CN101688195B - 制备重组人凝血酶‘644的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用重组ecarin从重组凝血酶原制备重组人凝血酶的方法，所述重组ecarin具有核苷酸序列SEQ ID NO 2编码的氨基酸序列。

Description

制备重组人凝血酶‘644的方法
技术领域
本发明涉及使用重组ecarin从重组凝血酶原制备重组人凝血酶的方法。
发明背景
凝血酶是凝血级联中的关键酶。通过凝血酶介导的纤维蛋白原蛋白水解消化成纤维蛋白单体，使血块形成的级联反应开始。血块形成是伤口愈合的第一步。除此之外凝血酶是伤口愈合有关的细胞的化学引诱剂，并且所形成的纤维蛋白网作为产生胶原的成纤维细胞的支架，其加强了吞噬作用，促进了血管发生并结合生长因子，由此进一步支持愈合过程。血块形成的速率依赖于凝血酶和纤维蛋白原的浓度。由于在血块形成中的重要功能，凝血酶作为单独的产品(即Thrombin-JMI)或与纤维蛋白或其他化合物组合(即Tisseel、Hemaseel、Crosseal)被用于许多用于止血和/或作为组织封闭剂或“胶”的产品中。可能的应用领域是多方面的：皮肤移植、神经外科、心外科、toracic外科、血管外科、肿瘤外科、整形外科、眼外科、矫形外科、创伤外科、头颈外科、妇科和泌尿外科、胃肠外科、牙外科、药物递送、组织工程和牙腔止血。
迄今为止，批准上市的含凝血酶制品中的凝血酶来自人或牛血浆。使用血浆衍生的蛋白具有某些不利因素，例如有限的利用度和安全性考虑，例如病毒和朊病毒(prion)传播风险和触发自身抗体形成的风险(牛制品)。已知由于接触牛凝血酶形成抗体能导致显著的出血障碍的病例。
在体内凝血酶通过凝血级联从凝血酶原的激活获得。通过凝血级联的激活依赖于功能性GLA-结构域的存在，其含有8-10个转化为γ-羧基谷氨酸盐的谷氨酸残基。在体外，不完全γ-羧化的凝血酶原可通过使用诸如ecarin的凝血酶原激活物转化成凝血酶。Ecarin，衍生自肯尼亚蝰蛇Echis carinatus的蛇毒，是促凝血剂，在残基Arg320-Ile321之间切割人凝血酶原产生meizothrombin的蛋白酶。进一步的自身催化加工形成meizothrombin desF1，随后形成α-凝血酶，其为凝血酶的成熟活性形式。
理想的凝血酶商业制备方法将使用高生产率下生产的重组凝血酶前体和重组蛋白酶，而不添加动物衍生成分。其他要求是很强的效率、便利和低成本。
有效重组人凝血酶(rh-凝血酶)的一个巨大的障碍是获得高产率的凝血酶原。尽管进行了许多努力，在适于生物制品制备的条件下获得高产率的凝血酶原长期以来一直是一个挑战。Yonemura等(JBiochem 135：577-582，2004)使用重组ecarin消化的重组GLA-结构域较少的(GLA-domain-less)前凝血酶原，产生重组人凝血酶。加工规模的前凝血酶产率为150-200mg/L，其为商业化规模生产的适度生产率。WO 01/04146中也描述了ecarin的重组生产。在该公开中，通过用来自CHO细胞的重组ecarin转化在COS细胞中生产的重组凝血酶原举例说明rh-凝血酶的产生。然而，该示范性的方法不适于大规模生产，并且使用了动物衍生的成分。
重组ecarin是作为需要被激活的前蛋白原生产的。两篇公开文献中均描述了有效激活r-ecarin的问题，所建议的激活步骤远不是最佳的。
因此需要改良的方法以获得重组人凝血酶。在我们努力改良γ-羧化的人凝血酶原的生产率的过程中，我们惊讶的发现，与γ谷氨酰羧化酶(GGCX)共表达显著地改进了不完全羧化的凝血酶原的生产率(参见WO2005038019)。
本发明描述了从重组凝血酶原有效制备人凝血酶的方法，所述凝血酶原通过WO2005038019中描述的表达方法获得。重组羧化或不完全羧化的凝血酶原与重组ecarin的组合之前未用于制备重组凝血酶。此外，激活重组ecarin的步骤是新的。该描述的方法将适于大规模的rh-凝血酶生产，而不添加动物衍生成分。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了使用具有序列SEQ ID NO 2或其同系物的重组ecarin从重组凝血酶原制备重组人凝血酶的方法。
根据另一个方面，提供了药物组合物，其包含根据所述方法的重组凝血酶与可药用的载体、赋形剂和/或佐剂的组合。
根据另一个方面，提供了分离的DNA序列，其编码根据SEQ IDNO 2或具有与SEQ ID NO 2至少80％同一性的其同系物的重组ecarin。
根据另一方面，提供了载体，其包含编码根据SEQ ID NO 2或具有与SEQ ID NO 2至少80％同一性的其同系物的重组ecarin的分离的DNA序列。
根据又一方面，提供了包含载体的细胞系，所述载体包含编码根据SEQ ID NO 2或具有与SEQ ID NO 2至少80％同一性的其同系物的重组ecarin的分离的DNA序列。
附图简述
图1.FII+GGCX构建体
图2.Ecarin构建体
图3.凝血酶制备方法流程图实例
图4.用于本发明的重组ecarin和野生型ecarin的核苷酸序列比对
图5.用于本发明的重组ecarin和野生型ecarin的氨基酸比对
图6.细胞死亡期间重组ecarin随时间激活的示意图
图7.细胞培养物中重组ecarin随时间的激活，通过SDS-PAGE测定
图8.CIEX纯化rh-凝血酶的色谱图
图9.CIEX纯化获得组分的非还原性SDS-PAGE分析
发明详述
本发明一部分由用编码伴随适当控制序列的人凝血酶原(FII)以及伴随适当控制序列的人γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)的载体(图1)稳定转染获得的细胞系组成。应当选择控制序列，以使得凝血酶原的表达超过GGCX表达至少为10倍。所述宿主细胞优选为真核细胞。典型的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。尤其优选哺乳动物细胞。适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHK和COS细胞及其衍生物。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞系CHO-S。获得的凝血酶原制备细胞系在优化用于凝血酶原高生产率的培养条件下生长，而不考虑γ-羧化。向该生长培养基中任选加入维生素K。
应当理解，本发明不限于特定的凝血酶原或γ-谷氨酰羧化酶或这些待共表达蛋白之一的蛋白编码序列。并且尤其是对于凝血因子来说，本领域中已公开了大量的蛋白突变形式。本发明同样适用于凝血酶原和γ-谷氨酰羧化酶的突变形式，包括所述蛋白天然存在的等位突变体以及野生型序列。在一个实施方案中，可采用任何野生型蛋白或与其具有至少90％、优选至少95％序列同一性的蛋白实施本发明。在另一个实施方案中，可使用表1中列出的序列。
表1
蛋白   CDNAEMBLACC# 剪接变体(蛋白) 突变   GENEEMBLACC#
  谷氨酸-γ-羧化酶 BC013979   2；BC013979；AF253530   1SNP(EMBL#U65896)；2SNPs(OMIM#137167) U65896
凝血酶原 V00595 1；V00595   约100SNP′s(EMBL#AF478696) AF478696
这些蛋白中的每一个(包括其核酸和氨基酸序列)都是公知的。表2鉴定了可用于本发明的多种蛋白的野生型和突变形式的代表性序列。
本文中使用的术语“γ-谷氨酰羧化酶”或“GGCX”是指催化谷氨酸残基羧化的维生素K依赖的酶。
GGCX酶广泛分布，已从许多不同种诸如白鲸Delphinapterusleucas、羞蟾鱼Opsanus tau、鸡(Gallus gallus)、粘盲鳗(Myxineglutinosa)、鲎(Limulus polyphemus)和鸡心螺(cone snail)织锦芋螺(Conus textile)中克隆(Begley等，2000，ibid；Bandyopadhyay et al.2002，ibid)。来自鸡心螺的羧化酶类似于牛羧化酶，已在COS细胞中表达(Czerwiec等.2002，ibid)。其他类似于GGCX的蛋白可在昆虫和原核生物诸如冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和钩端螺旋体属(Leptospira)中找到，其NCBI登记号分别为gi 31217234、gi 21298685、gi 24216281、gi24197548(Bandyopadhyay等，2002，ibid)。羧化酶具有显著的进化保守性。某些非人酶类显示或可能被预测具有类似于我们使用的人GGCX的活性，因此可用作人酶的备选物。
表2鉴定了可用于本发明的与人GGXC同源的预测蛋白的代表性序列(根据种来源分类)。
表2
  种   数据库登记号#/ID
  智人(Homo sapiens)(人)   NM_000821.2HUMGLUCARBHUMHGCABC004422HSU65896AF253530.1
  Papio hamadryas(红狒狒)   AC116665.1
  白鲸(Delphinapterus leucas)(白鲸)   AF278713
  牛(Bos taurus)(牛)   NM_174066.2BOVCARBOXGBOVBGCA
  绵羊(Ovis aries)(家绵羊)   AF312035
  褐鼠(Rattus norvegicus)(褐鼠)   NM_031756.1AF065387
  小家鼠(Mus musculus)(小鼠)   NM_019802.1AF087938
  蟾鱼(Opsanus tau)(硬骨鱼)   AF278714.1
  织锦芋螺(Conus textile)(软体动物)   AY0044904.1
  AF382823.2
  堂皇芋螺(Conus imperialis)(软体动物)   AF448234.1
  Conus episcopatus(软体动物)   AF448233.1
  Conus omaria(软体动物)   AF448235.1
  黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)   NM_079161.2
  冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)(蚊)   XM_316389.1
  黑麦(Secale cereale)(单子叶植物)   SCE314767
  小麦(Triticum aestivum)(普通小麦)   AF280606.1
  Triticum urartu(单子叶植物)   AY245579.1
  大麦(Hordeum vulgare)(大麦)   BLYHORDCA
  问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(螺旋体)   AE011514.1
  天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(高GC革兰氏阳性菌)   SCO939109SCO939124AF425987.1
  变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)(高GC革兰氏阳性菌)   SLU22894
  Streptomyces viginiae(高GC革兰氏阳性菌)   SVSNBDE
  藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(高GC革兰氏阳性菌)   MLSPCOPER
  雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(绿藻)   AF479588.1
  盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)(粘菌)   AC115612.2
  鹌鹑(Coturnix coturnix)(鸟类)   AF364329.1
  慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium.japonicum)(α-proteobacteria)   AP005937.1
  类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(α-proteobacteria)   RSY14197
  苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(α-proteobacteria)   RME603647AF119834
  Mesorhizobium loti(α-proteobacteria)   AP003014.2
  青紫色素杆菌(Chromobacterium violaceum)(β-proteobacteria)   AE016910.1AE016918.1
  铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(γ-proteobacteria)   AE004613.1AF165882
  地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)(γ-proteobacteria)   AE011706.1
  人疱疹病毒8   KSU52064
  KSU75698AF305694AF360120AF192756
上述鉴定的每一种GGCX蛋白和来自其他种的GGCX蛋白均可用作本发明的羧化酶。
本发明的第二部分是用编码ecarin和相关控制元件(图2)的多核苷酸稳定转染的细胞系。可优化ecarin编码序列以在哺乳动物细胞中表达，但不限于这些序列。在本发明的一个实施方案中，使用根据SEQ ID NO 2或其同系物的序列表达ecarin。编码ecarin的SEQ ID NO2的同系物具有与序列SEQ ID NO 2至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。所述宿主细胞优选为真核细胞。典型的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。尤其优选哺乳动物细胞。适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHK和COS细胞及其衍生物。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞系CHO-S。
在一个实施方案中，凝血酶原和ecarin产自源于同一母细胞系的细胞。该细胞系起源可以是但不限于包括衍生物的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和包括衍生物的NS0(骨髓瘤BALB/c小鼠)。使用同一细胞系背景的目的是利于纯化和评价所述凝血酶产品的纯度。
在另一个实施方案中，ecarin和凝血酶原产自不同的宿主细胞系，即分别产自CHO和NS0。
在本发明的一个方面优选使用重组ecarin，因为其利于在凝血酶产生过程中和最终凝血酶制品中检测非凝血酶制品衍生的成分。在第二方面中，优选重组ecarin，因为暴露于可能存在于衍生自蛇毒的ecarin中过敏性或毒性成分的风险下降。在第三方面中，不优选来自蛇毒的ecarin，因为ecarin制品的批间差异和有限的批次大小。
混合粗制凝血酶原和粗制ecarin，在允许凝血酶形成的条件下温育，例如实施例3中所述。产生的凝血酶随后用实施例4中描述的方法或本领域技术人员知晓的其他方法纯化。或者凝血酶原和/或ecarin可首先用本领域已知的方法纯化，随后混合以获得凝血酶。随后从非产品成分中纯化凝血酶。
图3中给出了适当的凝血酶制备过程的实例。
提供了使用重组ecarin从重组凝血酶原制备重组人凝血酶的方法，所述重组ecarin具有序列SEQ ID NO 2或其同系物。所述重组ecarin可被CHO-S细胞中的含有包含核苷酸序列SEQ ID NO 2或其同系物的基因的细胞表达和分泌，该ecarin具有与野生型ecarin相同的氨基酸序列。
在上述方法中，使重组凝血酶原经受重组ecarin的作用，所述重组ecarin可在CHO-S细胞胞外表达后以活性的形式分离，所述细胞被给予足够的时间凋亡/坏死以激活所述ecarin，随后分离人重组凝血酶。
重组凝血酶原可通过细胞系产生，所述细胞系包含凝血酶原表达基因，其具有包含SEQ.ID.NO.1或其同系物的核苷酸序列。编码凝血酶原的SEQ.ID.NO.1的同系物可具有与序列SEQ.ID.NO.1至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。重组凝血酶原可以是完全羧化的凝血酶原和不完全羧化的凝血酶原的混合物。在一个实施方案中，所述重组的凝血酶原是完全羧化的凝血酶原，在另一个实施方案中，所述重组的凝血酶原是不完全羧化的凝血酶原。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的方法获得的重组凝血酶。可以设计药物组合物，其包含根据本发明方法获得的重组凝血酶和可药用的载体、赋形剂和/或佐剂的组合。所述药物组合物可以是可应用的剂型。
在一个实施方案中，通过所述方法产生的凝血酶可用于制备组织封闭剂(“胶”)和其他蛋白(即来自重组细胞、转基因动物或人血浆的纤维蛋白)的组合。在另一个实施方案中，通过所述方法产生的凝血酶可作为单独的产品使用，作为单独活性成分或与非蛋白基质组合冻干，或作为单独活性成分或与其他活性成分组合存在于溶液中。
适当混入(mix-in)的成分包括但不限于胶原、壳多糖、可降解聚合物、纤维素、重组凝血因子和转基因或重组来源的纤维蛋白原。
组织封闭剂(“胶”)的潜在应用领域众多：皮肤移植、神经外科、心外科、toracic外科、血管外科、肿瘤外科、整形外科、眼外科、矫形外科、创伤外科、头颈外科、妇科和泌尿外科、胃肠外科、牙外科、药物递送、组织工程和牙腔止血。
本发明的另一方面涉及用于获得凝血的方法，其通过向患者施用治疗有效量的使用根据本发明的方法获得的重组人凝血酶。
本发明的另一方面是根据SEQ ID NO 2或其同系物的编码重组ecarin的分离的DNA序列。编码ecarin的SEQ ID NO 2同系物可具有与序列SEQ ID NO 2至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。SEQ ID NO 2是经设计优化用于最佳表达的序列，该序列尤其适于在哺乳动物细胞系统中表达。
根据另一方面，提供了包含SEQ ID NO 2或其同系物的载体。所述载体可被设计过表达SEQ ID NO2或其同系物，并且可操作地与容许SEQ ID NO 2或其同系物编码的ecarin表达的表达控制序列连接。根据第三方面提供了包含所述载体的宿主细胞，其能够表达SEQ IDNO 2或其同系物编码的ecarin。该宿主细胞优选为真核细胞。典型的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。尤其优选哺乳动物细胞。适宜的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHK和COS细胞及其衍生物。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞系CHO-S。
根据本发明的另一个实施方案，提供了包含SEQ ID NO：2或其同系物编码的氨基酸序列的多肽，其通过实施例2中所述的方法获得。
两条序列之间的序列同一性可通过配对计算机比对分析采用诸如BestFit、PILEUP、Gap或FrameAlign的程序确定。优选的比对工具是BestFit。实际上，当从序列数据库中搜索与查询检索相似/同一的序列时，通常需要采用适当的算法诸如Blast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA或Fasta3和评分矩阵例如Blosum 62进行类似序列的初始鉴定。所述算法尽量接近地模拟Smith-Waterman的“金标准”比对算法。因此，用于评价相似性(即两条一级多肽序列如何排列)的优选的软件/搜索引擎程序是Smith-Waterman。同一是指直接匹配，相似则允许保守性的替换。
实验部分
本发明将通过下述实施例进一步描述，其不应当理解为限制所附权利要求的范围。
实施例1
CHO细胞中重组人凝血酶原的高生产率。
根据WO2005038019中描述的方法，在发酵罐中生长含有具有核苷酸序列SEQ ID NO：1的图1所示构建体PN32的P1E2细胞系，采用无蛋白和动物成分生长培养基以产生用于制备凝血酶的凝血酶原。所述细胞以分批或灌流培养的方法生长(表1)，通过ecarin分析测定产生的凝血酶原的量。该ecarin分析基本上按Chromogenix分析(Sweden)进行，采用纯化的血浆衍生人凝血酶原(Haematologic Technologies Inc.，Vermont，USA)作为标准物。
表1.实验用发酵罐试验中凝血酶原产率的实例
  实验ID  培养方法&时间   存活细胞(百万细胞/mL)   凝血酶原mg/L
  CC2LC(272-8)   分批，238h   5.9   281
  CC2LD(272-8)   分批，238h   6.2   276
  326-11B   灌流，259h   18   722
发酵罐实验显示批次和灌流培养方法都可用于生产适于产生重组凝血酶的凝血酶原(表1)。这些发酵罐试验中获得的完全羧化的凝血酶原所占比例为约55-87％，剩余的是不完全羧化的凝血酶原。
实施例2
CHO细胞中重组ecarin的生产
合成为在哺乳动物细胞中表达而优化的具有核苷酸序列SEQ IDNO：2的ecarin编码序列，将其克隆至Invitrogen载体pCDNA 3.1+中(图2)。本发明使用的重组ecarin核苷酸序列与野生型ecarin(GI：717090)序列的比对参见图4。从图5中可看出，该重组ecarin与野生型ecarin的氨基酸序列具有100％的同源性。该构建体AZ ecarin(SEQ ID NO.3)被用于稳定转染CHO-S细胞(Invitrogen)。宿主细胞将ecarin分泌至细胞外间隙，为筛选ecarin生产克隆，除去培养物上清样品，与重组人凝血酶原(rhFII)混合至分析缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4含0.1％BSA)中最终浓度为1mg rhFII/L。将该混合物在37℃温育20-40分钟。加入1-2mM凝血酶生色底物S-2238溶液(Chromogenix，)，检测通过样品中存在的ecarin作用产生的凝血酶。监测颜色的变化，当适宜的时候用20％的乙酸终止。为评价产生的重组ecarin活性，从Sigma购买具有公开活性的蛇毒衍生ecarin，用作标准物。在无动物成分的培养基中生长的，实验室规模的振荡培养所获得的最佳生产细胞系产生了高达7000U ecarin每升培养物。
重组ecarin的激活
上述方法产生的重组ecarin是前体蛋白，因此，除去前体部分进行激活对于最佳活性是必须的。令我们惊讶的是，我们发现可通过在ecarin生产细胞死亡后继续温育培养物至少7天方便地进行激活(图6)。使用的培养基是CD-CHO，补充有HT添加剂、非必要氨基酸和Glutamax I(如Invitrogen针对CHO-S所建议的)，生长条件为摇瓶，37℃，在含有5％二氧化碳的气氛下培养。如前所述测定培养物样品的活性。如图6中所示，在激活期间重组ecarin的活性增加。
通过SDS-PAGE分离来自于培养物上清的样品，印迹到硝酸纤维素膜上。用定向至作为包涵体在大肠杆菌中表达的ecarin成熟部分的多克隆兔血清标记所述膜。“M”表示分子量标记物，数字表示样品收集的天。如图7中所示，重组ecarin在细胞死亡超过一周后仍然保持稳定。Ecarin的激活也可在更低的温度下进行，例如在室温下，但需要更长的时间激活。在死亡宿主细胞存在下，Ecarin在室温下能在数月内保持稳定。其活性将逐渐增加直至平稳(levels out)。除了在细菌感染或高温下，未观察到活性的降低。尝试采用胰蛋白酶活化ecarin，但未成功。
实施例3
采用ecarin将凝血酶原转化为凝血酶
Ecarin蛋白酶将凝血酶原转化为meizothrombin(一种具有凝血酶催化活性的凝血酶中间体形式)。进一步加工成凝血酶通过自身催化完成。为确定转化凝血酶原至凝血酶所需要的ecarin培养物的预期量，我们进行了一系列消化试验。将实施例2中获得的不同量的含ecarin培养物上清与1mg/ml凝血酶原(从实施例1中获得)在PBS缓冲液(Cambrex)中混合。在37℃下温育所述混合物1-3小时。随后通过SDS-PAGE分析样品，确定完成凝血酶原至凝血酶转化所需要的重组ecarin的量。通过该方法我们发现重组ecarin是非常有效的；在37℃下，一升7000U/L的ecarin培养物上清能在小于3小时内完成64克凝血酶原至凝血酶的转化。通常重组产生的凝血酶原必须被纯化以从不完全羧化的凝血酶原中分离完全羧化的凝血酶原，然而，对于本发明来说不需如此，因为重组ecarin能有效激活完全羧化和不完全羧化的凝血酶原。
实施例4
凝血酶的纯化
使用阳离子交换色谱(CIEX)纯化根据实施例3中所述步骤获得的凝血酶，采用-FPLC(GE Healthcare)和SP-Sepharose HP柱(GEHealthcare)，用pH 6.5的25mM磷酸钠缓冲液平衡。将实施例3中制备的Ecarin-消化的凝血酶原调节至pH6.2，电导率为约8mS/cm。使用柱平衡缓冲液中1M氯化钠梯度，以20倍柱体积洗脱凝血酶(图8)。用SDS-PAGE分析选定的组分(图9)。通过与凝血酶生色底物S-2238(Chromogenix，)共同温育确认了凝血酶活性。
实施例5
所得rh-凝血酶的分析
为进一步分析获得的凝血酶，使用凝血酶生色底物S-2366(Chromogenix)确定动力学参数。通过水蛭素滴定评价活性。所述rh-凝血酶在所有参数：活性、Kkat和Vmax方面类似于HaematologicTechnologies公司(Vermont，USA)的血浆衍生人α-凝血酶。
纯化的凝血酶同样进行了N-末端测序：通过SDS-PAGE分离还原的凝血酶重和轻多肽链，印迹至Immobilon P膜上(Millipor)。通过Edman降解法对切割的带进行测序。重链N末端头5个氨基酸被确认为IVEGS，轻链的5个N末端氨基酸为TFGS，与预期一致。

Claims (5)

1.一种制备活性蛇静脉酶的方法，其中所述活性蛇静脉酶用于制备重组人凝血酶，其中所述活性蛇静脉酶的制备包括：
(a)提供包含编码前蛇静脉酶原的DNA的哺乳动物细胞，所述前蛇静脉酶原包含如图5所示的AZ蛇静脉酶多肽；和
(b)基本上所有细胞停止存活后，通过温育所述细胞至少七天在所述细胞中表达所述前蛇静脉酶原，由此产生包含活性蛇静脉酶的培养基。
2.根据权利要求1的方法，其中编码前蛇静脉酶原的DNA包含SEQ ID NO2的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是CHO-S细胞。
4.根据权利要求3的方法，其中用包含SEQ ID NO2的核酸序列的DNA稳定转染CHO-S细胞。
5.一种从重组人凝血酶原制备重组人凝血酶的方法，其包含：
(a)将重组人凝血酶原与权利要求1的培养基混合，和
(b)分离和纯化所述重组人凝血酶。
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