada, con el fin de formar una capa de hielo en el extremo terminal .
Esta disposición permite que se haga un consumible extemporáneamente lo cual permite que la muestra sea pegada con el fin de muestrearla. Adicionalmente, con ' esta implementación del método de muestreo, la muestra nunca está en contacto directo con el extremo terminal de la sonda.
De acuerdo a una implementación del método, antes a la etapa de pegado, la muestra de materia biológica a ser muestreada es cubierta con una solución líquida, con el fin de formar una capa de hielo alrededor de la muestra durante superficie de pegado de la estalactita creada en esta forma y de esta forma para ser capaz de muestrear muestras grandes.
De acuerdo a una implementación del método de muestreo, el extremo terminal es removible.
Esta disposición hace posible incrementar considerablemente la superficie de pegado útil del extremo terminal .
De acuerdo a una implementación del método de i muestreo, el extremo terminal posee propiedades ferromagnéticas .
De acuerdo a una implementación del método' de muestreo, la etapa de muestrear todo o parte de la muestra de materia biológica consiste en aplicar un campo magnético, por ejemplo usando un electromagneto, adyacente al extremo terminal ferromagnético para así atraer el extremo terminal y de esta forma recuperarlo.
Esta disposición hace posible automatizar el muestreo sin arriesgar la contaminación de la muestra muestreada.
Otro objeto de la presente invención es un método para depositar en un contenedor o en una placa de análisis todo o parte de una muestra de materia biológica pegada sobre un extremo terminal congelado de una sonda, el método de deposición que incluye una etapa de separar el extremo terminal de la sonda a partir de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal.
Esta disposición hace posible emplear todo o parte de la muestra.
De acuerdo a una implementación del método de depósito, la etapa de separación se realiza sin la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal congelado que está en contacto con el contenedor o la placa de análisis .
En este caso, la etapa de separar el extremo terminal a partir de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal se realiza por aplicar un choque mecánico sobre el extremo terminal.
Esta disposición hace posible recolectar inmediatamente todo la muestra muestreada en un estado congelado .
De acuerdo a una implementación del método de deposición, se realiza la etapa de separar el extremo terminal de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal congelado por un medio de calentamiento o en aire ambiental .
Esta disposición hace posible recolectar la muestra en un estado líquido y hace posible distribuir varias partes de la muestra en varios soportes diferentes.
De acuerdo a una implementación del método de deposición, se logra la etapa de separación por contacto secuencial de la muestra de materia biológica con el contenedor o la placa de análisis, este contacto lleva a aproximadamente al punto de fusión de una capa superficial de hielo y la deposición de materia biológica. ¡
Esta disposición hace posible obtener control de la cantidad de muestra depositada y de elección de soporte de deposición, y el punto de fusión de la capa superficial 'hace posible obtener un depósito homogéneo, tanto en términos de distribución de materia biológica y la profundidad de la |capa depositada.
i De acuerdo a una implementación del método de deposición, todo o parte de la muestra de materia biológica
i ! es distribuido en una placa de análisis para así hacer varios depósitos distintos de partes de la misma muestra de materia
i biológica, la cual está pegada en el extremo terminal.
Esta disposición hace posible tomar varias mediciones sobre los depósitos a partir de la misma muestra, i cada uno de estos depósitos que es homogéneo, lo cual . hace posible mejorar la calidad de ciertos espectros de medición,
i i en particular para mediciones de espectrometría de masa dónde f un bajo grado bajo de homogeneidad en el depósito lleva a espectros que comprenden picos menos intensos con una señal la cual incluye un lote de ruido. ¦
De acuerdo a una implementación del método i de deposición, se efectúa la deposición a través de contacto intacto, por ejemplo en la forma de líneas, de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal con el contenedor o la placa de análisis. ¡ i
Esta disposición hace posible lograr un gradiente de concentración de materia biológica en el soporte de depósito, y entonces enfocar las mediciones en la zona de gradiente lo cual hace posible obtener los mejores
í ' resultados, por ejemplo para mediciones de espectrometría de
! i masa. ¡ j
Otro objeto de la presente invención esj un dispositivo para muestrear y depositar todo o parte dé una muestra de materia biológica, sin purificar, enriquecida o cultivada a través del contacto con un medio dé cultivo y ji ¡ propuesta para ser depositada en un contenedor o una placa de análisis, caracterizado porque comprende: una sonda equipada con un extremo terminal, un medio de enfriamiento propuesto para congelar el extremo terminal, medio de manejo propuesto para ejercer presión a partir de la sonda sobre la muestra para congelar todo o parte del agua contenida en la muestra
¡I con el fin de pegarla al extremo terminal, separar todo o parte de la muestra a partir de su soporte, como un medio de cultivo, para llevar todo o parte de la muestra al contenedor o la placa de análisis. ,
Esta disposición proporciona un dispositivo automatizado y reusable lo cual hace posible llevar a t cabo varios muéstreos y deposición en una cantidad mínima1 de tiempo. Í
De acuerdo a una modalidad, el dispositivo comprende un medio de calentamiento propuesto para desunir la muestra a partir del extremo terminal.
De acuerdo a una modalidad particular, el medio de calentamiento es propuesto para esterilizar el extremo terminal. La esterilización es realizada antes de cualquier mues reo .
Ventajosamente, el medio de enfriamiento y el medio de calentamiento están compuestos de por lo menos un elemento Peltier. Ventajosamente, se usan varios elementos Peltier sobrepuestos .
Esta disposición permite a la muestra
rápido al estado líquido y facilitar su resuspensión y homogenización . ,
De acuerdo a una modalidad, el extremo terminal es metálico o mineral .
Esta disposición hace posible absorber más rápidamente el calor contenido en el agua de la muestra, j¡ ¡y de
l esta forma congelarlo más rápidamente.
Ventajosamente, el extremo terminal es por lo menos parcialmente cubierto con un recubrimiento o tratamiento hidrofóbico. El recubrimiento permite drenaje más fácil y optimizado del liquido y/o la muestra presente en el extremo terminal cuando es descongelado. ¡
De acuerdo a una modalidad, el extremo terminal es removible . ' !
Esta disposición hace posible separar el extiremo terminal congelado, con el fin de pegarlo directamente a la muestra de materia biológica a ser muestreada. ;
Adicionalmente hace posible almacenar el extremo
i! : terminal en un ambiente refrigerado, lo cual puede ser particularmente ventajoso si se desea realizar un análisis
i 1 extemporáneo .
De acuerdo a una modalidad, el extremo terminal tiene una conformación la cual optimiza el pegado de todo o parte de la muestra de materia biológica para ser muestreada o de la solución líquida. De acuerdo a una modalidad particular, el extremo terminal comprende un extremo de punta. Ventajosamente, la forma del extremo terminal ¡puede ser ahusada. Esa forma facilita bastante el pegado de la muestra o de la solución líquida durante la humectación.
Esta disposición hace posible muestjrear precisamente la muestra, pero también muestrear muestras; muy pequeñas como mxcrocolonias bacterianas . ¡ |
De acuerdo a una modalidad, el dispositivo comprende por lo menos un sensor el cual controla la presión ejercida por el medio de manejo por medio de la sonda en contacto con la muestra de materia biológica a ser muestreada la cual es cultivada en el medio de cultivo, y hace esto con el fin de mantener esta presión.
Esta disposición hace posible evitar cualquier pegado del soporte de muestra, como un medio de cultivo de agar .
De acuerdo a una modalidad, el sensor es un sensor de presión o de fuerza, el cual puede ser colocado bajo un soporte de caja Petri por ejemplo.
Esta disposición hace posible controlar la cantidad de materia biológica, en la forma de una escala electrónica.
De acuerdo a una modalidad, el
comprende un sensor que detecta el contacto entre el extremo terminal y la materia biológica con el fin de evitar cualquier presión.
De acuerdo a una modalidad, el sensor es un sensor eléctrico binario.
Esta disposición hace posible evitar cualquier pegado del soporte de muestra, como un medio de cultivo de agar, en menor costo.
Otro objeto de la presente invención es un kit que comprende un dispositivo como se describe previamente, el cual incluye una pluralidad de extremos terminales intercambiables.
Estos extremos terminales pueden o no pueden ser de uso único. Pueden tener una punta, ser de forma de rizo, o cilindrico, y de diferentes tamaños. Esta disposición hace posible tener extremos terminales de diferentes formas y tamaños para el mismo dispositivo, con el fin de adaptar al tamaño de la muestra a ser muestreada.
Otro objeto de la presente invención es un aparato de análisis biológico el cual contiene un dispositivo o un kit como se describe previamente.
En cualquier caso, la invención será mejor entendida con la ayuda de la siguiente descripción, con referencia a las figuras esquemáticas anexos los cuales muestran, en una forma no limitada, un dispositivo el cual implementa las etapas de un método de acuerdo a la invención.
La Figura 1 muestra la perspectiva general de un dispositivo de acuerdo a la invención.
La Figura 2 muestra algunas etapas de un método de muestreo de acuerdo a una primera implementación de acuerdo a la invención.
La Figura 3 muestra algunas etapas de un método de muestreo de acuerdo a una segunda implementación de acuerdo a la invención.
La Figura 4 representa varios ejemplos de muestreo y deposición de todo o parte de una muestra.
La Figura 5 representa una modalidad de un medio de enfriamiento para el extremo terminal usando elementos Peltier.
La Figura 6 muestra un espectro de masa obtenido después de muestrear y depositar una colonia de Staphylococcus aureus usando los métodos de acuerdo a una primera modalidad de la invención.
¡' i
La Figura 7 muestra un espectro de masa obtenido después del muestreo y depositar una colonia de
coli usando los métodos de acuerdo a la primera modalidad de la invención.
La Figura 8 muestra un espectro de masa obtenido después del muestreo y depósito de una colonia de Escherichia coli usando los métodos de acuerdo a una segunda modalidad de la invención. , ¡
Como se representa en la Figura 1, un aparato de muestreo y deposición 1 de acuerdo a la invención comprende un dispositivo de muestreo y deposición 2.
Este dispositivo de muestreo y deposición 2 contiene una sonda 3, asi como también medios de manejo 5 propuestos para movimiento espacial de la sonda 3. ,
Este medio de manejo 5 puede ser constituido ¡ por brazos articulados automatizados, o cualquier otro medio equivalente conocido para la persona experta en la técnica.
La sonda 3 comprende un extremo terminal de metal, removible, de punta 4, el cual puede ser reemplazado por un extremo terminal 4 con una punta de tamaño diferente lo cual hace posible realizar muéstreos precisos en la mat ria biológica 7. 1 ¡ La sonda 3, por la acción del medio de manejo 5, se mueve arriba de un cultivo de materia biológica; 7,
! i constituida aquí por colonias bacterianas cultivadas en medio
i de cultivo de agar 8 en una caja de Petri 6.
La composición de la materia biológica 7 comprende esencialmente agua líquida.
La sonda 3 también comprende un medio de enfriamiento (no mostrado) para congelar su extremo terminal 4. Este medio puede por ejemplo ser constituido por nitró'geno líquido que es dirigido al extremo terminal 4 por un conducto situado en la sonda 3 o por despresurizar un gas refrigerante en un volumen el cual está en contacto con el extremo terminal 4.
I
Puede también ser constituido por uno o más
I
elementos de Peltier en contacto con el extremo terminal 4.
En particular, la Figura 5 muestra una modalidad en la cual el medio de enfriamiento comprende dos etapas 17a y 17b de los elementos Peltier en los cuales se monta el extremo terminal 4
Estos elementos tienen la ventaja de ser usados para tanto enfriar y calentar el extremo terminal 4,; ¡por invertir su voltaje de suministro eléctrico.
Con el fin de evitar el intercambio de calor con el aire ambiente, puede ser ventajoso aislar la parte superior del extremo terminal 4, la cual no está en contacto con la muestra. Este aislamiento hace posible optimizar la acción térmica del extremo terminal 4.
Es posible de hecho prevenir tener más de dos elementos Peliter sobrepuestos . Entre mayor es el número de elementos , mayor son las temperaturas extremas obtenidas .
De esta forma, el enfriamiento y calentamiento del extremo terminal 4 será más rápido. Puede ser posible prevenir usar esta construcción para esterilizar el extremo terminal por calentar a una alta temperatura. Esto es particularmente ventajoso para evitar la contaminación entre las diferentes muestras de materia biológica muestreada exitosamente.
El ciclo de muestreo/deposición de materia biológica 7 puede de esta forma ser acelerado y controlado.
La implementación de un método de muestreo ¡. hace posible pegar el extremo terminal 4 de la sonda todo o parte de la muestra 11 de la materia biológica 7 a ser muestreada; en este caso presente, una colonia de bacterias cultivadas en el medio de cultivo 8 en una caja de Petri 6.
En una primera modalidad del método de muestreo, se deposita una película de hielo en el extremo terminal 4 por medio del medio de enfriamiento.
La formación de la película de hielo li es permitida por la presencia del agua contenida en el aire ambiente .
Para este fin, el dispositivo 2 puede contener l> i directamente una fuente criogénica propuesta para enfriar la sonda 3 y el extremo terminal 4.
I
Como se muestra en la Figura 2, la sonda 3 con su extremo terminal 4, por medio del medio de manejo 51 es llevada a contacto con la colonia 11 de bacterias 7 la 'cual se ha desarrollado en el agar 8 contenido en la caja Petra. 6.
Estos medios de manejo 5, por medio del extremo i! i terminal 4, aplican una presión en la colonia 11 a ser muestreada. Esta presión asociada con la baja temperatura de la película de hielo 13 la cual cubre el extremo terminal 4
I
hace posible congelar el agua contenida en la colonia bacteriana 11. i!
Esta presión es medida por un sensor (no mostrado) el cual es situado abajo de la caja Petri 6 y el < cual controla el descenso del medio de manejo 5, deteniendo su descenso más allá de un umbral de presión especificada. ,
Alternativamente, el extremo terminal 4 puede simplemente estar en contacto con la colonia 11, sin ejercer presión en la colonia. Para hacer esto, es útil tener; un sensor de contacto el cual detiene el descenso del medió de i manejo 5 una vez que se hace el contacto. El sensor puede ¡por ejemplo ser un sensor eléctrico binario.
Cuando se congela, el agua contenida en la colonia i ¡ 11 forma un bloque sólido con la capa de hielo 13 situada en la superficie del extremo terminal 4 de la sonda 3. Todo o parte de la colonia 11 a ser muestreada es incluida en el hielo, y así es pegada en el extremo terminal 4.
La presión o tiempo de esfuerzo de contacto puede ser controlado ventajosamente por el dispositivo 2.
En una segunda implementación del método de muestreo, representado en la Figura 3, el extremo terminal 4 de la sonda 3 es humedecido en una solución líquida 12, como agua líquida o una matriz usada comúnmente para ionizar la muestra 11 de la materia biológica 7 con una visión para analizar por un dispositivo de medición como un espectrómetro de masa.
La solución líquida 12 entonces forma una capa de hielo 13 generalmente en la forma de una gota 16 en el extremo del extremo terminal 4. La gota 16 se congela bajo la acción del medio de enfriamiento para formar una superficie de adhesión la cual llega a estar en contacto, por medio del medio de manejo 5, con la colonia bacteriana 12 a ser mues read .
En una variante de esta segunda implementación del método de muestreo también ilustrado en la Figura 3, el extremo terminal de la sonda 3 es humedecido en la solución líquida 12 varias veces en sucesión con el fin de incrementar el tamaño de la capa de hielo 13 usado para la adhesión de las colonias 11 a ser muestreadas.
Es de esta forma posible ajustar el tamaño de esta capa de hielo 13 a las dimensiones de la colonia 11 a ser muestreada.
En estas implementaciones del método de muestreo, puede ser ventajoso tener un extremo terminal 4 de la sonda 3 el cual tiene una forma capaz de facilitar la unión de las gotas de solución líquida 12 en el extremo. Esta forma puede ser ahusada. El extremo puede también tener una muesca, por ejemplo, una muesca horizontal, en el borde del extremo con el fin de optimizar la unión de la gota de solución líquida 12.
De acuerdo a una modalidad particular, el contenedor que contiene la solución líquida puede también tener una forma particular. Primeramente, es ventajoso tener un receptáculo con un volumen pequeño en línea con el volumen de las gotas a ser formadas. Segundo, el interior del contenedor puede tener ventajosamente una forma especificada que corresponde a aquella la cual debe tener una gota. De esta forma, el interior del receptáculo puede ser ahusado. Es benéfico por otra parte que el contenedor sea profundo, en la medida en que sea posible obtener una gota congelada relativamente grande y de esta forma limitar los riesgos de contaminación del extremo terminal 4 por la muestra de materia biológica.
De acuerdo a otra modalidad particular, el contenedor puede tener su propio medio de enfriamiento. En ese caso, la solución líquida 12 contenida en el contenedor es enfriada. Por mantener la solución líquida en una temperatura cercana a su punto de congelamiento, es posible obtener una formación más rápida de la gota congelada cuando se sumerge el extremo terminal en la solución líquida.
En una tercera implementación del método de
I
muestreo (no mostrado) , una gota de solución líquida 12 es depositada en la colonia 11 a ser muestreada, de tal forma que la última es total o parcialmente cubierta en líquido. El extremo terminal 4 de la sonda 3 es entonces aplicado en la gota de solución líquida 12 de tal forma que la última es congelada, atrapar todo o parte de la colonia 11 a ser muestreada y a su vez congelar está última.
En una etapa subsecuente, el medio de manejo 5 separa todo o parte de la colonia 11 a partir de la capa 8 de agar, de esta forma realizando la etapa de muestreo.
El medio de manejo 5 hace posible mover la colonia muestreada 11 arriba de un contenedor 9, como un tubo de prueba 9 o una placa de análisis 4, como una placa de análisis usada en espectrometría de masa.
La implementación de un método de deposición hace subsecuentemente posible separar el extremo terminal congelado 4 de la sonda 3 de todo o parte de la colonia 11 pegada en él .
il 1
En esta primera implementación de este métodp de depósito, la separación entre la colonia 11 y el e éremo terminal 4 es realizada sin contacto con cualquier soporte en
I
aire ambiente después de la interrupción de la acción; del medio de enfriamiento. En efecto, una vez que la acción del medio de enfriamiento es interrumpida, se funde el 'hielo
i ¡ formado en el extremo terminal 4 de la sonda 3, de esta ¡forma congelando la colonia la cual se pega a él. Entonces se fforma una gota, con un volumen más o menos substancial
de la cantidad de hielo formado inicialmente, en el cual se suspenden las bacterias . ¡
i '
En una variante de esta primera implementación del método de deposición de acuerdo a la invención, un medió de calentamiento 10 contribuye a hacer más rápidamente el hielo que mantiene la colonia 11 contra el extremo terminal 4.
Este medio de calentamiento 10 puede igualmente ser bien constituido por una flama, una unidad de soldadurá de aire caliente, rayos de luz convergentes, el efecto joule producido por pasar una corriente en un componente eléctrico resistivo, o cualquier otro medio productor de calor equivalente .
Este medio de calentamiento 10 puede también , ser usado subsecuentemente como un medio de esterilización > ara esterilizar el extremo terminal 4 de la sonda 3.
1 i En la misma forma como para la primera implementación del método de deposición deácrito anteriormente, la colonia 11 muestreada a partir dé la segunda implementación del método de muestreo descrito anteriormente es también separada del extremo terminal 4 ,j por medio de un medio de calentamiento 10. i
En esta implementación del método de deposición, la colonia 11 puede también ser separada a partir del extremo terminal 4 de la sonda 3 por aplicar un choque mecánico sobre la capa de hielo 13. ¡
Este choque mecánico provoca que la capa de hielo
13 se rompa. Este es entonces recolectado al mismo tiempo como la colonia 11 muestreada en un tubo 9 de prueba. El tubo
i puede entonces ser empleado por ejemplo por un sistema de análisis automatizado como el sistema automatizado VITEK® 2, o una placa de análisis 14.
De acuerdo a una segunda implementación del método de deposición, todo o parte de la colonia 11 es depositada a
j través del contacto de todo o parte de la colonia 11 en la placa de análisis 14, con este contacto que fjnde progresivamente la capa superficial de hielo 13 de la muestra por la acción en la capa de hielo 13 de la tensión superficial de la superficie del contenedor 9 o de la placa de análisis 14. 1 !
Este contacto puede ser secuencial en la forma de manchas distribuidas en la placa de análisis 14, o continuo
I
I en la forma de líneas .
Depositar en la forma de manchas hace posible obtener una pluralidad de diferentes depósitos a partir de la
i misma muestra de materia biológica muestreada (colonia 11) . Estas manchas pueden entonces ser empleadas por ejemplo por un espectrómetro de masa.
Depositar en la forma de líneas continuas hace posible obtener un gradiente de concentración de materia biológica 7 con concentraciones más fuertes en el inicio de la deposición que al final de la deposición. Es de esta forma posible tomar mediciones en diferentes zonas del gradiente de concentración, con el fin de ubicar la zona donde los resultados de análisis son mejores, cuando el espectrómetro de masa está adquiriendo mediciones .
La Figura 4 ilustra algún medio para implementar los métodos de muestreo y deposición.
En una aplicación 1A que corresponde al método de muestreo, la totalidad o una parte de la colonia bacteriana 11 es congelada directamente y entonces muestreada en su caja de Petri 6 por la sonda 3 para entonces ser depositada en un tubo de prueba 9 en la cual la bacteria estará en suspensión después de la licuefacción del carámbano formado por la sonda 3 alrededor de su extremo terminal 4, con una vista para sufrir un análisis convencional.
En una aplicación IB, parte de la suspensión bacteriana contenida en el tubo de prueba 9 es muestreada para ser depositada en la placa de análisis 14.
En una aplicación 1C, parte de la suspensión bacteriana contenida en el tubo de prueba 9 es muestreada para ser depositada en el otro soporte con una visión para un segundo análisis convencional, por ejemplo una prueba para sensibilidad a antibióticos.
En una aplicación 2A, la colonia bacteriana 11 o parte de esta colonia es directamente congelada y entonces muestreada en la caja de petri 6.
Una parte de este muestreo es depositada directamente en la placa de análisis 14 de un espectrómetro de masa, mientras que otra parte, en la aplicación 2B> es depositada en otro soporte con una visión para un segundo análisis convencional, por ejemplo una prueba para sensibilidad a antibióticos.
El muestreo puede también ser conservado en forma
Í
congelada en la sonda 3 con el fin de postergar el segundo análisis. Esto es facilitado si es removible el extremo terminal 4. De hecho, el extremo terminal 4 puede ser conservado en forma congelada por depositar este extremo dentro de un congelador.
La placa de análisis 14 usada para realizar el análisis de espectrometría de masa de todo o parte de la colonia 11 contiene una matriz 15 usada para ionizar la muestra.
En una implementación particular, la matriz 15 está en la forma de un depósito seco, después de la distribución en la forma de manchas en la placa de análisis 14.
La licuefacción del depósito congelado de todo o parte de la colonia 11 en contacto con la placa de análisis 14 hace posible resuspender los elementos de la matriz 15 en una mezcla líquida homogénea que también contiene la bacteria.
Otra solución, ilustrada por la aplicación 3a consiste en muestrear la colonia 11 en la caja de Peéri 5 después de humectar el extremo terminal 4 de la sonda 3 directamente en la matriz 15 la cual está en su forma normal en estado líquido, formando un carámbano de matriz 15 alrededor del extremo terminal 4 de la sonda 3.
La licuefacción del depósito congelado en contacto con la placa de análisis 14, compuesta de todo o parte dé la colonia 11 muestreada por la sonda 3 y de la matriz 15, resuspenderá los elementos de la matriz 15 en una mezcla líquida homogénea que también contiene la bacteria.
En estas dos últimas modalidades es importante asegurar por adelantado que la concentración en elementos de matriz de ionización será suficiente con respecto al número de bacterias presentes en la mezcla.
Adicionalmente, las colonias 11 muestreadas por estos métodos, usando una solución líquida no tóxica como agua, y resembradas en una caja de Petri 6 se hacen crecer otra vez y son por lo tanto no muertas por estos métodos de muestreo y deposición.
Ejemplos de aplicaciones industriales son sugeridas posteriormente .
Ejemplos
Ejemplo 1
En este primer ejemplo, se usa una punta de 'hielo para muestrear una colonia de microorganismos no conocida, y para depositarla en un objetivo de espectrómetro de masa con el fin de identificar la colonia de microorganismos no
I
conocidos usando un espectrómetro de masa de acuerdo con el siguiente protocolo:
muestrear la colonia en agar de sangre (referencia bioMérieux) con una aguja de hielo, con una aguja de hielo,
i
- con la punta de hielo, depositar la colonia en un objetivo de espectrómetro de masa de 384 posiciones (Bruker) . El depósito es obtenido por aplicar brevemente la puntá de hielo en el objetivo en temperatura ambiente. Una película ligera de agua y microorganismos es de esta forma depositada en la superficie del objetivo.
- Depositar 2 µ? de matriz (ácido alfa-ciano disuelto en 10 mg/ml en una solución 50/50 de acetona y agua) en la superficie de la muestra.
- Introducir el objetivo en un espectrómetro de, masa MALDI-TOF (Ultraflex II, Bruker),
- Ajustar el espectrómetro de masa para optimizar la adquisición de masas entre 2000 y 20000 Da. La persona experta en la técnica está acostumbrada especialmente a ajustar la tensión y la potencia de láser del instrumento.
- Calibrar el espectrómetro de masa con las proteínas benchmark (ProteinMixte, Bruker) . ¡ ,
- Analizar la- muestra usando 20 series de 50 disparos láser. El espectro de masa obtenido por cada serie es resumido para obtener el espectro de masa del microorganismo. El número de disparos puede ser ajustado por la persona experta en la técnica para obtener el espectro más informativo posible, es decir con los picos de masa ' más posibles y mejor definidos, ¡
- Determinar las masas observadas en el espectro de masa del microorganismo usando el software Flex Análisis (Bruker) , '
- Comparar las masas observadas en el espectro de masa del microorganismo con las masas contenidas en una base de datos. Existen varias bases de datos para este propósito: el solicitante tiene su propia base de datos, y las bases de datos de las compañías Bruker (Biotyper) o Anagnostec
(Saramis) pueden también ser usadas. , ¡
Identificar el microorganismo el cual tiene las masas más cercanas a aquellas observadas en el espectro de masa del microorganismo desconocido.
Para este ejemplo, se ha aplicado este protocolo a dos colonias diferentes y ha hecho posible obtener los espectros de masa visibles en las Figuras 6 y 7.
El espectro de masas de la Figura 6 ha hecho posible identificar la colonia como que es una colonia de Staphylococcus aureus.
El espectro de masa de la Figura 7 ha hecho posible identificar la colonia como que es una colonia de Escherichia coli.
Este método es ventajoso ya que hace posible realizar un muestreo y una deposición muy rápidamente con una proporción excelente de éxito. A partir del primer intento, todas las colonias, independientemente de su tipo, son muestreadas exitosamente y entonces depositadas por la aguja de hielo.
Adicionalmente , ya que el objetivo es en temperatura ambiente, la aguja de hielo funde muy ligeramente cuando toca la superficie. La corriente ligera de agua la cual resulta de esto realiza la muestra y proporciona un depósito fino y homogéneo de microorganismos.
Este último punto es particularmente ventajoso ya que un depósito espeso provoca supresión de señal en espectrometría de masa. Este fenómeno, el cual es bien conocido, es debido al exceso de sales y una proporción de matriz la cual no es adecuada para ser la cantidad de muestra. Un depósito heterogéneo es también ventajoso, ya que la señal llega a ser heterogénea, lo cual hace difícil ajustar el espectrómetro de masa.
Ejemplo 2 :
En un segundo ejemplo, se implementa el mismo protocolo como en el ejemplo 1, con la diferencia que en esa etapa 2 se obtiene el depósito por frotar la punta de hielo sobre la superficie del objetivo de espectrómetro de masa¿
Se obtiene el espectro que representa la Figura 8. Este espectro lleva a la identificación de Escherichia coli.
Este protocolo tiene las mismas ventajas comó el ejemplo 1. Adicionalmente hace posible depositar sobre una superficie muy grande, lo cual puede ser útil para realizar varias adquisiciones sucesivas del mismo ejemplo, para adquirir sucesivamente varios espectros de masa con diferentes parámetros.
Ejemplo 3
En un tercer ejemplo, se cultivan 25 cepas de especies conocidas en una caja de Petri con un COS (medio de sangre de borrego Columbia, bioMérieux, referencia 43041) o medio de cultivo SDA (medio de glucosa Sabouraud, bioMérieux, referencia 43555) de acuerdo con las indicaciones que se presentan en la tabla 1 posterior:
Tabla 1
; i
Después de 16 horas de cultivo, para cada de Pet se muestrea una colonia con una aguja de hielo y se deposita en un objetivo de MALDI-TOF de acuerdo al método de la invención. Esta operación es repetida para obtener, dos depósitos independientes para cada especie estudiada. Los muéstreos y depósitos son realizados de acuerdo con el siguiente modo de operación. ' una punta metálica (extremo terminal) , la cual es cilindrica con una base ahusada, mantenida en -10°C por efecto Peltier (punta metálica en contacto con dos elementos Peltier de acuerdo con la Figura 5) . Es entonces sumergida por 15 segundos en un receptáculo de agua mantenido en 9°C.
La punta metálica es removida del agua. Una gota de agua se pega naturalmente a la punta metálica. Esta gota de agua se congela en 15 segundos por transferencia de frío a partir de la punta metálica en -10°C. Se forma de esta manera una aguja de hielo.
La aguja es posicionada en una colonia de microorganismos y es extraída inmediatamente. La colonia de microorganismos se adhiere instantáneamente a la aguja de hielo y permanece en la aguja de hielo. La colonia de microorganismos es de esta forma muestreada por la aguga de hielo. Inversamente, se toma el agar del medio de cultivo.
- La colonia de microorganismos es depositada en un objetivo de 48 posiciones de Fleximass DS desechable a partir de Shimadzu. Cada posición de deposición es un círculo con un diámetro de 3mm. La deposición es realizada por frotar la punta de hielo en la superficie de una de las' 48 posiciones de depósito del objetivo con un movimiento de espiral. Este movimiento es iniciado en el centro de la posición de deposición y se completa después de 4 circuitos para así cubrir la posición de deposición entera con una ligera película de agua y microorganismos.
- La muestra de microorganismos es secada en aire abierto por varios minutos .
1 µ? de matriz (ácido alfa-ciano-4 -hidroxicinámico listo para ser usado en solución (bioMérieux, referencia 411071) es depositada en la superficie de la muestra.
l !
La muestra de microorganismos y la matrizi son secados en aire abierto por varios minutos. ,
El objetivo es introducido en un espectrómetro de masa MALDI-TOF (Axima Assurance, Shimadzu) con un soporte objetivo FLEXIMASS DS . : '
El espectrómetro de masa es ajustado para optimizar la adquisición de masas entre 2000 y 20000 Da. La persona experta en la técnica está especialmente acostumbrada para ajustar la tensión y la potencia de láser del instrumento.
El espectrómetro de masa es calibrado con un depósito de E. coli (cepa ATCC8739) .
La muestra es analizada usando 100 series de 5 disparos de láser. El espectro de masa obtenido para pada serie es sumado para obtener el espectro de masa1 ! del microorganismo. El numero de disparos puede ser ajustado por la persona experta en la técnica para obtener el espectro1 más i i informativo posible, es decir con los picos de masa más
i posibles y mejor definidos.
- Las masas observadas en el espectro de ; masa del microorganismo son determinadas con la ayuda de software LaunchPad versión 2.8 (Shimadzu) . 1
Las masas observadas en el espectro de 1 masa del microorganismo son comparadas con las masas contenidas en la base de datos Sarmis (bioMérieux) usando la interface Spectral ID versión 1.1.0 (bioMérieux) y el microorganismo es identificado por comparación con los espectros de masa de microorganismos presentes en la base de datos.
Para este ejemplo, se hace posible el protocolo para identificar los depósitos de acuerdo con los resultados fijados en la tabla 2 posterior:
Tabla 2
Las especies identificadas corresponden exactamente a las especies esperadas, tomando en c¡uenta los comentarios posteriores:
- ID spectral proporciona el nombre abreviado de las especies. La persona experta en la técnica está acostumbrada a estas abreviaciones. Por la forma( de ejemplo, es claro que G. capitatum significa Geotrichum capitatum, que Entero. casseliflavus significa Enterococcus casseliflavus, y así sucesivamente. j
Micrococcus luteus es identificado ¡ como
I
i, ¡
Mic . luteus/lylae, es decir como que es posiblemente i' !,
Micrococcus luteus o Micrococcus lylae. No es posible diferenciar entre estas dos especies usando análisis MALDI-TOF y la base de datos Saramis.
Shigella flexneri es identificada como Escherichia coli, es decir Escherichia coli. Como anteriormente, Shigella flexneri y Escherichia coli son dos especies 1 las cuales son muy cercanas para ser distinguibles por MÁLDI- j
TOF . La ID espectral y clase Saramis estas dos especies como Escherichia coli.
- Aeromonas hydrophilia es identificada Aer. salm. salmonicida o Aerhydro . /caviae. Las 3 especies son muy cercanas y son difíciles de diferenciar por MALDI-TOF. ' i
- Salmonella ser. Gallinarum (pullovorum) ! es identificada como Group Salmonella . Los análisis MALDI-TOF no tienen suficiente resolución para distinguir inequívocamente serovar Gallinarum (pullovorum) a partir de otros serovars . El software Spectral ID y Saramis por lo tanto dan solamente una identificación en el nivel del género Salmonella . 1
El protocolo ha hecho de esta forma posible identificar todas las especies analizadas. 72 depósitos de 75 han sido identificadas, lo cual representa 97.3% de identificación correcta. Esta proporción de identificación es muy buena, en efecto incluso mejor que la persona experta en la técnica está acostumbrada a obtener con muestreo y deposición manual seguido por un análisis MALDI-TOF.
Este método es ventajoso ya que hace posible realizar el muestreo y deposición muy rápidamente con . una velocidad excelente de éxito y para cualquier tipo, de microorganismos (bacteria o levadura ( G. capítatum) . En particular, este método hace posible muestrear, y depositar con igual efectividad, microorganismos los cuales tienen formas y consistencias muy diferentes (Proteus, Bacillus, coliformes, etc.).
Aunque la invención ha sido descrita en conexión con ejemplos de implementación particular y ejemplos de modalidades de la invención, es claro que esto no significa limitado por estos y que comprende todas las
I ¡ técnicas equivalentes de las etapas y medios descritos, y
; I combinaciones de los mismos. ·
Se hace constar que con relación a esta fecha, el
[ i mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claró de
í ' la presente descripción de la invención.
i
Claims (30)
1. Un método para muestrear todo o parte dé i una muestra de materia biológica, la cual está sin purificar, enriquecida o cultivada a través del contacto con un medió de cultivo, posiblemente un medio de cultivo de agar, usando! una sonda equipada con un extremo terminal, caracterizado porque comprende las etapas de : enfriar el extremo terminal de la sonda pegar todo o parte de la muestra de la materia biológica a ser muestreada a través del contacto del extremo terminal en la muestra de materia biológica o por aplicar ¡una presión ejercida por el extremo terminal sobre la muestra de materia biológica y muestrear todo o parte de la muestra , de i materia biológica para así separar la muestra de materia biológica a partir de su soporte, como un medio de cultivo.
2. El método de muestreo de conformidad con, la i: ! reivindicación 1, caracterizado porque antes a la etapa, de pegado, se realiza una etapa de humectación del extremo terminal de la sonda en una solución líquida, con el fin de formar una capa de hielo en el extremo terminal . I
3. El método de muestreo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque antes a la etapa de pegado, la muestra de materia biológica a ser muestreada es cubierta con una solución líquida, con el fin de formar una capa de hielo alrededor de la muestra durante la etapa de pegado de todo o parte de la muestra al extremo terminal de la sonda.
4. El método de muestreo de conformidad con una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porqué la solución líquida es tomada del grupo que comprende aguaj una solución salina, un amortiguador, un medio de cultivo líquido o una matriz usada comúnmente para ionizar la muestra de materia biológica con una visión para analizarla usando un dispositivo de medición como un espectrómetro de masa.
5. El método de muestreo de conformidad con una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la etapa de humectar el extremo terminal de la sonda o la muestra de materia biológica a ser muestreada en una solución líquida es repetida sucesivamente por lo menos dos veces con el fin de formar capas sobrepuestas de hielo.
6. El método de muestreo de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el extremo terminal es removible.
7. El método de muestreo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el extremo terminal posee propiedades ferromagnéticas .
8. El método de muestreo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de muestreo de todo o parte de la muestra de materia biológica consiste ·¦ I en aplicar un campo magnético, por ejemplo usando un ¡¡ i electromagneto, adyacente al extremo terminal ferromagrie.tico para así atraer el extremo terminal y de esta forma j¡ recuperarlo. I i
9. Un método para depositar en un contenedor o sobre una placa de análisis todo o parte de una muestra de materia biológica pegada en un extremo terminal congelado de una sonda, caracterizado porque incluye una etapa de separar i el extremo terminal de la sonda a partir de todo o parte de j la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal . 1 I
10. El método de deposición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de separación es realizada sin la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal congelado que está en contacto con! el contenedor o la placa de análisis. ; , i
11. El método de deposición de conformidad con la ¡i reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de separar el extremo terminal a partir de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada al extremo terminal es realizada; por aplicar un choque mecánico en el extremo terminal.
12. El método de deposición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la etapa de separar el extremo terminal de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal congelado es realizada por un medio de calentamiento o en aire ambien¿e.
13. El método de deposición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de separación se logra por contacto secuencial de la muestra de materia biológica con el contenedor o con la placa de análisis,1 lo cual por lo mismo funde una capa superficial de hielo y deposita materia biológica.
14. El método de deposición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque todo o parte de la muestra de materia biológica se distribuye en una placa de análisis para así realizar varios depósitos distintos de partes de la misma muestra de materia biológica, la cual1 está pegada en el extremo terminal .
15. El método de deposición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la deposición es efectuada a través del contacto continuo, por ejemplo eri la forma de lineas, de todo o parte de la muestra de materia biológica pegada en el extremo terminal con el contenedor o la placa de análisis.
16. Un dispositivo para muestrear y depositar todo o parte de la muestra de materia biológica, la cual está sin purificar, enriquecida o cultivada a través del contacto! con un medio de cultivo, y se propone para ser depositada en un contenedor o en una placa de análisis, caracterizado porque Í ! comprende : i - una sonda equipada con un extremo terminal,' un medio de enfriamiento propuesto para congelar el extremo terminal, medio de manejo propuesto: para ejercer una presión, a partir de la sonda en la muestra para así congelar todo o parte del agua contenida en la muestra con el fin de pegarla al extremo terminal, ¦ para separar todo o parte de la muestra a partir de su soporte, como un medio de cultivo, - para llevar todo o parte de la muestra al contenedor o la placa de análisis.
17. El dispositivo de conformidad con; j la reivindicación 16, caracterizado porque comprende un medió de calentamiento propuesto para despegar la muestra a partir del extremo terminal .
18. El dispositivo de conformidad con ¡ la reivindicación 17, caracterizado porque el medio : de calentamiento se propone también para esterilizar el extremo terminal . : '
19. El dispositivo de conformidad con una de ¡ las ? reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el medio de enfriamiento y el medio de calentamiento están compuestos de por lo menos un elemento Peltier. i' i
20. El dispositivo de conformidad con una dé las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque el extremo terminal es metálico o mineral. ,
21. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque el extremo terminal es por lo menos parcialmente cubierto coñ un recubrimiento o tratamiento hidrofóbico.
22. El dispositivo de conformidad con una de las I ! reivindicaciones 16 a 21, caracterizado porque el extremo terminal es removible . ¡ j
23. El dispositivo de conformidad con una de las ! ! reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque el extremo í i terminal tiene una forma la cual optimiza el pegado de todo o parte de la muestra de materia biológica a ser muestreada o de la solución líquida.
24. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizado porque el extremo terminal comprende un extremo de punta. j
25. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizado porque comprende por lo menos un sensor el cual controla la presión ejercida por el medio de manejo por medio de la sonda en contacto con la muestra de materia biológica a ser muestreada la cual es cultivada en el medio de cultivo, y hace esto con el fin de mantener esta presión.
26. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sensor es un sensor de presión o de fuerza.
27. El dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 26, caracterizado porque comprende un sensor el cual detecta el contacto entre el extremo terminal y la materia biológica con el fin de evitar cualquier presión.
28. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, caracterizado porque el sensor es un sensor eléctrico binario.
29. Un kit caracterizado porque comprende un dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 28 que incluye una pluralidad de extremos terminales intercambiables .
30. Un aparato de análisis médico caracterizado porque contiene un dispositivo de conformidad con una de las reivindicaciones 16 a 28, o un kit de conformidad con la reivindicación 29.
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