JP5661459B2 - 組み換えヒトトロンビンの製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、組み換えエカリン(ecarin)を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法に関する。
トロンビンは、血液凝固カスケードにおける鍵となる酵素である。フィブリノーゲンからフィブリンモノマーへのトロンビン介在タンパク質消化により、血餅形成に至るカスケード反応が始まる。血餅形成は創傷治癒における第一段階である。加えて、トロンビンは創傷治癒に関与する細胞に対する化学誘引物質であり、そして、形成されたフィブリンネットワークはコラーゲン製造線維芽細胞の足場として働き、食作用を高め、血管形成を促進し、そして増殖因子と結合し、そうして治癒工程をさらに助ける。血餅形成の速度はトロンビンおよびフィブリノーゲンの濃度に依存する。血餅形成における重要な機能のために、トロンビンは、止血用の多くの製品におよび/または組織シーラントまたは“接着剤”として、いずれも単独型製品(すなわちThrombin-JMI)またはフィブリンまたは他の化合物との組み合わせ (すなわちTisseel、Hemaseel、Crosseal) として使用されている。使用の可能性のある領域は広い;皮膚移植、神経系外科、心臓外科、胸部(toracic)外科、血管外科、腫瘍外科、形成外科、眼科外科、整形外科、外傷外科、頭頚部外科、婦人科および泌尿器科外科、消化器外科、口腔外科、薬物送達、組織工学および歯腔止血。
本発明の第一の局面によって、配列番号2の配列を有する組み換えエカリンまたはその相同体を使用して組み換えプロトロンビンから組み換えヒトトロンビンを製造する方法が提供される。
本発明は、一部、適当な制御配列と結合したヒトプロトロンビン(FII)および適当な制御配列と結合したヒトガンマ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)をコードするベクター(図1)での安定なトランスフェクトによりもたらされた細胞株から成る。制御配列は、プロトロンビン発現が、GGCX発現の少なくとも10倍過剰となるように選択すべきである。宿主細胞は好ましくは真核細胞である。典型的宿主細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物細胞を含み、これらに限定されない。哺乳動物細胞が特に好ましい。適当な哺乳動物細胞株は、CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHKおよびCOS細胞、ならびにそれらの派生物を含み、これらに限定されない。一つの態様において宿主細胞は哺乳動物細胞株CHO−Sである。得られたプロトロンビン製造細胞株を、ガンマ−カルボキシル化を無視して、プロトロンビンの高収率のために最適化された培養条件下で増殖させる。ビタミンKを増殖培地に添加してもしなくてもよい。
適当なトロンビン製造方法の例を図3に概説する。
本発明をさらに以下の実施例の手段により記載し、それは添付の特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈してはならない。
CHO細胞における組み換えヒトプロトロンビンの高収率製造
図1に示す、配列番号1のヌクレオチド配列を有する構築物PN32を含むP1E2細胞株を、トロンビン製造に使用するためのプロトロンビンを製造するために、タンパク質および動物成分を含まない増殖培地を使用して、WO2005038019に記載の方法に従い醗酵機中で増殖させた。細胞培養バッチ法または灌流培養法(表1)のいずれかで増殖させ、製造されたプロトロンビンの量をエカリンアッセイにより測定した。このエカリンアッセイは、本質的にChromogenixアッセイ(Moelndal, Sweden)の通りに、標準として精製血漿由来ヒトプロトロンビン(Haematologic Technologies Inc., Vermont, USA)を使用して行った。
CHO細胞における組み換えエカリンの製造
哺乳動物細胞における発現のために最適化した配列番号2のヌクレオチド配列を有するエカリンコード配列を合成し、InvitrogenベクターpCDNA 3.1+にクローン化した(図2)。本発明で使用する組み換えエカリンのヌクレオチド配列と野生型エカリンの配列(GI:717090)のアラインメントを図4に示す。図5から明らかな通り、この組み換えエカリンは、野生型エカリンのアミノ酸配列と100%相同である。AZエカリン(配列番号3)であるこの構築物を使用して、CHO−S細胞(Invitrogen)を安定にトランスフェクトした。エカリンは宿主細胞により細胞外空間に分泌され、エカリン製造クローンについてスクリーニングするために、培養上清サンプルを採り、アッセイ緩衝液(0.1%BSA含有50mM Tris−HCl、pH7.4)中、組み換えヒトプロトロンビン(rhFII)と最終濃度1mg rhFII/Lまで混合した。この混合物を20−40分間、37℃でインキュベートした。サンプル中に存在するエカリンの作用により製造されたトロンビンを、次いで、色素生産性トロンビン基質S−2238(Chromogenix, Moelndal)の1−2mM溶液の添加により検出した。発色をモニターし、適当なときに20%酢酸を使用して停止させた。製造された組み換えエカリンの活性を概算するために、活性が証明されているヘビ毒由来エカリンをSigmaから購入し、標準として使用した。得られた最良の製造細胞株は、動物成分を含まない培地で増殖させて、実験室規模シェーカー培養の培養液1リットル当たり最大7000Uエカリンを製造した。
上記方法は組み換えエカリンをプロタンパク質として製造した。それ故、最適活性のためにプロ部分の除去による活性化が必要である。驚くべきことに、我々は、活性化が、エカリン製造細胞の死亡後、培養物のインキュベーションを少なくとも7日間継続することにより最も好都合に得られることを発見した(図6)。使用した培養培地は、HTサプリメント、非必須アミノ酸およびGlutamax Iを補ったCD−CHO(CHO−Sに関してInvitrogenが推奨する通り)であり、増殖条件は、37℃で、5%二酸化炭素含有雰囲気下のシェーカーボトルであった。培養サンプルを、上記の通り活性についてアッセイした。図6から明らかな通り、組み換えエカリンの活性はこの期間に増加した。
エカリンによるプロトロンビンからトロンビンへの変換
エカリンプロテアーゼは、プロトロンビンを、トロンビン触媒活性を有するトロンビンの中間体形態であるメイゾトロンビンに変換する。トロンビンへのさらなる処理が、自己触媒により達成される。プロトロンビンからトロンビンへの変換に必要なエカリン培養の量を概算するために、我々は一連の試験消化を行った。種々の量の実施例2で得たエカリン含有培養上清を、PBS緩衝液(Cambrex)中1mg/mlプロトロンビン(実施例1の通りに得た)と混合した。混合物のインキュベーションを37℃で1−3時間行った。次いで、サンプルをSDS−PAGEで分析して、プロトロンビンからトロンビンへの完全な変換に必要な組み換えエカリンの量を同定した。この方法により、我々は、組み換えエカリンが非常に強力であることを発見した;7000U/Lで1リットルのエカリン培養上清が、37℃で3時間以内に64グラムのプロトロンビンをトロンビンに変換することができた。通常組み換えにより製造したプロトロンビンは完全カルボキシル化プロトロンビンを不完全カルボキシル化プロトロンビンから分離するために精製しなければならない。しかしながら、本組み換えエカリンが完全カルボキシル化および不完全カルボキシル化プロトロンビンの両方を効率的に活性化できるため、本発明ではこれは必要ない。
トロンビンの精製
実施例3に記載の方法により得たトロンビンを、AEKTA-FPLC(GE Healthcare)および25mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5で平衡化したSP−セファロースHPカラム(GE Healthcare)を使用するカチオン交換クロマトグラフィー(CIEX)により精製した。実施例3の通りに製造したエカリン消化プロトロンビンをpH6.2および約8mS/cmの伝導性に調節した。トロンビンを、カラム平衡緩衝液中、20カラム容積にわたる1M塩化ナトリウム勾配で溶出した(図8)。選択フラクションをSDS−PAGEにより分析した(図9)。トロンビン活性を色素生産性トロンビン基質S−2238とのインキュベーションにより確認した(Chromogenix, Moelndal)。
得られたrh−トロンビンの分析
得られたトロンビンをさらに分析するために、色素生産性トロンビン基質S−2366(Chromogenix)を使用して動的パラメータを測定した。活性をヒルジンでの力価測定により概算した。全パラメータについてrh−トロンビンは次の通りであった;Haematologic Technologies Inc. (Vermont, USA)からの血漿由来ヒトα−トロンビンに類似する活性、KkatおよびVmax。
精製トロンビンをまたN末端配列決定に付した:還元トロンビン重および軽ポリペプチド鎖をSDS−PAGEにより分離し、Immobilon P膜(Millipor)にブロットした。摘出したバンドをEdman分解法により配列決定した。予想通り重鎖N末端の最初の5個のアミノ酸はIVEGSであると確認され、軽鎖の5個のN末端アミノ酸はTFGSであった。
Claims (32)
- (a)配列番号2のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含むエカリンをコードするDNAを含む哺乳動物細胞を提供すること;
(b)細胞がDNAからエカリンを発現できる条件下で細胞をインキュベートすることにより、エカリンを細胞で発現させること;
(c)すべての細胞が死亡するまで細胞のインキュベーションを継続し、死亡した細胞を含む培地を産生すること;および、
(d)培地中のエカリンから活性化エカリンを産生するのに十分な活性化期間にわたり、培地のインキュベーションを継続すること;
を含む、方法。 - (d)の活性化期間が、すべての細胞が死亡してから少なくとも7日間継続する、請求項1に記載の方法。
- 死亡した細胞を含有するフラクションから活性化エカリンを含有するフラクションを分離するために、(d)の活性化エカリンを含有する培地を分画することをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞がエカリンをコードするDNAで安定にトランスフェクトされている、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 細胞がCHO−S細胞である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 細胞が、配列番号2のヌクレオチド配列を含むエカリンをコードするDNAで安定にトランスフェクトされているCHO−S細胞である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンを提供すること;および、活性化エカリンを含有する培地を、組み換えヒトプロトロンビンと接触させ、それにより組み換えヒトトロンビンを産生すること、をさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンが培養された哺乳動物細胞を使用して発現される、請求項8に記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンおよびエカリンが、同一親細胞株由来の培養された哺乳動物細胞を使用して発現される、請求項8または9に記載の方法。
- 親細胞株がCHO−Sである、請求項10に記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンを発現する哺乳動物細胞が、ビタミンKを添加されていない培地で培養されている間に組み換えヒトプロトロンビンを発現する、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンを発現する哺乳動物細胞が、さらに、ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼをコードする組み換えDNAを含み、組み換えガンマ−グルタミルカルボキシラーゼを発現する、請求項9〜12のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンを発現する哺乳動物細胞によるプロトロンビンの発現レベルが、ガンマ−グルタミルカルボキシラーゼの発現レベルの少なくとも10倍である、請求項13に記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンを発現する哺乳動物細胞が、ビタミンKを添加されていない培地で培養されている間に組み換えプロトロンビンおよび組み換えガンマ−グルタミルカルボキシラーゼを発現する、請求項13または14に記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物である、請求項8〜15のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項8〜15のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトプロトロンビンが不完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項8〜15のいずれかに記載の方法。
- 組み換えヒトトロンビンを精製することをさらに含む、請求項8〜18のいずれかに記載の方法。
- 精製された組み換えヒトトロンビンを医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 死亡した細胞を含む培地から、活性化エカリンを含む培養上清を産生すること;および、プロトロンビンを培養上清と接触させ、それによりトロンビンを産生することをさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- プロトロンビンが不完全カルボキシル化プロトロンビンである、請求項21に記載の方法。
- プロトロンビンが完全カルボキシル化プロトロンビンと不完全カルボキシル化プロトロンビンの混合物である、請求項21に記載の方法。
- (d)の培地から活性化エカリンを含む培養上清を産生することをさらに含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 組み換えプロトロンビンを提供すること;および、培養上清の一部または全部を組み換えプロトロンビンと接触させ、それにより組み換えトロンビンを産生することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- 組み換えプロトロンビンを提供すること;および、活性化エカリンを組み換えプロトロンビンと接触させ、それにより組み換えトロンビンを産生することをさらに含み、活性化エカリンは組み換えプロトロンビンと接触する前に培養上清から精製されない、請求項24に記載の方法。
- 組み換えプロトロンビンを提供すること;および、活性化エカリンを組み換えプロトロンビンと接触させ、それにより組み換えトロンビンを産生することをさらに含み、活性化エカリンは組み換えプロトロンビンと接触する前に培地から精製されない、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも98%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- エカリンをコードするDNAが、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも99%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
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