JP5759371B2

JP5759371B2 - 真核生物における全長抗体の表面提示

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Publication number: JP5759371B2
Application number: JP2011517488A
Authority: JP
Inventors: ビアンカ，プリンツ; セスラマン，ナタラジヤン; チヤ，トンシン; ビルト，ステフアン; ボブローウイツ，ピヨートル
Original assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2008-07-09
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2015-08-05
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Also published as: JP2011527576A; WO2010005863A1; EP2304029A1; US8067339B2; CA2730243A1; US9260712B2; US20190055546A1; EP2304029B1; US20120021948A1; US20210317441A1; US12084651B2; US20100009866A1; US20170107509A1; CA2730243C; US11046951B2; DK2304029T3; US20170327817A9

Description

本発明は哺乳動物、植物、酵母及び糸状菌細胞を含む真核宿主細胞の表面に全長免疫グロブリン又は免疫グロブリンライブラリーを提示するための方法に関する。前記方法は目的の性質をもつ特定の免疫グロブリンを同定するために組換えグロブリンを産生する真核宿主細胞のライブラリーをスクリーニングするのに有用である。前記方法は該当免疫グロブリンを高レベルで発現する宿主細胞と、特定抗原に対して高い親和性をもつ免疫グロブリンを発現する宿主細胞を同定するために真核宿主細胞で免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングするのに特に有用である。

モノクローナル抗体の発見はヒトｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡライブラリーから抗体の選択を行うために抗体を作製するハイブリドーマ技術から生まれた。これは抗体の効力を改善するために抗体の結合親和性及び特異性の改善を図る要望によっても進められている。そこで、コンビナトリアルライブラリースクリーニング及び選択法は蛋白質の認識特性を改変させる一般的なツールとなっている（Ｅｌｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２７７９−２７８２（１９９７）；Ｐｈｉｚｉｃｋｙ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５））。抗体ライブラリーをインビトロ構築及びスクリーニングできるならば、抗体−抗原相互作用の強度と特異性の制御を改善できると期待される。

抗体ライブラリーを構築及びスクリーニングする技術として最も広く知られているのは、該当蛋白質をバクテリオファージコート蛋白質とのポリペプチド融合体として発現させた後に、固相化又は可溶性ビオチン化リガンドと結合することによりスクリーニングするファージディスプレイ法である。ファージの先端に３〜５コピー存在する遺伝子ＩＩＩ蛋白質（ｐＩＩＩ）と呼ばれるマイナーコート蛋白質との融合体を作製するのが最も一般的である。こうして構築されたファージは表現型（提示される抗体の結合活性）と遺伝子型（該当抗体をコードする遺伝子）の両方を１つのパッケージに併有するコンパクトな遺伝子「単位」とみなすことができる。ファージディスプレイ法は抗体、ＤＮＡ結合性蛋白質、プロテアーゼ阻害剤、短鎖ペプチド及び酵素への適用に成功している（Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４３１−４３６（１９９５）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）；Ｌａｄｎｅｒ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４２６−４３０（１９９５）；Ｌｏｗｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）；Ｍａｒｋｌａｎｄｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６７：２８−５１（１９９６）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ＆Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１１１３−１１１７（１９９３）；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６７：５２−６８（１９９６））。

「パンニング」と呼ばれる方法で固相化抗原と結合することにより望ましい結合特性をもつ抗体を選択する。非特異的抗体をもつファージを洗浄により除去した後、結合したファージを溶出させ、大腸菌の感染により増幅する。多数の抗原に対する抗体を作製するためにこのアプローチが適用されている。

しかし、ファージディスプレイ法にはいくつかの欠点がある。抗体ファージディスプレイライブラリーのパンニングは強力な技術であるが、その広範な適用の成功を阻むいくつかの固有の欠点がある。例えば、真核生物の分泌型蛋白質と細胞表面蛋白質には細菌細胞では得られないグリコシル化や大規模なジスルフィド異性化等の翻訳後修飾を必要とするものがある。更に、ファージディスプレイ法の性質により、リガンド結合パラメーターの定量的な直接識別が不可能である。例えば、非常に強い抗体−抗原相互作用を停止させるために必要な溶出条件は一般にファージ粒子が非感染性に変性するほど苛酷（例えば低ｐＨ、高塩）であるため、非常に高親和性の抗体（Ｋｄ≦１ｎＭ）をパンニングにより単離することは困難である。

更に、抗原を固相表面に物理的に固相化する必要があるため、多くの技術的問題が生じる。例えば、抗原表面密度が高いと、アビディティー効果を生じ、真の親和性が得られなくなる。また、物理的な繋留により抗原の並進及び回転エントロピーが低下し、抗体結合後にＤＳが低下し、その結果、可溶性抗原に対するよりも結合親和性が過大評価され、混合及び洗浄工程での変動の影響も大きいため、再現性に問題が生じる。更に、ファージ１粒子当たり１〜数個の抗体しか存在しないため、実質的な確率的変動が生じ、同様の親和性の抗体間の区別が不可能になる。例えば、効率的な区別には６倍以上の親和性の差が必要になることが多い（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ＆Ｗｅｉｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：８８４８−５５（１９９３））。最後に、より迅速に増殖する野生型ファージにより集団が追い越される可能性がある。特に、ｐＩＩＩはファージ生活環に直接関与するので、所定の抗体又は結合抗原の存在は結合したファージの増幅を妨げたり、遅らせるであろう。

他の細菌細胞表面提示法も開発されている（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０４４４−１０４４８（１９９３）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４（１９９７））。しかし、原核発現系を使用すると、予想外の発現バイアスが生じる場合があり（Ｋｎａｐｐｉｋ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：８１−８９（１９９５）；Ｕｌｒｉｃｈｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１９０７−１１９１１（１９９５）；Ｗａｌｋｅｒ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６９：２８４８７−２８４９３（１９９４））、細菌莢膜多糖層は拡散バリヤーとなり、このような系を小分子リガンドに制限する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：２８５−３１５（１９９６））。大腸菌は巨大分子結合反応の立体障害となり得るリポ多糖層又は莢膜をもつ。実際に、細菌莢膜の生理的機能は細胞を免疫系から保護するために、細胞膜への巨大分子拡散の制限であると推定される（ＤｉＲｉｅｎｚｏｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：４８１−５３２，（１９７８））。大腸菌のペリプラズムは抗体フラグメントのフォールディング及びアセンブリ用の区画として進化していないので、大腸菌における抗体の発現は一般に非常にクローン依存的であり、クローンによって十分に発現するものと、全く発現しないものがある。このような変動は大腸菌の表面に発現される抗体ライブラリー中の可能な全配列の均等な提示に関する問題を生じる。更に、ファージディスプレイ法は抗体の特異性又は親和性を変化させることができるグリコシル化等の所定の重要な翻訳後修飾を実施できない。循環モノクローナル抗体の約３分の１は可変領域に１個以上のＮ−結合型グリカンを含む。場合により、可変領域におけるこれらのＮ−グリカンは抗体機能に重要な役割を果たすと考えられる。

モノクローナル抗体治療薬の効率的な生産は酵母細胞等の下等真核細胞を利用する代替試験システムの開発により助長されると思われる。Ｂ細胞提示抗体と酵母細胞提示抗体の構造的類似性により、糸状菌ファージで得られるよりも密接なインビボ親和性成熟との類似が得られる。特に、下等真核細胞はグリコシル化蛋白質を産生することができるが、糸状菌ファージは産生できないので、下等真核宿主細胞で産生されるモノクローナル抗体は下等真核宿主細胞を利用する試験システムでそうであるように、ヒト及び他の哺乳動物でも同様の活性を示す可能性が高い。

更に、酵母では増殖培養が容易で遺伝子操作も簡単なため、大きな集団を迅速に突然変異誘発及びスクリーニングすることが可能になろう。哺乳動物体内における条件との対比により、抗体操作実験の自由度を更に増すように広範なｐＨ、温度及びイオン強度内で酵母培養に合わせて結合及び選択の物理化学的条件を変えることができる。コンビナトリアル蛋白質ライブラリーのスクリーニング用の酵母表面提示システムの開発については記載されている。

米国特許第６，３００，０６５号及び６，６９９，６５８号はコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング用の酵母表面提示システムと、抗体−抗原解離速度に基づくスクリーニング法の開発について記載している。このシステムは突然変異誘発法を使用して酵母細胞壁蛋白質と融合した抗体又は抗体フラグメントを発現するベクターを酵母にトランスフェクトし、抗体又は抗体フラグメントの突然変異体の多様化集団を作製した後に、望ましい高い表現型特性をもつ抗体又は抗体フラグメントを産生する細胞をスクリーニング及び選択する。米国特許第７，１３２，２７３号は各種酵母細胞壁アンカー蛋白質と、外来酵素又はポリペプチドを細胞壁に固相化するためにこれらの蛋白質を使用する表面発現システムを開示している。

注目すべきものとしては、Ｆｌｏ１ｐアンカーシステムを使用したＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞表面提示システムの構築を開示するＴａｎｉｎｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：９８９−９９３（２００６）；Ｆｌｏ１ｐアンカーシステムを使用したＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞表面提示システムにおけるアデノレグリンの提示を開示するＲｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：１０３−１０８（２００７）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−アグルチニンのＣ末端側半分に融合したＫ．ｌａｃｔｉｓ黄色酵素の提示を開示するＭｅｒｇｌｅｒｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：４１８−４２１（２００４）；α−アグルチニンを使用したＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの表面への蛋白質の提示を開示するＪａｃｏｂｓｅｔａｌ．，ＡｂｓｔｒａｃｔＴ２３，ＰｉｃｈｉａＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｏｃｔｏｂｅｒ８−１１，２００６）；特定のレクチンと結合する蛋白質を同定するための酵母提示システムの使用を開示するＲｙｃｋａｅｒｔｅｔａｌ．，ＡｂｓｔｒａｃｔｓＢＶＢＭＢＭｅｅｔｉｎｇ，ＶｒｉｊｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔＢｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２，２００５）；分泌される産物と結合する捕捉部分を細胞表面に固定した後に検出手段を使用して同定することにより、細胞により分泌される産物に基づいて細胞を同定する方法を開示する米国特許第７，１６６，４２３号；特定の抗体を発現する細胞を同定するために細胞の表面にプロテインＡ又はＧを結合するためのビオチン−アビジンシステムを開示する米国特許出願公開第２００４／０２１９６１１号；表面捕捉部分と蛋白質を細胞中で発現させ、捕捉部分と蛋白質の複合体を形成させ、細胞の表面に提示させることにより、特定蛋白質を発現する細胞を同定する方法を開示する米国特許第６，９１９，１８３号；細胞中で発現される細胞壁蛋白質と融合した結合性蛋白質から構成される融合蛋白質を使用して酵母又は真菌の表面に蛋白質を固相化する方法を開示する米国特許第６，１１４，１４７号が挙げられる。

癌治療、腫瘍画像診断、敗血症等のヒト疾患の診断及び治療用の抗体を工学的に設計する潜在的用途は遠大である。これらの用途では、高い親和性（即ちＫｄ≦１０ｎＭ）と高い特異性をもつ抗体が非常に望ましい。事例証拠と上記演繹的考察によると、ファージディスプレイ又は細菌提示システムはナノモル未満の親和性の抗体を安定して作製しにくいと思われる。また、ファージディスプレイ又は細菌提示システムを使用して同定された抗体を真核細胞で商業的規模の生産に利用することも難しそうである。今日までに、このような目的を達成することができるシステムは開発されておらず、使用もされていない。

従って、有効な蛋白質提示により免疫グロブリンの組換え生産用の遺伝的に強化された細胞の開発を助長するような改良型ベクター及び宿主細胞株に基づく別の蛋白質発現システムの開発が望ましい目標である。

米国特許第６，３００，０６５号明細書米国特許第６，６９９，６５８号明細書米国特許第７，１３２，２７３号明細書米国特許第７，１６６，４２３号明細書米国特許出願公開第２００４／０２１９６１１号明細書米国特許第６，９１９，１８３号明細書米国特許第６，１１４，１４７号明細書

Ｅｌｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：２７７９−２７８２（１９９７）Ｐｈｉｚｉｃｋｙ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４３１−４３６（１９９５）Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０（１９９７）Ｌａｄｎｅｒ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４２６−４３０（１９９５）Ｌｏｗｍａｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１）Ｍａｒｋｌａｎｄｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６７：２８−５１（１９９６）Ｍａｔｔｈｅｗｓ＆Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１１１３−１１１７（１９９３）Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．２６７：５２−６８（１９９６）Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ＆Ｗｅｉｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：８８４８−５５（１９９３）Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０４４４−１０４４８（１９９３）Ｇｅｏｒｇｉｏｕｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４（１９９７）Ｋｎａｐｐｉｋ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：８１−８９（１９９５）Ｕｌｒｉｃｈｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１９０７−１１９１１（１９９５）Ｗａｌｋｅｒ＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６９：２８４８７−２８４９３（１９９４）Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：２８５−３１５（１９９６）ＤｉＲｉｅｎｚｏｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：４８１−５３２，（１９７８）Ｔａｎｉｎｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：９８９−９９３（２００６）Ｒｅｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：１０３−１０８（２００７）Ｍｅｒｇｌｅｒｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：４１８−４２１（２００４）Ｊａｃｏｂｓｅｔａｌ．，ＡｂｓｔｒａｃｔＴ２３，ＰｉｃｈｉａＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｏｃｔｏｂｅｒ８−１１，２００６）Ｒｙｃｋａｅｒｔｅｔａｌ．，ＡｂｓｔｒａｃｔｓＢＶＢＭＢＭｅｅｔｉｎｇ，ＶｒｉｊｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔＢｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２，２００５）

本願の提示システムの最も強力な用途の１つは免疫グロブリン工学の領域におけるその使用である。結合特異性及び親和性の明白な低下を生じずに下等真核宿主細胞の表面にｓｃＦｖ抗原結合単位を発現させることができることが分かっている（例えば米国特許第６，３００，０６５号参照）。例えばハイブリドーマとＣＨＯ細胞の表面に全長抗体を捕捉及び結合できることも分かっている（米国特許第６，９１９，１８３号及び７，１６６，４２３号参照）。ファージディスプレイ技術を使用して多数の多様な抗原に対する抗体及びそのフラグメントの単離に成功しているが、真核宿主細胞、特に下等真核宿主細胞で免疫グロブリンを作製するための堅牢な提示システムが依然として必要とされている。ヒト様グリコシル化パターンをもつ免疫グロブリンを作製するための堅牢な提示システムを得ることが特に望ましい。種々のヒト様グリコシル化パターンをもつ糖蛋白質を産生する遺伝子組換え真核細胞が米国特許第７，０２９，８７２号と、例えばＣｈｏｉｅｔａｌ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１３；１４４１１４４３（２００６）；ＷｉｌｄｔａｎｄＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．３：１１９−１２８（２００５）；Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，ＧｌｙｃｏＢｉｏｌ．７５７−７６６（２００４）；Ｌｉｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２１０−２１５（２００６）；Ｃｈｉｂａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６２９８−２６３０４（１９９８）；及びＭａｒａｅｔａｌ．，ＧｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．１６：９９−１０７（１９９９）に記載されている。

本願に開示する方法はグリコシル化経路を変更又は改変するように宿主細胞が遺伝子操作されている場合に細胞の表面に特定のグリコシル化パターンをもつ全長免疫グロブリンの非常に多様なレパートリーを提示できるため、この用途に特に適している。多くの点で、本願の提示システムは天然免疫系に似ている。クローン化抗体Ｈ及びＬ鎖のディスプレイライブラリーから高親和性で結合するものを選択することにより抗原刺激を行うことができる。ＤＮＡ及び蛋白質としてのクローン化Ｈ及びＬ鎖のシャフリングと部位特異的組換えの使用により、発生中のＢ細胞におけるＨ及びＬ鎖遺伝子の組換え中に生じる多数の鎖置換に似せることができる（Ｇｅｏｆｆｏｒｙｅｔａｌ．Ｇｅｎｅ１５１：１０９−１１３（１９９４））。Ｈ及びＬ鎖のＣＤＲ領域に突然変異を導入することにより体細胞突然変異と同様の変異を生じることもできる。

「パンニング」と呼ばれる方式の親和性選択を使用して望ましい結合特異性又は親和性をもつ免疫グロブリンを同定することができる（Ｐａｒｍｌｅｙ＆Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ７３：３０５−３１８（１９８８））。まず免疫グロブリンのライブラリーを該当抗原の存在下でインキュベートした後に免疫グロブリンと結合した抗原を捕捉する。こうして回収した免疫グロブリンを次に増幅し、再び抗原と結合するものを選択し、該当抗原と結合する免疫グロブリンを増加する。１ラウンド以上の選択で望ましい特異性又はアビディティーをもつ抗体又はそのフラグメントの単離が可能になろう。従って、１回の実験で１０^４を上回る別個の抗体から望ましい抗体又はそのフラグメントを発現する希少な宿主細胞を容易に選択することができる。その後、個々の宿主細胞クローンのヌクレオチド配列により結合免疫グロブリンの一次構造を推定する。提示される免疫グロブリンでヒトＶＨ及びＶＬ領域を使用する場合には、本願の提示システムは非ヒト免疫グロブリンを新たに操作せずにヒト免疫グロブリンの選択を可能にする。

従って、１態様では、該当免疫グロブリンを発現する真核宿主細胞の作製方法を提供し、本方法は、第１の調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝的に多様な集団をコードする複数の核酸分子（ここで、重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも一方は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な複数の遺伝的に多様な宿主細胞を作製する段階と；宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分をコードする第１の核酸分子の発現を誘導する段階と；宿主細胞において捕捉部分をコードする第１の核酸分子の発現を阻害し、免疫グロブリンをコードする核酸分子の発現を誘導し、細胞の表面に該当免疫グロブリンを提示する宿主細胞を作製する段階を含む。他の側面において、前記方法は更に、その表面に提示される該当免疫グロブリンと特異的に結合する検出手段と宿主細胞を接触させる段階と；検出手段が結合した宿主細胞を単離し、該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を選択する段階を含む。

別の態様では、該当免疫グロブリンを発現する真核宿主細胞の作製方法を提供し、本方法は、第１の調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；免疫グロブリンをコードする１個以上の第２の核酸分子（ここで、重鎖又は軽鎖をコードする分子のいずれかは第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、突然変異誘発法を使用して免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団をコードする複数の宿主細胞を作製する段階と；宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分の発現を誘導する段階と；宿主細胞において捕捉部分の発現を阻害し、免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団の発現を誘導する段階と；該当免疫グロブリンと結合する検出手段と前記複数の宿主細胞を接触させ、該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を前記複数の宿主細胞中で同定する段階を含む。他の態様において、前記方法は更に、その表面に該当免疫グロブリンを提示する宿主細胞を単離し、該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を作製する段階を含む。

別の態様では、該当免疫グロブリンを発現する真核宿主細胞の作製方法を提供し、本方法は、第１の調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする１個以上の核酸分子（ここで、核酸分子をコードする重鎖又は軽鎖の少なくとも一方は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団をコードする複数の宿主細胞を作製する段階と；宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分の発現を誘導する段階と；宿主細胞において捕捉部分の発現を阻害し、免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団の発現を誘導し、宿主細胞を作製する段階を含む。他の態様において、前記方法は更に、該当免疫グロブリンと結合する検出手段と宿主細胞を接触させ、該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を同定する段階と；該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を単離し、該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を作製する段階を含む。

別の態様では、該当免疫グロブリンを発現する真核宿主細胞の作製方法を提供し、本方法は、第１の調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝的に多様な集団をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む複数の核酸分子（ここで、捕捉部分が重鎖と結合する場合には、少なくとも重鎖をコードするＯＲＦは第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、あるいは捕捉部分が軽鎖と結合する場合には、少なくとも軽鎖をコードするＯＲＦは第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な複数の遺伝的に多様な宿主細胞を作製する段階と；宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分をコードする核酸分子の発現を誘導する段階と；宿主細胞において捕捉部分をコードする核酸分子の発現を阻害し、免疫グロブリンをコードする核酸分子の発現を誘導し、宿主細胞を作製する段階を含む。他の態様において、前記方法は更に、宿主細胞の細胞表面に提示される該当免疫グロブリンと特異的に結合する検出手段と宿主細胞を接触させる段階と；検出手段が結合した宿主細胞を単離し、該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を選択する段階を含む。

別の態様では、ＶＨドメインとＶＬドメインをもち、更に該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ免疫グロブリンを産生する真核宿主細胞の作製方法を提供し、本方法は、（ａ）ＶＨドメインとＶＬドメインを含む免疫グロブリンをその表面に提示する真核宿主細胞のライブラリーを準備する段階（ここで、前記ライブラリーは、（ｉ）免疫グロブリンと結合することが可能な部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分を発現する真核宿主細胞（ここで、捕捉部分の発現は第１の調節性プロモーターにより行われる）を準備し；（ｉｉ）免疫グロブリンの遺伝的に多様な集団をコードする核酸分子のライブラリーを宿主細胞にトランスフェクトし、各々免疫グロブリンを発現する複数の宿主細胞を作製する（ここで、免疫グロブリンの遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１種以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して正のバイアスを示し、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の少なくとも一方の発現は第２の調節性プロモーターにより行われる）ことにより作製される）と；（ｂ）宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって宿主細胞において捕捉部分の発現を誘導する段階と；（ｃ）宿主細胞において捕捉部分の発現を阻害し、核酸配列のライブラリーの発現を誘導し、各宿主細胞にその表面に免疫グロブリンを提示させ、宿主細胞を作製する段階を含む。他の態様において、前記方法は更に、（ｄ）複数の宿主細胞を該当抗原と接触させ、その表面に提示された免疫グロブリンと該当抗原を結合させた宿主細胞を検出することにより、該当抗原に対して結合特異性をもつ免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を前記複数の宿主細胞中で同定し、ＶＨドメインとＶＬドメインをもち、更に該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ免疫グロブリンを産生する宿主細胞を作製する段階を含む。

上記態様の別の側面において、免疫グロブリンは合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインを含み、合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインはフレームワーク領域と超可変ループを含み、フレームワーク領域とＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初から２個の超可変ループは本質的にヒト生殖細胞系列であり、ＶＨドメインとＶＬドメインは改変型ＣＤＲ３ループをもつ。上記態様の別の側面において、改変型ＣＤＲ３ループをもつことに加えて、ヒト合成免疫グロブリンＶＨ及びＶＬドメインは他のＣＤＲループにも突然変異を含む。上記態様の更に別の側面において、各ヒト合成免疫グロブリンＶＨドメインＣＤＲループはランダム配列であり、上記態様の更に別の側面において、ヒト合成免疫グロブリンＶＨドメインＣＤＲループは公知標準構造であり、ランダム配列成分を含む。

別の態様では、調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする核酸分子と、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする１個以上の核酸分子を含む真核宿主細胞を提供し、重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも一方は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている。特定態様では、重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸分子が第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている。他の態様では、重鎖をコードする核酸分子が第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、軽鎖をコードする核酸分子が第３の調節性プロモーター又は構成的プロモーターと機能的に連結されている。他の態様では、軽鎖をコードする核酸分子が第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、重鎖をコードする核酸分子が第３の調節性プロモーター又は構成的プロモーターと機能的に連結されている。特定側面において、重鎖と軽鎖は別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされ、各ＯＲＦはプロモーターと機能的に連結されている。他の側面において、重鎖と軽鎖は単一のＯＲＦによりコードされ、タンデム配置の重鎖と軽鎖を含む単一の融合ポリペプチドとなり、ＯＲＦは調節性プロモーターと機能的に連結されている。単一のポリペプチドは重鎖と軽鎖に開裂可能であり、別々の重鎖及び軽鎖蛋白質となり、その後、会合して機能性抗体分子を形成することができる。

上記態様又は側面のいずれか１種の各種側面において、免疫グロブリンと結合する結合部分は免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する。このような結合部分の例としては、限定されないが、プロテインＡ、プロテインＡＺＺドメイン、プロテインＧ及びプロテインＬ、並びに免疫グロブリンとの結合能を維持するそのフラグメントから構成される群から選択されるものが挙げられる。他の結合部分の例としては、限定されないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質とその免疫グロブリン結合性フラグメントが挙げられる。ＦＣＲ蛋白質としては、γ免疫グロブリン（ＩｇＧ）と結合するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）ファミリー、ε免疫グロブリン（ＩｇＥ）と結合するＦｃε受容体（ＦｃεＲ）ファミリー、及びα免疫グロブリン（ＩｇＡ）と結合するＦｃα受容体（ＦｃαＲ）ファミリーのメンバーが挙げられる。ＩｇＧと結合し、本願の結合部分を構成することができる特定のＦｃＲ蛋白質としては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ又はＦｃγＲｎ（新生児）の少なくともＩｇＧ結合領域が挙げられる。

上記態様又は側面のいずれか１種の他の側面において、検出手段は該当免疫グロブリンと結合することが可能な抗原である。特定側面では、抗原を蛍光部分と共役ないし蛍光部分で標識する。他の側面において、検出手段は更に免疫グロブリン−抗原複合体に特異的であるか又は抗原上の別のエピトープに特異的な検出用免疫グロブリンを含み、この検出用免疫グロブリンを蛍光部分等の検出部分と共役ないし前記部分で標識する。

上記態様又は側面のいずれか１種の他の側面において、細胞表面アンカー蛋白質はグリコシルホスファチジルイノシトール係留型（ＧＰＩ）蛋白質である。特定側面において、細胞表面アンカー蛋白質はα−アグルチニン、Ｃｗｐ１ｐ、Ｃｗｐ２ｐ、Ｇａｓ１ｐ、Ｙａｐ３ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｃｒｈ２ｐ、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｓｅｄ１ｐ、Ｔｉｐ１ｐ、Ｗｐｉｐ、Ｈｐｗｐ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ及びＲｂｔ５ｐから構成される群から選択される。他の側面において、細胞表面アンカー蛋白質はＳｅｄ１ｐである。

使用することができる宿主細胞としては、下等及び高等両者の真核細胞が挙げられる。高等真核細胞としては、哺乳動物、昆虫及び植物細胞が挙げられる。上記態様又は側面のいずれか１種の他の側面において、真核生物は下等真核生物である。他の側面において、宿主細胞は酵母又は糸状菌細胞であり、特定側面ではＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ及びＮｅｕｒａｓｐｏｒａｃｒａｓｓａから構成される群から選択される。特定側面において、真核生物は酵母であり、他の側面において、酵母はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓである。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを宿主細胞として使用して本願の方法を例示しているが、本願に開示する同一目的のために他の下等真核又は高等真核細胞でも本願の方法を使用することができる。

上記方法のいずれか１種の他の側面では、宿主細胞における糖蛋白質のＯ−グリコシル化を抑制する。即ち、Ｃ−グリカン含有量とマンノース鎖長を減らす。酵母等の下等真核宿主細胞では、１種以上の蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：蛋白質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）をコードする遺伝子を欠損させるか又は１種以上のＰｍｔｐ阻害剤を添加した培地で宿主を増殖させることにより、Ｏ−グリコシル化を抑制することができる。他の側面において、宿主細胞はＰＭＴをコードする遺伝子の１種以上の欠損を含み、１種以上のＰｍｔｐ阻害剤を添加した培地で宿主細胞を培養する。Ｐｍｔｐ阻害剤としては限定されないが、ベンジリデンチアゾリジンジオンが挙げられる。使用することができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；及び５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。更に他の側面において、宿主細胞は更に分泌に導くシグナルペプチドをもつα−１，２−マンノシダーゼをコードする核酸を含む。

上記方法のいずれか１種の他の側面において、宿主細胞としては更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えばＢＭＴ１，ＢＭＴ２，ＢＭＴ３及びＢＭＴ４）（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号参照）の１種以上を欠損もしくは破壊するか又は干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用してβ−マンノシルトランスフェラーゼの１種以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻止することによりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質を排除するように遺伝子操作された下等真核細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母）が挙げられる。

本願の方法のいずれか１種の他の側面において、宿主細胞としては更に、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂ（例えば米国特許第７，１９８，９２１号及び７，２５９，００７号参照）の一方又は両方を欠損又は破壊することによりホスホマンノース残基をもつ糖蛋白質を排除するように遺伝子操作された下等真核細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母）が挙げられ、他の側面では更にＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠損又は破壊してもよいし、干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用してホスホマンノシルトランスフェラーゼの１種以上をコードするＲＮＡの発現を阻止してもよい。

更に他の側面において、宿主細胞は複合型Ｎ−グリカン、ハイブリッド型Ｎ−グリカン及び高マンノース型Ｎ−グリカンから構成される群から選択されるＮ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子改変されており、複合型Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡＣ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、及びＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択され；ハイブリッド型Ｎ−グリカンはＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、及びＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択され；高マンノース型Ｎ−グリカンはＭａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２及びＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択される。

上記態様又は側面のいずれか１種において、第１の調節性プロモーターは第２の調節性プロモーターの発現を誘導せずに誘導可能なプロモーターである。第２の調節性プロモーターは第１の調節性プロモーターの発現を誘導せずに誘導可能なプロモーターである。他の側面において、第２の調節性プロモーターのインデューサーは第１の調節性プロモーターからの転写を阻害する。宿主細胞が酵母である特定側面において、第１の調節性プロモーターはＧＵＴ１プロモーターであり、第２の調節性プロモーターはＧＡＤＰＨプロモーターである。他の側面において、第１の調節性プロモーターはＰＣＫ１プロモーターであり、第２の調節性プロモーターはＧＡＤＰＨプロモーターである。

一般に、上記態様又は側面において、免疫グロブリンはＩｇＧ分子となり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４免疫グロブリンとその亜種が挙げられる。他方、上記の特定側面において、免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ラクダ重鎖及びラマ重鎖から構成される群から選択される。

本願の宿主細胞及び方法からの情報を使用して親和性成熟免疫グロブリン、抗体の誘導体及び修飾免疫グロブリンを作製することができ、あるいは目的の免疫グロブリンをコードする核酸を免疫グロブリンの作製又は親和性成熟用の別の宿主細胞にサブクローニングすることができる。従って、上記方法のいずれか１種を使用して同定された免疫グロブリンを発現する宿主細胞も提供するが、この細胞は必ずしも免疫グロブリンを同定するために使用した宿主細胞でなくてもよい。宿主細胞は原核又は真核宿主細胞とすることができる。

上記態様又は側面のいずれか１種により作製された免疫グロブリンも提供する。

特に指定しない限り、以下の用語は以下の意味をもつものとする。

本願で使用する「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」なる用語は同義に使用し、Ｎ−結合型オリゴ糖、例えばアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によりポリペプチドのアスパラギン残基と結合したものを意味する。Ｎ−結合型糖蛋白質は蛋白質中にアスパラギン残基のアミド窒素と結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含む。糖蛋白質上に存在する主要な糖はグルコース、ガラクトース、マンノース、フコース，Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びシアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。Ｎ−結合型糖蛋白質では糖基のプロセシングはＥＲの内腔で翻訳と同時に行われ、ゴルジ装置で続行する。

Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の共通５糖コアをもつ（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ_３」）コア構造（別称「トリマンノースコア」、「５糖コア」又は「パウチマンノースコア」）に付加された末端糖鎖（例えばＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコース及びシアル酸）を含む分岐（側鎖）の数が相違する。Ｎ−グリカンはその分岐成分に従って分類される（例えば高マンノース型、複合型又はハイブリッド型）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基をもつ。「複合」型Ｎ−グリカンは一般に１，３マンノースアームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃと、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃをもつ。複合型Ｎ−グリカンは更に場合によりシアル酸又は誘導体（例えば「ＮＡＮＡ」ないし「ＮｅｕＡｃ」、ここで「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されたガラクトース（「Ｇａｌ」）又はＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をもつ場合がある。複合型Ｎ−グリカンは更に「分岐型」ＧｌｃＮＡｃとコアフコース（「Ｆｕｃ」）を含む分子鎖内置換をもつ場合がある。複合型Ｎ−グリカンは更に「トリマンノースコア」に複数の側鎖をもつ場合があり、「複数側鎖グリカン」と呼ぶことが多い。「ハイブリッド」型Ｎ−グリカンはトリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端に少なくとも１個のＧｌｃＮＡｃをもち、トリマンノースコアの１，６マンノースアームに０個以上のマンノースをもつ。各種Ｎ−グリカンを「グリコフォーム」とも言う。

本願で使用する略語は当分野で通常使用されている通りであり、例えば上記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語としては、「ＰＮＧアーゼ」ないし「グリカナーゼ」ないし「グルコシダーゼ」が挙げられ、いずれもペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。

「機能的に連結された」発現制御配列なる用語は、該当遺伝子を制御するために発現制御配列が該当遺伝子と隣接している結合と、該当遺伝子を制御するためにトランス又は距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。

「発現制御配列」又は「調節配列」なる用語は同義に使用し、本願で使用する場合にはこれらの配列を機能的に連結したコーディング配列の発現に作用するために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は核酸配列の転写、転写後イベント及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増加する配列（例えばリボソーム結合部位）；蛋白質安定性を増加する配列；更に必要に応じて蛋白質分泌を増加する配列が挙げられる。このような制御配列の種類は宿主生物により異なり、原核生物では、このような制御配列として一般にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が挙げられる。「制御配列」なる用語は最低限でその存在が発現に不可欠な全成分を含むものとし、更に存在すると有利な他の成分（例えばリーダー配列や融合パートナー配列）も含むことができる。

本願で使用する「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」）なる用語は組換えベクターを導入した細胞を意味するものとする。当然のことながら、このような用語は特定対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味するものとする。突然変異又は環境的影響により子孫世代には所定の変異が生じる場合があるので、このような子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、やはり本願で使用する「宿主細胞」なる用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は単離細胞でも培養増殖させた細胞株でもよいし、生体組織又は生体内に存在する細胞でもよい。

「トランスフェクト」、「トランスフェクション」、「トランスフェクトする」等の用語は高等及び下等両者の真核細胞への異種核酸の導入を意味する。従来では、酵母又は真菌細胞への核酸の導入を表すために「形質転換」なる用語が使用されているが、本願では酵母及び真菌細胞を含めて任意真核細胞への核酸細胞の導入を表すために「トランスフェクション」なる用語を使用する。

「真核」なる用語は有核細胞又は生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、動物細胞及び下等真核細胞が挙げられる。

「下等真核細胞」なる用語は酵母及び糸状菌を包含する。酵母及び糸状菌としては限定されないが、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ種、任意Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、任意Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａが挙げられる。

本願で使用する「抗体」、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン類」及び「免疫グロブリン分子」なる用語は同義に使用する。各免疫グロブリン分子はその特異抗原と結合できるようなユニークな構造をもつが、全免疫グロブリンは本願に記載するような同一の全体構造をもつ。基本的な免疫グロブリン構造単位はサブユニットの四量体からなることが知られている。各四量体は同一の２対のポリペプチド鎖をもち、各対は「軽」鎖（約２５ｋＤａ）１本と「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）１本をもつ。各鎖のアミノ末端部分は主に抗原認識に関与する約１００〜１１０アミノ酸又はそれ以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。軽鎖はκ又はλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、抗体のアイソタイプを夫々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに規定する。

軽鎖と重鎖は可変領域と定常領域に分けられる（一般に、ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄｅｄ．ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７参照）。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、無傷の抗体は２つの結合部位をもつ。二官能性又は二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同一である。全鎖は比較的保存されたフレームワーク（ＦＲ）に３つの超可変領域（別称相補性決定領域ないしＣＤＲ）が結合した同一の一般構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域により整列され、特異的エピトープと結合することが可能になる。これらの用語は天然に存在する形態に加え、フラグメントと誘導体も含む。免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラス、即ちＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤもこの用語の範囲に含む。ＩｇＧのサブタイプ、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４もこれらの用語の範囲に含む。この用語は最も広義に使用し、単独のモノクローナル抗体（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）に加え、複数のエピトープ又は抗原と結合する抗体組成物も含む。これらの用語は具体的にモノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びＣＨ２ドメインのＮ−結合型グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの部分を少なくとも含むかもしくは前記部分を含むように修飾されているという条件で抗体フラグメント、又はその変異体に対応する。イムノアドヘシン（米国特許出願公開第２００４０１３６９８６号）等のＦｃ領域のみから構成される分子、Ｆｃ融合体及び抗体様分子もこれらの用語に含む。

「Ｆｃ」フラグメントなる用語はＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを含む抗体の「結晶性フラグメント」Ｃ末端領域を意味する。「Ｆａｂ」フラグメントなる用語はＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬドメインを含む抗体の「抗原結合性フラグメント」領域を意味する。

本願で使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる用語は実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、集団を構成する個々の抗体は微量で存在する場合がある天然突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は単一抗原部位に対して高度に特異的である。更に、従来の（ポリクローナル）抗体製剤は一般に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含有するが、これとは対照的に、各ｍＡｂは抗原上の単一の決定基に特異的である。その特異性に加え、モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンに汚染されないハイブリドーマ培養により合成できるという利点もある。「モノクローナル」なる用語は実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特性を表し、特定方法による抗体の作製が必要であると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製してもよい。

「抗体」又は「免疫グロブリン」なる用語の範囲内の「フラグメント」なる用語は、フラグメントが標的分子との特異的結合能を維持するという条件で、各種プロテアーゼによる消化により生成されるもの、化学的切断及び／又は化学的解離により生成されるもの、並びに組換えにより生成されるものを包含する。このようなフラグメントとしては、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２、及び１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントが挙げられる。以下、「免疫グロブリン」なる用語は「フラグメント」なる用語も包含する。

免疫グロブリンは更に、配列を改変されているが、標的分子との特異的結合能を維持する免疫グロブリン又はフラグメントも包含し、種間キメラ及びヒト化抗体；抗体融合体；ヘテロマー抗体複合体及び抗体融合体（例えばダイアボディ（二重特異性抗体）、１本鎖ダイアボディ及びイントラボディ）が挙げられる（例えばＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｉｓｅａｓｅＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＮｅｗＹｏｒｋ，Ｉｎｃ．，１９９８）参照）。

「触媒抗体」なる用語は生化学反応を触媒することが可能な免疫グロブリン分子を意味する。触媒抗体は当分野で周知であり、Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎらの米国特許出願第７２０５１３６号、４８８８２８１号、５０３７７５０号と、Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩらの米国特許出願第５７３３７５７号、５９８５６２６号及び６３６８８３９号に記載されている。

本願で使用する場合に、「から本質的に構成される」なる用語は、指定する整数又は整数群の包含を意味するものとするが、指定する整数を著しく変化又は変更させるような変更又は他の整数は除く。Ｎ−グリカンの種に関して、指定するＮ−グリカン「から本質的に構成される」なる用語は、Ｎ−グリカンが糖蛋白質のアスパラギン残基と直接結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をフコシル化されているか否かに関係なく、Ｎ−グリカンを包含するものとする。

本願で使用する場合に、「主体とする」なる用語又は「主体」や「主体となる」等のその変形は、糖蛋白質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離したグリカンを質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ又はＨＰＬＣ）により分析した後に総中性Ｎ−グリカンの最高モルパーセント（％）を占めるグリカン種を意味するものとする。換言するならば、「主体とする」なる用語は他のどの個別物質よりも高いモルパーセントで存在する特定グリコフォーム等の個別物質として定義される。例えば、組成物が４０モルパーセントの種Ａと、３５モルパーセントの種Ｂと、２５モルパーセントの種Ｃから構成される場合、組成物は種Ａを主体とし、種Ｂは２番目に主体となる種であると言える。宿主細胞によっては中性Ｎ−グリカンとマンノシルリン酸等の荷電Ｎ−グリカンを含む組成物を産生するものもある。従って、糖蛋白質の組成物は複数の荷電及び非荷電又は中性Ｎ−グリカンを含有する場合がある。本発明では、組成物中の複数の総中性Ｎ−グリカンに対して主体となるＮ−グリカンを決定する。従って、本願で使用する場合に、「主体となるＮ−グリカン」とは組成物中の複数の総中性Ｎ−グリカンのうちで主体となるＮ−グリカンが特定構造であることを意味する。

本願で使用する場合に、フコースやガラクトース等の特定糖残基を「本質的に含まない」なる用語は、糖蛋白質組成物がこのような残基を含むＮ−グリカンを実質的に含まないことを表すために使用する。純度で表した場合、本質的に含まないとは、このような糖残基を含むＮ−グリカン構造の量が１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であることを意味し、ここで百分率は重量又はモルパーセントである。従って、本発明の糖蛋白質組成物中の実質的に全Ｎ−グリカン構造はフコース又はガラクトース又は両方を含まない。

本願で使用する場合に、検出可能な量のフコースやガラクトース等の特定糖残基がＮ−グリカン構造上に常に存在しないとき、糖蛋白質組成物はこのような糖残基を「欠損する」又は「欠損している」。例えば、本発明の好ましい態様において、糖蛋白質組成物は酵母（例えばＰｉｃｈｉａ種；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種）を含む上記のような下等真核生物により産生され、これらの生物の細胞はフコシル化Ｎ−グリカン構造を産生するために必要な酵素をもたないため、前記組成物は「フコースを欠損する」。従って、「本質的にフコースを含まない」なる用語は「フコースを欠損する」なる用語を包含する。他方、上記のように組成物がフコシル化Ｎ−グリカン構造をかつて含有していた場合又は限定量ではあるが、検出可能な量のフコシル化Ｎ−グリカン構造を含有している場合であっても、組成物は「本質的にフコースを含まない」と言える。

抗体及び抗体−抗原複合体と免疫系の細胞の相互作用並びに各種応答（抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）、免疫複合体のクリアランス（食作用）、Ｂ細胞による抗体産生並びにＩｇＧ血清半減期を含む）は夫々Ｄａｅｒｏｎｅｔａｌ．，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４；ＷａｒｄａｎｄＧｈｅｔｉｅ，１９９５，ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４；ＣｏｘａｎｄＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，２００１，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：３３９−３４５；Ｈｅｙｍａｎ，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８８：１５７−１６１；及びＲａｖｅｔｃｈ，１９９７，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１２１−１２５に定義されている。

免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖及び重鎖を別々に発現させ、該当免疫グロブリンを発現する細胞を標識抗原により検出する態様を使用する方法の一般操作を示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を示す。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの構築を示す。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔの構築を示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２の構築を示す。本発明の操作を実証するために使用した酵母株のいくつかの系図を示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８のマップを示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ３２００のマップを示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ４１３６及びｐＧＬＹ４１２４のマップを示す。プラスミドベクターｐＧＬＹ４１１６及びｐＧＬＹ４１３７のマップを示す。株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体を発現）、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６（空の株）、及びプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体を発現）をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８の存在下でインキュベートした蛍光顕微鏡観察結果を示す。プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６（空の株）を抗Ｈｅｒ２抗体の存在下でインキュベートした蛍光顕微鏡観察結果を示す。細胞表面に係留したプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と結合した抗抗体の検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８を使用した。プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６（空の株）、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ３９２０（抗ＣＤ２０抗体を発現）、及びプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体を発現）を抗Ｈｅｒ２抗体の存在下でインキュベートした蛍光顕微鏡観察結果を示す。細胞表面に係留したプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と結合した抗抗体の検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８を使用した。ＦｃＲＩＩＩ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１１６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６（空の株）を抗Ｈｅｒ２抗体の存在下でインキュベートした蛍光顕微鏡観察結果を示す。細胞表面に係留したプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と結合した抗抗体の検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８を使用した。プラスミドベクターｐＧＬＹ４３９及びｐＧＬＹ４１４４のマップを示す。ｐＧＬＹ４１３６（ＡＯＸプロモーター−プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質）をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（ＡＯＸプロモーター抗Ｈｅｒ２抗体）、ｐＧＬＹ４１３９（ＧＡＰＤＨプロモーター−プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質）をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（ＡＯＸプロモーター抗Ｈｅｒ２抗体）、及びｐＧＬＹ４１３９（ＧＵＴ１プロモーター−プロテインＡ／ＳＥＤ１融合抗体）をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ５４３４（ＧＡＰＤＨプロモーター抗Ｈｅｒ２抗体）の蛍光顕微鏡観察結果を示す。細胞表面に係留したプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と結合した抗抗体の検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８を使用した。種々に組合せたプロモーターの制御下におけるプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体の仮想発現を示す。各々ＧＵＴ１プロモーターの制御下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ５７５７（ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で抗ＣＤ２０抗体を発現）及び株ｙＧＬＹ５４３４（ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で抗Ｈｅｒ２抗体を発現）の蛍光顕微鏡観察結果を示す。先ずグリセロール条件下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質発現（ＧＵＴ１プロモーター）を誘導した後に、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の発現も阻害するデキストロース条件下でＧＡＰＤＨプロモーターからの抗体発現を誘導した。細胞表面に係留したプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と結合した抗抗体の検出用にヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８を使用した。図１８に示した細胞のＦＡＣＳソーティングの結果を示す。赤線は抗体を同時発現させない陰性対照を表す。青線は抗Ｈｅｒ２又は抗ＣＤ２０発現株のコロニーを表す。図１８に示した細胞のＦＡＣＳソーティングの結果を示す。赤線は抗体を同時発現させない陰性対照を表す。青線は抗Ｈｅｒ２又は抗ＣＤ２０発現株のコロニーを表す。プラスミドベクターｐＧＬＹ３０３３のマップを示す。

本発明は真核宿主細胞の表面に多様な免疫グロブリンライブラリーを提示することが可能な蛋白質提示システムを提供する。本願の組成物と方法は発見（即ちスクリーニング）又は分子進化プロトコールの関連で免疫グロブリン集合の提示に特に有用である。本願の方法の顕著な特徴は、表面アンカー蛋白質と融合した融合蛋白質として又は細胞表面に結合した捕捉部分により免疫グロブリンを捕捉することができる他の部分として該当免疫グロブリン分子を発現させる必要なしに無傷の全長の該当免疫グロブリン分子を宿主細胞の表面に提示することができる提示システムを提供する点である。本願の方法の別の特徴は、宿主細胞中の多様な免疫グロブリンライブラリーから該当免疫グロブリンを産生するライブラリー中の宿主細胞をスクリーニングした後に、該当免疫グロブリンを発現しないライブラリー中の他の宿主細胞から前記宿主細胞を分離することができる。重要な点として、単離した宿主細胞をその後、治療又は診断用の該当免疫グロブリンの作製に使用することができる。これは、ｓｃＦＶ又はＦａｂフラグメントの多様なライブラリーから該当ｓｃＦＶ又はＦａｂを発現する宿主細胞をスクリーニングした後に、該当ｓｃＦＶ又はＦａｂの特徴をもつ全長免疫グロブリンを発現する哺乳動物宿主細胞を構築するための一連の工程で使用するファージ及び酵母提示法の改善である。これらの後続工程には、ｓｃＦＶ又はＦａｂを全長免疫グロブリンに変換する成熟工程中に同定されたｓｃＦＶ又はＦａｂの望ましい親和性又は特異性が消失又は低下する可能性があるという危険がある。

現行のファージ法は実質的なライブラリー多様性を提供し、免疫グロブリンの開発法を著しく改善したが、ライブラリーを構築するために使用される原核宿主細胞がＮ−結合型グリコシル化糖蛋白質を産生しないという欠点がある。グリコシル化等の翻訳後修飾は免疫グロブリンの特異性又は親和性を変化させる可能性がある。完全に哺乳動物細胞に由来する循環モノクローナル抗体の約１５〜２０％は可変領域に１個以上のＮ−結合型グリカンを含むと推定される（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇｒｅｓｓ２１：１１−１６（２００５））。場合により、可変領域におけるこれらのＮ−グリカンは免疫グロブリン機能に重要な役割を果たすと考えられる。例えば、可変領域をＮ−グリコシル化した抗体分子には抗原結合にプラスとマイナス両方の影響が認められている。抗デキストラン抗体のＣＤＲ２領域内に付加したＮ−グリコシル化コンセンサス部位は種々の構造の糖鎖で満たされ、部位依存的に親和性、半減期及び組織ターゲティングの変化を示した（Ｃｏｌｏｍａｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１６２：２１６２−２１７０（１９９９））。従って、原核宿主細胞で作製され、スクリーニングされたライブラリーは可変領域をグリコシル化された免疫グロブリン種に対して負のバイアスを示し易い。そのため、可変領域の１以上の部位のグリコシル化に完全又は部分的に起因する特に望ましい特異性又は親和性をもつ免疫グロブリンが同定されなくなる。逆に、原核スクリーニング法により同定された抗体を真核宿主で発現させると、フォールディング又は親和性に悪影響のあるグリコシル化構造をもつ可能性がある。本願の方法とシステムはライブラリーが可変領域をグリコシル化された免疫グロブリンの集団を含む場合に免疫グロブリンライブラリーのスクリーニングを初めて可能にする。これはライブラリーの多様性が配列のみに基づく場合に予想される状況に対してライブラリーの多様性を増すという潜在的効果がある。この改善は現行方法で得られるよりも高い特異性又は親和性をもつ免疫グロブリンを開発する可能性を増すと予想される。

本願の方法とシステムは更に特定のＮ−グリカン構造を主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子操作した真核宿主細胞を使用できるという点で現行方法に勝る利点もある。Ｎ−グリカン構造としては、ヒト免疫グロブリンに現在認められるＮ−グリカン構造又は高等真核生物に由来する糖蛋白質に認められない特徴をもたないＮ−グリカン構造の任意のものが挙げられる。例えば、酵母の場合には、Ｎ−グリカンが過剰にマンノシル化されていない免疫グロブリンを産生するように宿主細胞を遺伝子操作することができる。Ｏ−グリコシル化の量を制限したり、哺乳動物細胞におけるＯ−グリコシル化に似せるようにＯ−グリコシル化を改変するように宿主細胞を遺伝子操作することができる。

前記方法とシステムの顕著な利点は、免疫グロブリンを作製するために宿主細胞又は免疫グロブリンをコードする核酸分子を新たに開発又は操作せずに、目的の免疫グロブリンを産生するとしてライブラリーで同定された宿主細胞を使用できる点である。即ち、細胞が目的の免疫グロブリンを分泌する前、後又はそれと同時に捕捉部分の発現を誘導せずに目的の免疫グロブリンの発現を誘導する条件下で目的の免疫グロブリンを発現するとして本願で同定された宿主細胞を培養した後に、当分野で周知の方法を使用して培養培地から回収することができる。重要な点は、産生される免疫グロブリンが無傷の全長免疫グロブリン分子であるという点である。現行のファージ又は酵母システムでは、このようにライブラリー細胞を使用して無傷の全長免疫グロブリンを作製することができない。これらのシステムでは、無傷の全長免疫グロブリンをコードする核酸分子を構築するために目的のＦａｂ又はｓｃＦＶをコードする核酸分子を更に操作する必要があり、その後、無傷の全長免疫グロブリンを産生させるために哺乳動物細胞にトランスフェクトする。従って、本願の方法とシステムは治療又は診断用の免疫グロブリンの開発及び作製に著しい改善をもたらす。

複数の免疫グロブリンを発現する宿主細胞のライブラリーから該当免疫グロブリンを発現する真核宿主細胞を構築及び単離するための方法も提供する。本方法は望ましい特異性及び／又は親和性をもつ免疫グロブリンの構築と選択を可能にする。一般に、本方法は、第１の調節性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階を含む。主体となる特定のＮ−グリカン構造をもつ免疫グロブリンを産生するように宿主細胞を更に遺伝子操作することができる。

１側面では、宿主細胞を培養増殖させて多数の宿主細胞を得た後に、複数の第２の核酸分子をトランスフェクトし、各核酸分子は免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードし、捕捉部分が重鎖と結合する場合には、少なくとも重鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、あるいは捕捉部分が軽鎖と結合する場合には、少なくとも軽鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている。こうして複数の宿主細胞を作製し、複数の宿主細胞の各宿主細胞は免疫グロブリンをその表面に提示することが可能であり、複数の宿主細胞の各宿主細胞は特定の別個の免疫グロブリン種を提示することが可能である。一般に、複数の宿主細胞における宿主細胞集団の多様性は宿主細胞にトランスフェクトされた核酸分子のライブラリーの多様性に依存することになろう。

別の側面では、宿主細胞を培養増殖させて多数の宿主細胞を得た後に、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする１個以上の第２の核酸分子をトランスフェクトし、捕捉部分が重鎖と結合する場合には、少なくとも重鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、あるいは捕捉部分が軽鎖と結合する場合には、少なくとも軽鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、コードされる免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な多数の宿主細胞が得られる。多数の宿主細胞の突然変異誘発を使用し、免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団をコードする複数の宿主細胞を作製する。多様性は使用する突然変異誘発法に依存する。適切な突然変異誘発法としては、限定されないが、カセット突然変異誘発法、エラープローンＰＣＲ、化学的突然変異誘発法、又は親核酸分子に似せた改変配列の規定レパートリーを作製するためのシャフリング法が挙げられる。

他の側面では、宿主細胞を培養増殖させて多数の宿主細胞を得た後に、複数の第２の核酸分子をトランスフェクトし、各核酸分子は免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードし、捕捉部分が重鎖と結合する場合には、少なくとも重鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、あるいは捕捉部分が軽鎖と結合する場合には、少なくとも軽鎖をコードする核酸は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されており、免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な複数の宿主細胞を作製する。その後、突然変異誘発を使用し、免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な複数の宿主細胞の多様性を更に増す。

特定態様では、重鎖及び軽鎖の両方をコードする核酸分子が第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている。他の態様では、重鎖の少なくとも１本をコードする核酸分子が第２の調節性プロモーターと機能的に連結され、軽鎖をコードする核酸分子は第３の調節性プロモーター又は構成的プロモーターと機能的に連結されている。特定側面では、重鎖のサブ集団をコードする複数の核酸を提供し、各サブ集団の発現は、種々のサブ集団を特定時点で発現させ、他のサブ集団をこの時点で発現させないように、第２、第３又は第４以下の調節性プロモーターにより実施される。

一般に、重鎖と軽鎖は別々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされ、各ＯＲＦはプロモーターと機能的に連結されている。他方、他の態様において、重鎖と軽鎖は単一のＯＲＦによりコードされ、タンデム配置の重鎖と軽鎖を含む単一の融合ポリペプチドとなり、ＯＲＦは調節性プロモーターと機能的に連結されている。単一のポリペプチドは重鎖と軽鎖に開裂可能であり、別々の重鎖及び軽鎖蛋白質となり、その後、会合して機能性抗体分子を形成することができる。（例えば米国特許出願公開第２００６／０２５２０９６参照）。

上記側面のいずれか１種では、捕捉部分を産生し、捕捉部分が宿主細胞から分泌される免疫グロブリン分子と結合できるように宿主細胞の表面に輸送後、結合させるために十分な時間にわたって捕捉部分をコードする第１の核酸分子の発現を誘導する。次に捕捉部分の発現を低下又は阻害し、第２の調節性プロモーターに機能的に連結された免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸分子の発現を誘導する。重鎖及び軽鎖の両方の発現を誘導することもできるが、特定側面では、重鎖の発現を誘導し、軽鎖の発現を構成的にする。他の側面では、捕捉部分が軽鎖と結合する場合には、軽鎖の発現を調節し、重鎖の発現を構成的にすることができる。従って、軽鎖又は重鎖のどちらの発現が調節されるかは、重鎖又は軽鎖のどちらが捕捉されるかにより決定される。

捕捉部分の発現の阻害は、捕捉部分の発現を誘導するインデューサーを提供しないこと、あるいは捕捉部分の発現を阻害する第１の調節性プロモーターの阻害剤を提供すること、あるいは捕捉部分の発現も阻害する第２以下の誘導性プロモーターと機能的に連結された免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖の発現のインデューサーを使用することにより実施することができる。阻害は発現の完全な抑制でもよいし、重鎖及び軽鎖のプロセシングと分泌経路輸送を妨害しないように捕捉部分を発現させるような量までの発現低下でもよい。発現させた免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖をプロセシングし、宿主細胞分泌経路を通って細胞表面まで輸送し、提示のために宿主細胞表面と結合した捕捉部分により捕捉させる。発現させた免疫グロブリンを複数の宿主細胞の表面に提示させた後、該当免疫グロブリンと結合するが、他の免疫グロブリンとは結合しない検出手段を使用してスクリーニングし、該当免疫グロブリンを提示しない宿主細胞から該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を同定する。該当免疫グロブリンを発現及び提示しない宿主細胞から該当免疫グロブリンを発現及び提示する宿主細胞を分離し、該当免疫グロブリンを提示する宿主細胞のみから構成されるか又はこのような細胞を多く含む宿主細胞集団を作製する。これらの分離した宿主細胞を増殖させ、目的用途に必要な量の該当免疫グロブリンを産生させるために使用することができる。免疫グロブリンをコードする核酸を決定し、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを構築及び使用し、原核又は真核宿主細胞であり得る別の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。

該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞の検出と分析は該当免疫グロブリンにより特異的に認識される抗原で宿主細胞を標識することにより実施することができる。特定側面では、抗原を検出部分で標識する。他の側面では、抗原を標識せず、該当免疫グロブリンと結合しない抗原のエピトープと結合する検出用免疫グロブリンを検出部分で標識して使用することにより検出を行う。こうして、検出用免疫グロブリンと結合したエピトープ以外のエピトープで抗原と結合する免疫グロブリンを産生する宿主細胞を選択することができる。別の側面において、検出用免疫グロブリンは免疫グロブリン−抗原複合体に特異的である。検出手段に関係なく、ラベルの検出量が多いと、該当免疫グロブリンは望ましい結合性をもつと判断され、ラベルの検出量が少ないと、該当免疫グロブリンは望ましい結合性をもたないと判断される。

標識に適した検出部分は当分野で周知である。検出部分の例としては、限定されないが、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ＡｌｅｘａＦｕｏｒ４８８等のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ類（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒ類（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨｙＬｉｔｅＦｌｕｏｒ類（ＡｎａＳｐｅｃ）、及びフィコエリスリンが挙げられる。他の検出部分としては、限定されないが、該当抗原又は該当免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン−抗原複合体に特異的な免疫グロブリンをコートした磁気ビーズが挙げられる。特定側面では、標識抗原又は免疫グロブリン上の蛍光ラベルに特異的な抗フルオロクロム免疫グロブリンを磁気ビーズにコートする。従って、宿主細胞を標識抗原又は免疫グロブリンの存在下でインキュベートした後に、蛍光ラベルに特異的な磁気ビーズの存在下でインキュベートする。

細胞集団の分析と、検出部分の存在に基づく該当免疫グロブリンを提示する宿主細胞のセルソーティングは当分野で公知の多数の技術により実施することができる。該当免疫グロブリンを提示する細胞は例えばフローサイトメトリー、磁気ビーズ又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により分析又は選別することができる。これらの技術は細胞の１種以上のパラメーターに従って分析及び選別することができる。通常では、１又は複数の分泌パラメーターを細胞の他の測定可能なパラメーター（限定されないが、細胞型、細胞表面抗原、ＤＮＡ含量等）と共に同時に分析することができる。データを分析し、測定したパラメーターの任意式又は組合せを使用して該当免疫グロブリンを提示する細胞を選別することができる。セルソーティング及び細胞分析法は当分野で公知であり、例えば、ＴｈｅＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１〜４巻（Ｄ．Ｎ．Ｗｅｉｒ編）及びＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇ（Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，１９９２）に記載されている。例えばレーザー走査型顕微鏡、蛍光顕微鏡等の顕微鏡技術を使用して細胞を分析することもでき、これら等の技術を画像分析システムと併用してもよい。他のセルソーティング法としては、例えばパンニングや、プレート、ビーズ及びカラム等の固相担体を使用する技術を含めてアフィニティー技術を使用する分離法が挙げられる。

他の側面では、特定抗原に対して望ましい特異性及び／又は親和性をもつ免疫グロブリンを産生する細胞を同定及び選択するためのライブラリー法を提供する。本方法は、ＶＨドメインとＶＬドメインを含む免疫グロブリンをその表面に提示する真核宿主細胞のライブラリーを準備する段階を含み、前記ライブラリーは、（ｉ）免疫グロブリンと結合することが可能な部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分を発現する真核宿主細胞（ここで、捕捉部分の発現は第１の調節性プロモーターにより行われる）を準備し；（ｉｉ）免疫グロブリンの遺伝的に多様な集団をコードする核酸配列のライブラリーを宿主細胞にトランスフェクトし、複数の宿主細胞を作製することにより作製され、ここで、免疫グロブリンの遺伝的に多様な集団のＶＨドメインは１種以上のＶＨ遺伝子ファミリーに対して正のバイアスを示し、少なくとも１本以上の重鎖又は軽鎖の発現は第２の調節性プロモーターにより行われ、前記複数の宿主細胞の各宿主細胞は免疫グロブリン種を発現する。宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって前記複数の宿主細胞において捕捉部分の発現の発現を誘導する。次に前記複数の宿主細胞において核酸配列のライブラリーの発現を誘導しながら捕捉部分の発現を阻害し、各宿主細胞にその表面に免疫グロブリン種を提示させる。前記複数の宿主細胞を該当抗原と接触させ、その表面に提示された免疫グロブリンと該当抗原を結合させた宿主細胞を検出することにより、該当抗原に対して結合特異性をもつ免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を前記複数の宿主細胞中で同定し、ＶＨドメインとＶＬドメインをもち、更に該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ免疫グロブリンを産生する宿主細胞を作製する。特定側面において、免疫グロブリンは合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインを含み、更に合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインはフレームワーク領域と超可変ループを含み、フレームワーク領域とＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初から２個の超可変ループは本質的にヒト生殖細胞系列であり、ＶＨドメインとＶＬドメインは改変型ＣＤＲ３ループをもつ。

こうして、複数の免疫グロブリン分子を発現することが可能な宿主細胞のライブラリーが得られ、特定抗原に特異的な免疫グロブリンと結合することができる検出手段により検出するために細胞表面に捕捉、提示させることができ、従って、ライブラリー中の前記複数の宿主細胞から免疫グロブリンを発現する宿主細胞を同定することができる。一般に、検出手段は通常では、検出部分で標識された抗原を使用する。細胞集団中の特定細胞の選択に現在使用されている任意手段（例えばＦＡＣＳソーティング）により前記複数の宿主細胞からこれらの宿主細胞を単離することができる。

従って、本方法は少なくとも２成分からなる。第１の成分は捕捉部分をコード及び発現する第１の核酸分子を含む発現カセットを含むヘルパーベクターであり、特定態様において前記捕捉部分は、免疫グロブリンと結合することが可能な結合部分とそのＮ又はＣ末端で融合しており、宿主細胞の表面に結合又は固定化することが可能な細胞表面アンカー蛋白質又は細胞壁結合性蛋白質を含む。結合部分が免疫グロブリンと相互作用できるように、細胞外環境に露出した細胞表面アンカー蛋白質の末端に結合部分を配置する。免疫グロブリン結合部分はプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ等の分子又はＦｃ受容体に由来する免疫グロブリン結合ドメインを含む。

第２の成分は該当免疫グロブリン又は該当免疫グロブリンを選択するライブラリー（例えば免疫グロブリンを発現するベクターのライブラリー）の重鎖及び軽鎖をコード及び発現する発現カセットを含む１個以上のベクターである。特定側面において、免疫グロブリンをコードする核酸分子は免疫グロブリン（例えばＶＨドメインとＶＬドメインをもち、更に該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ免疫グロブリン）の重鎖と軽鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。他の側面において、重鎖と軽鎖は別々の核酸分子でコードされる。いずれの場合も、これらの核酸分子は望ましい場合には、選択された宿主細胞において免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの翻訳を強化するように更にコドン最適化してもよい。核酸分子は望ましい場合には、選択された宿主細胞に適切なシグナルペプチドで内在性シグナルペプチドを更に置換してもよい。

１側面において、上記核酸分子は第２の調節性プロモーターと機能的に連結された単一の発現カセットを含むことができ、軽鎖と重鎖のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はインフレームであり、プロテアーゼ開裂部位をインフレームでコードする核酸分子により分離され、発現されると融合蛋白質となり、プロテアーゼ開裂部位に特異的なプロテアーゼで翻訳後プロセシングされ、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖となる。これらの発現カセットの例は例えば米国特許出願公開第２００６／０２５２０９６号に記載されている。別の側面では、軽鎖と重鎖の各々をコードするＯＲＦを第２の調節性プロモーターと機能的に連結した別々の発現カセットから重鎖及び軽鎖免疫グロブリンを発現させる。これらの発現カセットの例は例えば米国特許第４，８１６，５６７号及び４，８１６，３９７号に記載されている。別の側面では、重鎖をコードするＯＲＦを第２の調節性プロモーターと機能的に連結しれ、軽鎖をコードするＯＲＦを構成的プロモーターと機能的に連結した別々の発現カセットから重鎖及び軽鎖免疫グロブリンを発現させる。

特定側面において、コードされる免疫グロブリンは合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインを含み、合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインはフレームワーク領域と超可変ループを含み、フレームワーク領域とＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初から２個の超可変ループは本質的にヒト生殖細胞系列であり、ＶＨドメインとＶＬドメインは改変型ＣＤＲ３ループをもつ。更に他の側面において、改変型ＣＤＲ３ループをもつことに加え、ヒト合成免疫グロブリンＶＨ及びＶＬドメインは他のＣＤＲループにも突然変異を含む。他の側面において、各ヒト合成免疫グロブリンＶＨドメインＣＤＲループはランダム配列である。更に他の側面において、ヒト合成免疫グロブリンＶＨドメインＣＤＲループは公知標準構造であり、ランダム配列成分を含む。

両方の成分をベクターに配置し、相同組換えにより核酸分子を宿主細胞のゲノムに組込む。相同組換えはダブルクロスオーバー又はシングルクロスオーバー相同組換えとすることができる。ロールインシングルクロスオーバー相同組換えはＮｅｔｔｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ２２：２９５−３０４（２００５）に記載されている。各成分をゲノム内の同一遺伝子座に組込んでもよいし、ゲノム内の別々の遺伝子座に組込んでもよい。あるいは、一方又は両方の成分を宿主細胞で一過的に発現させてもよい。

図１は免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を別々に発現させ、標識抗原により検出する態様を使用する方法の一般操作を示す。図１はプロモーターＡと機能的に連結された捕捉部分融合蛋白質をコードする発現カセットと、各々プロモーターＢと機能的に連結された免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖及び重鎖をコードする発現カセットを示す。図示するように、宿主細胞に発現カセットをトランスフェクトし、プロモーターＡにより捕捉部分融合蛋白質の発現を誘導する条件下で形質転換細胞を増殖させる。捕捉部分融合蛋白質を細胞表面に係留する。次に捕捉部分融合蛋白質の発現を阻害又は低下させ且つプロモーターＢにより免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の発現を誘導する条件下で細胞を増殖させる。免疫グロブリンを細胞から分泌させ、細胞表面に係留した捕捉部分融合蛋白質により捕捉する。次に検出部分で標識した抗原を使用して免疫グロブリンを捕捉した細胞を該当Ｉｇについてスクリーニングする。図示するように、全細胞が該当免疫グロブリンを産生するわけではない。標識抗原と結合する細胞を選択し、該当免疫グロブリンを産生しない細胞から分離する。こうして、該当免疫グロブリンを発現する細胞を作製する。これらの細胞は治療用又は診断用免疫グロブリンを作製するために使用することができる。あるいは、細胞を突然変異誘発させ、免疫グロブリンをコードする発現カセットに突然変異を導入し、突然変異誘発前の免疫グロブリンの性質から改変又は変更した望ましい性質をもつ免疫グロブリンを産生する細胞について細胞をスクリーニングする。改変又は変更した望ましい性質をもつ免疫グロブリンを発現する細胞を他の細胞から分離し、治療用又は診断用免疫グロブリンを作製するために使用することができる。

グリコシルホスファチジルイノシトール係留型（ＧＰＩ）蛋白質は捕捉部分を宿主細胞の表面に繋留するのに適した手段となる。ＧＰＩ蛋白質はヒトから酵母及び真菌類に至る広範な種で同定され、特性決定されている。従って、本願に開示する方法の特定側面において、細胞表面アンカー蛋白質はＧＰＩ蛋白質又は細胞表面に係留することができるそのフラグメントである。下等真核細胞は発現された蛋白質がこれを発現した細胞の細胞壁に有効に提示されるように、発現された蛋白質を細胞壁に係留ないし繋留するのに関与するＧＰＩ蛋白質系をもつ。例えば、６６種類の推定ＧＰＩ蛋白質がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで同定されている（ｄｅＧｒｏｏｔｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ２０：７８１−７９６（２００３）参照）。本願の方法で使用することができるＧＰＩ蛋白質としては、限定されないが、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＷＰ１、ＣＷＰ２、ＳＥＤ１及びＧＡＳ１；ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＳＰ１及びＧＡＳ１；並びにＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＴＩＰ１が挙げられる。その他のＧＰＩ蛋白質が有用な場合もある。その他の適切なＧＰＩ蛋白質は本願に記載及び例示する本発明の方法と材料を使用して同定することができる。

適切なＧＰＩ蛋白質の選択は宿主細胞で産生させる特定の組換え蛋白質と、組換え蛋白質で実施する特定の翻訳後修飾により異なる。例えば、特定のグリコシル化パターンをもつ免疫グロブリンの作製には特定のグリコシル化パターンをもつ糖蛋白質を産生する組換え宿主細胞の使用が必要になろう。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリコシル化を主体とする抗体又はそのフラグメントを作製するためのシステムで最適なＧＰＩ蛋白質は必ずしもＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリコシル化を主体とする抗体又はそのフラグメントを作製するためのシステムで最適なＧＰＩ蛋白質でなくてもよい。更に、あるエピトープ又は抗原に特異的な免疫グロブリンを作製するためのシステムで最適なＧＰＩは必ずしも別のエピトープ又は抗原に特異的な免疫グロブリンを作製するためのシステムで最適なＧＰＩ蛋白質でなくてもよい。

従って、特定の免疫グロブリンを作製するために使用する宿主細胞の構築用ライブラリー法も提供する。一般に、宿主細胞により産生される特定の免疫グロブリンに付与される望ましい特性に基づいて、特定の免疫グロブリンを作製するのに望ましい宿主細胞を選択する。例えば、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２又はＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリコシル化を主体とする糖蛋白質を産生する宿主細胞を選択した後、１個以上の免疫グロブリン捕捉部分と融合したＧＰＩ蛋白質をコードするベクターのライブラリーを準備する（ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分）。次に宿主細胞のライブラリーを構築し、ライブラリーの各宿主細胞種がある特定のＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質を発現するように、ライブラリーを構成する各宿主細胞にＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質をコードするベクターライブラリー中のベクターの１個をトランスフェクトする。次にライブラリーの各宿主細胞種に目的の特定免疫グロブリンをコードするベクターをトランスフスクトする。宿主細胞の表面に前記特定免疫グロブリンを最良に提示する宿主細胞を特定免疫グロブリンの産生用宿主細胞として選択する。

一般に、本願に開示する方法で使用するＧＰＩ蛋白質はそのＮ末端を免疫グロブリン捕捉部分のＣ末端に融合したＧＰＩ蛋白質を含むキメラ蛋白質又は融合蛋白質である。捕捉部分のＮ末端をシグナル配列又はペプチドのＣ末端に融合し、分泌経路を通ってＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質を細胞表面に輸送し、ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質を選択後、細胞表面に結合できるようにする。所定の側面において、ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質は全長ＧＰＩ蛋白質を含み、他の側面において、ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分融合蛋白質は細胞表面と結合することが可能なＧＰＩ蛋白質の部分を含む。

免疫グロブリン捕捉部分は免疫グロブリンと結合することが可能な任意分子を含むことができる。その重鎖との相互作用により哺乳動物免疫グロブリンに対して親和性をもつ表面蛋白質を発現する多数のグラム陽性細菌種が同定されている。これらの免疫グロブリン結合性蛋白質のうちで最もよく知られているのはタイプ１ブドウ球菌プロテインＡとタイプ２連鎖球菌プロテインＧであり、主にヒト免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ２−Ｃ３界面を通って相互作用することが分かっている。更に、どちらも免疫グロブリン重鎖を介してＦａｂ領域と弱く相互作用することも分かっている。

最近、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍａｇｎｕｍｓに由来する新規蛋白質であるプロテインＬが報告され、その軽鎖との相互作用のみを介してヒト、ウサギ、ブタ、マウス及びラット免疫グロブリンと結合することが判明している。ヒトにおいて、この相互作用はκ鎖のみに生じることが分かっている。κ及びλ軽鎖はいずれも種々のクラスで共通であるため、プロテインＬはヒトの全クラス、特にマルチサブユニットＩｇＭと強く結合し、プロテインＬ軽鎖結合を示す種で同様に全クラスと結合すると予想される。

他の結合部分の例としては、限定されないが、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）蛋白質とその免疫グロブリン結合性フラグメントが挙げられる。ＦＣＲ蛋白質としては、γ免疫グロブリン（ＩｇＧ）と結合するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）ファミリー、ε免疫グロブリン（ＩｇＥ）と結合するＦｃε受容体（ＦｃεＲ）ファミリー、及びα免疫グロブリン（ＩｇＡ）と結合するＦｃα受容体（ＦｃαＲ）ファミリーのメンバーが挙げられる。ＩｇＧと結合し、本願に開示する捕捉部分を構成するために使用することができる特定のＦｃＲ蛋白質としては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ又はＦｃγＲｎ（新生児）のいずれか１種の少なくとも免疫グロブリン結合部分が挙げられる。

本願に開示する方法の実施に使用することができる調節配列としては、シグナル配列、プロモーター及び転写ターミネーター配列が挙げられる。使用する調節配列は宿主細胞と同一もしくは近縁であるか又は選択される宿主細胞型で利用可能な種又は属に由来することが一般に好ましい。シグナル配列の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼ；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒアミラーゼ及びグルコアミラーゼ；ヒト血清アルブミン；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｘｉａｎｕｓイヌリナーゼ；並びにＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ接合因子及びＫａｒ２のシグナル配列が挙げられる。酵母及び糸状菌で有用であるとして本願に示すシグナル配列としては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するα接合因子プレ配列及びプレプロ配列と、多数の他の種に由来するシグナル配列が挙げられる。

プロモーターの例としては多数の種に由来するプロモーターが挙げられ、限定されないが、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター（例えばグルココルチコイド、エストロゲン、エクジソン、レチノイド、チロイド）、金属調節型プロモーター、病原体調節型プロモーター、温度調節型プロモーター及び光調節型プロモーターが挙げられる。当分野で周知の調節性プロモーターシステムの特定例としては、限定されないが、金属誘導性プロモーターシステム（例えば酵母銅−メタロチオネインプロモーター）、植物除草剤薬害軽減剤活性化プロモーターシステム、植物熱誘導性プロモーターシステム、植物及び哺乳動物ステロイド誘導性プロモーターシステム、Ｃｙｍリプレッサー−プロモーターシステム（ＫｒａｃｋｅｌｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．Ａｌｂａｎｙ，ＮＹ）、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈＳｙｓｔｅｍ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＢｅｖｅｒｌｙＭＡ）、安息香酸誘導性プロモーターシステム（ＷＯ２００４／０４３８８５参照）、並びにレトロウイルス誘導性プロモーターシステムが挙げられる。当分野で周知の他の特定調節性プロモーターとしては、テトラサイクリン調節型システム（例えばＢｅｒｅｎｓ＆Ｈｉｌｌｅｎ，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２７０：３１０９−３１２１（２００３）参照）、ＲＵ４８６誘導性システム、エクジソン誘導性システム及びカナマイシン誘導性システムが挙げられる。下等真核生物特異性プロモーターとしては、限定されないが、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＥＦ−１プロモーター、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰＤＨプロモーター、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＵＴ１プロモーター、ＰＭＡ−１プロモーター、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＣＫ−１プロモーター、並びにＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ−１及びＡＯＸ−２プロモーターが挙げられる。ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分と免疫グロブリンの一時的発現には、ＧＰＩ−ＩｇＧ捕捉部分をコードする核酸分子に機能的に連結されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＵＴ１プロモーターと、免疫グロブリンをコードする核酸分子に機能的に連結されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰＤＨプロモーターが本願の実施例で有用であることが分かっている。

転写ターミネーター配列の例としては、多数の種及び蛋白質に由来する転写ターミネーターが挙げられ、限定されないが、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロームＣターミネーターと、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＬＧ３及びＰＭＡ１ターミネーターが挙げられる。

免疫グロブリンをコードする核酸分子はインビボ又はインビトロ起源から得られる脾細胞、肝細胞及び抗原刺激抗体産生細胞を含む任意の適切な起源から得ることができる。起源に関係なく、細胞ＶＨ及びＶＬｍＲＮＡをＶＨ及びＶＬｃＤＮＡ配列に逆転写する。逆転写は１段階で実施してもよいし、場合により逆転写／ＰＣＲ工程を組合せてもよく、複数の免疫グロブリンをコードするＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡライブラリーを作製する（例えばＭａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９６（１９９１）参照）。科学文献中の配列に基づいて核酸分子を新規合成することもできる。目的配列に対応するオーバーラップするオリゴヌクレオチドの伸長により核酸分子を合成することもできる（例えばＣａｌｄａｓｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：３５３−３６０（２０００）参照）。任意起源に由来する１個以上のライブラリー中のｃＤＮＡから相補性決定領域（ＣＤＲ）をＰＣＲ増幅し、ヒト免疫グロブリンフレームワークをコードする核酸分子にＰＣＲ増幅したＣＤＲをコードする核酸分子を組込み、複数のヒト化免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、ヒト化免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーを構築することができる（例えば米国特許第６，１８０，３７０号；６，６３２，９２７号；及び６，８７２，３９２号参照）。ある種に由来するｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡから可変領域をＰＣＲ増幅し、別の種に由来する免疫グロブリン定常領域をコードする核酸分子にＰＣＲ増幅した可変領域をコードする核酸分子を組込み、複数のキメラ免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーを作製することにより、キメラ免疫グロブリンをコードするｃＤＮＡライブラリーを構築することができる（例えば米国特許第５，８４３，７０８号参照）。蛋白質ライブラリー内に多様性を創出するために開発された各種方法を使用又は応用して本願に開示する免疫グロブリンを発現する複数の宿主細胞と、免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分を作製することができ、このような方法としては、ランダム突然変異誘発法（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：２０２９−２０３４（２０００）；Ｂｏｄｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７０１−１０７０５（２０００）；Ｈｏｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：５３８７−５３９２（２０００））、インビトロＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：，１０７４７−１０７５１（１９９４））、インビボＤＮＡシャフリング（Ｓｗｅｒｓｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．３２：ｅ３６（２００４））、及び部位特異的組換え（Ｒｅｈｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１１４９７−１１５０２（１９８２）；Ｓｔｒｅｕｌｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２８４８−２８５２（１９８１）；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅｅｔａｌ．，（１９９３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）；Ｓｂｌａｔｔｅｒｏ＆Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：７５−８０（２０００））が挙げられる。

活性な免疫グロブリンを作製するには、細胞による産生及び分泌時に蛋白質の正しいフォールディングが必要である。大腸菌では、抗体が複雑で寸法が大きいため、発現された軽鎖及び重鎖ポリペプチドの正しいフォールディングとアセンブリに支障を来たし、無傷の抗体の収率が不良になる。有効な分子シャペロン蛋白質の介在が必要になる場合があり、あるいはその介在により、細胞が正しく折り畳まれた蛋白質を産生及び分泌する能力を強化することができる。酵母における免疫グロブリンの産生を改善するために分子シャペロン蛋白質を使用することは米国特許第５，７７２，２４５号；米国特許第５，７００，６７８号及び５，８７４，２４７号；米国特許出願公開第２００２／００６８３２５号；Ｔｏｍａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２３３０３−２３３０９（２０００）；Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋｅｔａｌ．，ＭａｒｔｉｘＢｉｏｌ．１９：２９−３６（２０００）；Ｖａｄｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１６：２５１−２６０（２００５）；Ｉｎａｎａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．９３：７７１−７７８（２００５）；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２：１０９０−１０９５（２００６）；Ｄａｍａｓｃｅｎｏｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３８１−３８９（２００６）；Ｈｕｏｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．５４：２３４−２３９（２００７）；並びに２００８年２月２０日に出願された同時係属出願第６１／０６６，４０９号に開示されている。

本願で使用する場合に、上記方法は免疫グロブリンと結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分と無傷の全長免疫グロブリンを発現するように改変することが可能な任意種類の細胞系に由来する宿主細胞を使用することができる。本発明の範囲内で、「細胞」なる用語は個々の細胞、組織、臓器、昆虫細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、哺乳動物細胞、ハイブリドーマ細胞、初代細胞、連続細胞株、幹細胞、植物細胞、酵母細胞、糸状菌細胞の培養及び／又は遺伝子組換え細胞（グリコシル化免疫グロブリンを発現及び提示する組換え細胞）を意味する。

別の態様では、酵母や糸状菌等の下等真核生物は経済的に培養することができ、収率が高く、適切に改変すると、適切なグリコシル化が可能であるため、免疫グロブリンの発現と提示にこのような下等真核生物を使用する。酵母は特に迅速な形質転換、試験蛋白質局在化ストラテジー及び平易な遺伝子ノックアウト技術を可能にする遺伝子工学材料として定着している。適切なベクターは必要に応じてプロモーター（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素を含む）等の発現制御配列、複製起点、終結配列をもつ。

本発明で有用な宿主細胞としては、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｎｅｎａｔｕｍ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａが挙げられる。Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ及びＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等の各種酵母は高い細胞密度まで増殖し、大量の組換え蛋白質を分泌することができるので、細胞培養に特に適している。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ等の糸状菌も本発明の糖蛋白質を工業的規模で生産するために使用することができる。下等真核生物の場合には、捕捉部分の発現を誘導する条件下で細胞を常法により約１．５〜３日間増殖させる。約１〜２日間、捕捉部分の発現を阻害しながら免疫グロブリンの発現を誘導する。その後、該当免疫グロブリンを提示する細胞について細胞を分析する。

グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化型である糖蛋白質を発現するように下等真核生物、特に酵母と糸状菌を遺伝子改変することができる。こうして、目的とする特定のグリコフォームが組成物中で主体となる糖蛋白質組成物を作製することができる。これは、ＵＳ２００４／００１８５９０に記載されているように哺乳動物グリコシル化経路の全部又は一部に似せるように、選択された内在性グリコシル化酵素を排除すること、及び／又は宿主細胞を遺伝子操作すること、及び／又は外来酵素を供給することにより実現できる。必要に応じて、コアフコシル化を伴うか又は伴わない糖蛋白質を産生できるように、グリコシル化を更に遺伝子操作してもよい。下等真核宿主細胞を使用すると、これらの細胞は糖蛋白質の主体となるグリコフォームが組成物中の糖蛋白質の３０モルパーセントを上回るように、糖蛋白質の高度に均質な組成物を産生することができるという点で更に有利である。特定側面において、主体となるグリコフォームは組成物中に存在する糖蛋白質の４０モルパーセント、５０モルパーセント、６０モルパーセント、７０モルパーセントを上回ることができ、最も好ましくは８０モルパーセントを上回ることができる。

グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化型である糖蛋白質を発現するように下等真核生物、特に酵母を遺伝子改変することができる。これは、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，ＵＳ２００４００１８５９０に記載されているように選択された内在性グリコシル化酵素を排除すること及び／又は外来酵素を供給することにより実現できる。例えば、低下させないと糖蛋白質上のＮ−グリカンにマンノース残基を付加してしまう１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下させるように宿主細胞を選択又は設計することができる。

１態様において、宿主細胞は更に、通常ではα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインと結合しておらず、α１，２−マンノシダーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。

別の態様において、前記宿主細胞は更に、通常ではＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメインと結合しておらず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。

別の態様において、前記宿主細胞は更に、通常ではマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインと結合しておらず、マンノシダーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したマンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／０２３００４２号はマンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。

別の態様において、前記宿主細胞は更に、通常ではＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインと結合しておらず、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号及び２００５／０１７０４５２号はＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をヘキソサミニダーゼでインビトロ処理し、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質を作製することができる。

別の態様において、前記宿主細胞は更に、通常ではガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインと結合しておらず、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２もしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォーム又はその混合物を含む組換え糖蛋白質（例えばＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質組成物）が産生される。米国特許第７，０２９，８７２号と米国特許出願公開第２００６／００４０３５３号はＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖蛋白質を産生することが可能な下等真核宿主細胞を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をガラクトシダーゼでインビトロ処理し、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質（例えばＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質組成物）を作製することができる。

別の態様において、前記宿主細胞は更に、通常ではシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインと結合しておらず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質が産生される。酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞では、Ｎ−グリカンに転移するためにＣＭＰ−シアル酸を提供するための手段を更に宿主細胞に加えると有用である。米国特許出願公開第２００５／０２６０７２９号はＣＭＰ−シアル酸合成経路をもつように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示しており、米国特許出願公開第２００６／０２８６６３７号はシアル酸が付加された糖蛋白質を産生するように下等真核生物を遺伝子操作するための方法を開示している。上記細胞で産生された糖蛋白質をノイラミニダーゼでインビトロ処理し、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォーム又はその混合物を主体とする組換え糖蛋白質を作製することができる。

上記宿主細胞の任意１種は更に、米国特許出願公開第２００４／０７４４５８号及び２００７／００３７２４８号に開示されているような分岐型（ＧｎＴＩＩＩ）及び／又は複数側鎖（ＧｎＴＩＶ、Ｖ、ＶＩ及びＩＸ）Ｎ−グリカン構造をもつ糖蛋白質を産生するようにＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩ及びＧｎＴＩＸから構成される群から選択される１種以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを含むことができる。

他の態様において、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生する宿主細胞は更に、通常ではガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインと結合しておらず、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主体とする組換え糖蛋白質が産生される。

別の態様において、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生する前記宿主細胞は更に、通常ではシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインと結合しておらず、シアリルトランスフェラーゼ活性を宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置にターゲティングするように選択された細胞内ターゲティングシグナルペプチドと融合したシアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む。組換え糖蛋白質が宿主細胞のＥＲ又はゴルジ装置を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖蛋白質が産生される。

上記各種宿主細胞は更に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター（例えばキラー酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ及びハツカネズミＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター）、ＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター（例えばキイロショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＵＤＰ−ガラクトーストランスポーター）、及びＣＭＰ−シアル酸トランスポーター（例えばヒトシアル酸トランスポーター）等の１種以上の糖トランスポーターを含む。酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞は上記トランスポーターをもたないので、上記トランスポーターを加えるように酵母や糸状菌等の下等真核宿主細胞を遺伝子操作することが好ましい。

宿主細胞としては更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えばＢＭＴ１，ＢＭＴ２，ＢＭＴ３及びＢＭＴ４）（米国特許出願公開第２００６／０２１１０８５号参照）の１種以上を欠損又は破壊することによりα−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質を排除し、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１及びＭＮＮ４Ｂ（例えば米国特許第７，１９８，９２１号及び７，２５９，００７号参照）の一方又は両方を欠損又は破壊することによりホスホマンノース残基をもつ糖蛋白質を排除するように遺伝子操作された下等真核細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母）が挙げられ、他の側面では更にＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠損又は破壊してもよい。破壊としては、特定酵素をコードするオープンリーディングフレームの破壊又はオープンリーディングフレームの発現の妨害、あるいは干渉性ＲＭＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用してβ−マンノシルトランスフェラーゼ及び／又はホスホマンノシルトランスフェラーゼの１種以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻止する方法が挙げられる。宿主細胞としては更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように改変した上記宿主細胞の任意１種以上が挙げられる。

宿主細胞としては更に、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：蛋白質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）の１種以上（米国特許第５，７１４，３７７号参照）を欠損もしくは破壊することにより糖蛋白質のＯ−グリコシル化を抑制するように遺伝子改変するか、あるいは国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号に開示されているようにＰｍｔｐ阻害剤及び／又はα−マンノシダーゼの存在下で増殖させるか、あるいはその両方を実施した下等真核細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母）が挙げられる。破壊としては、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームの破壊又はオープンリーディングフレームの発現の妨害、あるいは干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等を使用してＰｍｔｐの１種以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻止する方法が挙げられる。宿主細胞としては更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように改変した上記宿主細胞の任意１種以上が挙げられる。

Ｐｍｔｐ阻害剤としては、限定されないが、ベンジリデンチアゾリジンジオンが挙げられる。使用することができるベンジリデンチアゾリジンジオンの例は５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸；及び５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸である。

特定態様では、少なくとも１種の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能又は発現を低下、妨害又は欠損させる。例えば、特定態様では、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３及びＰＭＴ４遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能又は発現を低下、妨害又は欠損させるか、あるいは１種以上のＰＭＴ阻害剤の存在下で宿主細胞を培養する。他の態様において、宿主細胞は１種以上のＰＭＴ遺伝子が欠損又は破壊され、１種以上のＰｍｔｐ阻害剤の存在下で宿主細胞を培養する。これらの態様の特定側面において、宿主細胞は分泌型α−１，２−マンノシダーゼも発現する。

ＰＭＴ欠損もしくは破壊及び／又はＰｍｔｐ阻害剤はＯ−グリコシル化度を低下させることにより、即ちグリコシル化される糖蛋白質上のＯ−グリコシル化部位の合計数を減らすことによりＯ−グリコシル化を抑制する。細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼを更に加えると、糖蛋白質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減らすことによりＯ−グリコシル化が抑制される。従って、ＰＭＴ欠損もしくは破壊及び／又はＰｍｔｐ阻害剤を分泌型α−１，２−マンノシダーゼの発現と併用すると、Ｏ−グリコシル化度と鎖長を減らすことによりＯ−グリコシル化が抑制される。特定状況では、特定の異種糖蛋白質（例えば抗体）を種々の程度の効率で発現させ、ゴルジ装置を通って輸送することができ、従って、ＰＭＴ欠損又は破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤及びα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せが必要になると思われるので、ＰＭＴ欠損又は破壊、Ｐｍｔｐ阻害剤及びα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せは経験的に決定される。別の側面では、１種以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子を欠損させる。この欠損を分泌型α−１，２−マンノシダーゼ及び／又はＰＭＴ阻害剤の供給と組合せてもよいし、分泌型α−１，２−マンノシダーゼ及び／又はＰＭＴ阻害剤の供給の代用としてもよい。

従って、本願に開示する宿主細胞において総収率又は正しくアセンブリされた糖蛋白質の収率を改善させながら特定糖蛋白質を産生させるためにはＯ−グリコシル化の抑制が有用であると思われる。全長抗体は分泌経路を通って細胞表面に輸送されるので、Ｏ−グリコシル化の低下又は阻止は全長抗体のアセンブリと輸送に有益な効果があると思われる。従って、Ｏ−グリコシル化が抑制された細胞において、正しくアセンブリされた抗体フラグメントの収率はＯ−グリコシル化が抑制されていない宿主細胞で得られる収率よりも増加する。

更に、Ｏ−グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性及び／又はアビディティーに影響を与えると思われる。抗体産生用の最終宿主細胞が抗体を選択するために使用された宿主細胞と同一でない場合にこれは特に顕著であると思われる。例えば、Ｏ−グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を妨害する可能性があり、従って、Ｏ−グリコシル化は抗体が抗原と結合する能力を妨害する可能性があるので、抗原に対して高い親和性をもつ抗体を同定できなくなる可能性がある。他方、Ｏ−グリコシル化は抗原に対する抗体のアビディティーを妨害するため、抗原に対して高いアビディティーをもつ抗体を同定できない可能性がある。前者の２例では、抗体の同定及び選択用の宿主細胞は別の細胞型、例えば酵母又は真菌細胞（例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞）であったため、哺乳動物細胞株で産生される場合に特に有効な抗体を同定できない可能性がある。酵母におけるＯ−グリコシル化が哺乳動物細胞におけるＯ−グリコシル化と著しく相違する場合があることはよく知られている。野生型酵母のｏ−グリコシル化を哺乳動物におけるムチン型又はジストログリカン型Ｏ−グリコシル化と比較すると、この点は特に顕著である。特定の場合では、Ｏ−グリコシル化が抗原に対する抗体の親和性又はアビディティーを妨害するのではなく、増加する場合もある。抗体を同定及び選択するために使用される宿主細胞と産生宿主細胞を別のものにする場合（例えば同定と選択を酵母で実施し、産生宿主は哺乳動物細胞とする場合）には、産生宿主ではＯ−グリコシル化は抗原に対する親和性又はアビディティーの増加を生じた型ではなくなるため、この効果は望ましくない。従って、Ｏ−グリコシル化を抑制すると、宿主細胞のＯ−グリコシル化システムにより影響される抗体を同定及び選択せずに抗原に対する抗体の親和性又はアビディティーに基づいて特定抗原に対して特異性をもつ抗体を同定及び選択するために本願の材料と方法を使用することが可能になる。このため、Ｏ−グリコシル化を抑制すると、哺乳動物細胞株で最終的に産生される抗体を同定及び選択する際の酵母又は真菌宿主細胞の有用性が更に増す。

状況によっては、哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質をコードする核酸分子を過剰発現させるか、あるいは１種以上の内在性シャペロン蛋白質をコードする遺伝子を１種以上の哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質をコードする核酸分子で置換することにより、抗体の収率を改善することができる。更に、宿主細胞で哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質を発現させても細胞におけるＯ−グリコシル化が抑制されると思われる。従って、本願に開示する宿主細胞であって、シャペロン蛋白質をコードする少なくとも１種の内在性遺伝子の機能を低下又は阻止し、シャペロン蛋白質の少なくとも１種の哺乳動物又はヒトホモログをコードするベクターを宿主細胞で発現させるものも本願に含まれる。内在性宿主細胞シャペロンと哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質を発現させる宿主細胞も含まれる。他の側面において、下等真核宿主細胞は酵母又は糸状菌宿主細胞である。収率を改善し、組換え蛋白質のＯ−グリコシル化を低下又は抑制するためにヒトシャペロン蛋白質を導入する宿主細胞のシャペロンの使用の例は米国仮出願第６１／０６６４０９号（出願日２００８年２月２０日）及び６１／１８８，７２３号（出願日２００８年８月１２日）に開示されている。上記と同様に、上記のように内在性シャペロン蛋白質の１種以上をコードする遺伝子を１種以上の哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは１種以上の哺乳動物又はヒトシャペロン蛋白質を過剰発現させることに加え、蛋白質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）蛋白質をコードする少なくとも１種の内在性遺伝子の機能又は発現を低下、妨害又は欠損させた下等真核宿主細胞も本願に含まれる。特定態様では、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３及びＰＭＴ４遺伝子から構成される群から選択される少なくとも１種の内在性ＰＭＴ遺伝子の機能を低下、妨害又は欠損させる。

従って、本願に開示する方法はＮ−グリカン組成物を含まない糖蛋白質を産生するように遺伝子改変された任意宿主細胞を使用することができ、主体となるＮ−グリカンは複合型Ｎ−グリカン、ハイブリッド型Ｎ−グリカン及び高マンノース型Ｎ−グリカンから構成される群から選択され、複合型Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、及びＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択され；ハイブリッド型Ｎ−グリカンはＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、及びＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択され；高マンノース型Ｎ−グリカンはＭａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２及びＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２から構成される群から選択される。特定側面において、Ｎ−グリカンの組成物は概算でＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２３９％、Ｇａｌ_１ＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２４０％、及びＧａｌ_２ＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２６％又は概算でＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２６０％、Ｇａｌ_１ＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２１７％、及びＧａｌ_２ＧｌｃＮＡＣ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２５％、又はその相互混合物を含有する。

酵母細胞が１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さない（即ちｏｃｈ１ｐをコードするＯＣＨ１遺伝子が破壊又は欠損している）上記態様において、宿主細胞は接合することができない。従って、形質転換効率に応じて、軽鎖及び重鎖の潜在的ライブラリー多様性は約１０^３〜１０^６の多様性の重鎖ライブラリーと、約１０^３〜１０^６の多様性の軽鎖ライブラリーに制限されると思われる。他方、接合可能な酵母宿主細胞では、軽鎖ライブラリーを発現する宿主細胞と重鎖ライブラリーを発現する宿主細胞を接合させ、重鎖／軽鎖ライブラリーを発現する宿主細胞を作製することができるので、多様性を約１０^６〜１０^１２まで増加することができる。従って、特定態様において、宿主細胞は１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示す（即ちｏｃｈ１ｐ機能をコードするＯＣＨ１遺伝子をもつ）が、細胞表面に抗体又はそのフラグメントを提示するように本願に記載するように改変されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母細胞である。これらの態様において、宿主細胞はその天然グリコシル化経路をもつ宿主細胞とすることができる。

本発明で使用することができる酵母選択マーカーとしては、薬剤耐性マーカーと、酵母宿主細胞に必須細胞栄養素（例えばアミノ酸）を合成させる遺伝子機能が挙げられる。酵母で一般に使用される薬剤耐性マーカーとしては、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネチシン）、ゼオシン等が挙げられる。酵母宿主細胞に必須細胞栄養素を合成させる遺伝子機能は対応するゲノム機能に栄養要求性突然変異をもつ入手可能な酵母株で使用する。一般的な酵母選択マーカーはロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１及びＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３，ＵＲＡ５ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リジン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１又はＡＤＥ２）等を合成するための遺伝子機能を提供する。他の酵母選択マーカーとしては、亜ヒ酸塩の存在下で増殖させる酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＲＲ３遺伝子が挙げられる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−０６６（１９９７））。多数の適切な組込み部位としては米国特許出願公開第２００７／００７２２６２号に記載されているものが挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の酵母又は真菌類に公知の遺伝子座のホモログが挙げられる。ベクターを酵母に組込む方法は周知であり、例えば米国特許第７，４７９，３８９号、ＷＯ２００７１３６８６５及びＰＣＴ／ＵＳ２００８／１３７１９を参照されたい。挿入部位の例としては、限定されないが、ＰｉｃｈｉａＡＤＥ遺伝子；ＰｉｃｈｉａＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子；ＰｉｃｈｉａＭＣＡ遺伝子；ＰｉｃｈｉａＣＹＭ遺伝子；ＰｉｃｈｉａＰＥＰ遺伝子；ＰｉｃｈｉａＰＲＢ遺伝子；及びＰｉｃｈｉａＬＥＵ遺伝子が挙げられる。ＰｉｃｈｉａＡＤＥ１及びＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎＣｅｒｅｇｈｉｎｏｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ２６３：１５９−１６９（２００１）と米国特許第４，８１８，７００号に記載されており、ＨＩＳ３及びＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ１４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｘ５６１８０に記載されている。

全長抗体を発現する態様では、分子の２９７位（グリコシル化部位）のアスパラギン残基をコードするコドンを、他の任意アミノ酸残基をコードするコドンで置換するように、抗体又はその重鎖フラグメントをコードする核酸分子を改変する。従って、宿主細胞で産生される抗体はグリコシル化されていない。この態様では、軽鎖ライブラリーを提示する宿主細胞に重鎖ライブラリーを提示する宿主細胞を接合し、得られたコンビナトリアルライブラリーを本願に教示するようにスクリーニングする。抗体はＮ−グリコシル化を欠損するので、目的の抗原に対する抗体親和性を妨害する宿主細胞の非ヒト酵母Ｎ−グリカンは組換え抗体上に存在しない。該当抗原に対する望ましい親和性をもつ抗体を産生する細胞を選択する。その抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を細胞から取出し、２９７位にアスパラギン残基を再導入するように、重鎖をコードする核酸分子を改変する。こうして、従来記載されているようなハイブリッド型又は複合型Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質を産生するように操作された宿主細胞にその抗体をコードする核酸分子を導入すると、抗体又はそのフラグメントの２９７位に適切なヒト様グリコシル化が得られる。

免疫グロブリンの組換え発現及び提示に使用される細胞系は更に動物界に由来する任意高等真核細胞、組織、生物（例えばトランスジェニックヤギ、トランスジェニックウサギ、ＣＨＯ細胞、昆虫細胞及びヒト細胞株）とすることができる。動物細胞の例としては、限定されないが、ＳＣ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０，ＮＳＯ細胞及びその誘導体が挙げられる。昆虫細胞としてはキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来細胞が挙げられる。細胞が特定又は主に特定のＮ−グリカンをもつ免疫グロブリンを産生できるようにこれらの細胞を遺伝子操作することができる。例えば、米国特許第６，９４９，３７２号はシアル酸が付加された糖蛋白質を昆虫細胞で産生させる方法を開示している。Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉｅｔａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−６２２（２００４）、Ｋａｎｄａｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬＢｉｏｅｎｇ．９４：６８０−６８８（２００６）、Ｋａｎｄａｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１７：１０４−１１８（２００６）、並びに米国特許出願公開第２００５／０２１６９５８号及び２００７／００２０２６０号はＮ−グリカンがフコースを含有しないか又は含有量の少ない免疫グロブリンを産生することが可能な哺乳動物細胞を開示している。

特定態様において、高等真核細胞、組織、生物は植物界に由来するものでもよい（例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、タバコ等）。あるいは、例えばＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｆｕｎａｒｉａ、Ｓｐｈａｇｎｕｍ、Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ及びＳｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ属の種からコケ植物細胞を選択することもできる。植物細胞の例としては、ＷＯ２００４／０５７００２及びＷＯ２００８／００６５５４に開示されているＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓのコケ植物細胞が挙げられる。細胞が特定Ｎ−グリカンを主体とする免疫グロブリンを産生できるようにグリコシル化経路を改変するように、植物細胞を使用する発現システムを更に操作することができる。例えば、コアフコシルトランスフェラーゼを機能低下もしくは欠損及び／又はキシロシルトランスフェラーゼを機能低下もしくは欠損及び／又はβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを機能低下もしくは欠損させるように細胞を遺伝子操作することができる。あるいは、残基を除去する酵素で処理することにより、ガラクトース、フコース及び／又はキシロースを免疫グロブリンから除去することができる。当分野で公知のＮ−グリカンからガラクトース、フコース及び／又はキシロース残基を遊離させる任意酵素を使用することができ、例えばα−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼ及びα−フコシダーゼが挙げられる。あるいは、１，３−フコシルトランスフェラーゼ及び／又は１，２−キシロシルトランスフェラーゼ及び／又は１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより基質として使用することができない改変型Ｎ−グリカンを合成する発現システムを使用することができる。植物細胞におけるグリコシル化経路の改変方法は米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号に記載されている。

本願に開示する方法は哺乳動物、昆虫及び植物細胞で使用するように適応させることができる。哺乳動物、昆虫又は植物細胞における発現カセットの発現を調節するために選択される調節性プロモーターは選択される細胞型で機能できるように選択すべきである。適切な調節性プロモーターの例としては、限定されないが、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えばＢｅｒｅｎｓ＆Ｈｉｌｌｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３１０９−３１２１（２００３）参照）、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター及びカナマイシン調節性システムが挙げられる。実施例に記載する発現カセットに例示するプロモーターの代わりにこれらのプロモーターを使用することができる。選択される細胞型で使用するのに適した細胞表面アンカー蛋白質に捕捉部分を融合することができる。ＧＰＩ蛋白質を含む細胞表面アンカー蛋白質は哺乳動物、昆虫及び植物細胞でよく知られている。ＧＰＩ係留型融合蛋白質はＫｅｎｎａｒｄｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏ．８：ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ｊｅｎｋｉｎｓ．ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）ｐｐ．１８７−２００（１９９９）に記載されている。実施例に例示するゲノムターゲティング及び組込み配列の代わりに、安定な形質転換体を作製するために発現カセットを宿主細胞ゲノムに組込むためのゲノムターゲティング配列を使用することができる。安定的及び一過的にトランスフェクトした哺乳動物、昆虫、植物宿主細胞を作製するためのトランスフェクション法は当分野で周知である。トランスフェクトした宿主細胞を本願に開示するように構築後、本願に開示するように該当免疫グロブリンの発現について細胞をスクリーニングし、選択することができる。

本発明は更に適切なパッケージに本発明の発現及びヘルパーベクターを含むキットも包含する。各キットは宿主細胞内へのベクターの送達を可能にする試薬を必須とする。ベクターの送達を助長する試薬の選択は使用する特定トランスフェクション又は感染方法により異なる。キットは更に外来配列と蛋白質産物の検出用の標識ポリヌクレオチドプローブ又は蛋白質プローブを作製するために有用な試薬を含むことができる。各試薬は固体形態で供給してもよいし、在庫保存と、その後に実験を実施する際に反応媒体への交換又は添加に適した液体緩衝液に溶解／懸濁してもよい。適切なパッケージを提供する。キットは場合により操作で有用な他のコンポーネントを提供することができる。これらの非必須コンポーネントとしては、限定されないが、緩衝液、捕捉用試薬、展開用試薬、標識剤、反応表面、検出手段、対照サンプル、説明書及び解釈情報が挙げられる。

本願に引用する全刊行物、特許及び他の文献は全体を本願に援用する。

以下の実施例は本発明を更に理解し易くすることを目的とする。

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓをモデルとして使用して本発明の有用性を実証した。糖鎖組換え型Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株ｙＧＬＹ２６９６をバックグラウンド株として使用した。株ｙＧＬＹ２６９６では、内在性ＰＤＩをコードする遺伝子がヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換され、ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードする核酸分子がＰＥＰ４遺伝子座に挿入されている。Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主体とする糖蛋白質を産生するように内在性グリコシル化経路を改変するようにこの株を更に操作した。株ＹＧＬＹ２６９６は２００８年２月２０日に出願された同時係属出願第６１／０６６，４０９号に開示されている。この株は免疫グロブリンを作製するため及びＯ−グリコシル化を低下させた免疫グロブリンを作製するために有用であることが分かった。株ｙＧＬＹ２６９６の構築は以下の工程を要した。

ヒトＰＤＩ蛋白質をコードする発現カセットと、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１をコードする遺伝子を、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子で置換するためにプラスミドベクターをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１遺伝子座にターゲティングするための核酸分子を含む発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を以下のように実施し、図８に示す。プライマーとしてｈＰＤＩ／ＵＰ１：５’ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＣ３’（配列番号１）及びｈＰＤＩ／ＬＰ−ＰａｃＩ：５’ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴ３’（配列番号２）と、ＰｆｕｔｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）と、ヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を使用してヒトＰＤＩ１をコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、プラスミドベクターｐＧＬＹ６１８を作製した。ヒトＰＤＩ１のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号３９及び４０）を表１に示す。

ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号４１及び４２）を表１に示す。ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡに由来する領域のＰＣＲ増幅により、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１５’及び３’領域を含む核酸分子の単離を行った。プライマーとしてＰＢ２４８：５’ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＴＡＧ３’（配列番号３）；ＰＢ２４９：５’ＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣ３’（配列番号４）を使用して５’領域を増幅した。プライマーとしてＰＢ２５０：５’ＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣ３’（配列番号５）；ＰＢ２５１：５’ＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧ−３’（配列番号６）を使用して３’領域を増幅した。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株ＮＲＲＬ−１１４３０ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲフラグメントＰｐＰＤＩ１（５’）及びＰｐＰＤＩ１（３’）を別々にプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ６２０及びｐＧＬＹ６１７を作製した。ｐＧＬＹ６７８を構築するために、プラスミドベクターをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＲＧ３遺伝子座にターゲティングする組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２４のＤＮＡフラグメントＰｐＡＲＧ３−５’及びＰｐＡＲＧ−３’を、プラスミドベクターｐＧＬＹ６７８をＰＤＩ１遺伝子座にターゲティングしてＰＤＩ１遺伝子座の発現を妨害するＤＮＡフラグメントＰｐＰＤＩ（５’）及びＰｐＰＤＩ（３’）で夫々置換した。

次にヒトＰＤＩをコードする核酸分子をプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８にクローニングし、ヒトＰＤＩをコードする核酸分子をＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ）の制御下においたプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を作製した。５’末端ＮｏｔＩ制限酵素部位と平滑３’末端をもつＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α接合因子（ＭＦ）プレ配列シグナルペプチド（ＳｃαＭＦプレシグナルペプチド）をコードする核酸分子と、プラスミドベクターｐＧＬＹ６１８からヒトＰＤＩをコードする核酸分子をＡｆｅＩとＰａｃＩで遊離させて作製した平滑５’末端と３’末端ＰａｃＩ部位をもつ核酸分子を含む発現カセットを、ＮｏｔＩとＰａｃＩで消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ６７８にライゲーションすることにより、発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２を構築した。得られた組込み／発現プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓプロモーターと機能的に連結されたヒトＰＤＩ１／ＳｃαＭＦプレシグナルペプチド融合蛋白質をコードする発現カセットと、ＰＤＩ１遺伝子座の破壊とＰＤＩ１遺伝子座への発現カセットの組込みのためにプラスミドベクターをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１遺伝子座にターゲティングするための核酸分子配列を含む。図２はプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２の構築を示す。ＳｃαＭＦプレシグナルペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号２７及び２８に示す。

ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードする発現／組込みベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を以下のように実施し、図３に示す。プライマーとしてｈＧＲＰ９４／ＵＰ１：５’−ＡＧＣＧＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１５）；及びｈＧＲＰ９４／ＬＰ１：５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＴＴＣ３’（配列番号１６）を使用してヒトＧＲＰ９４をヒト肝ｃＤＮＡ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で２０秒間、５５℃で２０秒間及び７２℃で２．５分間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。ＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６を作製した。ヒトＧＲＰ９４のヌクレオチド配列とアミノ酸配列（夫々配列番号４３及び４４）を表１に示す。

プラスミドベクターｐＧＬＹ２２１６からヒトＧＲＰ９４をコードする核酸分子をＡｆｅＩとＦｓｅＩで遊離させた。次に上記のようにＮｏｔＩ末端と平滑末端をもつＳｃαＭＰプレシグナルペプチドをコードする核酸分子に前記核酸分子をライゲーションし、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＥＰ４５’及び３’領域（夫々ＰｐＰＥＰ４−５’及びＰｐＰＥＰ４−３’領域）を含む核酸分子をもつプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３１をＮｏｔＩとＦｓｅＩで消化し、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２２９をＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化し、プラスミドベクターｐＧＬＹ２１８７からＰｐＰＤＩ１プロモーターを含むＤＮＡフラグメントをＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切出し、このＤＮＡフラグメントをｐＧＬＹ２２２９にライゲーションし、プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩプロモーターの制御下でヒトＧＲＰ９４融合蛋白質をコードし、ＰＥＰ４遺伝子座の破壊とＰＥＰ４遺伝子座への発現カセットの組込みのためにプラスミドベクターをゲノムのＰＥＰ４遺伝子座にターゲティングするためにＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＥＰ４遺伝子の５’及び３’領域を含む。図３はプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３の構築を示す。

プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２、ｐＧＬＹ１８９６及びｐＧＦＩ２０７ｔの構築を以下のように実施した。全Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドベクターはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ αＭＡＴプレシグナルペプチド（ＳｃαＭＰプレシグナルペプチド）に融合したＴ．ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号参照）をコードし、発現をＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰプロモーターの制御下におき、プラスミドベクターの組込みをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＲＯ１遺伝子座にターゲティングし、選択にＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５遺伝子を使用するｐＧＦＩ１６５に由来するものとした。プラスミドベクターｐＧＦＩ１６５のマップを図４に示す。

ｐＧＦＩ１６５のＧＡＰプロモーターをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１（ＰｐＡＯＸ１）プロモーターで置換することによりプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２を作製した。これは、ｐＧＬＹ２０２８からＥｃｏＲＩ（平滑化）−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてＰｐＡＯＸ１プロモーターを単離し、ＮｏｔＩ（平滑化）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＦＩ１６５に挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２のマップを図５に示す。

プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＭＮＮ２膜挿入リーダーペプチド融合蛋白質（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：５０２２（２００３）参照）と融合したマウスα−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインをコードする発現カセットをプラスミドベクターｐＧＦＩ１６５に挿入したものである（図５）。これは、ＸｈｏＩ（末端平滑化）とＰｍｅＩで消化したｐＧＬＹ１４３３からＧＡＰｐ−ＳｃＭＮＮ２−マウスＭＮＳＩ発現カセットを単離し、ＰｍｅＩで消化したｐＧＦＩ１６５にフラグメントを挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＬＹ１８９６のマップを図４に示す。

プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔは亜ヒ酸塩耐性を付与するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＲＲ３（ＳｃＡＲＲ３）遺伝子でＵＲＡ５選択マーカーを置換した以外はｐＧＬＹ１８９６と同様である。これはＡｓｃＩ（ＡｓｃＩ末端平滑化）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＦＩ１６６からＳｃＡＲＲ３遺伝子を単離し、ＳｐｅＩ（ＳｐｅＩ末端平滑化）とＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬＹ１８９６にフラグメントを挿入することにより実施した。プラスミドベクターの組込みはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＲＯ１遺伝子座を標的とし、選択にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＲＲ３遺伝子を使用する。プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔのマップを図４に示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＡＲＲ３遺伝子は亜ヒ酸塩の存在下で増殖させる細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与する（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−０６６（１９９７））。

上記発現／組込みベクターによる酵母トランスフェクションを以下のように実施した。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株をＹＰＤ培地（酵母エキス（１％），ペプトン（２％），デキストロース（２％））５０ｍＬ中でＯＤが約０．２〜６になるまで一晩増殖させた。氷上で３０分間インキュベーション後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞をペレット化した。培地を捨て、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄後、氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。直鎖化ＤＮＡ１０μＬ（５〜２０μｇ）と細胞懸濁液１００μＬをエレクトロポレーションキュベットに加え、氷上で５分間インキュベートした。プリセットＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓプロトコール（２ｋＶ，２５μＦ，２００Ω）に従ってＢｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌでエレクトロポレーションを実施し、直後にＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）１ｍＬを加えた。トランスフェクトした細胞を室温（２６℃）で４時間〜一晩回収後、細胞を選択培地に撒いた。

細胞株の作製を以下のように実施し、図６に示す。従来記載されている方法（例えばＮｅｔｔａｎｄＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：１２４４（２００３）参照）を使用して株ｙＧＬＹ２４−１（ｕｒａ５△：：ＭＥＴ１ｏｃｈ１△：：ｌａｃＺｂｍｔ２△：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１△：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１△ｍｎｎ４△：：ｌａｃＺｍｅｔ１６△：：ｌａｃＺ）を構築した。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）及び米国特許出願公開第２００６０２１１０８５号に開示されている。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ｍｎｎ４Ｌ１遺伝子（別称ｍｎｎ４ｂ）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。ｍｎｎ４とはｍｎｎ４Ｌ２又はｍｎｎ４ａを意味する。遺伝子型において、ＫｌＭＮＮ２−２はＫｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓＧｌｃＮＡｃトランスポーターであり、ＭｍＳＬＣ３５Ａ３はＭｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓＧｌｃＮＡｃトランスポーターである。ＵＲＡ５欠損によりｙＧＬＹ２４−１株をウラシル栄養要求性（米国特許出願公開第２００４／０２２９３０６号参照）にし、これを使用して以下のヒト化シャペロン株を構築した。本願の実施例では各種発現カセットをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの特定遺伝子座に組込んだが、当然のことながら、本発明の操作は組込みに使用する遺伝子座から独立している。本願に開示する遺伝子座以外の遺伝子座も発現カセットの組込みに使用することができる。適切な組込み部位としては、米国特許出願公開第２００７００７２２６２号に列挙されている部位が挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び他の酵母又は真菌類に公知の遺伝子座のホモログを含む。

内在性ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１遺伝子の不在下にＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞で発現されるヒトＰＤＩ１の有効性を試験するために株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４を作製した。株ｙＧＬＹ７０２及びｙＧＬＹ７０４（ｈｕＰＤＩ）を以下のように作製した。構成的ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターの制御下でヒトＰＤＩをコードする発現カセットを含むプラスミドベクターｐＧＬＹ６４２をｙＧＬＹ２４−１にトランスフェクトすることにより株ｙＧＬＹ７０２を作製した。プラスミドベクターｐＧＬＹ６４２は更にＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ５をコードする発現カセットを含むため、株ｙＧＬＹ７０２はウラシル原栄養性であった。５−ＦＯＡプレートでｙＧＬＹ７０２を対抗選択することによりＵＲＡ５発現カセットを除去し、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤＩ１遺伝子がヒトＰＤＩ遺伝子で安定的に置換され、株がウラシル栄養要求性である株ｙＧＬＹ７０４を作製した。

ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１プロモーターと機能的に連結されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＲｅｅｓｅｉマンノシダーゼ（ＴｒＭＮＳ１）をコードする発現カセット（ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１）を含むプラスミドベクターｐＧＬＹ１１６２をｙＧＬＹ７０４のＰＲＯ１遺伝子座にトランスフェクトすることにより株ｙＧＬＹ７３３を作製した。この株はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれており、ＵＲＡ５栄養要求株である。メタノールの存在下で細胞を増殖させると、ＰｐＡＯＸ１プロモーターにより過剰発現が可能になる。

各々プラスミドベクターｐＧＦＩ２０７ｔでＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結されたＴｒＭＮＳ１とマウスマンノシダーゼＩＡ（ＭｕＭＮＳ１Ａ）をコードする発現カセットを対照株ｙＧＬＹ７３３のＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓゲノムの５’ＰＲＯ１遺伝子座ＵＴＲに組込むことにより株ｙＧＬＹ７６２を構築した。この株はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換され、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれており、ＵＲＡ５栄養要求株である。

５−ＦＯＡプレート上でｙＧＬＹ７６２を対抗選択することにより株ｙＧＬＹ２６７７を作製した。この株はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＰｐＧＡＰＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれており、ＵＲＡ５原栄養株である。

ヒトＧＲＰ９４蛋白質をコードするプラスミドベクターｐＧＬＹ２２３３をＰＥＰ４遺伝子座に組込むことにより株ｙＧＬＹ２６９６を作製した。この株はＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＤ１をコードする遺伝子がヒトＰＤＩ１をコードする発現カセットで置換され、ＰｐＡＯＸ１−ＴｒＭＮＳ１発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ＰｐＧＡＰＤＨ−ＴｒＭＮＳ１及びＰｐＧＡＰＤＨ−ＭｕＭＮＳ１Ａ発現カセットがＰＲＯ１遺伝子座に組込まれ、ヒトＧＲＰ６４がＰＥＰ４遺伝子座に組込まれており、ＵＲＡ５原栄養株である。このシャペロンヒト化株の系図を図６に示す。

抗Ｈｅｒ２抗体と抗ＣＤ２０抗体をコードする発現ベクターを以下のように構築した。

発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８は抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖と軽鎖をコードする発現カセットを含む。α−ＭＡＴプレシグナルペプチドのＮ末端に融合した抗Ｈｅｒ２重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をＧｅｎｅＡｒｔＡＧにより合成した。α−アミラーゼシグナルペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号２７及び２８に示す。各々ユニークな５’ＥｃｏＲ１及び３’Ｆｓｅ１部位を付けて合成した。抗Ｈｅｒ２ＨＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号２９及び３０に示す。抗Ｈｅｒ２ＬＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３１及び３２に示す。ユニークな５’ＥｃｏＲ１及び３’Ｆｓｅ１部位を使用してＨＣ及びＬＣ融合蛋白質をコードする核酸分子フラグメントの両者を別々に（ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＴＲＰ２ターゲティング核酸分子とゼオシン耐性マーカーを含む）発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２１９８にサブクローニングし、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７及びｐＧＬＹ２３３８を形成した。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することにより、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１プロモーターとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＹＣターミネーターの制御下にＬＣ融合蛋白質をコードするＬＣ発現カセットをプラスミドベクターｐＧＬＹ２３３８から切出した後、ＢａｍＨ１とＮｏｔ１で消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７にＤＮＡフラグメントをクローニングし、最終発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８（図７）を作製した。

発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ３２００（マップはＬＣとＨＣがα−アミラーゼシグナル配列をもつ抗ＣＤ２０である以外はｐＧＬＹ２９８８と同一である）。抗ＣＤ２０配列は軽鎖（ＬＣ）フレームワーク配列がＶκ３生殖細胞系列に由来する配列に一致する以外はＧｅｎＭａｂ配列２Ｃ６に由来するものとした。（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来）α−アミラーゼシグナルペプチドのＮ末端に融合した重鎖（ＨＣ）及びＬＣ可変配列をＧｅｎｅＡｒｔＡＧにより合成した。α−アミラーゼシグナルペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を配列番号３３及び３４に示す。ＩｇＧ１及びＶκ定常領域を含む発現ベクターに可変領域を直接クローニングできるように、各々ユニークな５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＫｐｎＩ部位を付けて合成した。抗ＣＤ２０ＨＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３７及び３８に示す。抗ＣＤ２０ＬＣのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３５及び３６に示す。ＨＣ及びＬＣ融合蛋白質の両方を夫々ＩｇＧ１プラスミドベクターｐＧＬＹ３１８４及びＶκプラスミドベクターｐＧＬＹ２６００（各プラスミドベクターはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＴＲＰ２ターゲティング核酸分子とゼオシン耐性マーカーを含む）にサブクローニングし、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ３１９２及びｐＧＬＹ３１９６を形成した。ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することにより、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１プロモーターとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＣＹＣターミネーターの制御下にＬＣ融合蛋白質をコードするＬＣ発現カセットをプラスミドベクターｐＧＬＹ３１９６から切出した後、ＢａｍＨ１とＮｏｔ１で消化したプラスミドベクターｐＧＬＹ３１９２にＤＮＡフラグメントをクローニングし、最終発現プラスミドベクターｐＧＬＹ３２００（図８）を作製した。

上記抗Ｈｅｒ２又は抗ＣＤ２０抗体発現／組込みプラスミドベクターによる株ｙＧＬＹ２６９６のトランスフェクションを原則的に以下のように実施した。ＯＤが約０．２〜６になるまで適切なＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株をＹＰＤ培地（酵母エキス（１％），ペプトン（２％），デキストロース（２％））５０ｍＬ中で一晩増殖させた。氷上で３０分間インキュベーション後、細胞を２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化した。培地を捨て、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄後、氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。直鎖化ＤＮＡ１０μＬ（５〜２０μｇ）と細胞懸濁液１００μＬをエレクトロポレーションキュベットに加え、氷上で５分間インキュベートした。プリセットＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓプロトコール（２ｋＶ，２５μＦ，２００Ω）に従ってＢｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＸｃｅｌｌでエレクトロポレーションを実施し、直後にＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）１ｍＬを加えた。トランスフェクトした細胞を室温（２６℃）で４時間〜一晩回収後、細胞を選択培地に撒いた。抗ＨＥＲ２抗体をコードするｐＧＬＹ２９８８をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６をｙＧＬＹ４１３４と命名した。抗ＣＤ２０抗体をコードするｐＧＬＹ３２００をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６をｙＧＬＹ３９２０と命名した。

本実施例は免疫グロブリンと結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質をコードする発現カセットを含み、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓで使用するのに適したプラスミドの構築について記載する。このようなプラスミドは細胞表面アンカー蛋白質であるｓｅｄ１ｐをコードする核酸分子を含み、前記蛋白質は結合したグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）による翻訳後修飾を内在的に含み、細胞壁に係留される。ｓｅｄ１ｐをコードする核酸分子を、無傷の全長抗体と結合することが可能な抗体結合部分をコードする核酸分子とインフレームで連結した。

抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質発現カセットを含む４種類のプラスミドを構築した。プラスミドｐＧＬＹ４１３６はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＥＤ１（ＳｃＳＥＤ１）遺伝子に続いてＣＹＣターミネーターに融合したプロテインＡの５個のＦｃ結合ドメインをいずれもＡＯＸプロモーターの制御下でコードする（図９）。プラスミドｐＧＬＹ４１１６はＳｃＳＥＤ１遺伝子に融合したＦｃ受容体ＩＩＩ（ＦｃＲＩＩＩ（ＬＦ））をコードする（図１０）。プラスミドｐＧＬＹ４１３７はＳｃＳＥＤ１遺伝子に融合したＦｃ受容体Ｉ（ＦｃＲＩ）をコードし（図１０）、プラスミドｐＧＬＹ４１２４（図９）はＳｃＳＥＤ１遺伝子に融合したプロテインＡに由来するＺＺドメインをコードする。ＺＺドメインは５個のＦｃ結合ドメインのうちの２個から構成される。全４種類のプラスミドはｐＵＣ１９大腸菌起点と亜ヒ酸塩耐性マーカーを含み、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓゲノムのＵＲＡ６遺伝子座に組込まれる。

その内在性シグナルペプチドをもたないＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＥＤ１ＧＰＩアンカー蛋白質（ＳＥＤ１フラグメント）を含む融合蛋白質をコードする発現カセットを含むプラスミドｐＧＬＹ３０３３は２００８年３月３日に出願された同時係属出願第６１／０６７，９６５号に記載されている。その内在性シグナルペプチドをもたないＳＥＤ１アミノ酸配列を配列番号６０に示す。ＳＥＤ１フラグメントをコードする核酸分子をＧｅｎｅＡｒｔＡＧにより合成した。このフラグメントをコードするコドンはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓでの発現用に最適化されている。ＳＥＤ１フラグメントをコードするヌクレオチド配列を配列番号６１に示す。ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ６遺伝子座をＧＰＩアンカー蛋白質発現カセットの組込み部位として選択した。ＵＲＡ６遺伝子をＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングし、プラスミドｐＧＬＹ１８４９を作製した。クローニングの目的でサイレント突然変異により遺伝子内のＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を突然変異させた。プラスミドｐＧＬＹ２１８４のＴＲＰ２ターゲティング核酸分子をｐＧＬＹ１８４９に由来するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＵＲＡ６遺伝子で置換した。更に、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＲＧ１選択マーカーをプラスミドｐＧＦＩ８に由来する亜ヒ酸塩マーカーカセットで置換した。最終プラスミドをｐＧＦＩ３０ｔと命名し、そのアミノ末端でＧＲ２コイルドコイルペプチドに融合したＳＥＤ１フラグメント蛋白質をコードする核酸分子を含む発現カセットと、ＰｐＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ α−アミラーゼシグナルペプチドを含むプラスミドｐＧＬＹ３０３３（図２０）を作製するために使用した。ＧＲ２コイルドコイルとシグナルペプチドをコードするフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化により切出し、抗体捕捉部分で置換すると、捕捉部分を細胞表面アンカー蛋白質に融合した融合蛋白質を作製することができる。

ＡＯＸ１プロモーターの制御下でＳＥＤ１フラグメントに融合したプロテインＡの５個のＦｃ結合ドメインをコードする発現カセットを含むプラスミドｐＧＬＹ４１３６を以下のように構築した。Ｎ末端でＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α接合因子プレシグナル配列に融合し、Ｃ末端でＨＡ及び９×ＨＩＳタグ配列に融合した５個のＦｃ結合ドメインをコードすると共に、ＥｃｏＲＩ５’末端とＳａｌＩ３’末端をもつように、プロテインＡに由来する５個のＦｃ結合ドメインをコードする核酸分子フラグメントをＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。フラグメントａｐｒｅ−５ｘＢＤ−Ｈｔａｇは配列番号４５に示すヌクレオチド配列をもつ。ａｐｒｅ−５ｘＢＤ−Ｈｔａｇ融合蛋白質は配列番号４６に示すアミノ酸配列をもつ。ａｐｒｅ−５ｘＢＤ−Ｈｔａｇ融合蛋白質をコードする核酸分子をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化してＧＲ２コイルドコイルをコードするフラグメントを切出しておいたｐＧＬＹ３０３３にフラグメントをクローニングした。こうして、ＰｐＡＯＸ１プロモーターに機能的に連結され、ＳＥＤ１フラグメントをコードする核酸分子にインフレームで連結されたａｐｒｅ−５ｘＢＤ−Ｈｔａｇ融合蛋白質をコードする核酸分子を含むプラスミドｐＧＬＹ４１３６を作製した。このプラスミドはプラスミドをＵＲＡ６遺伝子座にターゲティングする組込み／発現ベクターである。この組込み／挿入プラスミドにより発現される融合蛋白質を本願ではプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と言う。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をＧＡＰＤＨプロモーターの制御下におくために、プラスミドｐＧＬＹ４１３６をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＡＯＸ１プロモーターを遊離させ、ｐＧＬＹ８８０に由来するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＡＰＤＨプロモーターを挿入した。こうしてプラスミドｐＧＬＹ４１３９を作製した。

ＡＯＸ１プロモーターの制御下でＳＥＤ１フラグメントと融合したプロテインＡＺＺドメインをコードする発現カセットを含むプラスミドｐＧＬＹ４１２４を以下のように構築した。以下のプライマー：プライマーα−ａｍｙ−ＰｒｏｔＡＺＺ／ｕｐ：

及びＨＡ−ＰｒｏｔＡＺＺ−ＸｈｏＩＺＺ／ｌｐ：

を使用してＧｅｎｅＡｒｔプラスミド０７０６２０８ＺＺＨＡｔａｇに由来するＺＺドメインをＰＣＲ増幅した。α−ａｍｙ−ＰｒｏｔＡＺＺ／ｕｐプライマーはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ α−アミラーゼシグナルペプチド（下線部）の最初から２０個のアミノ酸のコーディング配列をインフレームで含む。これらのプライマーはコーディング領域の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入し、３’末端にＸｈｏＩ部位を導入する。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてのＺＺドメインの核酸配列を配列番号４９に示す。ＺＺドメインのアミノ酸配列を配列番号５０に示す。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９８℃で１０秒間、６５℃で１０秒間及び７２℃で１分間２０サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。

ＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングし、クローニングしたフラグメントをシーケンシングし、配列がプロテインＡＺＺドメインをコードすることを確認した。ＺＺドメインフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ消化によりｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターから切出し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化してＧＲ２コイルドコイルをコードするフラグメントを切出しておいたプラスミドｐＧＬＹ３０３３にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントをクローニングした。こうして、ＰｐＡＯＸ１プロモーターと機能的に連結され、ＳＥＤ１フラグメントをコードする核酸分子とインフレームで連結されたプロテインＡＺＺドメイン−αアミラーゼシグナルペプチド融合蛋白質をコードする核酸分子を含むプラスミドｐＧＬＹ４１２４を作製した。このプラスミドはプラスミドをＵＲＡ６遺伝子座にターゲティングする組込み／発現ベクターである。この組込み／挿入プラスミドにより発現される融合蛋白質を本願ではＺＺ／ＳＥＤ１融合蛋白質と言う。

ＡＯＸ１プロモーターの制御下でＳＥＤ１フラグメントに融合したＦｃＲＩＩＩａＬＦ受容体をコードする発現カセットを含むプラスミドｐＧＬＹ４１１６を以下のように構築した。ＦｃＲＩＩＩａＬＦ受容体をコードする核酸分子をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてプラスミドｐＧＬＹ３２４７（ＦｃＲＩＩＩａＬＦ）からＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＧＬＹ３２４７において、ＦｃＲＩＩＩａＬＦ受容体は内在性シグナルペプチドをα−ＭＦプレプロで置換した融合蛋白質である。５’プライマーはシグナルペプチドをコードする配列にアニールし、３’プライマーは受容体の末端でＨｉｓタグにアニールし、受容体の停止コドンを省略する。５’プライマーは５Ｅｃｏａｐｐ：ＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣ（配列番号５１）とし、３’プライマーは３ＨｔａｇＳａｌＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣ（配列番号５２）とした。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で７０秒間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。

受容体融合蛋白質をコードするＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングし、クローニングしたフラグメントをシーケンシングし、配列が受容体をコードすることを確認した。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてのＦｃＲＩＩＩ（ＬＦ）のヌクレオチド配列を配列番号５３に示す。αＭＦプレシグナル配列をもつＦｃＲＩＩＩ（ＬＦ）のアミノ酸配列を配列番号５４に示す。

プラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化してＧＲ２１コイルドコイルをコードするフラグメントを切出しておいたｐＧＬＹ３０３３に受容体をコードするＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントをクローニングした。こうして、ＰｐＡＯＸ１プロモーターと機能的に連結され、ＳＥＤ１フラグメントをコードする核酸分子とインフレームで連結されたＦｃＲＩＩＩａＬＦ／α−ＭＦプレプロシグナルペプチド融合蛋白質をコードする核酸分子を含むプラスミドｐＧＬＹ４１１６を作製した。このプラスミドはプラスミドをＵＲＡ６遺伝子座にターゲティングする組込み／発現ベクターである。この組込み／挿入プラスミドにより発現される融合蛋白質を本願ではＦｃＲＩＩＩａ融合蛋白質と言う。

ＳＥＤ１フラグメントと融合したＦｃＲＩ受容体をコードするプラスミドｐＧＬＹ４１３７を以下のように構築した。ＦｃＲＩ受容体をコードする核酸分子をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてプラスミドｐＧＬＹ３２４８からＰＣＲ増幅した。プラスミドｐＧＬＹ３２４８において、ＦｃＲＩ受容体は内在性シグナルペプチドをα−ＭＦプレプロで置換した融合蛋白質である。５’プライマーはシグナルペプチドをコードする配列にアニールし、３’プライマーは受容体の末端でＨｉｓタグにアニールし、受容体の終止コドンを省略する。５’プライマーは５Ｅｃｏａｐｐ：ＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣ（配列番号５１）とし、３’プライマーは３ＨｔａｇＳａｌＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣ（配列番号５２）とした。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間及び７２℃で７０秒間を２５サイクル後、７２℃で１０分間を１サイクルとした。

受容体融合蛋白質をコードするＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯにクローニングし、クローニングしたフラグメントをシーケンシングし、配列が受容体をコードすることを確認した。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとしてのＦｃＲＩのヌクレオチド配列を配列番号５５に示す。αＭＦプレシグナル配列をもつＦｃＲＩのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。

プラスミドｐＣＲ２．１ＴＯＰＯをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化してＧＲ２１コイルドコイルをコードするフラグメントを切出しておいたｐＧＬＹ３０３３に受容体をコードするＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントをクローニングした。こうして、ＰｐＡＯＸ１プロモーターと機能的に連結され、ＳＥＤ１フラグメントをコードする核酸分子とインフレームで連結されたＦｃＲＩ／α−ＭＦプレプロシグナルペプチド融合蛋白質をコードする核酸分子を含むプラスミドｐＧＬＹ４１１６を作製した。このプラスミドはプラスミドをＵＲＡ６遺伝子座にターゲティングする組込み／発現ベクターである。この組込み／挿入プラスミドにより発現される融合蛋白質を本願ではＦｃＲＩ融合蛋白質と言う。

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおける抗体と抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質の同時発現を以下のように実施した。

Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株ｙＧＬＹ４１３４（抗ＨＥＲ２抗体を発現）及びｙＧＬＹ３９２０（抗ＣＤ２０抗体を発現）に各々ｐＧＬＹ４１１６（ＦｃＲＩＩＩ受容体／ＳＥＤ融合蛋白質を発現）、ｐＧＬＹ４１３６（プロテインＡ／ＳＥＤ融合蛋白質を発現）、ｐＧＬＹ４１２４（プロテインＡＺＺドメイン／ＳＥＤ融合蛋白質を発現）、又はｐＧＬＹ４１３７（ＦｃＲＩ受容体／ＳＥＤ融合蛋白質を発現）をトランスフェクトした。ｙＧＬＹ２６９６にも同様に上記４種類の発現／組込みベクターの各々をトランスフェクトした。トランスフェクションでは、培養液が約ＯＤ６００＝２．０の密度に達するまでＢＭＧＹ培地５０ｍＬ中で株を増殖させる。細胞を１Ｍソルビトールで３回洗浄し、１Ｍソルビトール１ｍＬに再懸濁する。直鎖化プラスミド約１〜２μｇを細胞と混合する。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓへの核酸分子のエレクトロポレーションに特有の製造業者のプログラムを使用してＢｉｏＲａｄエレクトロポレーション装置でトランスフェクションを実施する。回収培地１ｍＬを細胞に加えた後、亜ヒ酸塩５０μｇ／ｍＬを添加したＹＰＧ（酵母エキス：ペプトン：グリセロール培地）に撒く。

以下のように細胞表面標識を行った。株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体を発現）、ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現）、及びｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ＹＧＬＹ２６９６（プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現）を９６穴ディープウェルプレートでＢＭＧＹ（緩衝最少グリセロール培地−酵母エキス，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）６００μＬ中又は２５０ｍＬ容振盪フラスコでＢＭＧＹ５０ｍＬ中にて２日間増殖させた。細胞を遠心により採取し、上清を捨てた。ＷＯ２００７／０６１６３１に教示されている方法に従い、ＢＭＭＹ３００μＬ又は２５ｍＬ中でＰｍｔｉ−３阻害剤を加えて一晩インキュベートすることにより細胞を誘導した。Ｐｍｔｉ−３は米国特許第７，１０５，５５４号及び国際出願公開第ＷＯ２００７０６１６３１号に記載されているような３−ヒドロキシ−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒド；３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）ベンズアルデヒドである。Ｐｍｔｉ−３阻害剤はＯ−グリコシル化度、即ち抗体分子上の総Ｏ−グリカン数を低下させる。前記細胞は更に抗体分子上に存在する総Ｏ−グリカンの鎖長を制御するようにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ αＭＡＴプレシグナルペプチドと連結されたＴ．ｒｅｅｓｅｉ α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを発現する。

誘導した細胞を以下のようにヤギ抗ヒト重鎖及び軽鎖（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）共役抗体で標識し、蛍光顕微鏡を使用して観察した。誘導後、約０．５〜１．０ＯＤ６００の密度の細胞を遠心により１．５ｍＬ管に採取した。細胞をＰＢＳ１ｍＬで２回リンスし、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中１：５００）０．５ｍＬを加えた。管を３７℃で１時間回転させ、遠心し、ＰＢＳ１ｍＬで３回リンスし、検出抗体を除去した。細胞をＰＢＳ約５０〜１００μＬに再懸濁し、１０μＬアリコートを蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影した（図２）。予想通り、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６を導入しない抗Ｈｅｒ２抗体発現株ｙＧＬＹ４１３４と、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６を導入したが、抗Ｈｅｒ２抗体を発現しないｙＧＬＹ２６９６はいずれも表面標識を示さなかった。ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトしたｙＧＬＹ２６９６の細胞で検出された弱い標識はヤギ抗ヒト重鎖及び軽鎖（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ４８８共役抗体と発現されたプロテインＡの交差反応によるものであると思われる。他方、同様に図１１から明らかなように、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗Ｈｅｒ２抗体を同時発現させると（ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４）、細胞表面に抗体は提示されず、バックグラウンド標識しか示さなかった。この結果から、抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１蛋白質を同時に発現させると、細胞表面への抗体の提示が妨げられ、あるいはプロテインＡ／ＳＥＤ１蛋白質が細胞表面に正しく係留されないと予想された。

本実施例はプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質が細胞表面に正しく係留されることと、抗Ｈｅｒ２抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を同時に発現させると、細胞表面への抗体の捕捉と提示が妨げられることを実証する。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質自体が細胞表面に提示されるか否かを試験するために、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードするｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６を前記実施例に記載したように増殖させ、誘導した。約０．５〜１．０ＯＤ６００の細胞密度で細胞を遠心により１．５ｍＬ管に採取し、ＰＢＳ１ｍＬで２回リンスした。抗Ｈｅｒ２抗体１０又は５０ｎｇを外部から細胞に加え、細胞を１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ１ｍｌで３回洗浄し、前記実施例に記載したようにヤギ抗ヒトＨ＋Ｌで標識した。その結果、抗Ｈｅｒ２抗体は細胞の表面に捕捉され、提示された。これを図１２に示すが、強い細胞表面染色が認められる。この結果、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質が発現され、発現された融合蛋白質が細胞表面に正しく挿入され、融合蛋白質が細胞表面に抗体を捕捉及び提示できることが確認される。

同時発現が細胞表面への抗体の提示を妨げるか否かを試験するために、ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６（プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現する空の株）、ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現する株）、及びｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ３９２０（抗ＣＤ２０抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現する株）を前記実施例と同様に増殖させ、誘導した。抗Ｈｅｒ２抗体１０ｎｇを外部から加えて細胞をインキュベートし、前記実施例と同様に標識し、検出した。図１３はプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質のみを発現する空の株（ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトしたｙＧＬＹ２６９６）では強い細胞表面標識を示すが、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体を同時発現させた場合の株（ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトしたｙＧＬＹ４１３４と、ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトしたｙＧＬＹ３９２０）では弱い染色しか示さない。プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現する細胞は外部から加えた抗体を捕捉して提示することができたが、抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を同時に発現する細胞は外部から加えた抗体を捕捉できず、それ自体が分泌した抗体を提示することもできなかった。

これらの結果から、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質は抗体同時発現株では細胞表面に十分に提示されないと思われた。これは、メタノール誘導下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と強力なＡＯＸプロモーターに由来する抗体を同時に発現させると、ＥＲに抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の複合体が凝集し、分解するためであると思われる。あるいは、ＥＲで産生された抗体とプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の複合体はその分子量又は立体障害により十分に分泌されないと思われる。

Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの細胞表面に抗体を提示する能力について他の抗体結合部分を試験した。Ｆｃ受容体Ｉ（ＦｃＲＩ）、Ｆｃ受容体ＩＩＩ（ＦｃＲＩＩＩ）及びプロテインＡＺＺドメインを試験した。株ｙＧＬＹ２６９６（空）、ｙＧＬＹ４１３４（抗Ｈｅｒ２抗体を発現）及びｙＧＬＹ３９２０（抗ＣＤ２０抗体を発現）にプラスミドｐＧＬＹ４１１６（ＦｃＲＩＩＩ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードする）、ｐＧＬＹ４１２４（プロテインＡＺＺドメイン／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードする）、及びｐＧＬＹ４１３６（プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードする）の各々を別々にトランスフェクトし、実施例４と同様に増殖させ、誘導し、標識した。

ＺＺドメインの結果は染色が多少弱かったが、プロテインＡの結果と同様であった。このことから、２個のＦｃ結合ドメインは５個のＦｃ結合ドメインをもつ無傷のプロテインＡに比較して抗体に対する親和性が低いと考えられる。

ＦｃＲＩＩＩ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体を同時に発現させると、細胞表面染色を生じなかった。ｐＧＬＹ４１１６（ＦｃＲＩＩＩ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードする）をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６を実施例４に記載したように増殖させ、誘導し、抗Ｈｅｒ２抗体１０又は５０ｎｇ外部から加えて細胞をインキュベートした。プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現した株からの結果とは逆に、多少の細胞内染色は認められるが、細胞表面染色は認められなかった（図１４）。以上の結果から、ＦｃＲＩＩＩ／ＳＥＤ１融合蛋白質を細胞で発現させることはできるが、分泌されなかったようである。

本実施例はプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体の一時的な発現により、分泌された抗体を細胞表面に正しく発現及び捕捉できることを実証する。

上記実験の結果、抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質と抗体を同時に発現させると、アンカーを細胞表面に提示できないと思われた。上記実験では、抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質と抗体の両方を強力なＡＯＸ誘導性プロモーターと機能的に連結した核酸分子から発現させた。先ず抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質の発現を誘導後、十分な抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質を産生させて細胞表面に係留した後に、抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質の発現を阻害し、抗体の発現を誘導すると、抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質により抗体を細胞表面に捕捉できるのではないかと仮定した。従って、抗体結合部分／細胞表面アンカー融合蛋白質をコードする核酸分子と抗体の一時的な発現を可能にすると思われる種々のプロモーターを試験した。

ＧＵＴ１プロモーターはグリセロールの存在下で増殖させた細胞中で誘導され、グリセロールを含有せず且つデキストロースを含有する培地に細胞を交換すると抑制されるプロモーターである。ＰＣＲを使用し、プライマー５ｇｕｔＢｇｌＩＩＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＣＣＣＡＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣ（配列番号５７）及びプライマー３ｇｕｔＥｃｏＲＩＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＴＡＴＡＧＴＧＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧ（配列番号５８）を使用してＧＵＴ１プロモーターをＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓのゲノムＤＮＡからＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして増幅した。次にＰＣＲフラグメントをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにクローニングした後、シーケンシングし、配列を確認した。ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化によりｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターからＧＵＴ１プロモーターフラグメントを切出し、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＧＬＹ４１３６にクローニングし、ＡＯＸ１プロモーターをＧＵＴ１プロモーターで置換した。ＢｇｌＩ及びＥｃｏＲＩ末端を含むＧＵＴ１プロモーターのヌクレオチド配列を配列番号５９に示す。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質プラスミドｐＧＬＹ４１３６に由来するＡＯＸプロモーターをＰｐＧＡＰＤＨプロモーターで置換し、プラスミドｐＧＬＹ４１３９を作製し、又はＧＵＴ１プロモーターで置換し、プラスミドｐＧＬＹ４１４４を作製した（図１５）。ＰｐＧＡＰＤＨプロモーターはデキストロース中で誘導され、グリセロール中ではこのレベルの約８０％で誘導されるが、ＧＵＴ１プロモーターはグリセロール中で誘導され、デキストロース中では抑制される。ＡＯＸプロモーターの制御下で抗Ｈｅｒ２抗体を発現するｙＧＬＹ４１３４にｐＧＬＹ４１３９をトランスフェクトした。更に、抗Ｈｅｒ２発現がＧＡＰＤＨプロモーターにより調節される株ｙＧＬＹ５４３４（ｐＧＬＹ４１４２をトランスフェクトしたｙＧＬＹ２６９６）にｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗Ｈｅｒ２抗体の発現がどちらもＡＯＸプロモーターにより調節されるｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４を９６穴ディープウェルプレートでＢＭＧＹ（グリセロールを炭素源とする）６００μＬ中又は２５０ｍＬ容振盪フラスコでＢＭＧＹ５０ｍＬ中にて２日間増殖させた。細胞を遠心により採取し、上清を捨てた。ＢＭＭＹ（メタノールを炭素源とする）３００μＬ又は２５ｍＬ中でＰＭＴｉ阻害剤を加えて一晩インキュベートすることにより細胞を誘導した。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の発現がＰｐＧＡＰＤＨプロモーターにより調節され、抗Ｈｅｒ２抗体の発現がＡＯＸプロモーターにより調節されるｐＧＬＹ４１３９をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ４１３４をＢＭＧＹ（グリセロールを炭素源とする）中で増殖させ、ＢＭＭＹ（メタノールを炭素源とする）中にてＰＭＴｉ阻害剤で誘導した。

プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の発現がＧＵＴ１プロモーターにより調節され、抗Ｈｅｒ２抗体の発現がＧＡＰＤＨプロモーターにより調節されるｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ５４３４をＢＭＧＹ（グリセロールを炭素源とする）中で増殖させ、ＢＭＤＹ（デキストロースを炭素源とする）中にてＰＭＴｉ阻害剤で誘導した。デキストロースはＧＵＴ１プロモーターからの転写を阻害する。誘導後、全３種の株を実施例１に記載したようにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識した。一般に、増殖は１．５日〜３日間、誘導は１〜２日間とすることができる。通常では株を２日間増殖させた後に更に２日間誘導した後に分析を行う。

図１６は上記株の細胞表面染色の結果を示す。実施例５に示したように、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗Ｈｅｒ２抗体をいずれも強力なＡＯＸプロモーター下に同時に発現させると（ｐＧＬＹ４１３６をトランスフェクトしたｙＧＬＹ４１３４）、細胞表面標識を示さない。グリセロール中で増殖中にＧＡＰＤＨプロモーター下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現させ、メタノールで誘導中にＡＯＸプロモーターにより調節される抗Ｈｅｒ２抗体を発現させると（ｐＧＬＹ４１３９をトランスフェクトしたｙＧＬＹ４１３４）、多少弱いが、明白な細胞表面標識を示す。この場合には、ＧＡＰＤＨプロモーターはメタノール誘導条件下で完全に抑制されないので、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質は抗体の誘導中にまだ多少のレベルで発現される。しかし、グリセロール中で増殖中にＧＵＴ１プロモーター下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現させた後にデキストロース中で誘導中にＧＡＰＤＨプロモーターにより調節される抗Ｈｅｒ２抗体を誘導すると（ｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトしたＹＧＬＹ５４３４）、強い細胞表面標識を示した。この場合には、ＧＵＴ１プロモーターはデキストロース中で完全に抑制されるので、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質は抗体誘導条件下で発現されなかった。

図１７はプロモーターの各種組み合わせの制御下におけるプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体の予想発現パターンを示す図である。グリセロール増殖期に抑制され、メタノール誘導期に誘導される強力なＡＯＸプロモーター下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体を発現させると、検出可能な細胞表面提示は生じなかった。同様に、同時発現の結果、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体の複合体がＥＲ中に形成され、細胞表面に分泌されないか又は分解する。

グリセロール中で増殖中にＧＡＰＤＨプロモーター下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現させ、メタノール中で誘導中にＡＯＸプロモーター下で抗体を発現させると、弱い細胞表面提示が生じた。この場合には、ＧＡＰＤＨプロモーターはメタノール誘導条件下で完全に抑制されないので、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質は抗体の誘導中にまだ多少のレベルで発現される。即ち、誘導条件下ではＥＲ中にプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質と抗体の複合体が形成され、分泌経路を詰まらせるため、細胞表面には少量のプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質しか得られないと思われる。

グリセロール中で増殖中にＧＵＴ１プロモーター下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現させた後に、デキストロースで抗体発現の誘導中にＧＡＰＤＨプロモーター下で抗体を発現させると同時にプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質の発現を抑制すると、強い細胞表面提示を生じた。従って、先ずプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質を発現させた後に抗体誘導中に完全に抑制すると、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質は細胞壁に分泌され、分泌時に抗体を捕捉することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターはグリセロール下で抑制されないので、抗体はプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質増殖中に多少のレベルで発現されるが、抗体の発現レベルは十分に低いため、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質分泌を妨げないと思われる。

ＧＵＴ１プロモーター下で調節されるプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質による全長抗体の細胞表面提示が種々の抗体で得られることを実証するために、プロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードし、ＧＵＴ１プロモーターにより発現を調節されるプラスミドｐＧＬＹ４１４４を抗ＣＤ２０抗体発現株ｙＧＬＹ５７５７にもトランスフェクトした。株ｙＧＬＹ５７５７はプラスミドｐＧＬＹ４０７８をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ２６９６である。プラスミドｐＧＬＹ４０７８はＧＡＰＤＨプロモーターの調節下で抗ＣＤ２０抗体の重鎖及び軽鎖をコードする。

ＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結された抗ＣＤ２０抗体を発現し、ｐＧＬＹ４１４４（ＧＵＴ１プロモーターの制御下でプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質をコードする）をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ５７５７と、ＧＡＰＤＨプロモーターと機能的に連結された抗Ｈｅｒ２抗体を発現し、ｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした株ｙＧＬＹ５４３４を図６について記載したようにプロテインＡ／ＳＥＤ１融合蛋白質発現のためにグリセロール中で増殖させた後に、抗体発現及び分泌のためにデキストロース中で誘導した。どちらの抗体でも強い細胞表面染色が認められた（図１８）。従って、一時的調節により抗Ｈｅｒ２抗体抗体だけでなく、種々の抗体を係留抗体結合部分により酵母表面に提示できることが明らかである。

図１９は図８からのサンプルのＦＡＣＳソーティングの結果を示す。ｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした抗Ｈｅｒ２発現株ｙＧＬＹ５７５７、ｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした抗ＣＤ２０発現株ｙＧＬＹ５４３４及びｐＧＬＹ４１４４をトランスフェクトした空の株ｙＧＬＹ２６９６をグリセロール中で増殖させた後、デキストロース中で誘導した。細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８で標識し、ＦＡＣＳソーティングにより分析した。図９に示すように、抗体を発現しない空の株はバックグラウンド蛍光染色を示したが、抗ＣＤ２０発現株の３個のクローンでは、蛍光は右側に移動し、細胞表面標識を示した。抗Ｈｅｒ２発現株でも同じことが認められた。この株の１個のクローンは細胞表面標識を示さなかったが、抗体又はアンカーを発現しないトランスフェクションからの疑陽性であると思われる。これらの結果から、ＦＡＣＳソーティングを使用して全長抗体を提示する細胞を選別できることが明らかである。

本願では例証する態様に関して本発明を説明するが、当然のことながら、本発明はこれらの態様に限定されない。本願の教示に接した当業者はその範囲内の他の変形及び態様に想到しよう。従って、本発明は添付の特許請求の範囲のみに限定される。

Claims

該当免疫グロブリンを発現する酵母宿主細胞の作製方法であって、
（ａ）第１の調節性プロモーターと機能的に連結された、免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝的に多様な集団をコードする複数の核酸分子（ここで、重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも一方は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、免疫グロブリンをその表面に提示することが可能な複数の遺伝的に多様な宿主細胞を作製する段階と；
（ｃ）宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分をコードする核酸分子の発現を誘導する段階と；
（ｄ）宿主細胞において捕捉部分をコードする核酸分子の発現を阻害し、免疫グロブリンをコードする核酸分子の発現を誘導し、提示される該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を作製する段階を含む前記方法。
前記方法が更に、
（ｅ）宿主細胞の細胞表面に提示される該当免疫グロブリンと特異的に結合する検出手段と宿主細胞を接触させる段階と；
（ｆ）検出手段が結合した宿主細胞を単離する段階を含む請求項１に記載の方法。
結合部分が免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する請求項１に記載の方法。
結合部分がプロテインＡ、プロテインＡＺＺドメイン、プロテインＧ及びプロテインＬから構成される群から選択される請求項１に記載の方法。
細胞表面アンカー蛋白質がＧＰＩ蛋白質である請求項１に記載の方法。
該当免疫グロブリンを発現する酵母宿主細胞の作製方法であって、
（ａ）第１の調節性プロモーターと機能的に連結された、免疫グロブリンと特異的に結合することが可能な結合部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分をコードする第１の核酸分子を含む宿主細胞を準備する段階と；
（ｂ）免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする１個以上の核酸分子（ここで、重鎖又は軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも一方は第２の調節性プロモーターと機能的に連結されている）を宿主細胞にトランスフェクトし、その後、該宿主細胞を突然変異させて免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団をコードする複数の宿主細胞を作製する段階と；
（ｃ）宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって捕捉部分の発現を誘導する段階と；
（ｄ）宿主細胞において捕捉部分の発現を阻害し、免疫グロブリンの突然変異体の多様化集団の発現を誘導し、該当免疫グロブリンを発現する宿主細胞を作製する段階を含む前記方法。
前記方法が更に、
（ｅ）該当免疫グロブリンと結合する検出手段と宿主細胞を接触させ、該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を同定する段階と；
（ｆ）該当免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を単離する段階を含む請求項６に記載の方法。
結合部分が免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する請求項６に記載の方法。
結合部分がプロテインＡ、プロテインＡＺＺドメイン、プロテインＧ及びプロテインＬから構成される群から選択される請求項６に記載の方法。
細胞表面アンカー蛋白質がＧＰＩ蛋白質である請求項６に記載の方法。
ＶＨドメインをもつ免疫グロブリンとＶＬドメインをもつ免疫グロブリンを産生する酵母宿主細胞の作製方法であって、これら免疫グロブリンが、該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位を有する抗体又は抗体断片を形成するものであり、当該方法が、
（ａ）酵母宿主細胞のライブラリーを準備する段階、
ここで、該ライブラリーの酵母宿主細胞は、免疫グロブリンＶＬドメインと免疫グロブリンＶＨドメインの遺伝的に多様な集団をコードする核酸分子を含み、ここで、免疫グロブリンＶＨドメイン又は免疫グロブリンＶＬドメインの少なくとも１つの発現は、第２の調節性プロモーターにより行われ、ここで、該酵母宿主細胞は、前記ＶＨドメインを含む免疫グロブリンと前記ＶＬドメインを含む免疫グロブリンをその表面に提示し、
ここで、前記ライブラリーは、
（ｉ）免疫グロブリンと結合することが可能な部分と融合した細胞表面アンカー蛋白質を含む捕捉部分を発現する酵母宿主細胞（ここで、捕捉部分の発現は第１の調節性プロモーターにより行われる）を準備し；
（ｉｉ）該宿主細胞を該核酸分子でトランスフェクトすることにより作製される；
（ｂ）宿主細胞の表面に捕捉部分を産生するために十分な時間にわたって宿主細胞に第１の調節性プロモーターの発現を誘導する段階と、
（ｃ）宿主細胞において第１の調節性プロモーターの発現を阻害し、第２の調節性プロモーターの発現を誘導し、それにより各宿主細胞にその表面にＶＨドメインをもつ免疫グロブリンとＶＬドメインをもつ免疫グロブリンを提示させる段階
を含み、
これら免疫グロブリンが、該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ抗体又は抗体断片を形成することを特徴とする、前記方法。
免疫グロブリンが合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインを含み、合成ヒト免疫グロブリンＶＨドメインと合成ヒト免疫グロブリンＶＬドメインがフレームワーク領域と超可変ループを含み、フレームワーク領域とＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方の最初から２個の超可変ループが本質的にヒト生殖細胞系列であり、ＶＨドメインとＶＬドメインが改変型ＣＤＲ３ループをもつ請求項１１に記載の方法。
改変型ＣＤＲ３ループをもつことに加えて、ヒト合成免疫グロブリンＶＨ及びＶＬドメインが他のＣＤＲループにも突然変異を含む請求項１２に記載の方法。
各ヒト合成免疫グロブリンＶＨドメインＣＤＲループがランダム配列である請求項１２に記載の方法。
前記方法が更に、
（ｄ）複数の宿主細胞を該当抗原と接触させ、その表面に提示された免疫グロブリンと該当抗原を結合させた宿主細胞を検出することにより、該当抗原に対して結合特異性をもつ１つの免疫グロブリンをその表面に提示する宿主細胞を前記複数の宿主細胞中で同定し、ＶＨドメインとＶＬドメインをもち、更に該当抗原に対する結合特異性を備える抗原結合部位をもつ免疫グロブリンを産生する宿主細胞を作製する段階を含む請求項１１に記載の方法。
抗体がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥから構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
結合部分が免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する請求項１１に記載の方法。
結合部分がプロテインＡ、プロテインＡＺＺドメイン、プロテインＧ及びプロテインＬから構成される群から選択される請求項１１に記載の方法。
細胞表面アンカー蛋白質がＧＰＩ蛋白質である請求項１１に記載の方法。