JP5829621B2 - 顕微鏡センサ - Google Patents

Description

本発明は、デジタル走査型顕微鏡の分野に関し、有利には、デジタル病理学の分野に適用される。

特に、本発明は、２Ｄピクセルアレイを含むセンサを有するデジタルスキャナにより、サンプルを微視的にイメージングする方法と、以下でスキャナと呼ばれるこの方法を実施するデジタル走査型顕微鏡と、に関する。

デジタル走査型顕微鏡は、通常、例えば顕微鏡スライドに置かれる組織サンプルのようなサンプルのデジタル画像を作る。

これは、一般に、顕微鏡スライド全体の上のサンプルを走査し、異なる画像バンドを縫合することによって、及び／又はそれぞれ異なる波長で測定された画像をオーバレイすることによって、行われる。

図１は、このような顕微鏡スライドの横断面を概略的に示している。顕微鏡スライドは、特に、１ｍｍ（ミリメートル）の典型的な厚さをもつガラススライド１と、０．１７ｍｍの典型的な厚さをもつカバースリップ２と、組織層のようなサンプル４を固定し閉じ込めるためのマウント剤３と、を含む。サンプル４の厚さは約５μｍであり、サンプルを含むマウント層は、約１０乃至１５μｍである。

デジタル走査型顕微鏡が、ライン走査カメラとして又は線形アレイセンサとして知られる１Ｄラインセンサを含むことができることは、例えば国際公開第２００１０８４２０９号パンフレットから知られている。このようなセンサは、検知ピクセルのただ１つのライン、言い換えると１つの行、を含む。更に、例えば２Ｄアレイセンサのような他のタイプのセンサと比較して、１Ｄラインセンサは、より良好な連続機械走査オペレーション、及びより少ない縫合問題を提供することが可能であり、いわゆる時間遅延積分（Time Delay Integration、ＴＤＩ）ラインセンサの使用を可能にしうることが知られている。

概して、このような１Ｄラインセンサは、サンプルの良好な品質画像を達成するために、効率的なオートフォーカスシステムと組み合わせられる必要があり、Ｚ軸（深さ方向）に沿ったフォーカスの位置は、数ミクロン（顕微鏡の焦点深さより大きくてもよい）で変化しうる。特に、このようなセンサの使用は、本質的に、サンプル全体の画像取得中に多数の走査インクリメントを必要とし、それゆえ、走査中のフォーカス調整の増大を伴うので、このような要求は、実際に重要であることに留意すべきである。

この点で、国際公開第２００１０８４２０９号パンフレットは、フォーカスマップを生成し使用することを含む当技術分野において知られる最も一般的なソリューションを開示している。このようなフォーカスマップは、走査パスに沿ったさまざまな異なる走査位置に従って、スキャナ対物レンズのために使用されるべき測定された最適フォーカス位置を提供する。フォーカスマップは、サンプルの実際の画像取得の前に生成され、このような任意の取得プロセスにおいて使用されるために利用可能にされる。サンプルの画像を取得する走査プロセスの間、スキャナ対物レンズのフォーカス位置は、測定された最適フォーカス位置の間を補間する軌道上に設定される。

本発明の発明者は、フォーカスマップに基づくオートフォーカスと１Ｄラインセンサとの組み合わせが、利点を提供するにもかかわらず、いくつかの欠点を有しうることを見出した。

例えば、このようなフォーカスマップのニーズは、上述されるように、マップ生成の少なくとも１つの事前ステップを必要とするので、スキャナの全体のスループット時間を制限しうる（スループット時間は、サンプルの画像を出力し又は特定の状況ではこのサンプルの画像バンドを出力するのに必要な総時間をさしうる）。更に、１Ｄラインセンサに関して必要とされる多数のフォーカス調整は、高速且つ正確な画像獲得を達成するために、複雑で扱いにくい機械部品の使用を必要としうる。例えば、走査プロセスの間、対物レンズのフォーカス位置を調整するために、複雑で扱いにくいアクチュエータが必要とされうる。

更に、フォーカス誤差のため、時々、走査プロセスそれ自体が、より複雑にされるはずである。例えば、同じサンプルエリアの複数回の取得を実施することが必要とされることがある。

従って、本発明の目的は、上述の問題を解決する新しい方法及び新しいデジタルスキャナを提供することである。

これに関して、本発明の第１の見地によれば、ＸＹ座標系の２Ｄピクセルアレイを含むセンサを備えるスキャナにより、サンプルを微視的にイメージングする方法であって、Ｙ軸は、スキャン方向に対し実質的に垂直であり、スキャナは、センサがサンプルのオブリーク断面をイメージングすることができるように構成される、方法が提示される。より正確に言うと、この方法は、
ａ）２Ｄピクセルアレイの第１のサブアレイを活性化するステップであって、第１のサブアレイが、第１のＸ座標においてＹ軸に沿って主に延在する、ステップと、
ｂ）ピクセルの第１のサブアレイによりサンプルの第１の領域をイメージングすることによって、第１の画像を生成するステップと、を含む。

ここで、実質的とは、Ｙ軸が、好適には走査方向に対し９０°の角度をなすが、わずかに異なる角度が使用されてもよいことを意味することに注意すべきである。事実、この角度は、走査中に１つのピクセル行によって掃引される領域が可能な限り大きくなるようなものであるべきである。最適条件は、最大の掃引領域を生じさせることができ、従って、走査型顕微鏡の最大スループットは、Ｙ軸が走査方向に対し正確に垂直である場合に達成されることができる。しかしながら、他の設計考慮が、合理的な逸脱につながりうる。具体的には、６０度から１２０度のレンジ内の角度を選択することが合理的でありうる。実際、このようなレンジは、なお、スキャナの最大スループットの少なくとも８７％のスループット（相対スループットは、コサイン（９０−６０）に等しい）をなお提供する。

従って、本発明によれば、２Ｄアレイセンサは、その検知領域の制限された選択（サブアレイ）を使用することによって、ｘラインセンサ（ここで文字「ｘ」は、後述するように２Ｄアレイセンサのラインの総数以下の整数をさす）として動作するようにされる。言い換えると、２Ｄアレイセンサは、ｘラインセンサの機能及び動作をシミュレートするようにされる。以下で明確になるように、サンプルの断面がこのようなシミュレートされるｘラインセンサによってイメージングされる場合に、スキャナ装置のこのようなｘラインセンサを使用することは、上述の問題を解決するためにさまざまな利点を与える。特に、走査イメージングシステムは、走査中、焦点深さの効果的な変化を与えられる。

本発明の好適な実施形態において、ｘラインセンサは、１Ｄラインセンサである。従って、第１のサブアレイは、１つのピクセルラインを含む。１つのピクセルラインが走査プロセスで使用される場合、ラインのＸ位置は、走査中、更新された位置に、定期的に調整され、スキャナは、その位置で、ラインの焦点が合っているか判定する。好適な実施形態において、その中の第１のサブアレイが例えば１Ｄラインセンサとして動作するために使用される２Ｄアレイセンサは、シミュレートされたラインセンサについて所望の焦点位置を決定するために、サンプルのより大きいフォーカスレンジから情報を同時に得るために使用される。このように、走査イメージングシステムは、効率的なオートフォーカスと、走査中の焦点深さの効果的な変化と、を提供される。特に、１つの２Ｄアレイセンサが、１Ｄラインセンサとして及びオートフォーカスシステムの焦点検出器として、同時に動作する。同時とは、画像及びフォーカス情報が、正確に同時に取得され、又は画像及びフォーカス情報が、十分に高いデューティサイクルで、インタリーブされた態様で取得されることを意味する。

本発明の他の実施形態は、以下の通りである：
−方法は更に、
・サンプルを走査するステップと、
・２Ｄピクセルアレイの第２のサブアレイを活性化するステップであって、第２のサブアレイは、第１のＸ座標とは異なる第２のＸ座標においてＹ軸に沿って主に延在する、ステップと、
・ピクセルの第２のサブアレイによって、サンプルの第２の領域をイメージングすることによって、第２の画像を生成するステップと、を含む；
−方法は更に、第１及び第２の画像を組み合わせることによって、サンプルの合成画像を構築するステップを含む；
−方法は更に、第１の座標を提供するステップを含む；
−方法は更に、第１のサブアレイが予め決められたフォーカスで第１の画像を提供することができるように、第１のＸ座標を決定するステップを含む；
−方法は更に、第１及び第２のサブアレイが、実質的に等しいフォーカスで第１及び第２の画像を提供することができるように、第１及び第２のＸ座標を決定するステップを含む；

−方法は、
・前記センサの２Ｄアレイのピクセルの予め決められたサブセットにより、サンプルの第２の領域をイメージングするステップであって、前記予め決められたサブセットが、ピクセルのサブアレイとは異なる、ステップと、
・この画像からフォーカス情報を導き出すステップと、
・フォーカス情報から第１のＸ座標を決定するステップと、を更に含む；
−方法は更に、ピクセルの予め決められたサブセットを、それが矩形形状を有してＸ軸に沿って主に延在するように、活性化するステップを含む；

−ピクセルのサブセットは、２Ｄピクセルアレイの少なくとも２つの別個の領域上に分布されることができる；
−サンプルが特定の厚さを有するものとして、方法は、ピクセルの第１のサブアレイが予め決められたフォーカスでサンプルをイメージングすることができる厚さ内の深さに関する情報を提供するステップと、この深さ情報に従って第１のＸ座標を決定するステップと、を含む；
−予め決められたフォーカスは、ベストフォーカスの状態に対応しうる；
−サンプルの断面は、スキャン方向に対して斜め（オブリーク）でありうる；
−スキャナは、保持表面を含むサンプルホルダを有することができ、ピクセルの２Ｄアレイは、実質的に、前記保持表面に対し傾斜角をなす平面内にありうる；
−２Ｄアレイセンサは、第１のサブアレイが、Ｙ軸に沿って３未満のピクセル行、好適にはただ１つのピクセル行を含むように第１のサブアレイを活性化することによって、１Ｄラインセンサをシミュレートし、又は第１のサブアレイが、Ｙ軸に沿って各ステージにおいて３未満のピクセル行、好適にはただ１つのピクセル行を含むように第１のサブアレイを活性化することによって、１Ｄ Ｎ−ステージＴＤＩセンサをシミュレートするように、制御されることができる。

本発明の別の見地により、本発明の方法を実施する走査型顕微鏡が提示される。

本発明のこれら及び他の見地及び利点が、非限定的な例として添付の図面を参照して与えられる本発明の実施形態の以下の詳細な説明を読むことにより、一層明らかになる。

組織スライドアセンブリの断面を概略的に示す図。 本発明の実施形態による走査型顕微鏡を概略的に示す図。 本発明の走査型顕微鏡において使用されるセンサの２Ｄピクセルアレイを概略的に示す図。 本発明の走査型顕微鏡の組織スライドアセンブリ及び２Ｄアレイの投影を概略的に示す図。 前記投影が２つの異なる位置で組織層と交わる２つの状況を概略的に示す図。 ２Ｄピクセルアレイを概略的に示し、特に本発明の一実施形態によるピクセルのサブセットを示す図。 本発明の実施形態による方法のステップを表すブロック図。 ２Ｄピクセルアレイを概略的に示し、特に本発明の一実施形態によるピクセルのサブセットを示す図。 ＴＤＩ原理を使用して本発明の実施形態を概略的に示す図。

本発明の一実施形態による走査型顕微鏡が図２に示されている。

このスキャナは、ガラススライド１０とカバースリップ１１との間に配置されることができるサンプル（例えば図示しない組織層）をイメージングするように構成される。

このような顕微鏡スライドは、図示されないサンプルホルダの保持表面上に配置される。

当技術分野において知られているように、イメージングパスＰに沿って、顕微鏡スライドから開始して、スキャナは、特に、複数のレンズ２０ａ、ｂ及びｃから一般に構成される顕微鏡対物レンズ２０と、組織サンプルからの非散乱反射光をブロックする開口２１と、チューブレンズ２３と、センサ２４と、を有する。

センサ２４は、本明細書においてピクセルマトリックスとも呼ばれる２Ｄピクセルアレイを含む。このセンサは、一般にＣＭＯＳイメージングセンサである。

図２から分かるように、ピクセルマトリックスは、顕微鏡対物レンズの光学軸Ｏに対して傾けられる。

スキャナは更に、スキャナの動作プロセス、及び特にサンプルをイメージングするための走査プロセスを制御する制御モジュール２５を有する。制御モジュールは、一般に、例えばＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＤＳＰ（デジタルシグナルプロセッサ）のようなプロセッサを含む。

当技術分野において知られているように、いわゆる反射又は透過モードの光源を使用することによって、光スポットは、組織層の或る領域を照射することができる。このスポットによって反射される又は透過される光は、顕微鏡対物レンズ、開口、チューブレンズを通って進み、センサの検知領域、すなわち２Ｄピクセルアレイの検知領域上に投影され、検知領域によって検出される。

図３に例として示される非デカルト座標系ＸＹＺが以下で使用され、マトリックス表面が、Ｘ及びＹ軸に平行な平面上に延在し、軸Ｚが、軸Ｘ及びＹに対し垂直でありうる。

当業者であれば明白であるように、ピクセルマトリックスは、上述したように傾けられた構造であるので、このマトリックス上へ投影されるものは、サンプルの、例えば組織層の、オブリーク断面の像である。ここで、このマトリックス上に投影される像は、中心像平面の周囲の十分に大きい深さレンジからのサンプルの画像情報が、ピクセルマトリックスに投影されることを確実にするために、走査方向に対し十分に斜めであることが好ましいことに注意すべきである。中心像平面は、走査方向及びＹ軸と平行なイメージングされている対象内の面をさす。中心像平面は、例えば、ピクセルマトリックスの中央に最も近いＸ軸に沿った位置Ｘにおける単一の完全なピクセルライン（ピクセルマトリックスのＹ軸に沿って延在する）として規定されるサブアレイから連続する像を取得することが、この中心像平面の像をもたらすような、サンプル内の位置である。

図３を次に参照して、センサの傾けられたピクセルマトリックスの概略的な説明が示されている。

非限定的な説明のために、マトリックスの各ピクセル、例えばピクセル３０、は正方形で表現されており、図３は、このマトリックスの表面全体を示す。

理解されるように、マトリックス表面は、Ｘ及びＹ軸と平行な平面に延在する。言い換えると、マトリックスは、システム座標の２つの軸Ｘ及びＹに沿って延在し、複数の行（又は言い換えるとライン）及び複数の列を含む２次元（Ｘ，Ｙ）を有する。

軸Ｚは、光学軸Ｏと平行でありえ、特に、深さに言及する際に以下で使用されることに注意すべきである。

更に、ＸＹＺ座標系は、デカルト又は非デカルトでありうる。その結果、スキャナの走査方向は、Ｚ軸に対し垂直でありうる。しかしながら、他の実施形態において、光学軸は、ピクセルマトリックスに対し垂直でありうる。この場合、サンプルの平行移動は、ＸＹ平面と平行でなく、それゆえ、走査方向に対するサンプルのオブリーク断面が、ピクセルマトリックス上にイメージングされる。

本発明の方法の実施形態によれば、制御モジュール２５は、特定の座標（例えば図３のＸ１）において、センサのピクセルマトリックス内のピクセルの第１のサブアレイ３１（図３の破線領域）を活性化する。

本発明の意味において、マトリックスと比較して、サブアレイは、実質的により少数のピクセルを含むべきであることが理解されるべきである。好適には、サブアレイの表面は、マトリックスの表面全体のの１／２未満を表すべきである。より好適には、サブアレイの表面は、マトリックスの表面全体の１／４未満を表すべきである。

更に、主にＹ軸に沿って延在するサブアレイは、列の数が行の数より実質的に多いことを意味することが理解されるべきである。好適には、このようなサブアレイは、１行のすべてのピクセルを含み、マトリックスの行の総数の１／３未満を含む。より好適には、サブアレイは、１行のすべてのピクセルを含み、３未満の行を含む。より好適には、サブアレイは、１行のすべてのピクセルを含み、１行のみを含む。このような構造は、図３において非限定的な例として示されている。

上述の実施形態による方法に戻って、ピクセルのサブアレイは、サンプルから投影される光に対し感受性があり、従って、その光を検出する。

次いで、制御モジュールは、前記断面の第１の領域の第１の画像を生成する。

より大きい領域の画像を構築するために、センサが顕微鏡スライドに対して走査される間、上述のステップが、繰り返されることができる。この場合、各スキャン位置において、新しいサブアレイが指定され、活性化され、サンプルの断面の各々の新しい領域の新しい画像が、生成される。これらの画像の組み合わせから、より大きい領域の画像が生成されることができ、合成画像と呼ばれる。

例えばＸ１（図３を参照）のような、活性化されるべきサブアレイのＸ座標は、さまざまな態様で提供され、決定されることができる。

実施形態によれば、座標は、フォーカス情報に関連して決定されることができる。

これに関して、好適な実施形態において、スキャナは、イメージングのために及び連続オートフォーカスのために、上述した同じ２Ｄアレイセンサを利用する。

連続とは、オートフォーカスが、走査プロセス中にオンザフライで測定され、制御されることを意味する。

この実施形態のスキャナは、予め決められたフォーカス（例えば予め決められた量のデフォーカス又は正確なフォーカス）で画像を生成することができるように、フォーカス情報、活性化されるべきサブアレイの座標を得ることが可能であるとともに、同じ２Ｄアレイセンサを使用することによって、その画像を生成することが可能である。

この実施形態は、非限定的な例として提供される図４を参照することによって行われる以下の考察に依存することができる。

この図は、再び、ガラススライド５１と、カバースリップ５２と、組織層５４を含むマウント剤５３と、を有する顕微鏡スライドを示す。

センサに関連する座標系ＸＹＺが再び示されているが、スキャナ全体に関連する新しい非デカルト座標系Ｘ'ＹＺが一緒に示されている。

センサが、ホルダの表面（理想的には水平面）に対し傾斜角β'をなすものとして、軸Ｘ及びＸ'は、互いに対し同じ角度β'をなす。

明確さのために、この図は、顕微鏡スライドに対するセンサの２Ｄピクセルアレイの投影５５を示している。この投影は、センサが実際に検出し、この顕微鏡スライドからイメージングすることができるものに対応する。

上記に説明したように、２Ｄアレイセンサは、サンプルのオブリーク断面の画像を生成することが可能である；断面は、事実上、投影５５に対応する。

このオブリーク断面５５は、複数位置（例えば交差Ｉ又は位置５４０を参照）において組織層５４と交わる。明らかなように、この交差は、特に、顕微鏡対物レンズの焦点面に対する組織層の軸方向位置に依存する。これは特に、図４が示すように、組織層５４の（Ｚに沿った）深さ位置が、走査方向において一様でないからである。

オブリーク断面全体の像が、２Ｄアレイセンサ上に投影されることができるので、組織層５４を含むこの断面は、センサの２Ｄアレイにおけるピクセルに、すなわち交差Ｉをイメージングすることが可能なピクセルに、常に焦点が合っていることが導かれうる。

図５ａの例に示されるように、組織層５４がカバースリップ５２に近いほど、交差の位置は、２Ｄピクセルアレイの左側に寄る（交差５８を参照）。

図５において、左とは、ベクトルＸとで平行あって、逆向きの方向をさすことに注意されたい。

対照的に、図５ｂに示されるように、組織層５４が、ガラススライド５１に近いほど、交差の位置は、２Ｄピクセルアレイの右側に寄る（交差５９を参照）。

その結果、ピクセルマトリックスの中の交差の位置、例えば座標、を決定することによって、対応するサンプル領域に焦点を合わせてイメージングするために、ピクセルのどのサブアレイが活性化されるべきかを決定するることが可能である。

従って、理解されるように、スキャナは、連続オートフォーカス及びイメージングのために同じ２Ｄアレイセンサを使用することができる。

本発明の実施形態において、走査型顕微鏡のオートフォーカスは、センサの２Ｄアレイの中で選択された固定数のピクセルによって実施される。

明確さのために、本発明によれば、オートフォーカスのために使用されるピクセルは、ピクセルのサブセットによって指定され、上記で規定されたサブアレイが、イメージングのために使用されるピクセルを指定する。

当然ながら、サブセット及びサブアレイは、特にピクセルの個々の数又は位置に関して、互いに実質的に異なりうる。しかしながら、それらの双方は、マトリックス領域内で重複することができる。当然ながら、イメージングされるサンプルの領域が、サブアレイがサブセットと一致しうる深さにある、という状況がありうる。しかしながら、この状況は特別でありえ、ピクセルコンテントの少なくともわずかな違いが２つの間にありうる。

図６は、この実施形態によるサブセットの第１の例を示している。マトリックスにおいて、このサブアレイは、３つの別個の領域１００、２００、３００に分布されている。サブセットの３つの対応する部分１０１、２０１及び３０１は、それぞれ、マトリックスのＸ次元全体に沿って延在するピクセルの２列の活性化によって、矩形形状を有する。

このような構造は、以下の方法において使用されることができる。

図６及び図７を参照して、ステップ７００において、ピクセル１０１、２０１、３０１のサブセットが活性化される。

ステップ７０１において、サブセットの３つの部分に対応するサンプルの３つの領域の画像が生成される。

ステップ７０２において、フォーカス情報がこの画像から導き出される。例えば、制御モジュール２５は、サブセットのどの（複数）ピクセルが焦点の合った画像を取得することができるかを決定し、対応する（複数）行を導き出す。

このような決定は、当業者が容易に認識するであろうさまざまなやり方で行われることができる。例えば、サブセットによって生成される画像を解析し、フォーカス特性を決定するためのアルゴリズムが、使用されることができる。例えば、制御モジュールは、サブセットの各ピクセルにおけるフォーカス特性を決定するために、この画像の鮮明度を解析するアルゴリズムを実行することができる。行は、Ｘ及びＹ次元に規定されることができるので、当該ピクセルの対応するＸ座標が、スキャナによって知られる。

ピクセルのサブアレイが、イメージングのために指定される。図６の非限定的な例において、指定されるサブアレイ４０１は、４つのピクセルラインからなる長方形をなす。従って、４つのＸ座標が提供されることができる。代替として、１つの座標が与えられることができる。この座標は、スキャナが、任意の予め規定された関係によって３つの他の座標を導き出すことを可能にしうる。例えば、１つの座標は、サブアレイの幅の中心の位置又は中心に最も近い位置に対応しうる。

サブアレイが一旦指定されると、方法は、それを活性化するためのステップ７０３を更に含む。

ステップ７０４において、サブアレイがイメージングすることができるものに対応するサンプル内の領域の第１の画像が、生成される。

この方法は、サンプルのより多くの領域をイメージングするために及び一般にはサンプルの表面全体をイメージングするために、使用される走査プロセスにおいて繰り返されることができる。

この例では、センサは、走査方向Ｘ'に従って及びサンプルに対し相対的に、移動されることができる。その後、ステップ７００乃至７０４が再び実行されることができる。上述したように、サンプルとセンサとの間の距離が、走査プロセスの間に変化する間、サブアレイは、それに対応して、マトリックスのＸ次元に沿って、交差Ｉが生じる座標へ移動し、それによってサンプルを所望のフォーカスに保つ。当技術分野において知られているように、付加の画像が生成され、組み合わせられて、サンプルの合成画像を構成する。

走査の各位置においてステップ７００乃至７０２を実施する必要はない。その代わり、ステップ７０３及び７０４のみが実施される位置がある。この場合、最後に指定されたサブアレイが、イメージングのために再び使用されることができる。生成される各画像ごとにステップ７００乃至７０２を実施しない利点は、利用できるセンサ帯域幅よりも少ない帯域幅が、フォーカス情報を得るために使用され、画像の実際の取得のためにより多くの帯域幅を残すことであり、結果的に、所望のフォーカス位置のバリエーションのより遅い追跡を犠牲にして、スキャナのより高いスループットをもたらす。

本発明の実施形態によれば、サブアレイの行の数は、走査プロセス全体の間、固定であり、例えば、１Ｄラインセンサをシミュレートするために１行に固定され、又は検知領域を拡大するために少し多い数の行に固定される（図６は、サブアレイの幅が４行に固定される例を示す）。

代替として、行の数は、走査プロセスの間、動的に設定されることができる。

非限定的な例として、この数は、予め決められたフォーカスで、例えば焦点が合った状態で、画像を提供することが可能であると決定されたサブセットの行の数の関数で変わりうる。従って、場合によっては、サブアレイの幅は、走査中、変わりうる。

実施形態において、スキャナは、サブアレイの形状を、前記交差Ｉの形状に適合させるように設定されることができる。従って、これらの実施形態において、サブアレイの形状は、例えば屈曲、カーブ等の任意の形でありうる。

更に、代替例において、サブアレイの行の最大数が規定されることができる。本発明の実施形態により、他のサブセット構造が使用されることができる。

非限定的な例として、図８は、サブアレイ８００、及び主にサブアレイと同じ方向、すなわち走査方向Ｘ'に垂直な方向、に沿って延在するピクセルサブセットを示している。より正確に言うと、サブセットは、参照８０１乃至８０４によって示される４つの部分を形成する４つの別個の領域に分布されている。これらの部分は対で構成される。一対は、同じＸ座標に位置付けられる。具体的には、第１の対８０１、８０２は、座標Ｘ１に位置付けられ、第２の対８０３、８０４は、座標Ｘ２に位置付けられる。各対において、１つの部分（８０１又は８０３）は、７ピクセルの１行からなり、１つの部分（８０２又は８０４）は、６ピクセルの１行からなる。

当然ながら、当業者であれば、一般の目安として、サブセットの構造は、センサが自己フォーカスサブアレイセンサとしてふるまうことを可能にする任意の考え得る形状に対応しうることが分かるであろう。例として、形状は、円、カーブ、屈曲等でありうる。

本発明の実施形態によれば、サブセットは、走査プロセスの間、変化しうる。例えば、図８の座標Ｘ１及びＸ２は、第１の走査位置で使用されることができ、座標Ｘ３、Ｘ４は、第２の走査位置で使用されることができる。このようにして、サブセットは、図８の右側の矢印によって表されるように、マトリックスの寸法Ｘにわたって走査されることができる。

実施形態の第１の詳細な実現例が以下に記述される。

この実現例において、サンプルのオブリーク断面の、センサの２Ｄアレイへの投影は、ここでも、保持表面に対しセンサを角度β'傾けることによって提供される。

再び図４を参照して、オートフォーカスシステムの深さレンジΔｚ'ｔｏｔは、他のパラメータの現実的な設定に関して十分に大きくなりうる。

センサは、軸Ｘに沿ってＮ_ｘピクセルを有するものとし、この軸に沿ったピクセルサイズはｂとする。センサは更に、Ｙ軸に沿ってＮ_ｙピクセルを有するものとする。思い出すために、（軸Ｘ'に沿った）走査方向は、軸Ｘに対し角度β'をなす。

センサは、角度β'傾けられるので、横方向及び軸方向のサンプリングは、
Δｘ＝ｂ ｃｏｓβ'
Δｚ＝ｂ ｓｉｎβ'
によって与えられる。

組織スライドの横方向及び軸方向のサンプリングは、
Δｘ'＝Δｘ／Ｍ
Δｚ'＝ｎΔｚ／Ｍ^２
によって与えられる。ここで、Ｍは倍率であり、ｎは組織スライドの屈折率である。

対物レンズにおける軸方向のサンプリングは、

に従う。Ｎ_ｘピクセルがある場合、深さレンジ全体は、

である。

センサは、フォーカス検出及び画像取得のために使用されることができるので、サンプリング間隔（すなわち対物レンズ空間のピクセルサイズ）は、スキャナの所望の解像度によって決定される。

０．５μｍ解像度を有する「４０Ｘ」スキャナの例が示される。

この例は、０．２５μｍサンプリング間隔（すなわちピクセルサイズ）に対応する。

従って、４０Ｘスキャナの場合、対物レンズ空間のピクセルサイズ（すなわち、サイズｂを有する１つの物理的ピクセルに投影される像のサイズ）は、ｘ＝０．２５μｍでありうる。

原則的に、ＣＭＯＳ又はＣＣＤ画像センサ上のピクセルサイズは選択自由である。ピクセルサイズは、リソグラフィ方法の最小のフィーチャサイズによって下部サイズが制限され、全体のセンササイズによって上側サイズが制限されることができ、これは、特定の解像度及びピクセルサイズを与えられる場合になお費用効果的である。今日、良好な性能を有する入手可能なセンサを与えるＣＭＯＳ画像センサのピクセルサイズｂの実際値は、５μｍでありうる。

これは、４０Ｘスキャナの場合、倍率係数Ｍが２０に等しいことを示す。

屈折率ｎが１．５に等しいものとして、これは、Δｚ'の２６７倍を超える約１の対物レンズ空間Δｚの軸方向サンプリングをもたらす。

センサに実際的な１０μｍの動作深さレンジを与えるために、センサは、画像空間の２．７ｍｍのレンジをカバーするように傾けられることができる。

センサ表面の増大された反射と、ピクセルの光活性領域が基板にわずかに沈み込みうるという事実により、センサの傾斜角は、好適には２０度より小さく、より好適には約１０度でありうる。

ｘ方向のセンサのサイズが約１６ｍｍである場合、１０度傾けられるセンサは、画像空間の２．７ｍｍの深さレンジ、ゆえに対物レンズ空間の１０μｍをカバーすることができる。

これは、Ｎ_ｘ＝３２００ピクセルを示すことができ、それは、約３．３ｎｍの軸方向サンプリング間隔Δｚ'をもたらす。

これが必要とされるよりも非常に高い場合、約１μｍの４０Ｘ顕微鏡の典型的な焦点深度を考慮して、Ｘ方向におけるセンサのピクセルの間隔を増大することが実際的な選択肢でありうる。

サイズは顕微鏡の解像力（ＭＴＦ）を決定するので、同じままでなければならない。

第２の詳細な実現例によれば、組織サンプルのオブリーク断面が、走査型顕微鏡に光学装置を加えることによって、センサ上に投影される。

この装置は、サンプルの或るポイントから、このポイントをイメージングするのに使用されるセンサ上のピクセル領域までの光路長は、走査方向に沿った位置に従って線形に変化するように構成される。このような装置を加える効果は、センサに投影される画像のフォーカス深さが、走査方向に沿った位置に従って線形に変化することである。従って、このような装置を使用することは、第１の実現例において上述したようにセンサを傾けるのと同じ効果を可能にする。

例示の実施形態において、前記光学装置は、光路に配置されるプリズムである。例えば、プリズム２５は、サンプルから始まる光路中、センサの直前に配置されることができる。更に、プリズムは、センサの近傍に、又はセンサに直接的若しくは間接的に接触して、配置されることができる。

この第２の実現例によれば、軸Ｚが軸Ｘ、Ｙ及びＸ'に対し垂直であるようにスキャナを配置することが可能であることに注意することができる。

当然ながら、本発明は、上述の実施形態に制限されなくてよい。

例えば、特定の領域のただ１つの画像（合成画像でない）を得るために、ただ１回の走査ステップを実行することによって本発明のスキャナを使用することが望ましいことがある。

非限定的な例として、病理学者が第１の解像度で組織サンプル全体の初期画像を得るという状況がありうる。

この初期画像は、本発明のスキャナによって、又は傾けられた構造の有無にかかわらず別のスキャナによって、事前に取得しておくことができる。

初期画像は、任意の通信システム（例えばイントラネット、インターネット又は任意の他の通信ネットワーク）を使用して、別の専門家によって病理学者に通信されることができる。

初期画像を解析することによって、病理学者は、サンプルの特定の領域内の或る詳細を見たいと望むことがある。

従って、この領域を決定することによって、病理学者は、ユーザインタフェースを通じて、この特定の領域の新しい画像の取得を生じさせるために、本発明のスキャナに情報を提供することができる。

前記情報は、さまざまな形態で提供されることができる。

例えば、病理学者は、走査の位置、及び／又は新しい画像を生成するために活性化されなければならないサブアレイの座標を直接入力することが可能でありうる。スキャナは、組織サンプルに対してセンサを、正しい位置に移動させ、マトリックスの前記座標のサブアレイを活性化し、所望の解像度で特定の領域の画像を生成することができる。

代替として、マウス、トラックボール等を使用することによって、病理学者は、スキャナのディスプレイに表示される初期画像の特定の領域を選択することができ、制御モジュールは、この情報を、当該サブアレイの走査位置及び座標に変換することができる。

座標は更に、例えばフラッシュメモリ、コンパクトなディスク又はデジタルビデオディスクのような記憶媒体から、情報を取り出すことによって提供されることができる。例えば、スキャナは、本発明のスキャナによって生成された電子ファイルを取り出すことができる。このファイルは、初期合成画像を生成するために事前に使用されたであろうすべての走査位置及びサブアレイを決定するための情報を含むことができる。病理学者が彼が再び取得したいと望む特定の領域のスキャナ情報を入力すると、スキャナは、ファイル内に含まれる情報から、個々の（複数）走査位置、及び（複数）走査位置で指定され／活性化されるべきサブアレイを導き出すことが可能である。

（複数）サブアレイの（複数）座標がスキャナから知られると、制御モジュールは、サンプルに対しセンサを前記位置に移動させ、この（これらの）サブアレイを活性化し、画像を生成する。

このような原理は、当業者が容易に認識するであろう多くの他の例にも適用することができる。

例えば、病理学者は、初期画像の特定の領域の焦点がよく合っていないと考えることがあり、病理学者が、再びこの領域を取得したいと望むことがある。再び、病理学者は、（複数）走査位置及び／又は活性化されるサブアレイが決定されることができるように、スキャナに情報を入力することができる。

別の例として、病理学者は、サンプル中の（ｚ軸に沿った）特定の深さにおいて、サンプルの特定の領域の画像を得ることを望むことがある。病理学者は、入力情報として、所望の深さを提供することができ、スキャナは、（複数）走査位置及び／又は活性化されるべきサブアレイを導き出すことができる。

初期画像が事前に取得される場合、スキャナは、特定の領域が同じ条件でイメージングされることを確実にするために、幾つかの内部パラメータを調整する必要がありうることに注意すべきである。例えば、初期画像が、別の傾斜角をもつ又は非傾斜構造をもつスキャナを使用して生成される場合、本発明のスキャナは、これを考慮に入れる必要がありうる。

これに関して、当業者は、これがその人の一般的な能力に属する場合、行われるべき調整を決定することが可能である。

他の見地によれば、本発明の及び特に上述された原理は、ＴＤＩ（時間遅延積分）センサの使用に有利に適応されることができる。

従って、本発明の実施形態において、サブアレイは、それが１ＤラインＴＤＩスキャナのＮステージ（Ｎは整数）を構成するように指定される。

非限定的な例として、図６に関して記述された実施形態は、指定されるサブアレイ４０１の４つのラインが、１ラインの４ステージをそれぞれ構成するように、容易に適応されることができる。

このような実施形態によってＴＤＩを使用するより詳細な例が、図９に示されている。この図には、４つのＴＤＩステージ（例えば９０Ａ、９１Ａ、９２Ａ、９３Ａ）の３つのブロックＢＡ、ＢＢ、ＢＣが、ピクセルマトリックスに示されている。

ＴＤＩブロックは、機能ＴＤＩユニットとして働く、ピクセルマトリックス全体の中のサブアレイを意味することに注意されたい。

必須でないが、間隙Ｇ１及びＧ２は、ブロックＡ、ＢとブロックＢ、Ｃとの間に規定されることもできる。間隙は、光活性ピクセルが規定されず、ピクセルが活性化されることができないマトリックス上の領域をさす。

当業者は、明らかな態様で、このような実施形態によりＴＤＩセンサが如何にして動作しうるかを導き出すであろう。幾つかの実施形態が、非限定的な例によりここに記述されている。それらの全ては、２つの優勢なイメージングセンサタイプ（すなわちＣＣＤ及びＣＭＯＳ画像センサ）の双方に適用可能である。ＣＣＤ画像センサの場合、ＴＤＩアクションは、アナログドメインにおいて、ピクセルの或る組からピクセルの別の組に電荷をコピーすることによって一般に実行される。ＣＭＯＳ画像センサの場合、ＴＤＩアクションは、デジタルドメインにおいて、ピクセルの或る組のデジタル値をピクセルの別の組のデジタル値に加えることによって一般に実施される。しかしながら、デジタル及びアナログＴＤＩの両方が、ＣＣＤ及びＣＭＯＳのいずれにも適用されることができる。

このテキストの残りの部分において、ＴＤＩアクションは、ピクセル値の移動として記述されるが、それは、アナログＴＤＩが用いられる場合はアナログ電荷移動として、デジタルＴＤＩが用いられる場合はピクセル値移動として、理解されるべきである。

図９の例に戻って、センサは、ピクセル値が移動される間、顕微鏡スライドに対し更なる走査位置へ移動される。図９の例において、ＴＤＩアクションは、上方へ働き、センサに対するサンプルの平行移動も上方へ行われるものとする。

ステージ９０Ａ（ステージは、好適にはピクセルのフルラインを含む）は、各露光ごとに０のピクセル値から始めり、ステージ９３Ａからのピクセル値が、ブロックＡにおける最終的な画像を生成する。

フルＴＤＩサイクルの間にサンプルの画像の１つのラインをたどる場合、当技術分野において知られている方法は以下の通りである：時間ｔ＝０の露光中、サンプルの画像が、センサによって取得される。ｔ＝１の次の露光において、サンプルは、ステージ９０Ａでｔ＝０に投影されたサンプルの画像の部分がステージ９１Ａに投影されるように、平行移動される。露光ｔ＝０とｔ＝１との間に、ステージ９０Ａのピクセル値が、ステージ９１Ａにコピーされる。ｔ＝１の露光中、ステージ９１Ａ上の露光から生じるピクセル値が、ｔ＝０におけるステージ９０Ａでの露光から生じた既に存在する値に加えらえる。ステージ９１Ａの値は、ｔ＝０のステージ９０Ａでの露光及びｔ＝１のステージ９１Ａでの露光から生じたピクセル値の合計である。露光ｔ＝１とｔ＝２との間に、ステージ９１Ａのピクセル値が、ステージ９２Ａにコピーされる。ｔ＝２の露光中、ステージ９２Ａ上の露光から生じるピクセル値は、ｔ＝０のステージ９０Ａでの露光及びｔ＝１のステージ９１Ａで露光から生じた既に存在する値に加えられる。ステージ９２Ａの値は、ｔ＝０のステージ９０Ａでの露光、ｔ＝１のステージ９１Ａでの露光及びｔ＝２のステージ９２Ａでの露光から生じたピクセル値の合計である。露光ｔ＝２とｔ＝３との間で、ステージ９２Ａのピクセル値は、ステージ９３Ａにコピーされる。ｔ＝３の露光中、ステージ９３Ａ上の露光から生じるピクセル値は、ｔ＝０でのステージ９０Ａでの露光、ｔ＝１のステージ９１Ａでの露光、及びｔ＝２のステージ９２Ａでの露光から生じた既に存在する値に加えられる。ステージ９３Ａの値は、ｔ＝０のステージ９０Ａでの露光、ｔ＝１のステージ９１Ａでの露光、ｔ＝２のステージ９２Ａでの露光、及びｔ＝３のステージ９３Ａでの露光から生じたピクセル値の合計である。サンプルの画像は、ＴＤＩアクションと同じ方向に同じスピードで、センサ上を平行移動されるので、この例では、４つの等しい露光が、サンプル上の同じ領域から行われる。これは、サンプルの平行移動を減速することなく且つ付加のモーションブラーを導入することなく、露光期間の４倍と同等になる。

上述の説明は、ブロックＢＢ及びＢＣのような任意の他のブロックにも適用できる。

このような実施形態において、ＴＤＩブロックの４つのステージが、同じフォーカスで同じ領域の画像を取得することが可能でありうることに注意すべきである。

従って、各ＴＤＩブロックのＴＤＩステージは、それらが同じ距離サンプルから隔てられるようにされうる。

例えば、上述の第１の詳細な実現例に戻り、４つのステージが、各ブロックについて使用されることができる。従って、ＴＤＩブロックの各々は、ピクセルサイズｂと同じサイズをもつピッチによって、互いに隣り合って位置するピクセルの４つのラインによって構成されることができる。ピッチとは、２つの近隣のピクセルの中心間の距離をさすことに注意されたい。各々のＴＤＩブロックは、ピッチより大きい間隙距離離れて配置されることができる。間隙距離は、センサの深さ位置のＺ解像度を決定する。各ＴＤＩブロックの個々のピクセルは互いにより近くに置きながら、相対的に大きい間隙を有することが有利でありうる。このようにして、各ＴＤＩステージの個々のステージは互いに近づけられるので、相対的に大きいＺレンジが、あまりに多くのピクセルを使用することなく得られることができる、その結果、それらは、同じ深さで取得を行い、１又は複数のステージのデフォーカスにより、画像ソフトニングを低減する。当然ながら、間隙を使用しないことも可能であり、ＴＤＩブロックを、連続するピクセルマトリックス全体のサブアレイとすることが可能である。

上述のこの第１の詳細な実現例において与えられるパラメータ数に関して、当業者であれば、ＴＤＩセンサ画像の４つのステージが、組織層のほぼ同じ深さにおいて、すなわち３．３ｎｍの４倍のおよそのレンジ内で、画像を取得することが容易に分かるであろう。

この実現例では、１０μｍの所望の深さレンジの場合、実際的な選択は、ＴＤＩブロックの１００グループでありえ、各々が４ＴＤＩステージを含む。これらの４つの隣接するステージは、２０μｍの幅でありえ、間隙は１４０μｍの幅である。センサのＸ方向に沿って４００ピクセルがある場合、フォーカス位置は、１００ｎｍの正確さで設定され解析されることができ、これは、本例の４０Ｘスキャナの典型的な１μｍの焦点深度よりかなり小さい。

任意に、間隙は、異なる色（例えばＲ、Ｇ、Ｂ）に関してＴＤＩブロックを利用するために使用されることができる。白色照明は、センサの異なるＴＤＩステージ上又はその前に置かれる異なるカラーフィルタと共に使用されることができる。センサは、カラーフィルタなしで使用されてもよい。この場合、順次のカラー照明が、フルカラー画像を得るために使用されることができる。

本発明は、図面及び上述の記述において詳しく示され、記述されているが、このような図示及び記述は、説明的又は例示的なものとして考えられるべきであり、制限的なものとして考えられるべきではない。本発明は、開示される実施形態に制限されない。

他の変更例が、図面、開示及び添付の請求項の検討により、請求項に記載の本発明を実施する際に当業者によって理解され実現されることができる。

請求項において、「含む、有する(comprising)」という語は、他の構成要素又はステップを除外せず、不定冠詞「a」又は「an」は複数性を除外しない。

特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示さない。

請求項における任意の参照符号は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。

Claims (15)

1. ＸＹ座標系の２Ｄピクセルアレイを含むセンサを有するスキャナにより、サンプルを微視的にイメージングする方法であって、Ｙ軸は、走査方向に対し垂直であり、前記スキャナは、前記センサが前記サンプルのオブリーク断面をイメージングすることができるように構成され、前記方法は、
   第１のＸ座標においてＹ軸に沿って主に延在する、前記２Ｄピクセルアレイの第１のサブアレイを活性化するステップと、
   前記第１のサブアレイによって前記サンプルの第１の領域をイメージングすることによって、第１の画像を生成するステップと、
   を含み、
   前記方法が更に、前記第１のサブアレイを活性化するステップに先立って、
   前記センサの前記２Ｄピクセルアレイの予め決められたピクセルのサブセットを活性化して、前記サンプルの領域をイメージングすることにより、該領域の画像を生成するステップであって、前記予め決められたピクセルのサブセットが、前記第１のサブアレイのピクセルとは異なるものである、ステップと、
   該領域の画像から、フォーカス情報を導き出すステップであって、前記サブセットのどのピクセルが焦点の合った画像を取得することができるかを決定することを含むステップと、
   前記フォーカス情報から、活性化されるべき前記第１のサブアレイを特定する前記第１のＸ座標を決定するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記サンプルを走査するステップと、
   前記第１のＸ座標と異なる第２のＸ座標においてＹ軸に沿って主に延在する、前記２Ｄピクセルアレイの第２のサブアレイを活性化するステップと、
   前記第２のサブアレイによって前記サンプルの第２の領域をイメージングすることによって、第２の画像を生成するステップと、
   を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１及び前記第２の画像を組み合わせることによって、前記サンプルの合成画像を作るステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のＸ座標を提供するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１のサブアレイが予め決められたフォーカスで前記第１の画像を提供することが可能であるように、前記第１のＸ座標を決定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１及び前記第２のサブアレイは、等しいフォーカスで前記第１及び前記第２の画像を提供することが可能であるように、前記第１及び前記第２のＸ座標を決定するステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
7. 前記予め決められたピクセルのサブセットが、矩形形状を有してＸ軸に沿って主に延在するように、前記予め決められたピクセルのサブセットを活性化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記ピクセルのサブセットが、前記２Ｄピクセルアレイの少なくとも２つの別個の領域に分布される、請求項１又は７に記載の方法。
9. 前記サンプルが特定の厚さを有し、前記方法は、
   前記第１のサブアレイが予め決められたフォーカスで前記サンプルをイメージングすることができる前記厚さ内の深さに関する情報を提供するステップと、
   前記深さ情報に従って、前記第１のＸ座標を決定するステップと、
   を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記予め決められたフォーカスは、ベストフォーカスの状態を示す、請求項５乃至９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記サンプルの断面は、前記走査方向に対し傾いている、請求項１に記載の方法。
12. 前記スキャナは、前記保持表面を含むサンプルホルダを有し、前記２Ｄピクセルアレイは、前記保持表面に対し傾斜角をなす平面にある、請求項１に記載の方法。
13. 前記２Ｄアレイセンサは、前記第１のサブアレイが、Ｙ軸に沿って３未満のピクセル行を含むように、前記第１のサブアレイを活性化することによって、１Ｄラインセンサとして機能するように、又は前記第１のサブアレイが、各ステージにおいてＹ軸に沿って３未満のピクセル行を含むように、前記第１のサブアレイを活性化することによって、ＴＤＩセンサとして機能するように制御される、請求項１に記載の方法。
14. 請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成される、サンプルをイメージングするための走査型顕微鏡。
15. サンプルのオブリーク断面をイメージングする装置であって、
    ＸＹ座標系の２Ｄピクセルアレイを含むセンサと、
    制御モジュールと、
    を有し、前記制御モジュールが、
    第１のＸ座標においてＹ軸に沿って主に延在する、前記２Ｄピクセルアレイの第１のサブアレイを活性化し、
    前記第１のサブアレイによって前記サンプルの第２の領域をイメージングすることによって、第１の画像を生成し、
    前記制御モジュールが更に、前記第１のサブアレイの前記活性化に先立って、
    前記センサの前記２Ｄピクセルアレイの予め決められたピクセルのサブセットであって前記第１のサブアレイのピクセルとは異なるサブセットを活性化して、前記サンプルの領域をイメージングすることにより、該領域の画像を生成し、
    該領域の画像から、前記サブセットのどのピクセルが焦点の合った画像を取得することができるかを決定して、フォーカス情報を導き出し、
    前記フォーカス情報から、活性化されるべき前記第１のサブアレイを特定する前記第１のＸ座標を決定する、
    装置。

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