JP5726532B2 - Ｇｌｐ−１アナログの半組換え調製 - Google Patents

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Description

本発明は、組換え発現技術の使用と化学ペプチド合成を組み合わせてＮ末端部に非タンパク新生アミノ酸を含むＧＬＰ−１アナログ及び誘導体の調製のための半組換え法に関する。
ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、血糖代謝、胃腸管分泌及び代謝及び食物摂取の調節に関連する３７アミノ酸残基の消化管ホルモンである。ＧＬＰ−１は、とりわけ回腸末端部、膵臓及び脳のＬ細胞で合成されるプレプログルカゴンに由来する。ＧＬＰ−１は、グルコース依存的な形でインスリン分泌を刺激し、インスリン生合成を刺激し、ベータ細胞レスキューを促進し、グルカゴン分泌、胃内容排出及び食物摂取を低減させる。ヒトＧＬＰ−１は、共にインスリン分泌性薬剤であるＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）−アミドに加水分解される。２型糖尿病患者に投与されるＧＬＰ−１の薬理学的用量は循環インスリンレベルを有意に上昇させ、血漿グルカゴンレベルを低下させることが示されている。ＧＬＰ−１の作用は、膵臓、心臓、腎臓、中枢神経系及び消化管においてＧＬＰ−１レセプターによって媒介される。よって、ＧＬＰ−１は糖尿病の治療において非常に重要になることが予想される。
しかしながら、天然ヒトＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１レセプターアンタゴニストとして作用する切断型ＧＬＰ−１（９−３６）アミド代謝物への血漿酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる分解によって迅速に不活性化される。これはペプチドに短い循環半減期を付与する。
この短い循環半減期は、多くの糖尿病患者、特にいわゆる「針恐怖症」、つまり自分で注射をすることに対して大きな恐怖がある２型糖尿病セグメントに対して問題である。２型糖尿病セグメントでは、殆どの患者は経口低血糖剤で治療される。ＧＬＰ−１化合物は注射可能な薬学的製品であることが予想されるので、注射の恐怖は、これらの臨床的に非常に有望な化合物を幅広く使用するための深刻な障害になりうる。
よって、ある範囲の異なったアプローチ及び方法を用いて、インビボでのより長い作用期間を提供するためにＧＬＰ−１化合物の構造を改変することがなされている。よって、かなりの努力が、例えばＤＰＰ−ＩＶによる分解速度を低減させるためにＤＰＰ−ＩＶ媒介加水分解を受けることが少ないＧＬＰ−１化合物のアナログ及び誘導体を開発するのに払われている。ＷＯ２００６／０９７５３８、ＷＯ２００６／０９７５３６、ＷＯ２００６／０３７８１０、ＷＯ２００６／００５６６７、ＷＯ２００５／０５８９５８、ＷＯ２００５／０２７９７８、ＷＯ９８／０８８７１及びＵＳ２００１／００１１０７１には、ＤＰＰ−ＩＶによる加水分解に対してある種の保護を付与しうる、非タンパク新生アミノ酸、つまり非天然アミノ酸）を含むＧＬＰアナログを含む様々なＧＬＰ−１アナログ及び誘導体が記載されている。
天然ＧＬＰ−１のような、タンパク新生アミノ酸 (つまり、天然アミノ酸)のみを含むポリペプチドは組換え技術を使用して又は化学合成によって製造することができる。しかしながら、Ｎ末端が伸展されたＧＬＰ−１アナログのような非タンパク新生アミノ酸を含むポリペプチドは、組換え発現技術によって実際的な形で現在は調製することができず、一般に化学合成によって調製されている。ペプチド合成のための最も広く使用されている方法は、固体担体としてポリマーを使用して十分な保護されたアミノ酸が段階的な形で導入される固相ペプチド合成法である。
固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）は、ある種のペプチドの調製では非常に効率的でありうるが、過剰な反応物の一貫した使用と合わさって保護されたアミノ酸の使用のためこのアプローチは比較的高価になる。また、固相ポリペプチド合成における各アミノ酸の伸長には徹底的な洗浄手順を必要とする。典型的には、一つのアミノ酸の導入には、ＮＭＰ、ＤＭＦ又はＤＣＭのような溶媒を用いた１０までの洗浄工程が関与する。
インスリン分泌性剤、ＧＬＰ−１アナログ、ＧＬＰ−１の切断型アナログ及びＧＬＰ−１の誘導体のようなポリペプチドを、ＳＰＰＳを使用して合成する場合、合成中の二次構造の形成がしばしば個々の合成工程の効率を低下させてしまう。その結果、大きなペプチド又はある種のアミノ酸配列を含むペプチドは、しばしば低い純度及び収率で製造される。不純物は、一又は複数のアミノ酸が最終配列中で失われている欠失ペプチドであることが多い。これらの不純物は所望のペプチドから分離することが非常に難しく、欠失ペプチドで汚染された生成物が生じる場合がある。
Ｎ末端部に非タンパク新生アミノ酸を有することによってＤＰＰ−ＩＶ保護されたＧＬＰ−１アナログ及び誘導体の効率的で経済的な調製方法を提供することが本発明の目的である。該方法は、組換え技術を使用する切断型ＧＬＰ−１前躯体分子の対費用効率に優れた生産を、非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端伸展の化学合成と組み合わせている。ＧＬＰ−１アナログ又は誘導体の製造コストの有意な低減が達成される。安価なＧＬＰ−１アナログ及び誘導体は治療を利用できる患者の数を最大にし、また例えば経皮及び経肺デリバリーなど、皮下注射よりもバイオアベイラビリティが低い代替のデリバリー経路の利点を活用するために非常に望ましい。
その最も広い態様では、本発明は、Ｎ末端部に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むことによって保護されたＤＰＰ−ＩＶであるＧＬＰ−１アナログ及び誘導体を製造する方法に関する。
よって、一態様では、本発明は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
（ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログ又は誘導体の前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
（ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
（ｉｉｉ）発現された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、
（ｉｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を、当該分野で知られている適切な手段によって単離する
工程を含む方法に関する。
図１は酵母プラスミドｐＳＡ２７３を示す。該プラスミドは、プラスミド中に出芽酵母ＴＰＩ遺伝子の転写プロモーター及び転写ターミネーター間に挿入されたＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を含む発現カセットを含む。発現カセットはＭＦａ１＊プレプロリーダー、二塩基プロセシングエンドペプチダーゼＫｅｘ２のＬｙｓ−Ａｒｇ切断部位、及びＧＬＰ−１前躯体（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）からなる融合産物をコードする。 図２は、ＧＬＰ−１前躯体をコードするＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡ断片を示している。ＤＮＡ断片によってコードされるＧＬＰ−１前躯体アミノ酸配列は太字で示してある。ａ）（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）；ｂ）Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８−Ｅｘｔ２及びｃ）Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）−Ｅｘｔ２；ｄ）（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）。 図３は、ＧＬＰ−１前躯体及び最適化されたリーダー配列をコードするＮｃｏＩ−ＸｂａＩ ＤＮＡ断片を示している。（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）は非限定的実施例として示す。大文字は異なった配列を示す。ＤＮＡ断片によってコードされる最適化されたアミノ酸は太字で示す。「ＫＲ」は最少Ｋｅｘ２ｐ切断部位ＬｙｓＡｒｇを含むコンストラクトを示している。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ１からＰ６までの最適化：（Ａ−Ｆ）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ１からＰ６までの最適化：（Ａ−Ｆ）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。プロリンの導入：（Ｈ、Ｉ）。ＤＡＰａｓｅでの下流プロセシングのためのコンストラクト：（Ｇ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。ＤＡＰａｓｅでの下流プロセシングのためのコンストラクト：（Ｇ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。ＤＡＰａｓｅでの下流プロセシングのためのコンストラクト：（Ｇ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。 図４は、実施例として（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）リーダー最適化を示す。Ｐ７からＰ１１への荷電アミノ酸の導入：（Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。収率はＭＦａｌｐｈａ＊−リーダー及び単純なＬｙｓＡｒｇ Ｋｅｘ２ｐ切断部位を持つ（３４Ｒ）ＧＬＰ−１（１１−３７）に対するパーセントで与える。
発明の詳細な記載
本発明者等は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部に含むＧＬＰ−１アナログ及び誘導体を調製するための経済的で効率的な方法を開発した。よって、タンパク新生アミノ酸のみを含む組換え的に生産されたＧＬＰ−１前駆体分子を、例えば伸展断片の場合によっては活性化されるカルボン酸誘導体とＧＬＰ−１アナログの前躯体を反応させることにより、非タンパク新生アミノ酸又は一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むペプチドを使用してＮ末端に効果的に伸展せしめ得ることが見出された。
より詳細には、本発明は、７、８、９及び／又は１０位を含むＮ末端に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＧＬＰ−１アナログ及び誘導体の半組換え調製方法を提供する。また、アシル化によるＧＬＰ−１アナログ前躯体分子中のリジン残基のε−Ｎの誘導体化の有用な方法が提供される。よって、本発明は、化学合成のフレキシビリティと組換え技術を使用するＧＬＰ−１アナログ及び誘導体の対費用効率に優れた生産を組み合わせる。
本明細書では、次の用語は示した意味を有する：
ここで使用される「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により結合した少なくとも２つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであり得、また遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸でありうる。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばγ−カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、β−アラニン、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
２２のタンパク新生アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンである。
よって、非タンパク新生アミノ酸は、ペプチド結合を介してペプチドに導入可能であるが、タンパク新生アミノ酸ではない部分である。非タンパク新生アミノ酸の例は、限定されないが、γ−カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニン及びＤ−グルタミンである。合成の非タンパク新生合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸を含み、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス−アミノ−ヒスチジン、アミノ酸のベータアナログ、例えばβ−アラニン等、Ｄ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニン、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、(１-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(１-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(１-アミノシクロへプチル)カルボン酸、又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸、α−メチルプロリン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンである。
ポリペプチドを言及する、ここで使用される「ＤＰＰ−ＩＶ保護された」なる用語は、前記化合物を血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−ＩＶ）耐性にするために化学的に修飾されたポリペプチドを意味する。血漿中のＤＰＰ−ＩＶ酵素は幾つかのペプチドホルモン、例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エクセンジン−４等の分解に含まれることが知られている。従って、ＤＰＰ−ＩＶによる分解速度を低減させるために、ＤＰＰ−ＩＶを介した加水分解を受けやすいポリペプチドのアナログ及び誘導体を開発する多大な努力がなされる。一実施態様では、ＤＰＰ−ＩＶ保護されたペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３７）よりもＤＰＰ−ＩＶに対してより耐性である。
ＤＰＰ−ＩＶによる分解に対するペプチドの耐性は、次の分解アッセイによって決定される：
１００μＬの０．１Ｍのトリエチルアミン−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中において、ペプチドアリコート（５ｎｍｏｌ）を、５ｍＵの酵素活性に相当する１μＬの精製ＤＰＰ−ＩＶと共に３７℃で１０−１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加して、酵素反応を終結させ、ペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア（３０ｎｍ孔、５μｍの粒子）２５０×４．６ｍｍのカラムに適用し、Siegel等, Regul. Pept. 1999；79；93-103及びMentlein等, Eur. J. Biochem. 1993；214：829-35に従って、０．１％のトリフルオロ酢酸中に線形段階的勾配でアセトニトリルが入ったもの（３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０−２４％のアセトニトリル、１分間は２４−４８％のアセトニトリル）を、１ｍｌ／分の流量で溶出させる。ペプチドとその分解産物を、２２０ｎｍ（ペプチド結合）又は２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）の吸光度によりモニターし、標準のものに関連させてそれらのピーク面積を積分することにより定量する。ジペプチジルペプチダーゼＤＰＰ−ＩＶによるペプチドの加水分解速度は、加水分解されるペプチドが１０％未満になるインキュベーション時間で推定される。
その最も広い意味では、ここで使用される「ＧＬＰ−１アナログ」なる用語は、ペプチド又はエキセンディンのファミリーのアナログのグルカゴンファミリーの分子のアナログを意味する。ペプチドのグルカゴンファミリーはプレプログルカゴン遺伝子によってコードされ、相同性の高い３つの小ペプチド、つまり、グルカゴン（１−２９）、ＧＬＰ−１（１−３７）及びＧＬＰ−２（１−３３）を包含する。エキセンディンはトカゲに発現されたペプチドであり、ＧＬＰ−１のように、インスリン分泌性である。エキセンディンの例は、エキセンディン−３及びエキセンディン−４である。
ペプチドに言及してここで使用される「アナログ」なる用語は、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が該ペプチドから欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が該ペプチドに付加されている修飾されたペプチドを意味する。アミノ酸残基のかかる付加又は欠失は、ペプチドのＮ末端及び／又はペプチドのＣ末端で起こりうる。よって、本発明に係るＧＬＰ−１アナログは、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドに付加されている本発明に係るＧＬＰ−１のアナログ（１−３７）である。
本発明の目的では、任意のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加は、配列番号：１としてここに含まれるヒトＧＬＰ−１（７−３７）の配列に対するものを言う。しかしながら、列挙された配列のアミノ酸残基の番号付けは、常に１番から出発するが、本発明の目的において我々は、当該分野で確立されている実務に従い、アミノ酸残基７番から出発し、それに番号７を割り当てることを望む。よって一般的には、ＧＬＰ−１（７−３７）配列の位置番号に対するここでの任意の言及は、７位にあるＨｉｓから出発し、３７位のＧｌｙで終結する配列に対するものである。
ＧＬＰ−１アナログを記述するために簡単なシステムがしばしば使用される：例えば［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）Ｌｙｓは、３４位の自然に生じたリジンがアルギニンで置換され、リジンがＣ末端に付加されているＧＬＰ−１（７−３７）アナログを意味する。他の例の［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（１１−３７）は、３４位の自然に生じたリジンがアルギニンで置換され、７、８、９及び１０位のアミノ酸が存在しないＧＬＰ−１アナログを意味する。
修飾されたＧＬＰ−１（７−３７）配列を特徴付けるためにここで使用される「同等の位置」なる表現は、（配列番号：１の配列を有する）天然のＧＬＰ−１（７−３７）配列における対応位置を意味する。対応位置は、例えば簡単な筆記及び目視（ｅｙｅｂａｌｌｉｎｇ）により、容易に推測される。代替法として、標準的なタンパク質又はペプチドアラインメントプログラム、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントである「アライン（ａｌｉｇｎ）」を使用してもよい。該アルゴリズムは、Needleman, S.B. 及びWunsch, C.D.,(1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453に記載されており、またMyers 及び W. Miller、「Optimal Alignments in Linear Space」 CABIOS(computer applications in the biosciences)(1988) 4:11-17によるアラインプログラムである。アラインメントについて、デフォルトスコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ５０及びデフォルトアイデンティティマトリックスが使用されてもよく、ギャップにおける最初の残基についてのペナルティは−１２、ギャップにおける付加残基のペナルティは−２にセットしうる。
ペプチドに関してここで使用される「誘導体」なる用語は、少なくとも一の置換基がその未修飾のペプチド又はアナログに存在していない化学的に修飾されたペプチド又はそのアナログ、すなわち共有結合的に修飾されたペプチドを意味する。典型的な修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル等である。ＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体の例は、Ｎｅ２６−（ｇ−Ｇｌｕ（Ｎａ−ヘキサデカノイル）））−［Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ２６］）ＧＬＰ−１（７−３７）である。
光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸はＬ−異性体を意味するものと理解されなければならない。
本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大１７のアミノ酸が、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）に対して修飾（置換、欠失、付加又はその任意の組合せ）されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大１５のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大１０のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大８のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大７のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大６のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大５のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大４のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大３のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の最大２のアミノ酸が修飾されている。本発明の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログ中の１つのアミノ酸が修飾されている。
一実施態様では、ＧＬＰ−１アナログはインスリン分泌性剤である。
一実施態様では、ＧＬＰ−１アナログはＧＬＰ−１アゴニストである。
ここで使用される「ＧＬＰ−１アゴニスト」なる用語は、ヒトＧＬＰ−１レセプターを完全に又は亜部分的に活性化する任意のグルカゴン様ペプチドを意味する。好ましい実施態様では、「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、当該分野で知られた方法（例えばＷＯ９８／０８８７１参照）によって測定して、１μＭ以下、例えば１００ｎＭ以下の親和性定数（ＫＤ）又は作用強度（ＥＣ５０）をもって、ＧＬＰ−１レセプターに結合し、インスリン分泌活性を示す任意のグルカゴン様ペプチドであり、ここで、インスリン分泌活性は当業者に知られたインビボ又はインビトロアッセイで測定することができる。例えば、GLP-1アゴニストは、動物に投与され、インスリン濃度が経時的に測定されうる。
本発明の一態様では、本発明の薬学的組成物に含められるＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−１のアナログであり、ここで、アナログは少なくとも一の非タンパク新生ペプチドを含む。
本発明の一態様では、ＧＬＰ−１アナログは、Ａｉｂ８，２２，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，２２ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６，３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ２６Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｒｇ３４Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，３５Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２Ａｌａ３７Ｌｙｓ３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ８，２２，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｉｂ８，２２Ｌｙｓ３７ＧＬＰ−１（７−３８）からなる群から選択される。
本発明の一態様では、ＧＬＰ−１アナログは、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｐｈｅ（ｍ−ＣＦ３）２８］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ２０，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ｔｈｒ（Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ）３３，］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｌｙｓ３０］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６，Ｌｙｓ３１］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ２０，Ａｒｇ２６，２−ナフチルアラニン２８、Ｇｌｕ３０，］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４，］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ２０，Ａｒｇ２６、２−ナフチルアラニン１２、Ｇｌｕ３０，］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｌｙｓ３１，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−アミド、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ１８，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２６］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３５）、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ３３，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８，Ｌｙｓ２０，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（（７−３７）Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）
からなる群から選択される。
更に他の実施態様では、本発明の薬学的組成物に含められるＧＬＰ−１アナログは、ＧＬＰ−２のアナログであり、該アナログは少なくとも一の非タンパク新生ペプチドを含む。
更に他の実施態様では、ＧＬＰ−１アナログは、エキセンディン−４又はエキセンディン−３のアナログであり、該アナログは少なくとも一の非タンパク新生ペプチドを含む。エキセンディン並びにそのアナログの例はＷＯ９７／４６５８４、ＵＳ５４２４２８６及びＷＯ０１／０４１５６に開示されている。ＵＳ５４２４２８６はエキセンディンペプチドを用いたインスリン放出の刺激方法を記載している。開示されたエキセンディンペプチドは、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＸ（配列番号１２）を含み、ここで、Ｘ−Ｐ又はＹで、エキセンディン−３はＨＳＤＧＴＦＩＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１３）で、エキセンディン−４（１−３９）はＨＧＥＧＴＦＩＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２）である。ＷＯ９７／４６５８４はエキセンディンペプチドの切断型を記載している。開示されたペプチドは、インスリンの分泌及び生合成を増加させるが、グルカゴンのものは低減させる。ＷＯ０１／０４１５６はエキセンディン−４アナログ及び誘導体並びにこれらの分子の調製を記載している。
ここで使用される「エキセンディン−４ペプチド」なる用語は、エキセンディン−４（１−３９）（配列番号：２）、エキセンディン−４（１−３９）アナログ、エキセンディン−４（１−３９）誘導体又はエキセンディン−４（１−３９）アナログの誘導体、のインスリン分泌性断片、そのインスリン分泌性アナログ及びそのインスリン分泌性誘導体を意味する。エキセンディン−４のインスリン分泌性断片は、全配列をエキセンディン−４（配列番号：２）の配列に見出すことができ、少なくとも一の末端アミノ酸が欠失しているインスリン分泌性剤である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性断片の例は、エキセンディン−４（１−３８）及びエキセンディン−４（１−３１）である。
ある化合物のインスリン分泌性は、当該分野でよく知られているインビボ又はインビトロアッセイにより決定することができる。例えば、化合物を動物に投与し、インスリン濃度を経時的にモニターすることができる。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性アナログは、一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置き換えられており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が欠失されており、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が付加されている各分子を意味し、但し、該アナログは、インスリン分泌性であるか、インスリン分泌性化合物のプロドラッグである。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性アナログの例は、Ｓｅｒ２Ａｓｐ３−エキセンディン−４（１−３９）であり、ここで２及び３位のアミノ酸残基がそれぞれセリン及びアスパラギン酸で置き換えられている（この特定のアナログは、エキセンディン−３として、当該分野で知られている）。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性誘導体及びそのアナログは、当業者がこれらのペプチドのアナログであることを認めたもの、すなわち、親ペプチドに存在しない少なくとも一の置換を有するものであり、但し、該誘導体は、インスリン分泌性であるか、インスリン分泌性化合物のプロドラッグである。置換基の例は、アミド類、炭水化物、アルキル基、エステル、及び親油性置換基である。エキセンディン−４（１−３９）のインスリン分泌性誘導体及びそのアナログの例は、Ｔｙｒ３１−エキセンディン−４（１−３１）−アミドである。
ここで使用される「安定したエキセンディン−４化合物」なる用語は、化学的に修飾されたエキセンディン−４（１−３９）、つまり一般的な方法によって定量して、ヒトにおいて少なくとも１０時間のインビボ血漿排出半減期を示すアシル化エキセンディン−３又はアシル化エキセンディン−４アナログを意味する。
光学異性体が述べられていない全てのアミノ酸はＬ異性体を意味するものと理解されなければならない。
ここで使用される場合「インスリン分泌性剤」なる用語は、ヒトＧＬＰ−１レセプターのアゴニストである化合物、すなわち、ヒトＧＬＰ−１レセプターを含む適切な媒体（このような媒体の一つは以下に開示される）において、ｃＡＭＰの形成を刺激する化合物を意味する。
クローンされたヒトＧＬＰ−１レセプターを発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＢＨＫ−４６７−１２Ａ）を、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μＬ／ｍＬのストレプトマイシン、５％のウシ胎仔血清及び０．５ｍｇ／ｍＬのジェネテシンＧ−４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が添加されたＤＭＥＭ培地で増殖させた。細胞を、リン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、ヴェルセンを用いて収集した。バッファー１（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）においてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いてホモジナイズすることにより、細胞から細胞膜を調製した。ホモジネートを、４℃で１５分、４８０００×ｇで遠心分離した。洗浄手順をもう一回繰り返した。最終ペレットをバッファー２に懸濁させ、直ぐにアッセイに使用するか、又は−８０℃で保存した。
機能的レセプターアッセイを、インスリン分泌性剤による刺激に対する反応として、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を測定することにより、実施した。形成したｃＡＭＰを、アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）ＴＭｃＡＭＰキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により定量した。次の添加物：１ｍＭのＡＴＰ、１μＭのＧＴＰ、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．０１％のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、０．１％のＢＳＡ、６μｇの膜調製物、１５μｇ／ｍＬのアセプタービーズ、２０μｇ／ｍＬのドナービーズで、６ｎＭのビオチニル−ｃＡＭＰでプレインキュベートされたものと共に、全用量５０μＬのバッファー３（５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）内の、９６−ウェルマイクロタイタープレート半領域においてインキュベートを実施した。アゴニスト活性について試験される化合物を、バッファー３に溶解し、希釈した。各実験について、ＧＴＰは新たに調製した。室温で３時間、ゆっくりと攪拌しつつ、暗所でプレートをインキュベートし、続いてフュージョン（ＦｕｓｉｏｎＴＭ）機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において計数した。個々の化合物について、濃度−反応曲線をプロットし、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）バージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いた４パラメーターロジスティックモデルを使用し、ＥＣ５０値を推定した。
ここで使用される「半組換え」なる用語は、組換えプロセスによって、つまり宿主細胞の培養から、ＧＬＰ−１アナログの第一断片のような第一ペプチド断片を調製し、ついで、ペプチドの第一断片にペプチドの第二断片をカップリングさせる工程を含む方法を意味し、ここで、第二断片はする化学的に、つまり溶液中において、又は固相ペプチド化学法を使用して樹脂上で調製される。断片のカップリングは化学的に又は酵素的に実施されうる。
ここで使用される「発現された前躯体分子を分離させる」なる用語は、組換え的に生産された化合物の単離を含む任意の種類の分離を意味し、また宿主細胞を崩壊させ又は透過させることを含む。
従って、本発明は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
（ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
（ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
（ｉｉｉ）発現された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、
（ｉｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法に関する。
本文脈において、「ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子」なる用語は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エキセンディン−３又はエキセンディン−４ペプチドから誘導されるペプチド、つまり、Ｎ末端アミノ酸伸展の付加前のＧＬＰ−１アナログ配列として理解されなければならない。例としては、限定されないが、ヒトＧＬＰ−１（１１−３７）又はそのアナログ、ヒトＧＬＰ−１（９−３７）又はそのアナログ及びヒトＧＬＰ−１（８−３７）又はそのアナログが含まれる。
従って、一態様では、本発明に係るＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、配列番号１に示されたＧＬＰ−１（７−３７）配列から誘導されたＧＬＰ−１ペプチドを含む。
エキセンディン−４は、Ｇｉｌａ巨大トカゲ（アメリカドクトカゲ(Heloderma suspectum)及びメキシコドクトカゲ(Heloderma horridum))の毒液から単離された３９アミノ酸残基のペプチドである。このペプチドは、オーバーラップ領域においてＧＬＰ−１（７−３７）と５２％の相同性を共有する。エキセンディン−４は強力なＧＬＰ−１レセプターアゴニストであり、ヌに注射されたときにインスリン放出とその後の血糖値低下を刺激することがまた示されている。
よって、オーバーラップ領域におけるＧＬＰ−１（７−３７）との５２％の相同性のため、本発明に係るＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、ある実施態様では、配列番号２に示されたエキセンディン−４ペプチドから誘導されうる。
従って、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、更なる態様では、一般式：
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５（配列番号３）
（上式中、
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含みうる。
本発明の更なる態様では、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、一般式：
Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５（配列番号４）
（上式中、
Ｘａａ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり、
Ｘａａ１０はＧｌｙ又はＡｌａであり、
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在の場合、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含む前躯体分子のリストから選択される。
本発明の更なる態様では、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、一般式：
Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５（配列番号５）
（上式中、
Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
Ｘａａ１０はＧｌｙ又はＡｌａであり；
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在の場合、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含む前躯体分子から選択される。
本発明のＧＬＰ−１アナログ前躯体分子は、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む適切な宿主細胞を前躯体分子の発現に適した条件下で培養することにより、当業者に知られた一般的な方法及び原理を使用する組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードする核酸配列は、例えば自動ＤＮＡ合成機においてオリゴヌクレオチドを合成し、ついで精製し、アニールし、ライゲートさせ、核酸配列を適切なベクター中にクローニングすることにより、当該分野で良く知られている確立された標準的方法によって合成的に調製することができる。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードする核酸配列のクローニングは、例えば良く知られたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、行うことができる。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードする核酸配列は、組換えＤＮＡ手順を簡便に施すことができる任意のベクターであり得る組換え発現ベクター中に挿入される。ベクターの選択はしばしばそれが導入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは、自己複製ベクター、つまり染色体外体として存在し、その複製が染色体複製に独立であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（群）と共に複製されるものであってもよい。
細胞外産物の場合、上清のタンパク質性成分は、当該ポリペプチドのタイプに応じて、濾過、カラムクロマトグラフィー又は沈殿、例えば精密濾過法、限外濾過、等電沈殿、様々なクロマトグラフィー手順による精製、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等によって単離される。細胞内又は周辺質産物の場合は、培養培地から単離された細胞が崩壊され又は透過処理され、抽出されてポリペプチド産物又はその前躯体が回収される。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするＤＮＡ配列は、適切には、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来ものであってよい(例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF及びManiatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照)。また、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されているホスホアミダイト(phosphoamidite)法、又はMatthes等, EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載されている方法により、合成的に調製することもできる。またＤＮＡ配列は、例えばＵＳ４６８３２０２、又はSaiki等, Science 239 (1988),487-491に記載されているように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製することもできる。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするＤＮＡ配列は、便宜的に、組換えＤＮＡ手順が施されうる任意のベクターに挿入することができ、ベクターの選択は、しばしば、それが挿入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであってよく、その複製は染色体複製、例えばプラスミドとは無関係である。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、その内部に組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。
ベクターは、好ましくは、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするＤＮＡ配列が、プロモーターー等、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している発現ベクターである。プロモーターーは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞に対して同族又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されてもよい。種々の宿主細胞において本発明のペプチドをコードするＤＮＡの転写を方向付けるのに適切なプロモーターーの例は、例えば上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等、当該分野でよく知られている。
また、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーターー、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に結合されうる。本発明の組換えベクターは、当該宿主細胞において、ベクターが確実に複製するＤＮＡ配列を更に含みうる。
ベクターは、選択可能なマーカー、例えばその産物が遺伝子、宿主細胞における欠陥を補完し、薬剤、例えばアンピシリン、カイナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子をまた含みうる。大規模な製造に対しては、選択可能マーカーは好ましくは抗生物質耐性ではなく、例えばベクター中の抗生物質耐性遺伝子は、ベクターが大規模製造に使用される場合、好ましくは切除される。ベクターから抗生物質耐性遺伝子を除去する方法は当該分野で知られており、例えば、出典明示によりここに援用されるＵＳ６３５８７０５を参照のこと。
宿主細胞の分泌経路に本発明のＧＬＰ−１アナログの前躯体分子を向かわせるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プロプレ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクター中に提供されうる。分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームで、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５’に位置している。分泌シグナル配列は通常ペプチドに付随しているものでもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。
ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするＤＮＡ配列、プロモーターー及び場合によってはターミネーターー及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている（例えば上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等）。
ＤＮＡ配列又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子を生産可能な任意の細胞であってよく、限定されないが、哺乳動物宿主細胞、トリ宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞及び酵母宿主細胞を含む。よく知られており、当該分野で使用される適切な宿主細胞の例は、限定されるものではないが、出芽酵母、ピキア・パストリス及び他の酵母、大腸菌、枯草菌、及び蛍光菌又は哺乳類ＢＨＫ又はＣＨＯ細胞系である。
外来性核酸を宿主中に導入する方法は、当該分野でよく知られており、使用される宿主細胞で変動する。宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、ＧＬＰ−１前躯体分子を合成し、これは、続いて（宿主細胞がそれを培地中に分泌するならば）培養培地から又は（それが分泌されないならば）それを生産する宿主細胞から直接収集されうる。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は酵母細胞中で生産される。酵母発現宿主は、当該分野でよく知られており、限定されないが、出芽酵母、カンジダ・アルビカンス及びカンジダ・マルトーサ(C. maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(polymorpha), クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）及びクルイベロミセス・ラクチス(K. lactis)、ピキア・ギレリモンディイ(Pichia guillerimondii)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）、分裂酵母、及びアルカン資化酵母(Yarrowia lipolytica)を含む。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は細菌系において生産される。細菌発現宿主は当該分野でよく知られており、限定されないが、大腸菌、枯草菌、蛍光菌、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus cremoris)、及びストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)を含む。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は糸状菌において発現される。糸状菌宿主は、当該分野でよく知られており、限定されないが、パンカビ、アオカビ属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニデュランス、コウジカビ及びクロコウジカビを含む。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は昆虫細胞において生産される。発現系は、ネッタイシマカ、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica）、カイコ、キイロショウジョウバエ、ヨトウガ、及びイラクサギンウワバに対して開発されている。これらの細胞株の各々はタンパク質の発現の分野の当業者によって知られ、また利用可能である。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は他の高等真核細胞中で生産される。これらには、限定されないが、トリ細胞及び植物細胞、例えばコナミドリムシが含まれる。
一実施態様では、ＧＬＰ−１前駆体分子は哺乳動物宿主細胞株中で生産される。これらの例には、限定されないが、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞が含まれる。より具体的な例には、限定されないが、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞株（２９３）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）が含まれる。
適切な宿主細胞は当業者によって選択される。
宿主細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖させるのに適した任意の一般的な培地、例えば最少培地又は適切な栄養分を含む複合培地でありうる。適切な培地は市販の供給者から入手でき、又は刊行された処方（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ）に従って調製されうる。
細胞によって生産されるＧＬＰ−１アナログの前駆体分子は、ついで、遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離を含む一般的な手段によって培養ブロス又は培養培地から分離することができる。
上述のように、血漿ペプチダーゼジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−ＩＶ）に対して化合物をより耐性にするために、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展を発現されたＧＬＰ−１アナログ前躯体分子にカップリングさせることが本発明の態様である。
かかる非タンパク新生アミノ酸は、γ−カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニン及びＤ−グルタミン、Ｄ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス−アミノ−ヒスチジン、β−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロへプチル）カルボン酸、（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸、α−メチルプロリン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択されうる。デスアミノ−ヒスチジンは、アミノ基を含んでいないが、ここでは、分類と命名を容易にするために、非タンパク新生アミノ酸と呼ばれる。
本発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さは１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸又は４アミノ酸である。
本発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さは１アミノ酸、２アミノ酸又は４アミノ酸である。
本発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さは１アミノ酸又は２アミノ酸である。
本発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さは２アミノ酸である。
本発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さは１アミノ酸である。
Ｎ末端アミノ酸伸展のアミノ酸の全てが必ずしも非タンパク新生アミノ酸ではないことが考えられる。よって、ある態様では、Ｎ末端アミノ酸伸展は１、２、３又は４の非タンパク新生アミノ酸を含む。
発明の一態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展は、一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０
（上式中、
Ｘａａ７は、シ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され；
Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択され、
Ｘａａ９はＧｌｕ、Ａｓｐ、γ，γ−ジメチルＧｌｕ、β，β−ジメチルＧｌｕ及びβ，β−ジメチルＡｓｐから選択され、及び
Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、及び（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸から選択される）
を有する。
配列Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０の遊離のカルボン酸は、文献(Organic Synthesis solid Phase, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000), (Novabiochem Catalog, Merck Biosciences 2006/2007)及び(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Edited by W.C. Chan及びP.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5)に記載された適切な反応条件を使用し十分に保護されたビルディングブロックを使用して、Ｆｍｏｃベース方策によって、２−クロロトリチルクロリド樹脂のような樹脂上に又は溶液中に効率的に調製されうる。配列中のアミノ酸は保護され又は脱保護されうる。配列Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０のＮ末端伸展ペプチドは活性化されたアシル化剤に活性化されうる。「活性化された」アシル化剤なる用語は、例えば“Amide bond formation and peptide coupling" [Tetrahedron 61(46), 10827-10852 (2005)]に記載されているような一般的技術を使用して活性化されたアシル化剤を意味する。活性化されたエステルの例には、限定されないが、酸塩化物、酸臭化物、酸フッ化物、対称無水物、混合無水物、一般的なカルボジイミド、例えば限定されないが、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して活性化されたカルボン酸が含まれる。更に含まれるものは、限定されないが、上述のカルボジイミドと添加剤を使用するカルボン酸、例えば限定されないが、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、６−クロロ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＤｈｂｔＯＨ）である。また含まれるものは、限定されないが、ウロニウム塩又はホスホニウム塩で活性化されたカルボン酸、例えば限定されないが、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、（２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート）（ＴＣＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１−ベンゾトリアゾリオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ）である。他の活性化されたエステルには、限定されないが、文献 (Organic Synthesis on solid Phase, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000), (Novabiochem Catalog, Merck Biosciences 2006/2007)及び(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, W.C. Chan及びP.D. White編, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5)に記載された反応条件を使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル（ＮＨＳエステル）、ペンタフルオロフェノールエステル（ＰｆＰ−エステル）、２，４−ジニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）及びカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート（ＮＥＰＩＳ）、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はＨＯＢｔエステル又はその誘導体が含まれる。
一般式Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０を有するＮ末端伸展ペプチドの一例は、
Figure 0005726532
（上式中、R１及びＲ２は個々に選択される保護基、例えば限定されないが、カルバメートで、限定されないが９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）を含むもの；アミドで、限定されないが、ベンズアミドを含むもの；イミドで、限定されないが、Ｎ−フタルイミドを含むもの；及びアルキル類で、限定されないが、１−アダマンチル（１−Ａｄｏｃ）及びトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）を含むものである。）である。好ましい実施態様では、Ｒ１は９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）からなる群から選択され、Ｒ２はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）及びトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択される。Ｒ３は個々に選択される保護基、例えば限定されないが、エステルで、限定されないが、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル及び９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（Ｆｍ）を含むものである。好ましい実施態様では、Ｒ３はｔｅｒｔ−ブチル又はベンジルである。
対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化される配列Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０のＮ末端伸展ペプチドの一例は、
Figure 0005726532
（上式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、例えば上述のもののような個々に選択される保護基である）である。
本発明の更なる態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展は、一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８
（上式中、
Ｘａａ７はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され；及び
Ｘａａ８はＧｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択される）
を有している。
配列Ｘａａ７−Ｘａａ８の遊離カルボン酸は上に記載された適切な反応条件を使用し十分に保護されたビルディングブロックを使用して、例えばFmocベース方策によって、2-クロロトリチルクロリド樹脂のような樹脂上に効率的に調製されうるか、あるいはそれは溶液中に調製されうる。配列中のアミノ酸は保護され又は脱保護されうる。
配列Ｘａａ７−Ｘａａ８のＮ末端伸展ペプチドは上述の活性化されたアシル化剤に活性化されうる。
式Ｘａａ７−Ｘａａ８のＮ末端伸展ペプチドの例は、
Figure 0005726532
（上式中、Ｒ１及びＲ２は上述のような個々に選択される保護基である）である。
対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化された配列Ｘａａ７−Ｘａａ８のＮ末端伸展ペプチドの例は、
Figure 0005726532
（上式中、Ｒ１及びＲ２は上述のような個々に選択される保護基である）である。
本発明のまた更なる態様では、一の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展は、一般式Ｘａａ７
（上式中、
Ｘａａ７はＤ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択される）を有する。
配列Ｘａａ７の遊離カルボン酸は上に記載された適切な反応条件を使用し十分に保護されたビルディングブロックを使用して、例えば２−クロロトリチルクロリド樹脂のような樹脂上に効率的に調製されうるか、あるいは溶液中に調製されうる。配列中のアミノ酸は保護され又は脱保護されうる。
Ｎ末端伸展Ｘａａ７中のアミノ酸は、上述のように活性化されたアシル化剤に活性化されうる。
式Ｘａａ７のアミノ酸の例は、
Figure 0005726532
（上式中、Ｒ２は上述の保護基又は水素である）
である。
対応するＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化される式Ｘａａ７のアミノ酸の例は、
Figure 0005726532
である。
本発明の更なる態様では、本発明に従って製造されるＧＬＰ−１アナログは、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、上述の一般式Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０を有するＧＬＰ−１アナログであり；
該ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、上述の一般式
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５を有する。
本発明の更なる態様では、本発明に従って製造されるＧＬＰ−１アナログは、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、上述の一般式Ｘａａ７−Ｘａａ８を有するＧＬＰ−１アナログであり；
該ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、上述の一般式
Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５を有する。
本発明のまた更なる態様では、本発明に従って製造されるＧＬＰ−１アナログは、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、上述の一般式Ｘａａ７を有するＧＬＰ−１アナログであり；
該ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子は、上述の一般式
Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５を有する。
例えばＧＬＰ−１アナログ前躯体分子のような保護されていないポリペプチド断片への更なるアミノ酸アナログのカップリングは、使用された反応条件下で生じうる可能な多数の副反応のために些細な仕事ではない場合がある。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性エステルのような求電子試薬は一般にポリペプチド中に存在する求核試薬と反応する。かかる求核試薬はチオール類、アミン類、イミダゾール類、フェノール性ヒドロキシ基、アルコール類、及びグアニジン類でありうる。官能基に対するアシル化率は、個々の基の固有の反応性に依存するが、またポリペプチドの一次、二次、三次及び四次構造にさえ依存する。従って、ポリペプチド中の異なったアミノ酸部分の相対反応性を予測することは難しい場合が多い。実際、保護されていないポリペプチドへの反応は生成物の混合物を生じる。しかしながら、ポリペプチド中の個々の基の相対反応性は、ある場合には反応が実施される条件によって部分的に制御されうる。よって、反応混合物中のｐＨ変化により、幾つかの基の反応性が変更されうる。同様に、非プロトン性からプロトン性への溶媒変化により、幾つかの基の反応性が変更されうる。
本発明に係る方法では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のＧＬＰ−１前躯体分子へのカップリングは、ある有用な実施態様では、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドから選択される有機極性溶媒を含む溶媒中で生じうる。
他の有用な実施態様では、Ｎ末端アミノ酸伸展のカップリングは、水性溶媒混合物、例えば１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドから選択される溶媒の様な有機極性溶媒を含みうる水性溶媒混合物中で生じうる。
更に、本発明に係るＮ末端アミノ酸伸展のカップリングは、有用な実施態様では、反応混合物中のｐＨが６と１２の間、例えば７と１０の間である水性溶媒混合物中で生じることが見出された。更なる実施態様では、反応混合物中のｐＨは７−８、８−９、９−１０又は１０−１２の範囲にある。
先に記載したように、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展中のアミノ酸は一又は複数の保護基を含みうる。よって、本発明に係る方法は一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展からこれらの保護基の一又は複数を除去する一又は複数の工程を更に含みうることが考えられる。かかる脱保護工程は文献に十分に記載されている。
本発明に係る方法は、発現された前躯体分子又は発現された前躯体分子へのＮ末端伸展分子のカップリングから得られたＧＬＰ−１アナログ中の少なくとも一のリジン残基のεアミノ基をアシル化剤でアシル化する更なる工程を含みうる。
ある実施態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をＧＬＰ−１アナログ前躯体分子にカップリングするまえにこの工程を実施することが有用でありうる。よって、本発明に係る方法において使用されるＧＬＰ−１アナログ前躯体分子は、ある実施態様では、場合によっては、例えばリジン残基のイプシロン−アミノ−基で活性化された、アシル化剤でアシル化され得る。
よって、一態様では、本発明は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造する方法であって、
（ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
（ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
（ｉｉｉ）場合によっては、発現された前躯体分子中の少なくとも一のリジン残基のεアミノ基を、場合によっては活性化されるアシル化剤でアシル化して、前躯体分子誘導体を得、場合によっては該前躯体分子誘導体を単離し、
（ｉｖ）発現された前躯体分子又は前躯体分子誘導体に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、
（ｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法に関する。
本発明に係る方法は、少なくとも一のリジン残基のイプシロン−アミノ−基を上述のアミン保護剤で選択的に保護する工程を場合によっては更に含みうる。
ある実施態様では、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のＧＬＰ−１アナログ前躯体分子へのカップリングの前にこの保護工程を実施することが有利な場合がある。よって、本発明の該実施態様に係る方法において使用される得られたリジン保護されたＧＬＰ−１アナログ前躯体分子誘導体は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展にカップリングされうる。リジン保護されたＧＬＰ−１アナログ前躯体分子へのＮ末端アミノ酸伸展の該カップリングの後に、任意のリジンのイプシロンアミン基上の保護基が、一般的技術を使用して除去され得、リジンの得られたイプシロン−アミノ−基が場合によっては活性化されるアシル化剤で場合によってはアシル化されうる。
よって、一態様では、本発明は、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部に含むＧＬＰ−１アナログを製造する方法であって、
（ｉ）上記インスリン分泌性ペプチドの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
（ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
（ｉｉｉ）発現された前躯体分子中の少なくとも一のリジン残基のεアミノ基を保護剤で保護して保護された前躯体分子を得、場合によっては該保護された前躯体分子を単離し、
（ｉｖ）発現された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、場合によっては該保護されたＧＬＰ−１アナログを単離し、
（ｖ）イプシロンアミノ保護基を脱保護し、場合によっては得られたＧＬＰ−１アナログを単離し、
（ｖｉ）場合によっては、ＧＬＰ−１アナログ中の少なくとも一のリジン残基のイプシロン−アミノ−基を、場合によっては活性化されるアシル化剤でアシル化して前躯体分子誘導体を得、
（ｖｉｉ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を、当該分野で知られている適切な手段によって単離する
工程を含む方法に関する。
本発明の一態様では、リジン残基のイプシロン−アミノ−基のアシル化に使用されるアシル化剤は、一般式：
Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ
のカルボン酸アナログであり、ここで、一つの末端の遊離カルボン酸、例えばＡ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨの−ＯＨ基は、場合によっては活性化され、任意の他の含まれる遊離カルボン酸は場合によっては適切な保護基、例えば限定されないがｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル又はアリルから選択されるもので保護され、
ここで、
Ａは、
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｎは１４、１５、１６、１７、１８及び１９からなる群から選択され、ｐは１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択され、ｄは０、１、２、３、４及び５からなる群から選択され、及びｍは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７からなる群から選択され、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択され、Ｒ１は９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）−の群から選択され、
Ｂは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｘは０、１、２、３及び４からなる群から選択され、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択され、
Ｃは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｂ及びｅはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、ｃ及びｆはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、但し、ｃが０のとき、ｂは１又は２であり、又はｃが１または２のとき、ｂは０であり、ｆが０のとき、ｅは１又は２であり、又はｆが１又は２のときｅは０であり、Ｄは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、ここで、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択される。
発明の一態様では、リジン部分のε−Ｎのアシル化に使用される断片Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨは、上述の活性化されたアシル化剤に活性化されるカルボン酸誘導体である。
発明の一態様では、遊離の官能化学基、例えば断片Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨの断片Ａ又はＣ中に含まれるカルボン酸は、限定されないがｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル又はアリルから選択される適切な保護基で保護される。
ここで用いられる場合、ペプチド及び／又はカルボン酸のような官能化学基についてアシル化剤に関連して「含まれる」なる用語は、ペプチド又はアシル化剤中に存在する官能化学基を意味する。
カルボン酸誘導体は、(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Edited by W.C. Chan及びP.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5)に記載された反応条件を使用して十分に保護されたビルディングブロックを使用するＦｍｏｃベース方策によって、2-クロロトリチルクロリド樹脂のような樹脂上に効率的に調製されうる。
断片Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨの例は、
Figure 0005726532
である。
対応する活性化アナログはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでありうる；
Figure 0005726532
断片Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−の例は、
Figure 0005726532
Figure 0005726532
である。
断片Ａ−Ｃ−Ｄ−の例は、
Figure 0005726532
Figure 0005726532
である。
断片Ａ−Ｂ−Ｃ−の例は、
Figure 0005726532
である。
全ての特に述べた断片Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨにおいて、任意の含まれる遊離カルボン酸は、場合によっては、限定されないがｔｅｒｔ−ブチル、ベンジル又はアリルから選択される適切な保護基で保護されうる。
全ての特に述べた断片Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨにおいて、記載されていようといまいと、キラル中心は同じ断片中の他のキラル中心とは独立してＲ又はＳエナンチオマーでありうる。
一実施態様では、一又は複数のキラル中心が存在する場合、断はエナンチオマーの混合物の形態でありうる。
他の実施態様では、一又は複数のキラル中心が存在する場合、断片は、キラル中心の各々がＲかＳである純粋なエナンチオマーの形態であり得る。
他の実施態様では、キラリティーは本発明の特に述べられた断片に示される通りである。
発明の一態様では、リジンアミノ酸残基のεアミン保護基は、限定されないが、次の例から選択されうる：
Figure 0005726532
本発明に係る方法では、アシル化工程は、ある有用な実施態様では、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドから選択される有機極性溶媒を含む溶媒中で生じうる。
更なる実施態様では、アシル化工程は、有機極性溶媒を含む水性溶媒混合物のような水性溶媒混合物中で生じうる。かかる有機極性溶媒は、有利には、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドから選択されうる。
更なる実施態様では、アシル化工程は水溶液中で生じうる。
１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ−メチル−ホルムアミドの量は、ある実施態様では、該溶媒の量が８０％（ｖ／ｖ）未満、例えば５０％（ｖ／ｖ）未満であるようなものである。他の態様では、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ−メチル−ホルムアミドの量は４０−４５、４５−５０、５０−６０、６０−７０及び７０−８０％（ｖ／ｖ）の範囲を含む約４０−８０％（ｖ／ｖ）の範囲である。アシル化剤は固形物として反応混合物に添加されうることも更に考えられる。
アシル化工程が生じる水性溶媒混合物のｐＨ値は、有用な実施態様では、９と１３の間、例えば１０と１２の間、例えば１０．５と１１．５の間である。更なる実施態様では、反応混合物中のｐＨは９−１０、１０−１１、１１−１２又は１２−１３の範囲である。
本発明によって使用されるアシル化剤は、一又は複数の保護基を含みうる。よって、本発明に係る方法は、ＧＬＰ−１アナログ前躯体分子にひとたびカップリングがなされたら、アシル化剤からこれらの保護基の一又は複数を除去する一又は複数の工程を更に含みうることが考えられる。かかる脱保護工程は文献に十分に記載されている。
宿主細胞における効率的な異種タンパク質の発現には、タンパク質がプロペプチド、すなわち（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）分泌シグナル配列を有するポリペプチドの形態で発現されることがしばしば必要である。しかしながら、このリーダー配列は通常は所望のポリペプチドでは望まれず、よって、本発明に係る方法は、ある態様では、ＧＬＰ−１アナログ前躯体分子から末端及び／又はＣ末端プロペプチド伸展を除去する更なる工程を含む。
本発明に係る方法は、適切な手段、例えば当該分野で知られている標準的な精製法によって、得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を単離する工程を含む。
本発明に係る方法から得られるＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を、ある実施態様ではアルブミン結合部分で誘導体化するか又はペグ化することもまた本発明の範囲内にある。、
本発明のリーダー配列は図４に列挙された最適形態でありうる。
ここで使用される「アルブミン結合部分」なる用語は、ヒト血清アルブミンに非共有的に結合する残基を意味する。治療用ポリペプチドに結合されるアルブミン結合残基は、ヒト血清アルブミンに対して典型的には１０μＭ以下、好ましくは１μＭ以下の親和性を有している。遠い酸性基を有する４−４０の炭素原子を含む直鎖状及び分岐状親油性部分の中に、ある範囲のアルブミン結合残基が知られている。
発明の実施態様
１． 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
（ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
（ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
（ｉｉｉ）発現された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、
（ｉｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法。
２． 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
ｉｉｉ）前駆体分子のリジン基を保護し、
ｉｖ）保護された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせて、保護されたＧＬＰ−１アナログを得、
ｖ）上記ＧＬＰ−１アナログのリジン基を脱保護し、
ｉｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法。
３． Ｎ末端アミノ酸伸展が、カップリング工程におけるその使用前に保護され、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、保護された前駆体分子にカップリングされ、保護されたＧＬＰ−１アナログがＮ末端伸展のカップリング後に再び脱保護される実施態様１又は２に記載の方法。
４． 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
ｉｉｉ）発現された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含む保護されたＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせ、
ｉｖ）保護されたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体の保護基を脱保護し、
ｖ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法。
５． 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を製造するための方法であって、
ｉ）上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前躯体分子の発現に適した条件下で培養し、
ｉｉ）発現された前躯体分子を培養ブロスから分離し、
ｉｉｉ）前駆体分子のリジン基を保護し、
ｉｖ）保護された前躯体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含む保護されたＮ末端アミノ酸伸展をカップリングさせて、保護されたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を得、
ｖ）保護されたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体の保護基を脱保護し、
ｖｉ）得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する
工程を含む方法。
６． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子が、一般式：
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
（上式中、
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含む前躯体分子のリストから選択される方法。
７． 実施態様１−５の何れかに記載の方法において、上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子が、一般式：
Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
（上式中、
Ｘａａ９はＧｌｕ又はＡｓｐ
Ｘａａ１０はＧｌｙ又はＡｌａ
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含む前躯体分子のリストから選択される方法。
８． 実施態様１−５の何れか一項に記載の方法において、上記ＧＬＰ−１アナログの前躯体分子が、一般式：
Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
（上式中、
Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ
Ｘａａ９はＧｌｕ、Ａｓｐ
Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ａｌａ
Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
のアミノ酸配列を含む前躯体分子のリストから選択される方法。
９． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展中の非タンパク新生アミノ酸が、γ−カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニン及びＤ−グルタミン、Ｄ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス−アミノ−ヒスチジン、β−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロへプチル）カルボン酸、（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸、α−メチルプロリン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンからなる群から選択される方法。
１０． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さが１アミノ酸である方法。
１１． 実施態様１−９の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さが２アミノ酸である方法。
１２． 実施態様１−９の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さが３アミノ酸である方法。
１３． 実施態様１−９の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展の長さが４アミノ酸である方法。
１４． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸伸展が２つの非タンパク新生アミノ酸を含む方法。
１５． 実施態様１−１３の何れかに記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸伸展が３つの非タンパク新生アミノ酸を含む方法。
１６． 実施態様１−１３の何れかに記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸伸展が４つの非タンパク新生アミノ酸を含む方法。
１７． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０
（上式中、
Ｘａａ７はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され、
Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択され、
Ｘａａ９はＧｌｕ、Ａｓｐ、γ，γ−ジメチルＧｌｕ、β，β−ジメチルＧｌｕ及びβ，β−ジメチルＡｓｐから選択され、及び
Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、及び（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸から選択される）
を有している方法。
１８． 実施態様１−１６の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８
（上式中、
Ｘａａ７はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され；及び
Ｘａａ８はＧｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択される）
を有している方法。
１９． 実施態様１−１６の何れかに記載の方法において、一の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が一般式
Ｘａａ７
（上式中、Ｘａａ７はＤ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎａ−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択される）を有している方法。
２０． 実施態様１９に記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸伸展がデスアミノ−ヒスチジンであり、カップリング反応が、発現された前躯体分子と、４−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−エチル］−１Ｈ−イミダゾール−１−イウム塩、例えばトリフルオロ酢酸塩によって実施される方法。
２１． 実施態様１−５の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、実施態様１７に定義された一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０を有しており；
ＧＬＰ−１アナログが、実施態様３に定義された一般式
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
を有している方法。
２２． 実施態様１−５の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、実施態様８において定義された一般式
Ｘａａ７−Ｘａａ８を有し；
ＧＬＰ−１アナログが、実施態様４に定義された一般式
Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５を有している方法。
２３． 実施態様１−５の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展が、実施態様９に定義された一般式
Ｘａａ７を有し；
ＧＬＰ−１アナログが実施態様４に記載の一般式
Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５を有している方法。
２４． 実施態様１７−２３の何れかに記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸伸展Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０又はＸａａ７−Ｘａａ８中のＣ末端非タンパク新生又はタンパク新生アミノ酸あるいは非タンパク新生アミノ酸Ｘａａ７が活性化される方法。
２５． 実施態様２４に記載の方法において、活性化されたアミノ酸が、酸塩化物、酸臭化物、酸フッ化物、対称無水物、混合無水物、一般的なカルボジイミドを使用して活性化されたカルボン酸、カルボジイミド及び添加剤を使用するカルボン酸及びウロニウム塩又はホスホニウム塩で活性化されたカルボン酸からなる群から選択される方法。
２６． 実施態様２４に記載の方法において、活性化されたアミノ酸が、一般的なカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して活性化されたカルボン酸からなる群から選択される方法。
２７． 実施態様２４に記載の方法において、活性化されたアミノ酸が、カルボジイミドと、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、６−クロロ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）及び３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＤｈｂｔＯＨ）からなる群から選択される添加剤を使用するカルボン酸からなる群から選択される方法。
２８． 実施態様２４に記載の方法において、活性化されたアミノ酸が、ウロニウム塩又はホスホニウム塩、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１−ベンゾトリアゾリオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル（ＮＨＳエステル）、ペンタフルオロフェノールエステル（ＰｆＰ−エステル）、２，４−ジニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート（ＮＥＰＩＳ）で活性化されたカルボン酸からなる群から選択される方法。
２９． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドからなる群から選択される有機極性溶媒中で生じる方法。
３０． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが、水性溶媒混合物中で生じる方法。
３１． 実施態様３０に記載の方法において、水性溶媒混合物が、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドからなる群から選択される有機極性溶媒を含む方法。
３２． 実施態様３０又は３１に記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが水性溶媒混合物中で生じ、反応混合物中のｐＨが４と１２の間、好ましく６と１０の間である方法。
３３． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展中のアミノ酸が一又は複数の保護基を含む方法。
３４． 実施態様３３に記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含む上記Ｎ末端アミノ酸伸展から一又は複数の保護基を除去する工程を更に含む方法。
３５． 実施態様１に記載の方法において、発現された前躯体分子中の少なくとも一のリジン残基のεアミノ基をアシル化剤でアシル化する工程を更に含む方法。
３６． 実施態様３５に記載の方法において、アシル化剤が、活性化されていてもよく、及び／又は一又は複数の保護基で保護されていてもよい一般式
Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ
のカルボン酸アナログであり、
ここで、
Ａは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｎは１４、１５、１６、１７、１８及び１９からなる群から選択され、ｐは１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択され、ｄは０、１、２、３、４及び５からなる群から選択され、及びｍは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７からなる群から選択され、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択され、Ｒ１は９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）−の群から選択され、
Ｂは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｘは０、１、２、３及び４からなる群から選択され、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択され、
Ｃは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、
ここで、ｂ及びｅはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、ｃ及びｆはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、但し、ｃが０のとき、ｂは１又は２であり、又はｃが１または２のとき、ｂは０であり、ｆが０のとき、ｅは１又は２であり、又はｆが１又は２のときｅは０であり、
Ｄは
Figure 0005726532
からなる群から選択され、ここで、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択される方法。
３７． 実施態様３６に記載の方法において、カルボン酸Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨが活性化されたアシル化剤に活性化される方法。
３８． 実施態様３５に記載の方法において、上記アシル化工程が水性溶媒混合物中で生じる方法。
３９． 実施態様３８に記載の方法において、上記水性溶媒混合物が有機極性溶媒を含む方法。
４０． 実施態様３９に記載の方法において、上記有機極性溶媒が、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドからなる群から選択される方法。
４１． 実施態様４０に記載の方法において、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ−メチル−ホルムアミドの量が８０％（ｖ／ｖ）未満である方法。
４２． 実施態様４０に記載の方法において、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、N,N-ジメチルホルムアミド又はN-メチル−ホルムアミドの量が５０％（ｖ／ｖ）未満である方法。
４３． 実施態様４０に記載の方法において、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ−メチル−ホルムアミドの量が約４０−８０％（ｖ／ｖ）の範囲である方法。
４４． 実施態様３５に記載の方法において、アシル化剤が固形物として反応混合物に添加される方法。
４５． 実施態様３５に記載の方法において、上記アシル化工程が、水性溶媒混合物中で生じ、反応混合物中のｐＨが９と１３の間、好ましくは１０と１２の間、又は更により好ましくは１０．５と１１．５の間である方法。
４６． 実施態様３５に記載の方法において、活性化されていてもよいアシル化剤が，一又は複数の保護基を含む方法。
４７． 実施態様４６に記載の方法において、上記活性化されたアシル化剤から一又は複数の保護基を除去する工程を更に含む方法。
４８． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、得られた前躯体分子からＮ末端プロペプチド伸展を除去する工程を更に含む方法。
４９． 実施態様１−４７の何れかに記載の方法において、得られた前躯体分子からＣ末端プロペプチド伸展を除去する工程を更に含む方法。
５０． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である方法。
５１． 実施態様１−４９の何れかに記載の方法において、宿主細胞が細菌宿主細胞である方法。
５２． 実施態様１−４９の何れかに記載の方法において、宿主細胞が酵母宿主細胞である方法。
５３． 実施態様５２に記載の方法において、酵母宿主細胞が出芽酵母である方法。
５４． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、ＧＬＰ−１アナログが、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）、ヒトＧＬＰ−２、エキセンディン−３又はエキセンディン−４のアナログ又は誘導体である方法。
５５． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、ＧＬＰ−１アナログがヒトＧＬＰ−１（７−３７）のアナログ又は誘導体である方法。
５６． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、上記ＧＬＰ−１アナログが、
Ａｉｂ８−ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド、Ａｉｂ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ｇｌｕ３０，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｐｈｅ（ｍ−ＣＦ３）２８］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［ｄデスアミノＨｉｓ７，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
及びそのアナログからなる群から選択される方法。
５７． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、ＧＬＰ−１アナログが薬学的組成物中の唯一の生物学的に活性な物質である方法。
５８． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、ＧＬＰ−１アナログがエキセンディン−４アナログである方法。
５９． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、少なくとも一のリジン残基のイプシロン−アミノ−基を選択的に保護する工程を含む方法。
６０． 実施態様５９に記載の方法において、工程（ｉｉ）の後に、発現された前躯体分子を培養ブロスから分離する工程が添加される方法。
６１． 実施態様５９に記載の方法において、実施態様１に記載の工程（ｉｖ）の後に、得られたＧＬＰ−１アナログ又は誘導体を適切な手段によって単離する工程が添加される方法。
６２． 実施態様１９に記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸が、活性化されたアシル化剤４−｛３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル｝−１Ｈイミダゾール−１−イウム
Figure 0005726532
によって導入されたデスアミノ−ヒスチジンである方法。
６３． 実施態様１９に記載の方法において、Ｎ末端アミノ酸が、活性化されたアシル化剤４−｛３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル｝−１Ｈイミダゾール−１−イウムトリフルオロアセテート
Figure 0005726532
の使用により導入されたデスアミノ−ヒスチジンである方法。
６４． 先の実施態様の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドからなる群から選択される有機極性溶媒中で生じる方法。
６５． 実施態様１−６３の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが、水性溶媒混合物中で生じる方法。
６６． 実施態様６５に記載の方法において、水性溶媒混合物が、１−メチル−ピロリジン−２−オン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ−メチル−ホルムアミドからなる群から選択される有機極性溶媒を含む方法。
６７． 実施態様１−６３の何れかに記載の方法において、一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸展のカップリングが水性溶媒混合物中で生じ、反応混合物中のｐＨが７と１１の間、好ましくは８と１０の間である方法。
６８． 活性化されたアシル化剤４−｛３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル｝−１Ｈイミダゾール−１−イウム：
Figure 0005726532
の使用でインスリン分泌性剤にデス−アミノヒスチジンを導入する方法。
６９． 活性化されたアシル化剤４−｛３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル｝−１Ｈイミダゾール−１−イウムトリフルオロアセテート
Figure 0005726532
の使用でインスリン分泌性剤にデス−アミノヒスチジンを導入する方法。
以下、本発明を次の非限定的実施例及び図面により詳細に記載する。
使用される略語：
Ａｄｏｃ： アダマンチルオキシカルボニル
Ａｉｂ： α−アミノイソ酪酸
Ｂｏｃ： ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル
ＣＨ３ＣＮ： アセトニトリル
ＤＣＭ： ジクロロメタン
ＤＩＣ： ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ： ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド
ＥｔＯＡｃ： エチルアセテート
Ｅｔ２Ｏ： ジエチルエーテル
Ｆｍｏｃ： ９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ： ２−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル−）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ： ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｈ２Ｏ： 水
ＨＯＡｔ： １−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ： １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＭｅＣＮ： アセトニトリル
Ｍｔｔ： ４−メチルトリチル
ＭＷ： 分子量
ＮａＯＨ： 水酸化ナトリウム
ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＮＭＰ： １−メチル−ピロリジン−２−オン
ＯｔＢｕ： ｔｅｒｔブチルエステル
ＰｙＢｏＰ （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＰｙＢｒｏＰ ブロモ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ｒ．ｔ： 室温
ＯＳｕ： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ｔＢｕ： ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＢＭＥ： ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル
ＴＥＡ： トリエチルアミン
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
ＴＦＦＨ テトラメチルフルオロホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＩＰＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリチル，トリフェニルメチル
ＴＳＴＵ： Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
一般的方法
ペプチド調製のための一般的方法（方法Ａ）
ペプチドは、０．２５ｍｍｏｌ又は１．０ｍｍｏｌスケールでＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３３ペプチド合成機で、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）中でのＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル−）−１，１，３，３テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）又はＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）媒介カップリング及びＦｍｏｃ保護基の脱保護のＵＶモニタリングを用いる製造者提供のＦａｓｔＭｏｃ ＵＶプロトコルを使用して、Ｆｍｏｃ方策に従って合成することができる。Ｗａｎｇ又はトリチルベース樹脂を固形担体として使用することができ、使用された保護されたアミノ酸誘導体はＡＢＩ４３３Ａ合成機に適した予め計量されたカートリッジで供給される標準的なＦｍｏｃ−アミノ酸（例えばＡｎａｓｐｅｃ，又はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから供給）である。Ｎ末端アミノ酸はαアミノ基でＢｏｃ保護されている（例えばＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）ＯＨがＮ末端にＨｉｓを持つペプチドに使用される）。ペプチドの合成は、ある場合には、限定されないが、２−Ｆｍｏｃ−オキシ−４−メトキシベンジル又は２，４，６−トリメトキシベンジルのような、酸性条件下で切断されうる基を持つジペプチドアミド結合で保護されたジペプチドの使用によって改善されうる。セリン又はスレオニンがペプチド中に存在している場合には、疑似プロリンジペプチドを使用することができる（例えばＮｏｖｏｂｉｏｃｈｅｍ２００２／２００３又は更に新しい版のカタログ、又はＷ．Ｒ． Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）、Ｊ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．５、４０３を参照）。
ペプチド調製のための一般的方法（方法Ｂ）
ペプチド合成の一代替法は、マイクロ波ベースのＬｉｂｅｒｔｙペプチド合成機（ＣＥＭ Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）でのＦｍｏｃケミストリーによる。Ｗａｎｇ又はトリチルベース樹脂を固形担体として使用することができる。カップリングケミストリーは、ＮＭＰ中０．４Ｍで８−１０倍のモル過剰のアミノ酸溶液を使用してＮＭＰ中のＤＩＣ／ＨＯＡｔで実施される。カップリング条件は７０℃までで５分である。脱保護は７０℃までＮＭＰ中の５％ピペリジンで達成される。
ＧＬＰ−１前駆体分子は、当該ポリペプチドのタイプに応じて、例えば様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ等によって精製できる。
アシル化剤Ａ−ＯＨ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ及びＮ末端アミノ酸伸展Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０、Ｘａａ７−Ｘａａ８及びＸａａ７の調製のための一般的方法
必要なカルボン酸は、標準的Ｆｍｏｃ化学を使用して２−クロロトリチルクロリド樹脂で調製することができる。先ず、Ｆｍｏｃ保護されたアミノカルボン酸を、樹脂を適切な溶媒、例えばＮＭＰ、ＤＣＭ、ＤＭＦ等、好ましくはＤＣＭに膨潤させることによって２−クロロトリチルクロリド樹脂に結合させることができる。十分に保護されたＦｍｏｃアミノカルボン酸が、ＤＩＰＥＡ又はＴＥＡのような適切な塩基と共に添加され、樹脂が室温で例えば３０分のような適切な期間、撹拌される。樹脂は、ＮＭＰ、ＤＭＦ又はＤＣＭのような適切な溶媒で洗浄される。
Ｆｍｏｃ脱保護は、ＮＭＰ中のピペリジン、好ましくはＮＭＰ中の２０％ピペリジンを室温で１から３０分、典型的には１０分使用することにより達成され、その後に樹脂をＮＭＰ、ＤＭＦ又はＤＣＭで十分に洗浄する。該工程は、完全な脱保護が得られるまで、典型的には３回以上、繰り返される。
次のＦｍｏｃ保護されたアミノカルボン酸のカップリングは標準的なカップリング条件を使用して達成される；樹脂がＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＣＭ又はこれらの混合物のような溶媒中で膨潤させられる。ＮＭＰ、ＤＭＦ、ＤＣＭ又はこれらの混合物のような溶媒中のＦｍｏｃ保護アミノカルボン酸の他の溶液及びＨＯＢｔ又はＨＯＡｔにＤＩＣ又はその等価物を加える。この混合物を樹脂に加え、混合物にＤＩＰＥＡ又はＴＥＡを加え、混合物を室温で１から１６時間、典型的には３時間撹拌する。あるいは、混合物を１から６０分撹拌した後、ＤＩＰＥＡ又はＴＥＡを混合物に加える。カップリングがＴＮＢＳ試験、ニンヒドリン試験又はクロラニル試験によって完了していないと判断されると、ネガティブ試験まで工程が繰り返される。
あるいは、Ｆｍｏｃ保護アミノカルボン酸の活性化は、次のカップリング試薬；ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒＯＰ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ，又はＴＦＦＨを使用して達成することができる。
十分に保護されたＦｍｏｃ−アミノカルボン酸の更なる導入は、上記の手順を使用してなすことができる。カルボン酸誘導体の取り込みを含む最後のカップリング工程が、上述のカップリング条件を使用して導入される。
樹脂からの切断は、ＤＣＭ中の２０％トリフルオロエタノール、ＤＣＭ−ＴＩＰＳ−ＴＦＡ（９５．５：２．５：２）又はヘキサフルオロイソプロパノールで５分から３時間、樹脂を処理することにより達成することができ、完全に保護された誘導体が得られる。
樹脂からの切断はまた５分から３時間、ＴＦＡ−ＴＩＰＳ−水（９５：２．５：２．５）を使用することにより達成することができ、完全に脱保護された誘導体が得られる。
あるいは、誘導体は、文献に記載された標準的な手順を使用して溶液中で調製することができる。
適切に保護されたビルディングブロックは市販されており、又は文献に記載された手順を使用して調製されうる。
Ｘａａ７は市販されており、又は文献に記載された手順を介して調製されうる。
アシル化剤Ａ−ＯＨ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ及びＮ末端アミノ酸伸展Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０、Ｘａａ７−Ｘａａ８及びＸａａ７の活性化のための一般的方法
必要とされるアミノ酸の活性化は、文献に記載された標準的な手順を使用して達成することができる。活性なエステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが必要とされる場合、カルボン酸は、適切な溶媒、例えばＴＨＦ、酢酸エチル、ＮＭＰ又はＤＭＦに溶解される。Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートのような試薬が、ＤＩＰＥＡ又はＴＥＡのような塩基と共に溶液に添加される。混合物は、反応が完了するまで、典型的には３から１６時間、室温で撹拌される。あるいは、カルボン酸はＮ−ヒドロキシスクシンイミドと共に溶解され、ＤＩＣで処理されうる。生成混合物は更なる精製なしに直接使用することができ、又はそれに水性ワークアップを施すことができる。
精製
粗ペプチドは、Ｃ１８シリカを充填したカラムでの分取ＨＰＬＣによって精製した。乾燥後、粗ペプチドをＨ２Ｏ中の５０％酢酸に溶解させ、Ｈ２Ｏで希釈し、カラムに注入し、ついで水中ＣＨ３ＣＮ及び０．１％ＴＦＡ １０ｍｌ／分の勾配で４０℃で５０分、溶離させた。ペプチドを含む画分を集め、水での希釈後に凍結乾燥した。
分析
ＬＣＭＳ
ＬＣＭＳは、Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ１００ Ｓｉｎｇｌｅ四極子質量分析計からなる装置で実施した。機器制御及びデータ獲得はウィンドウ２０００コンピュータで動くＳｃｉｅｘ Ｓａｍｐｌｅコントロールソフトウェアによって行った。ＨＰＬＣポンプは、
Ａ： 水中０．０５％トリフルオロ酢酸
Ｂ： アセトニトリル中０．０５％トリフルオロ酢酸
を含む２つの溶離液リザーバに接続した。
分析は、アセトニトリルの勾配で溶離されたカラムに適切な容積の試料（好ましくは２０μｌ）を注入することによって室温で実施した。
使用したＨＰＬＣ条件、検出器設定及び質量分析計設定は次の表にまとめる：
カラム： Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ−１８Ｘ３ｍｍ内径５μｍ
勾配： ５％−９０％アセトニトリル線形、７．５分、１．５ｍｌ／分
検出： ２１０ｎｍ（ＤＡＤからのアナログ出力）
ＥＬＳ （ＥＬＳからのアナログ出力）：４０℃
ＭＳイオン化モード： ＡＰＩ−ＥＳ
ＨＰＬＣ
方法０１＿Ｂ４＿２： ＲＰ−分析を、ウォーターズ９９６ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ６００Ｓシステムを使用して実施した。４２℃で、シンメトリー（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ）３００Ｃ１８、５μｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍカラムを使用し、２１４ｎｍと２５４ｎｍでのＵＶ検出を収集した。１．０ｍｌ／分の流量で、１５分以上かけ、５−９５％のアセトニトリル、９０−０％の水、及び５％のトリフルオロ酢酸（１．０％）の線形勾配を用いて溶出させた。
方法０２＿Ｂ４＿４： ＲＰ−分析を、ウォーターズ２４８７二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ２６９５システムを使用して実施した。４２℃で、シンメトリー３００Ｃ１８、５μｍ、３．９ｍｍ×１５０ｍｍカラムを使用し、２１４ｎｍと２５４ｎｍでのＵＶ検出を収集した。１．０ｍｌ／分の流量で、１５分以上かけ、５−９５％のアセトニトリル、９０−０％の水、及び５％のトリフルオロ酢酸（１．０％）の線形勾配を用いて溶出させた。
実施例１
酵母発現系の構築とＧＬＰ−１アナログ前駆体分子（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）の生産
発現プラスミドは、Ｃ−ＰＯＴタイプのものであり、ＥＰ１７１１４２に記載のものと類似している。これらは、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での安定性及びプラスミド選別の目的で分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＰＯＴ）を含有することを特徴とする２μベースの発現ベクターである。また、プラスミドは、出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼプロモーターー及びターミネーターーを含んでいる。これらの配列は、１）リーダーとインスリン生成物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の配列、２）サイレント変異が導入され、発現ベクター中の２μ領域のＮｃｏＩ部位が除去されていることを除き、全ての配列が、プラスミドｐＫＦＮ１００３（ＷＯ９０１０００７５に記載）の対応配列と類似している。異なる融合タンパク質のクローニングを容易にするために、ＭＦａ１プレプロリーダーをコードするＤＮＡ配列が変化させられてＮｃｏＩ部位（図２参照）が導入され、ＭＦａ１＊プレプロリーダーと呼ばれる。よって、ＮｃｏＩ−Ｘｂａｌ断片が、興味あるＧＬＰ−１前躯体分子をコードするＮｃｏＩ−Ｘｂａｌ断片によって単に置き換えられている。かかるＮｃｏＩ−Ｘｂａｌ断片は標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを使用して合成することができる。α−リーダーに加えて、他のリーダーを使用することができる。
（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）、（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８及び（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）をコードする配列を含む合成ＤＮＡ断片を、Geneart AG, BioPark, Josef-Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Germanyから取得した。（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８及び（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）をコードする合成ＤＮＡには、酵母での発現を容易にするために（図２）、Ｎ末端及びＣ末端伸展をコードする３’及び５’ＤＮＡ配列が備えられ、Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８−Ｅｘｔ２及びＥｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）−Ｅｘｔ２と名付けた。合成ＤＮＡをＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化させ、修飾されたｃＰＯＴタイプの発現ベクターのＮｃｏＩ−ＸｂａＩベクター断片に結合させた（図１）。これにより、それぞれ（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）（配列番号６）、Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８−Ｅｘｔ２（配列番号７）及びＥｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）−Ｅｘｔ２（配列番号８）をコードする３種の発現プラスミドｐＳＡ２７３、ｐＳＡ２７７及びｐＳＡ２７８が得られた。
発現プラスミドを、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）を使用して、大腸菌中で増殖させ、アンピシリンの存在下で成長させ、単離した。プラスミドＤＮＡを挿入のために適切な制限ヌクレアーゼ（例えばＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ）によってチェックし、配列解析によってＧＬＰ−１アナログ前躯体分子（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）、Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８−Ｅｘｔ２及びＥｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）−Ｅｘｔ２の適切な配列を含むことが示された（図２）。
プラスミドを出芽酵母株ＭＥ１７１９（ＭＡＴａ／αｌｅｕ２／ｌｅｕ２ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２Δｕｒａ３／Δｕｒａ３Δｙｐｓ１：：ＵＲＡ３／Δｙｐｓ１：：ｕｒａ３Ｃｉｒ＋）中に形質転換した。この株はＷＯ９８／０１５３５に記載されている。プラスミドを有する酵母形質転換体を、ＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）寒天（２％）プレート上の炭素源としてグルコース利用によって選択した。これによって３つの酵母株：（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）（配列番号９）、Ｅｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８−Ｅｘｔ２（配列番号１０）及びＥｘｔ１−（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）−Ｅｘｔ２（配列番号１１）を発現するｙＳＡ２５１、ｙＳＡ２５９及びｙＳＡ２６０がそれぞれ得られた。
ＭＥ１７１９酵母株ｙＳＡ２５１、ｙＳＡ２５９及びｙＳＡ２６０を５ｍｌの増殖培地、例えば、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１８４ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、２．８８ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、１．４２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ． ７Ｈ２Ｏ、１．２８ｇ／Ｌ、Ｋ２ＳＯ４、１０．００ｇ／Ｌ コハク酸、１０．００ｇ／Ｌ カザミノ酸、０．０１１２ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、０．００８６ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４ ．Ｈ２Ｏ、０．００１４ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、０．００１８５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４ ．７Ｈ２Ｏ、０．０１２９ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．０７１ｇ／Ｌ クエン酸、２８．０ｍｇ／Ｌ ｍ−イノシトール、１４．０ｍｇ／Ｌ 塩化コリン、２．８ｍｇ／Ｌ チアミン、２．８ｍｇ／Ｌ ナイアシンアミド、２．１ｍｇ／Ｌ Ｃａ−パントテン酸、０．１４ｍｇ／Ｌ ビオチン、０．１４ｍｇ／Ｌ 葉酸、４０ｇ／Ｌ グルコースからなる培地中に播種した。培養を３０℃で３日間、実施した。遠心分離後、上清を定量的ＨＰＬＣ分析のために除去し、この方法で分泌されたＧＬＰ−１アナログの濃度を測定した。ＧＬＰ−１前駆体分子の同一性をＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４）ＧＬＰ−１（８−３７）Ｋ３８及び（Ｅ２２，Ｒ２６，Ｒ３４，Ｋ３７）ＧＬＰ−１（８−３７）の発現を容易にするために用いたＮ末端及びＣ末端伸展を、十分に確立された手順に従って、リジン特異的アクロモバクター溶菌性プロテアーゼ１によって除去した。
実施例２
酵母発現系の構築及びＧＬＰ−１アナログ前躯体分子（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）の生産
（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）をコードする合成ＤＮＡ断片を、プライマー５’−ＡＧＧＧＧＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−３’及び５’−ＡＡＴＣＴＴＡＧＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧ−３’及び（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（７−３７）をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドを使用する標準的ＰＣＲによって構築した。プライマーは５’ＮｃｏＩ部位及び３’ＸｂａＩ部位と設計した。よって、ＰＣＲ断片は精製後にＮｃｏＩ及びＸｂａＩによって消化され得、実施例１に記載の修飾されたｃＰＯＴタイプの発現ベクターのＮｃｏＩ−ＸｂａＩベクター断片にライゲートできた。（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）をコードする得られたベクターはｐＳＡ８２と名付けた。
発現プラスミドを、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）を使用して、大腸菌中で増殖させ、アンピシリンの存在下で成長させ、単離した。プラスミドＤＮＡを挿入のために適切な制限ヌクレアーゼ（例えばＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ）によってチェックし、配列解析によってＧＬＰ−１アナログ前躯体分子（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）の適切な配列を含むことが示された。
プラスミドを出芽酵母株ＭＥ１７１９中に形質転換し、ラスミドを有する酵母形質転換体を、実施例１に記載されたようにして選択した。（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）を発現する得られた酵母株をｙＳＡ９６と名付けた。
酵母株を増殖培地中で培養し、（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）を、実施例１に記載されたようにして培地から回収した。
実施例３
ＧＬＰ−１前躯体のための酵母発現系の構築
リーダー及びＫｅｘ２ｐ切断部位を、プロセシングされた分泌ペプチドの発現収率を増強するために最適化した。様々なリーダー及び（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）、又は（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（９−３７）コンストラクトをコードする合成ＤＮＡ断片を標準的なＰＣＲによって増幅させた。順方向プライマーは、最適化リーダー配列をコードする配列及びＮｃｏＩ−部位を含んでいた。逆方向プライマーはＸｂａＩ−部位を含んでいた。よって、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ制限ＰＣＲ断片のＮｃｏＩ−ＸｂａＩへのクローニングの許容は、ｃＰＯＴ−タイプ発現ベクターを制限した。配列、（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）コード化発現コンストラクトのプラスミド番号付け及び株名については図４を参照のこと。
発現プラスミドを、標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）を使用して、アンピシリンの存在下で大腸菌中で増殖させ、単離した。プラスミドコンストラクトは、適切な制限酵素を使用する制限エンドヌクレアーゼ消化によって検査した。コード配列は実証した配列であった。
プラスミドを出芽酵母株ＭＥ１７１９に形質転換した。プラスミドを有する酵母細胞を実施例に記載されたようにして選択した。酵母株の培養は本質的に実施例１に記載された通りとした。
Ｋｅｘ２ｐ切断部位の近く配列Ｐ１からＰ６の最適化は中程度の収率増加を生じた（図４：Ｂ）。配列（Ｐ３からＰ６）におけるプロリンの導入を、Ｋｅｘ２ｐ切断部位のＫｅｘ２ｐへの暴露増加の潜在的手段として探求した。しかしながら、これは、（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）の場合はそうではないが、有益な効果が（Ｒ３４）ＧＬＰ−１（１１−３７）（図４：Ｈ、Ｉ）に対して観察された。残基Ｐ７からＰ１１の変異は発現収率について顕著な効果を有しており、２−２．５倍の増加が、荷電アミノ酸を含むモチーフを導入したとき観察された（図４：Ｍ−Ｚ、Ｋ５−７、Ｌ２−４）。一連のコンストラクトを、下流のプロセスにおいて（図４：Ｇ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）、ＤＡＰ−１（ジペプチジルアミノペプチダーゼ）でのプロセシングに対して設計した。コンストラクトＪ及びＬは、ＧＬＰ−１ペプチドのＤＡＰ−１による乱雑な切断に対して保護するためにＴｈｒ−１１の前の位置にＱを含んでいた。このＧｌｎは、ついで、酵素Ｑ−シクラーゼ及びｐＧＡＰａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して除去することができる。
Figure 0005726532
実施例４
Ｎ末端伸展Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨの調製
Figure 0005726532
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１％ＤＶＢ、１．４ｍｍｏｌ／ｇ、１０ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ中で予め膨潤させた後、それに１００ｍＬ ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（８．３ｇ、２８ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９．０３ｇ、７０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、室温で３０分攪拌した。樹脂をＮＭＰ（２×１００ｍＬ）及び２×１００ｍＬ ＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＤＩＰＥＡ（８０：１５：５、１０分）と、ついでＮＭＰ（３×１００ｍＬ）で洗浄した後、ＮＭＰ（３×１００ｍＬ）中の２０％ピペリジンで各１０分間処理した。樹脂をＮＭＰ（６×１００ｍＬ）、ＤＣＭ（２×１００ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させた。樹脂を、１００ｍＬのＮＭＰ中２０％ピペリジンで１０分間処理した。該工程を２回繰り返した後、ＮＭＰ（５×１００ｍＬ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−ＯＨ（２３．８ｇ、５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＮＭＰ及び２０ｍＬのＣＭの混合物に溶解させた。ＨＯＡｔ（７．６２ｇ、５６ｍｍｏｌ）を添加した後、ＤＩＣ（７．０７ｇ、５６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を１５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（９．０３ｇ、７０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を樹脂に移した。樹脂を１６時間撹拌した後、それをＮＭＰ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。樹脂を、ＮＭＰ（１００ｍＬ）中の２０％ピペリジンで１０分間処理した。該工程を２回繰り返した後、ＮＭＰ（５×１００ｍＬ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ（１８．２２ｇ、５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＮＭＰ及び２０ｍＬのＤＣＭの混合物に溶解させた。ＨＯＡｔ（７．６２ｇ、５６ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＩＣ（７．０７ｇ、５６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を２０分撹拌した後、それを樹脂に加えた。混合物を３０分撹拌した後、ＤＩＰＥＡを加えた。混合物を１６時間攪拌した後、樹脂をＮＭＰ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。樹脂をＮＭＰ（１００ｍＬ）中の２０％ピペリジンで１０分間処理した。該工程を２回繰り返した後、それをＮＭＰ（５×１００ｍＬ）で洗浄した。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１９．９ｇ、５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのＮＭＰ及び２０ｍＬのＤＣＭの混合物に溶解させた。ＨＯＡｔ（７．６２ｇ、５６ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＩＣ（７．０７ｇ、５６ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。混合物を２０分間攪拌した後、それを樹脂に加えた。混合物を３０分撹拌した後、ＤＩＰＥＡを加えた。混合物を１６時間攪拌した後、樹脂をＮＭＰ（３×１００ｍＬ）、ＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。
トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、１２５ｍＬ）を加え、樹脂を１時間撹拌した。濾液を集め、トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、１２５ｍＬ）を一部加え、１５分撹拌した。濾液を集め、溶媒を真空下で除去して清澄な油を得た。氷冷ジエチルエーテル（３００ｍＬ）を加えたところで、白色沈殿物が形成された。軽油エーテル（１００ｍＬ）を加え、沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥させた。
収量：７．３ｇ
ＨＰＬＣ（方法０１＿Ｂ４）：Ｒｔ＝７．８分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝９４４（Ｍ＋Ｈ）＋
算定ＭＷ＝９４３．２
実施例５
Ｎ末端伸展Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＳｕｃの調製
Figure 0005726532
無水ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．０ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（０．４７ｇ、３．６６ｍｍｏｌ）及びＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．１０ｇ、３．６６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。ジクロロメタン（２５０ｍＬ）を加え、溶液をＨ２Ｏ（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して、１．１ｇのＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＳｕを得た。
ＨＰＬＣ（方法０１＿Ｂ４）：Ｒｔ＝８．３分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝７８０．９（Ｍ＋Ｈ）＋
算定ＭＷ＝７７９．９
実施例６
アシル化剤１７−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製
Figure 0005726532
表題化合物を、上に記載され実施例４と同様のアシル化剤Ａ−ＯＨ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨの調製と活性化の一般方法によって調製した。
ＨＰＬＣ（方法０１＿Ｂ４）：Ｒｔ＝１６．２分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝９４４（Ｍ＋Ｈ）＋
算定ＭＷ＝９４３．２
実施例７
アシル化剤１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）−ヘプタデカン酸の調製
Figure 0005726532
１７−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］−エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルをＴＦＡに溶解させ、得られた溶液を２時間撹拌し、真空で蒸発させて乾固させた。得られた油をトルエンと共に３回、共蒸発させて乾固し、油性残留物を得た。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝８３１（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例８
ＧＬＰ−１誘導体［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（１１−３７）−Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）の調製
Figure 0005726532
［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−（１１−３７）（５０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を２ｍＬの水に加え、ＤＩＰＥＡ（８９μＬ、０．５１ｍｍｏｌ）を加えた。ｐＨが１０．６と測定される前に、混合物を１０分撹拌した。ついで、ＭｅＣＮ（１．５ｍＬ）中の１７−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２０．５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液を１０分かけて滴下して加えた。反応混合物を１時間撹拌した後、ＭｅＣＮを除去し、溶液を凍結乾燥した。
得られた残留物をＮＭＰ（２ｍＬ）に溶解し、ついでＤＩＰＥＡ（２２μＬ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（２６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４時間撹拌した後、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（１３ｍｇ０．０１７ｍｍｏｌ）の更なる部分を加え、反応混合物を一晩撹拌した。氷冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加えたところ、白色沈殿物が形成された。該沈殿物を遠心分離によって分離し、上清をデカントした。沈殿物を１０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄し、空気中で乾燥させた。
脱保護
粗中間体をＴＦＡ−トリイソプロピルシラン−Ｈ２Ｏ（９５：２．５：２．５、１０ｍＬ）に溶解し、３時間撹拌したところで、溶液を約１ｍＬまで真空濃縮した。氷冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を加えたところで、沈殿物が形成された。沈殿物を遠心分離によって単離し、上清をデカントした。沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。粗化合物を酢酸−Ｈ２Ｏ（３：７）（１０ｍＬ）に溶解し、ＨＰＬＣで精製した。
ＨＰＬＣ（方法０２＿Ｂ４）：Ｒｔ＝９．６分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７２．５（Ｍ＋３Ｈ）３＋
算定ＭＷ＝４１１３．７
実施例９
ＧＬＰ−１誘導体Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヘプタデカノイル−アミノ）−４（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）アセチル］−［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（９−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
ＮＭＰ（２．０ｍｌ）中の１７−｛（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−［２−（２−｛［２−（２−カルボキシメトキシエトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピルカルバモイル｝ヘプタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９４．０ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）の溶液にＯ−（１−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＴＳＴＵ、４１．７ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（９６．０μｌ、０．６９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分撹拌した後、水（９ｍＬ）及びＴＥＡ（９６．０μｌ、０．６９ｍｍｏｌ）中の［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（９−３７）ペプチド（２２０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の溶液に、混合物を滴下して加えた。室温で更に３０分間攪拌した後、混合物を水（３０ｍｌ）で希釈し、１６時間凍結乾燥して、油／非晶質混合物を得、これを酢酸−アセトニトリル−水の混合物（３０：２０：５０、１８０ｍｌ）に溶解させ、濾過し、ＨＰＬＣにより精製して、Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヘプタデカノイル−アミノ）−４（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）アセチル］−［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（９−３７）ペプチドを得た。
ＨＰＬＣ（方法０２＿Ｂ４＿４）：Ｒｔ＝１２．１分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１３３５．５（Ｍ＋３Ｈ）３＋
算定ＭＷ＝４００３．６
実施例１０
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ）−ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］−エトキシ｝エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
ＮＭＰ（２．０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ（２３ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（１Ｈ−９−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、２０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２９μｌ、０．２０８ｍｍｏｌ）を加えた。４５分撹拌後、混合物をＮ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）−エトキシ］エトキシ）アセチル］−［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（９−３７）ペプチド（８３ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ３．６ｕｌ、０．０２６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。１４日間攪拌した後、反応混合物を水（１００ｍｌ）で希釈し、ＨＰＬＣによって精製した。精製した画分をプールし、有機溶媒を真空除去した後、残留物を１６時間凍結乾燥した。
残留物にトリフルオロ酢酸−トリイソプロピルシラン−水（９４：３：３，１０ｍｌ）の混合物を加えた。２時間撹拌後、反応混合物を真空蒸発させ、残留物を水−アンモニア（９９：１，１００ｍｌ）の混合物に溶解させ、分取ＨＰＬＣによって精製して、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ（方法０２＿Ｂ４＿４）：Ｒｔ＝９．４分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７２（Ｍ＋３Ｈ）３＋
計算ＭＷ＝４１１３．７
実施例１１
アシル化剤２０−［４−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）ピペリジン−１−イル］−２０−オキソ−イコ酸ｔｅｒｔブチルエステルの調製
Figure 0005726532
表題化合物を、上述した実施例４と同様のアシル化剤Ａ−ＯＨ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨの調製及び活性化の一般方法によって調整した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１１１１（Ｍ＋Ｈ）＋
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１０８２．６（Ｍ＋Ｈ）＋
算定ＭＷ＝１０８２．４
実施例１２
ＧＬＰ−１アナログ［デスアミノ−Ｈｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，３４，Ｌｙｓ３７（Ｌｙｓ（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（（Ｓ）−４−カルボキシ−４−｛［１−（１９−カルボキシノナデカノイル）ピペリジン−４−カルボニル］アミノ｝−ブチリルアミノ）エトキシ］−エトキシ｝−アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチル）］−ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
２ｍＬ水中の［Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（８−３７）ペプチド（４６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（５０．４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１０分間攪拌した後、１ｍＬのＭｅＣＮ中の２０−［４−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−ピペリジン−１−イル］−２０−オキソ−イコ酸ｔｅｒｔブチルエステル（３２．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液を１５分の時間をかけて滴下して加えた。反応混合物を２０分間攪拌した後、水（２０ｍＬ）を加え、溶液を凍結乾燥させた。
得られた残留物をＮＭＰ（１ｍＬ）に溶解させ、４−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−エチル］−イミダゾール−１−カルボン酸アダマンタン−１−イルエステル（Ａｄｏｃ−デスアミノＨｉｓ−ＯＳｕエステル）混合物を３時間攪拌した後、それを滴下して氷冷ジエチルエーテル（２０ｍＬ）に加えた。白色沈殿物を遠心分離によって単離し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で２回洗浄し、乾燥させた。
得られた残留物をＴＦＡ−ＴＩＰＳ−水（９５：２．５：２．５、１ｍＬ）で３時間処理した後、それを滴下して氷冷ジエチルエーテル（１０ｍＬ）に加えた。白色沈殿物を遠心分離によって単離し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で２回洗浄した。三流物を分取ＨＰＬＣによって精製して、表題化合物を得た。
ＨＰＬＣ（方法０１＿Ｂ４＿２）：Ｒｔ＝１１．１分
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１４８４（Ｍ＋３Ｈ）３＋
算定ＭＷ＝４４５２．１
実施例１３
４−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）エチル］イミダゾール−１−カルボン酸アダマンタン−１−イルエステルの調製
Figure 0005726532
４−（２−カルボキシエチル）イミダゾール−１−カルボン酸アダマンタン−１−イルエステル（１ｇ、３．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた。溶液を０℃に冷却し、ＴＳＴＵ及びＤＩＥＡを加えた。溶液を０℃で１時間、室温で１６時間、撹拌した。試料を真空下で濃縮させた。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加え、溶液を０．２ＮのＨＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、真空で濃縮して、粘着性の結晶残留物（１．１８ｇ、９０％収率）を得た。粗生成物を更なる精製なしに使用した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝４１６．２（Ｍ＋Ｈ）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ）（選択されたシグナル）δ ８．２２（ｓ、１Ｈ）、７．３７（ｓ、１Ｈ）、３．０２（ｔ、２Ｈ）、２．８２−２．８８（ｍ、２Ｈ）、２．８１（ｓ、４Ｈ）、２．１９（ｓ−ｂｒ、９Ｈ）、１．６６（ｓ、６Ｈ）。
実施例１４
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン３７｛２−［２−（２−｛２−［２−（（Ｒ）−３−カルボキシ−３−｛［１−（１９−カルボキシノナデカノイル）ピペリジン−４−カルボニル］アミノ｝プロピオニルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチル［Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６，３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（８−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
ＧＬＰ−１アナログを、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ｗａｎｇ樹脂を用いて開始し、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙペプチド合成機を使用して調製した。Ａｌａ８からのＦｍｏｃ基を除去した後、Ｎ末端を、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートでの２重カップリングを実施することによって保護した。樹脂をＤＣＭで洗浄し、樹脂を室温でヘキサフルオロイソプロパノールで１５分間処理し、樹脂をＤＣＭで洗浄することによって、Ｍｔｔ基を除去した。Ｎ−イプシロン３７の修飾物を、Ｆｍｏｃ保護試薬及びエイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを使用してＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔペプチド合成機で調製した。粗ペプチドを樹脂ＴＦＡ−ＴＩＰＳ−水（９５：２．５：２．５）から切断し、氷冷エーテル中に沈殿させ、遠心分離によって単離し、粗ペプチドを分取ＨＰＬＣ（４ｃｍ径×２００ｍｍ、Ｃ１８、６０ｍＬ／分、３３−５３％アセトニトリル）によって精製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１０６５．８（Ｍ＋４Ｈ）４＋
実施例１５
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン３７｛２−［２−（２−｛２−［２−（（Ｒ）−３−カルボキシ−３−｛［１−（１９−カルボキシノナデカノイル）ピペリジン−４−カルボニル］アミノ｝プロピオニルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチル［デスアミノ−Ｈｉｓ（Ａｄｏｃ）７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６，３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの調製
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン３７｛２−［２−（２−｛２−［２−（（Ｒ）−３−カルボキシ−３−｛［１−（１９−カルボキシノナデカノイル）ピペリジン−４−カルボニル］アミノ｝プロピオニルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ｝アセチル［Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６，３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（８−３７）ペプチド（２．１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１０５μＬ）に溶解させた。４−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）エチル］イミダゾール−１−カルボン酸アダマンタン−１−イルエステルの溶液を、１２９６μＬのＮＭＰ中に２５．３ｍｇを溶解させ留ことによって調製し、２５μＬのこの溶液をペプチド溶液に加えた後、ＤＩＥＡ（０．９μＬ）も加えた。生成物への転換についてＬＣＭＳ分析を続けた。室温で２時間後、出発ペプチドに対する生成物のＥＬＳシグナル比は９７６：２８（９７％転化率）であると観察された。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１１４１．１（Ｍ＋４Ｈ）４＋
実施例１６
アシル化剤１９−｛［トランス−４−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−シクロヘキシルメチル］−カルバモイル｝−ノナデカン酸の調製
Figure 0005726532
１９−｛［トランス−４−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−シクロヘキシルメチル］−カルバモイル｝−ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．０ｇ、０．９ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（１０ｍＬ）中で１時間４５分撹拌した後、１００ｍＬの氷冷ジエチルエーテルを加えた。白色沈殿物を遠心分離によって単離し、ジエチルエーテルで３×洗浄して表題化合物を得た。沈殿物を真空下で１６時間乾燥させた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝９９９（Ｍ＋１）＋
実施例１７
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン３７−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（｛トランス−４−［（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）メチル］シクロヘキサンカルボニル｝アミノ）−ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］−［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
６ｍＬの水に溶解させた組換え技術で調製した［Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（８−３７）（３００ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）にＤＩＰＥＡ（３７３μＬ、２．１９ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌したところで、ＮＭＰ（１．７ｍＬ）中の１９−｛［トランス−４−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−シクロヘキシルメチル］−カルバモイル｝−ノナデカン酸（１７５．７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して加えた。混合物を９０分撹拌した後、Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（４７０．６ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを、１ＮのＨＣｌを使用して８．４に調節した。
他のフラスコ中で、３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−プロピオン酸（９３．２ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１５９．０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１８０μＬ、１．０６ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（０．７５ｍＬ）に混合し、溶液を１時間撹拌した後、ペプチドを含む反応混合物にそれを滴下して加えた。混合物を１４時間撹拌したところで、ピペリジン（３５０μＬ、３．５１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を更に２時間撹拌した後、２０ｍＬの全容積になるまでそれを水で希釈し、水中３３から５３％のＭｅＣＮの勾配を使用して分取ＨＰＬＣにより精製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１４７５．８（Ｍ＋３Ｈ）３＋
実施例１８
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−ｃａｒｂｏｘｙヘプタデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）−アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）の別の調製
Figure 0005726532
２ｍＬの水に溶解させた組換え技術で調製した［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（１１−３７）（１００ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）にＤＩＰＥＡ（１１３μＬ、０．６６ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌したところで、１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピル−カルバモイル）−ヘプタデカン酸（５５ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）（実施例２，３及び１３に従って調製した）を１５分かけて少しずつ添加した。混合物を６０分撹拌した後、Ｎａ２ＨＰＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ（３５３．９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを、１ＮのＨＣｌを使用して８．３に調節した。Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（２４６．２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、該ペプチドを含む反応混合物に加え、混合物を１４時間撹拌したところで、ピペリジン（４００μＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を更に３０分撹拌した後、４０ｍＬの全容積になるまでそれを水−ＭｅＣＮ（９：１）で希釈し、水中３０から５０％ＭｅＣＮの勾配を使用して、分取ＨＰＬＣにより精製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７２．５（Ｍ＋３Ｈ）３＋
実施例１９
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）−アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの別の調製
アシル化： Ｍｅｔｒｏｈｍ ８４８ Ｔｉｔｒｉｎｏ＋滴定装置の７０ｍＬの反応チャンバ中で、組換え［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（１１−３７）（９９ｍｇであり；３３μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（４ｍＬ）に懸濁させた。ｐＨを、自動滴定ＳＥＴプログラムによって制御されたｐＨ＝１１．３に調節した（３．８ｍＬ、０．１ＭのＮａＯＨ（水性）の添加による）。ｐＨ＝１１．３で、ペプチドは完全に溶解した。活性化された側鎖１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）−ヘプタデカン酸（５５ｍｇ、６６μｍｏｌ、２当量）をＮＭＰ（２５０μＬ）に溶解させ、２５０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに移した。自動シリンジポンプの作動によって、２５０μＬ（２．０当量）のこの溶液を１０分かけて加えた。更に６０分後に、試料（１０μＬ）を取り出し、９０μＬのＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ（１：１）で希釈した。ＵＰＬＣは、Ｎ２６アシル化産物（およそ９５％）の主要ピーク＋微量の未反応ペプチド＋微量の加水分解された側鎖を示した。
ライゲーション： テトラペプチドＮＨＳエステルＦｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（１２３ｍｇ、１６５μｍｏｌ、５当量）をＮＭＰ（２５０μＬ）に溶解させた。反応混合物のｐＨを希酢酸で６．９に調節した。ついで、滴定装置のｐＨスタット機能によって７．０に調節した。２５０μＬのＮＨＳエステルを２０分かけて加えた。ｐＨはｐＨ＝７．０±０．１に安定化された。
試料を更に３０分後に採り、ＵＰＬＣは１：１の比のアシル化中間体及び予想生成物（Ｎ末端位置でＦｍｏｃ保護）を示した。
更に５当量のテトラペプチドＮＨＳエステルを上記のようにして加えた。溶液を撹拌しながら１６時間放置した。そのときの比は２：８のアシル化中間体及び生成物であった。
更に２．５当量（全体で１２．５当量）のテトラペプチドＮＨＳエステルを上記のようにして加えた。溶液を撹拌しながら１６時間放置した。そのときの比はおよそ１：９のアシル化中間体及び生成物であった。
ピペリジン（１．６ｍＬ）を反応混合物に加え、１時間撹拌を継続した。
ＵＰＬＣは完全な脱保護を示した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣで精製して、６２ｍｇ（４５％）の所望の生成物（９８％純度）を得た。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７２．５（Ｍ＋３Ｈ）３＋
実施例２０
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨの調製
Figure 0005726532
Figure 0005726532
グリシンの充填
樹脂をＤＣＭ（１リットル、２０分）で前もって膨潤させた後、それに、５００ｍＬのＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ及びＤＩＰＥＡの溶液を加え、６０分撹拌した。樹脂をＤＭＦ（２×５００ｍＬ）及び２×５００ｍＬのＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＤＩＰＥＡ（８０：１５：５、１０分）、ついでＤＭＦ（３×５００ｍＬ）、ＤＣＭ（５００ｍＬ）で洗浄し、室温で一晩放置した。
カップリング１
ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の２０％ピペリジンを５０分、Ｆｍｏｃ脱保護に使用した後、樹脂をＤＭＦ（８×５００ｍＬ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ及びＴＣＴＵを７００ｍＬのＤＭＦに溶解させ、反応器に加え、ＤＩＰＥＡを加えた。混合物を６時間撹拌した。ＨＰＬＣ試験では、遊離のアミン基が尚も存在していた；カップリングを１／４の試薬を用いて繰り返した。カップリング反応が終わったとき（アミノ基が存在しない）、樹脂をＤＭＦ（４×５００ｍＬ）で洗浄した。
カップリング２
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ及びＴＣＴＵを７００ｍＬのＤＭＦ溶液に溶解させ、反応器に入れ、ＤＩＰＥＡを加えた。混合物を５０分撹拌した。カップリング反応が終わったとき（アミノ基が存在しない）、樹脂をＤＭＦ（４×５００ｍＬ）で洗浄した。
カップリング３
ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の２０％ピペリジンを３０分、Ｆｍｏｃ脱保護に使用した後、樹脂をＤＭＦ（８×５００ｍＬ）で洗浄した。
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及びＴＣＴＵを７００ｍＬのＤＭＦに溶解させ、溶液を反応器に加え、ＤＩＰＥＡを加えた。混合物を５０分撹拌した。カップリング反応が終わったとき（アミノ基が存在しない）、樹脂をＤＭＦ（３×５００ｍＬ）及びＤＣＭ（２×５００ｍＬ）で洗浄した。
第一の切断
第一の切断は１／７の樹脂を使用して行った。トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、５００ｍＬ）を加え、樹脂を７０分撹拌した。濾液を集め、溶媒を真空除去して油を得た。その油を酢酸エチルに溶解させ、冷蔵庫に入れておいて結晶を形成させた。結晶を濾過し、ジエチルエーテルを使用して洗浄し、空気乾燥させて、６．１ｇの生成物（収率４５％）、ＨＰＬＣによる純度９９．０％を得た。
第二の切断
第二の切断は３／７のの樹脂を使用して行った。トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、１０００ｍＬ）を加え、樹脂を９０分撹拌した。濾液を集め、溶媒を真空除去して油を得た。その油を酢酸エチルに溶解させ、冷蔵庫に一晩入れておいて結晶を形成させた。結晶を濾過し、ジエチルエーテルによって洗浄し、空気乾燥させて、３３．１ｇの生成物（収率８０％）、ＨＰＬＣによる純度９８．７％を得た。
収量：６．１ｇ（４５％）
ＥＳＩ＋ＭＳ ｍ／ｚ：８０５．１（Ｍ＋Ｈ）＋、１６１０．７（２Ｍ＋Ｈ）＋。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（Ｌｕｎａ ４．６×２５０、５ｕｌ、１００Ａ；アセトニトリル／バッファー＊ ３０：７０から６０：４０、３０分、１ｍＬ／分、２２０ｎｍ）：２３．３１分；純度９９．０％
及び３３，１ｇ（８０％）
ＥＳＩ＋ＭＳ ｍ／ｚ：８０５．１（Ｍ＋Ｈ）＋、１６１０．８（２Ｍ＋Ｈ）＋。
ＨＰＬＣ Ｒｔ（Ｌｕｎａ ４．６×２５０、５ｕｌ、１００Ａ、アセトニトリル／バッファー＊ ３０：７０から６０：４０、３０分、１ｍＬ／分、２２０ｎｍ）：２３．１６分；純度９８．７％
＊バッファー：２．７１ｇのＫＨ２ＰＯ４、７．１３ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ２Ｏ（２Ｌ）に溶解；
実施例２１
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＳｕｃ・ＴＦＡ塩の調製
Figure 0005726532
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（１．２５ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解させ、ＤＩＰＥＡ（０．６４ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（０．５６ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。混合物を一晩撹拌した。
ＬＣＭＳ： およそ９５％の転化率。混合物を濾過し、溶媒を真空下で除去した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を加え有機相を冷０．１ＮのＨＣｌで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、ｆｉｌｔｅｒｅｄ粗Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（１．１ｇ、７９％）を得た。粗生成物をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解させ、ＴＦＡ（１ｍＬ）を加えた。１時間撹拌した。ＬＣＭＳ：１００％が脱保護された。有機溶媒の蒸発後に、氷冷ジエチルエーテルを残留物に加え、得られた沈殿物を濾過によって集め、真空オーブンで乾燥させて、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ＯＳｕ（４３０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝７４６．３（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例２２
３−（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの調製
Figure 0005726532
３−（Ｎ−トリチルイミダゾール−４−イル）プロピオン酸（Jung等, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 2317-2336、1998）（５０ｇ、０．１３ｍｏｌ）をＤＣＭ（５００ｍＬ）に溶解させ、氷浴を用いて内部温度を３０℃以下に保ちながら、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２４ｇ、０．２０９ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３５ｇ ０．１７０ｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を濾過し、得られた溶液を真空濃縮し、加熱してＴＨＦ（３５０ｍＬ）に再溶解させ、２−プロパノール（３５０ｍｌ）と混合して３２℃の温度とし、ついで５℃に冷却した。結晶性生成物を濾過し、２−プロパノール（１５０ｍＬ）で洗浄し、真空で乾燥させて表題化合物（４７．３ｇ、収率７５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ ７．１５−６．９９（ｍ、９Ｈ）、６．８２（ｓ、１Ｈ）、６．８１−６．６２（ｍ、６Ｈ）、６．３８（ｓ、１Ｈ）、２．６３（ｔ、３Ｈ）、２．４（ｍ、６Ｈ）。
実施例２３
４−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−エチル］−１Ｈ−イミダゾール−１−イウムトリフルオロアセテートの調製
Figure 0005726532
３−（１−トリチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（４０ｇ、８３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２４０ｍＬ）に溶解させた。トリイソプロピルシラン（４２ｍＬ）及びトリフルオロ酢酸（２４０ｍＬ）を加え、得られた溶液を室温で９０分撹拌した。その溶液を真空蒸発させ、アセトニトリル（１２０ｍＬ）に再溶解させ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２９０ｍＬ）を滴下して加え、溶液を８℃に冷却した。沈殿物を濾過によって集め、真空乾燥させて白色化合物（２４ｇ、８２％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ６−ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ ８．９０（ｓ、１Ｈ）、７．４７（ｓ、１Ｈ）、３．０９（ｔ、２Ｈ）、２．７９（ｔ、２Ｈ）、２．７９（ｓ、４Ｈ）。
実施例２４
ＧＬＰ−１アナログＮ−イプシロン３７−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（｛トランス−４−［（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）メチル］シクロヘキサンカルボニル｝アミノ）−ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］−［デスアミノＨｉｓ７，Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの別の調製
Figure 0005726532
組換え技術で調製された［Ｇｌｕ２２，Ａｒｇ２６，Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（８−３７）ペプチド（８０ｇ、０．０２３ｍｏｌ）を水（６４００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２８ｍＬ）を加えてｐＨ１１．０にした。（２２Ｓ）−２２−｛［（トランス−４−｛［（１９−カルボキシノナデカノイル）アミノ］メチル｝−シクロヘキシル）カルボニル］アミノ｝−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９−トリオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサ−２３−ン酸（３４．９ｇ、０．０３５ｍｏｌ）をＮＭＰ（２１０ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミンの連続添加によってｐＨを１１．０−１１．１の間に維持しながら、２時間かけて溶液に加えた。ｐＨは、１Ｍ硫酸（水性、１４０ｍＬ）の添加によって７．０に調節した。４−［２−（２，５−Ｄｉオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−エチル］−１Ｈ−イミダゾール−１−イウムトリフルオロアセテート（３６．９９ｇ、０．１０５ｍｏｌ）はＮＭＰに溶解させ、トリエチルアミンの連続添加によってｐＨを７．０−７．１の間に維持しながら、２時間かけて溶液に加えた。ｐＨは、１ＭのＮａＯＨ（水性、５００ｍＬ）の添加によって１１．２に調節し、溶液を室温で７時間撹拌した。ｐＨを、１Ｍの硫酸（水性、１４０ｍＬ）の添加によって７．４に調節し、全７９７３．８ｇを分取ＨＰＬＣによって精製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１４７６（Ｍ＋３Ｈ）３＋
実施例２５
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１［９−３７］・４ＴＦＡ（１０３ｍｇ；０．０２８ｍｍｏｌ）を２ｍＬの水に溶解し、更なる２×１ｍＬの水と共に滴定反応チャンバーに移した。反応チャンバーに撹拌磁石、ｐＨ電極及び滴定剤チューブを備えた。溶液のｐＨは１．９であった。滴定装置は固定ｐＨ＝１１．３での「スタット」法にプログラムした。滴定剤水酸化ナトリウム（３．２７ｍＬ、０．１Ｍ水性）を滴定装置によって加えてｐＨ＝１１．３とした。（Ｂｏｃ）２Ｏ（１８６ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、３当量）をＮＭＰ（２．５００ｍＬ）に溶解させ、２５０μＬのＨａｍｍｉｌｔｏｎシリンジにこの溶液（つまり、２５０μＬ；１８．６ｍｇ（Ｂｏｃ）２Ｏ、３当量）を満たした。
水（１．０ｍＬ）を反応チャンバーに加え、全容量８．３ｍＬとし、ついで（Ｂｏｃ）２ＯＮＭＰ溶液を、室温でシリンジポンプを使って２０分かけて添加した。滴定装置は、滴定剤の自動添加によってｐＨ＝１１．３を維持した。更に１０分撹拌した後、ＬＣＭＳは、ｄｉｂｏｃ生成物（９％）及び出発材料（３％）と共に８８％のＬｙｓ２６（ＮＨＢｏｃ）生成物を示した。溶液のｐＨは、小容量の希ＨＯＡｃ（水性）で６．５に調節され、滴定装置は更なる反応に対してｐＨ＝７．５に設定された。
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＳｕ（３０５ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ、２０当量）の溶液をＮＭＰ（５００μＬ）に溶解させ、全容量７１５μＬを得た。この溶液から２×２５０μＬ（２×７当量）を、ｐＨ＝７．５を維持しながら２×３０分かけて反応混合物に添加した。Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＳｕの即座の沈殿が観察されたが、撹拌すると溶解した。添加終了時に、混合物をｐＨ＝７．５及び室温で更に２時間撹拌し、溶解と反応物の反応を進めた。
混合物を凍結乾燥させ、３％ＴＩＰＳ及び３％水を含むＴＦＡで２時間処理した。溶媒を蒸発させ、残留物をＨＰＬＣによって精製して所望の生成物を得た。
ＬＣＭＳｍ／ｚ：８４９．８８（Ｍ＋４Ｈ）４＋、１１３２．８６（Ｍ＋３Ｈ）３＋。算定値３３９６．６９８（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例２６
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨの調製
Figure 0005726532
Ａｉｂ： ２−クロロトリチルクロリド樹脂１％ＤＶＢ（充填１．１ｍｍｏｌ／ｇ）（１０．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）の充填物をＤＣＭ中で予め膨潤させた後、それにＤＣＭ（１００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ（７．１６ｇ、２２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９．４ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を６０分撹拌した。樹脂をＮＭＰ（２×１００ｍＬ）及びＤＣＭ−ＭｅＯＨ−ＤＩＰＥＡ（８０：１５：５）（２×１００ｍＬ、各１０分）、及びＮＭＰ（３×１００ｍＬ）で洗浄した。洗浄した樹脂をＮＭＰ（３×１００ｍＬ、各１０分）中の２０％ピペリジンで処理した。樹脂をＮＭＰ（６×１００ｍＬ）で洗浄した。
カップリング： Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１５．６４ｇ、４４ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１００ｍＬ）に溶解させ、ＤＣＭ（２０ｍＬ）及びＨＯＢｔ（５．９５ｇ、４４ｍｍｏｌ）を加えた後、ＤＩＣ（６．８１ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。混合物を１５分間撹拌した後、ｓＤＩＰＥＡ（９．４０ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を加えた。活性化された混合物を樹脂に加え、樹脂を１６時間撹拌した後、それをＮＭＰ（４×１００ｍＬ）及びＤＣＭ（１０×１００ｍＬ）で洗浄した。
切断： トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、１００ｍＬ）を加え、樹脂を１時間撹拌した。濾液を集め、トリフルオロエタノール−ＤＣＭ（１：４、１００ｍＬ）を更に加え、１５分撹拌し、濾液を集めた。組み合わせた濾液を真空蒸発させ、石油エーテル（５０ｍＬ）を加えた。得られた沈殿物を石油エーテルで洗浄し、収集し、１６時間４０℃で真空オーブンで乾燥させ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ（１．００ｇ、収率２１％、純度９５％）を得た。
ＬＣＭＳｍ／ｚ：４４１．１８（Ｍ＋Ｈ）＋。算定値４４０．２２７（Ｍ＋Ｈ）＋。
実施例２７
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＳｕの調製
Figure 0005726532
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−Ａｉｂ−ＯＨ（０．７０ｇ、１．５９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５．０ｍＬ）に溶解させ、ＴＳＴＵ（１．４４ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１．３６ｍＬ、７．９５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。ＬＣＭＳはオキサゾロン産物への略完全な転化を示した。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２９２ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．６当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。ＵＰＬＣは、所望のＳｕ−エステル（８５％）の主要ピーク、微量の未反応出発物質及び５％の閉環オキサゾロンを示す。溶媒を減圧下で室温で蒸発させ、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）を加えて未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを溶解させた。Ｈ２Ｏをデカントし、残留物を残基ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解させ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、７０％の所望の生成物を含む白色フォームを得た。
ＬＣＭＳｍ／ｚ：５３８．１８（Ｍ＋Ｈ）＋。算定値５３８．２５１（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例２８
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−ＯＳｕの調製
Figure 0005726532
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ａｉｂ−ＯＨ（５ｇ、７．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解した。ＤＣＣ（１．６１ｇ、７．８ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（０．９４ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を室温で１６時間攪拌した。ＤＣＵを濾過し溶液を真空蒸発させた。得られた油をＤＣＭ（３４ｍｌ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（３４ｍｌ）及びＴＩＰＳ（６ｍｌ）を加えた。溶液を室温で２時間攪拌し、２５ｍｌまで真空蒸発させ、ＴＢＭＥ（２００ｍＬ）に滴下して加え、６０分撹拌し、得られた白色沈殿物を濾過によって集め、更なるＴＢＭＥで洗浄した。集めた沈殿物を真空下で１６時間乾燥させた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝５６０（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例２９
ＧＬＰ−１誘導体［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドの調製
Figure 0005726532
［Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（９−３７）ペプチド・４ＴＦＡ（１０３ｍｇ；０．０２８ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＴＥＡ（水性、７．５ｍｌ）に溶解し、更なるＴＥＡを加え（１４０ｍｌ）、１１．２８のｐＨを得た。ＦｍｏｃＯＳｕ（９０ｍｇ）をＮＭＰ（１６００μｌ）に溶解し、３３４μｌ（０．０５５ｍｍｏｌ）のこの溶液を滴下してペプチド水溶液に添加した。１ＭのＨ２ＳＯ４（水性）の添加により、ｐＨを７に調節した。ＦｍｏｃＨｉｓＡｉｂＯＳｕトリフルオロ酢酸塩（９０ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（８００μｌ）に溶解させ、１ＭのＮａＯＨ（水性）の連続添加によってｐＨを７．０から７．５に維持しながら、溶液に滴下した。ピペリジン（２ｍｌ）を加え、得られた溶液を室温で６０分撹拌した。ＴＢＭＥ（５ｍＬ）を加え、混合物を３０分撹拌した。水性相を分離し、凍結乾燥した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ＝１１３４（Ｍ＋３Ｈ）３＋

Claims (13)

  1. 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸をＮ末端部分に含むＧＬＰ−１誘導体を製造するための方法であって、
    ｉ）ＧＬＰ−１前駆体分子をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を該前駆体分子の発現に適した条件下で培養し、
    ｉｉ）発現された前駆体分子を培養ブロスから分離し、
    ｉｉｉ）発現された前駆体分子中の少なくとも一のリジン残基のεアミノ基を、活性化されていてもよいアシル化剤でアシル化して、前駆体分子誘導体を得、該前駆体分子誘導体は単離されてもよく、
    ｉｖ）発現されアシル化された前駆体分子に一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸長をカップリングさせ、
    ｖ）得られたＧＬＰ−１誘導体を適切な手段によって単離する
    工程を含んでなり、
    前記Ｎ末端アミノ酸伸長中の一又は複数の非タンパク新生アミノ酸はペプチド結合を介してペプチドに導入可能であるが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群から選択されるタンパク新生アミノ酸ではない部分であり、
    前記アシル化工程が、水性溶媒混合物中で生じ、反応混合物中のｐＨが９と１３の間である、方法。
  2. Ｎ末端アミノ酸伸長が工程ｉｖ）での使用前に保護され、Ｎ末端伸長のカップリング後に再び脱保護される請求項１に記載の方法。
  3. Ｎ末端アミノ酸伸長又は保護されたＮ末端アミノ酸伸長は１から４アミノ酸の長さを有する、請求項１及び２の何れか一項に記載の方法。
  4. 前記前駆体分子が、一般式：
    Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
    （上式中、
    Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
    Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
    Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
    Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
    Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
    Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
    Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
    但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
    のアミノ酸配列を含む前駆体分子のリストから選択される請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 前記前駆体分子が、一般式：
    Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
    （上式中、
    Ｘａａ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
    Ｘａａ１０はＧｌｙ又はＡｌａであり；
    Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
    Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
    Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
    Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
    Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
    Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
    Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
    但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
    のアミノ酸配列を含む前駆体分子のリストから選択される請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  6. 前記前駆体分子が、一般式：
    Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ１６−Ｓｅｒ−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０−Ｇｌｕ−Ｘａａ２２−Ｘａａ２３−Ａｌａ−Ｘａａ２５−Ｘａａ２６−Ｘａａ２７−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３０−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３３−Ｘａａ３４−Ｘａａ３５−Ｘａａ３６−Ｘａａ３７−Ｘａａ３８−Ｘａａ３９−Ｘａａ４０−Ｘａａ４１−Ｘａａ４２−Ｘａａ４３−Ｘａａ４４−Ｘａａ４５
    （上式中、
    Ｘａａ８はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＬｙｓであり；
    Ｘａａ９はＧｌｕ又はＡｓｐであり；
    Ｘａａ１０はＧｌｙ又はＡｌａであり；
    Ｘａａ１６はＶａｌ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ１８はＳｅｒ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ１９はＴｙｒ又はＧｌｎであり；
    Ｘａａ２０はＬｅｕ又はＭｅｔであり；
    Ｘａａ２２はＧｌｙ又はＧｌｕであり；
    Ｘａａ２３はＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２５はＡｌａ又はＶａｌであり；
    Ｘａａ２６はＬｙｓ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ２７はＧｌｕ又はＬｅｕであり；
    Ｘａａ３０はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３３はＶａｌ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇであり；
    Ｘａａ３５はＧｌｙであり；
    Ｘａａ３６はＡｒｇ、Ｇｌｙ又はＬｙｓであり；
    Ｘａａ３７はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３８はＬｙｓ、Ｓｅｒ，又は不存在であり；
    Ｘａａ３９はＳｅｒ、Ｌｙｓ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４０はＧｌｙ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４１はＡｌａ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４２はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４３はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４４はＰｒｏ，又は不存在であり；
    Ｘａａ４５はＳｅｒ，又は不存在であり；
    但し、Ｘａａ３８、Ｘａａ３９、Ｘａａ４０、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４３、Ｘａａ４４又はＸａａ４５が不存在ならば、下流の各アミノ酸残基もまた不存在である）
    のアミノ酸配列を含む前駆体分子のリストから選択される請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  7. Ｎ末端アミノ酸伸長中の一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含む非タンパク新生アミノ酸が、γ−カルボキシグルタマート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニン及びＤ−グルタミン、Ｄ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス−アミノ−ヒスチジン、β−アラニン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロへプチル）カルボン酸、（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸、α−メチルプロリン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンからなる群から選択される請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸長が、一般式
    Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０
    （上式中、
    Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され、
    Ｘａａ８は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択され、
    Ｘａａ９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、γ，γ−ジメチルＧｌｕ、β，β−ジメチルＧｌｕ及びβ，β−ジメチルＡｓｐから選択され、
    Ｘａａ１０は、Ｇｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸、及び（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸から選択される）
    を有する請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  9. 一又は複数の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸長が、一般式
    Ｘａａ７−Ｘａａ８
    （上式中、
    Ｘａａ７は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択され；
    Ｘａａ８は、Ｇｌｙ、Ａｉｂ、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、（１−アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１−アミノシクロヘプチル）カルボン酸，又は（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸及びα−メチルプロリンから選択される）
    を有する請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  10. 一の非タンパク新生アミノ酸を含むＮ末端アミノ酸伸長が、一般式
    Ｘａａ７
    （上式中、Ｘａａ７はＤ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン，α−フルオロメチル−ヒスチジン，α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン及び４−ピリジルアラニンであり；１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、及び４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］ピリジン−６−カルボン酸β−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニンから選択される）を有する請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  11. アシル化剤が、活性化されていてもよく、及び／又は一又は複数の保護基で保護されていてもよい一般式：
    Ａ−ＯＨ、Ａ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＯＨ又はＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＯＨ
    （上式中、
    Ａは
    Figure 0005726532
    からなる群から選択され、ここで、
    ｎは１４、１５、１６、１７、１８及び１９からなる群から選択され、ｐは１０、１１、１２、１３及び１４からなる群から選択され、ｄは０、１、２、３、４及び５からなる群から選択され、及びｍは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７からなる群から選択され、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択され、Ｒ１は一般的に許容される保護基であり、
    Ｂは
    Figure 0005726532
    からなる群から選択され、ここで、
    ｘは０、１、２、３及び４からなる群から選択され、ｙは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選択され、
    Ｃは
    Figure 0005726532
    からなる群から選択され、ここで、
    ｂ及びｅはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、ｃ及びｆはそれぞれ独立して０、１及び２からなる群から選択され、但し、ｃが０のとき、ｂは１又は２であり、又はｃが１または２のとき、ｂは０であり、ｆが０のとき、ｅは１又は２であり、又はｆが１又は２のときｅは０であり、
    一又は複数の遊離のカルボン酸が存在する場合、それらは一般的に許容される保護基で保護されていてもよく、
    Ｄは
    Figure 0005726532
    からなる群から選択され、ここで、ｋは０、１、２、３、４、５、１１及び２７からなる群から選択され、ｍは０、１、２、３、４、５及び６からなる群から選択される）
    のカルボン酸アナログである請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. Ｒ１が、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
  13. 宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞、トリ宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞及び酵母宿主細胞から選択される請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
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