JP5667223B2 - Trpv2阻害剤,疾患の予防又は治療剤,薬剤探索用リード化合物,及び薬剤探索方法 - Google Patents
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Description
下記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される少なくとも1つの化合物を含むことを特徴とする、TRPV2阻害剤。
上記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される少なくとも1つの化合物を含むことを特徴とする、筋変性疾患の予防又は治療剤。
筋変性疾患が、筋ジストロフィー,心筋症,心不全,心筋梗塞のいずれかであることを特徴とする、第二の発明に記載の予防又は治療剤。
上記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される少なくとも1つの化合物を含むことを特徴とする、TRPV2の活性化に起因する疾患の予防又は治療剤。
上記式(I)乃至(V)で表わされる群から少なくとも1つ選択される、TRPV2阻害剤又は筋変性疾患あるいはTRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤を探索するためのリード化合物。
上記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される少なくとも1つをリード化合物とし、コンピューターを用いたドラッグデザインを経て又は経ること無しに公知の合成手法を用い、TRPV2阻害剤,又は筋変性疾患あるいはTRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤を探索する方法。
また、本発明のリード化合物を用いた薬剤探索方法によって、TRPV2阻害剤や、筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤の探索が、飛躍的に効率的になる。
本発明で用いられる化合物(I)は、下記の構造式によって示されるものである。
本発明で用いられる化合物(II)は、下記の構造式によって示されるものである。
本発明で用いられる化合物(III)は、下記の構造式によって示されるものである。
本発明で用いられる化合物(IV)は、下記の構造式によって示されるものである。
本発明で用いられる化合物(V)は、下記の構造式によって示されるものである。
(4,4’-{3-[2(l-ethyl-4-(1-H)quinolidene)ethylidene]}propenylene[bis(l-ethyl quinolinium iodide)])
本発明の、TRPV2阻害剤,筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤は、上記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される化合物を用いることによって製造することができるが、これらの化合物の2つ以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明のTRPV2阻害剤や、筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤中の、有効成分(式(I)乃至(V)で表される少なくとも1つの化合物)の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、好ましくは0.2μM〜200 mM,より好ましくは2μM〜100 mM,特に注射剤の場合、好ましくは0.2μM〜4 mM,より好ましくは0.4μM〜2mM,固形剤の場合、好ましくは20μM〜1M,より好ましくは40μM〜400 mM等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。
本発明のTRPV2阻害剤や、筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤の投与量は、投与経路,症状,年齢,体重,予防又は治療剤の形態等によって異なるが、例えば、TRPV2阻害剤や、筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重1kg当たり好ましくは0.005〜500mg,より好ましくは、0.1〜100mg,但し、成人に対して1日あたり、下限として好ましくは0.01mg(より好ましくは0.1mg),上限として、好ましくは20g(より好ましくは2000mg,更に好ましくは500mg,特に好ましくは100mg)となるように、1回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
上記式(I)乃至(V)で表わされる化合物は、TRPV2阻害剤又は筋変性疾患あるいはその他のTRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤を探索するためのリード化合物としても、利用することができる。
上記式(I)乃至(V)で表わされる群から選択される少なくとも1つをリード化合物とすることによって、コンピューターを用いたドラッグデザインを経て,又は経ること無しに公知の合成手法を用い、TRPV2阻害剤,又は筋変性疾患あるいはその他のTRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤を探索することができる。
尚、実施例に先立って、実施例のTRPV2阻害剤の効果を確認するために用いた試験方法について説明する。
特開2007-259745号に記載の方法に準じて行う。
具体的には、以下の様な手順に従って行う。
2)TRPV2発現用細胞にカルシウム指示薬を添加し、細胞内にカルシウム指示薬を負荷する。
3)さらに、2-APB (2-aminoethoxydiphenyl borate)をpH5.0〜6.5条件下で添加する。
4)カルシウム指示薬の反応産物を測定する。
b)配列番号1で特定される塩基配列のうち、少なくとも第368-2662位に示される塩基配列を含むDNA;
c)配列番号2で特定される塩基配列のうち、少なくとも第455-2725位に示される塩基配列を含むDNA;
d)上記b)またはc)で特定されるDNAのうち、1〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、挿入し、および/または付加されてなるDNA。
反応時間は、1〜10分間、好ましくは1〜5分間、さらに好ましくは約1分間とすることができ、反応時間は使用するTRPV2アゴニストの濃度などにより適宜選択することができる。
この方法は、96穴のマイクロプレート及びマイクロプレートリーダー等を用いることで、Ca2+量を測定することができるため、ハイスループットなスクリーニング系を構築することができる。
TRPV2以外のTRPについての阻害効果を、下記の方法で、測定する。
そこで、細胞をタプシガージンというERCa2+ATPase阻害剤(10μM)で 外液 Ca2+のない条件下で5分間処理してER内Ca2+を枯渇させたあとで、被験物存在あるいは非存在下で外液5mMCa2+によって起こる細胞内Ca2+上昇を測定した。
細胞内Ca2+上昇率は、Ca2+を加えた後の最大蛍光強度(Fmax)とそれ以前の蛍光強度(F0)の差を蛍光変化(△F)として、△F/F0値で表し、これをTRPC1活性とした。
△F/F0値が低い程、TRPC1の活性を阻害していることを示す。
このような方法によって、TRPV1及びTRPC1の阻害効果を確認することによって、被験物が、TRPV2だけを特異的に阻害するか否かを確認する。
また、TRPC1発現用細胞としては、公知のhTRPC1 HEK293細胞(ヒトTRPC1を発現したヒト胎児腎臓細胞由来細胞)を用いた。
HEK293細胞はATCCより、CRL1573として、入手することができる。
hTRPV1 HEK293細胞は、Journal of Biomolecular Screening 2002 7 466-475を参照し、また、hTRPC1 HEK293細胞は、Journal Biological Chemistry 2000 275 36 2799-27805を参照し、常法に従い、DNAのトランスフェクションにて作製することができる。
心筋症モデルとして公知のハムスター「BIO14.6」(7週齢,雄),1群各3匹)を用い、被験化合物を、それぞれの群に対し、2週間経口投与した後、下記の各項目について評価を行う。
被験物の投与前後での、Fractional Shortening(FS)を測定し、その効果を確認する。
FSは、下記式(1)で算出する。
LVDs:左室収縮期径(Left Ventricle Dimension at Systole)
トロポニンは、筋原繊維の細いフィラメント中に存在する心筋構造蛋白の一つであり、トロポニンI(TN-I)とトロポニンT(TN-T)の2種類がある。
従って、心筋のTN-I(cardiac TN-I:cTN-I)が、血清中に溶け出した濃度を測定することによって、筋原繊維の崩壊,つまり心臓の筋肉の、変性の程度を調べることができる。
公知のMasson trichrome染色法を用い、未処理及びTRPV2阻害剤投与後の、心筋症ハムスターモデルの心臓切片を染色し、その画像を解析する。
Masson trichrome染色とは、筋原繊維を赤く,コラーゲン基質や骨基質を青く染める方法であり、筋組織が変性して繊維におきかわると青に染まることから、筋変性の度合いを調べることができる。
下記表1に示した組成の、各種のTRPV2阻害剤を作成し、各々実施例1〜18及び比較例1〜6とした。
実施例及び比較例(公知のTRPV2阻害剤)の各阻害剤を、上記(1)のTRPV2阻害作用確認試験方法によって評価し、その結果を図1及び図2に記載した。
尚、hTRPV2 CHO細胞(図2)を用いたアッセイでは、蛍光カルシウム指示薬fura2を負荷した発現細胞を被験物の存在下あるいは非存在下で、高濃度Ca2+(5mM)(アゴニスト2-APBはなし)で刺激した後の細胞内Ca2+濃度上昇を測定した。刺激後の最大蛍光強度(Fmax)とその前の蛍光強度(F0)の差を蛍光変化(△F)とし△F/F0値で表した。
また、図2中の、左端のデータは、ヒトTRPV2を発現していないCHO細胞を用いた場合の結果を示し、左から2番目のデータは、阻害剤を添加しない場合(コントロール)の結果を示す。
特に、化合物(I)は、比較例の公知の阻害剤と比較して、極めて低濃度で阻害を発揮することが分かった。
実施例及び比較例の各阻害剤を、上記(2)のTRPV2阻害作用の特異性確認試験方法によって評価し、その結果を図3(TRPV1阻害試験),図4(TRPC1阻害試験)に記載した。
TRPV1阻害試験においては、実施例3,6,9,14,18(化合物I,II,III,IV,V),及び比較例3の各阻害剤を用いた。
また、図3中の左端2つのデータは、2種類のアゴニスト(左端:1μMのcap(カプサイシン:TRPV1アゴニスト,左から2番目:2-APB)それぞれの存在化、阻害剤を添加しない場合(コントロール)の△F/F0値を表す。
TRPC1阻害試験においては、実施例3,6,9,14,18(化合物I,II,III,IV,V),及び比較例3,6の各阻害剤を用いた。
また、図4中左から2番目のデータは、阻害剤を添加しない場合(コントロール)の△F/F0値を表す。
この結果、実施例3,6,9,14,18,つまり、化合物(I)〜(V)は、TRPファミリーの中でも、TRPV2だけを、特異的に抑制できることが分かった。
本発明のTRPV2阻害剤や、筋変性疾患・その他TRPV2活性化に起因する疾患の予防又は治療剤の有効成分である、式(I)乃至(V)で表わされる化合物及び対照となる化合物を、上記(3)の心筋症ハムスターモデルを用いた心筋機能改善効果確認試験方法の(a)〜(c)によって評価し、(a)の結果を図5,(b)の結果を図6,(c)の結果を図7及び図8に、各々記載した。
尚、化合物IIは3mg/kg/day,その他の化合物は6mg/kg/day投与した。
尚、図5中のNとは、正常ハムスターのFSを示す。
尚、図6中のNとは、正常ハムスターの血清中cTN-I濃度を示す。
図7から、化合物Iを含有する本発明の阻害剤が、筋組織の繊維化部位(図7では、カラー表示ができないため、判別困難であるが、実際には青に染色されている。)の増加を抑制し、筋変性疾患の予防効果を奏していることが分かった。
これによって、染色像で示した繊維化の抑制効果が、より明確となった。
尚、図8中の「none」とは、心筋症ハムスターモデルに、被験物を投与しなかった(無処理)の結果を示す。
Claims (1)
- 下記式(V)で表わされる化合物を含むことを特徴とする、筋ジストロフィー,心筋症,心不全,又は心筋梗塞の予防又は治療剤。
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