JP5637255B2 - １×１０−８ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法に関する。
特許文献１は、試料溶液に含有される化学物質を、電圧差測定方法によって定量する方法を開示している。電圧差測定方法では、化学反応に伴い変化する測定電極の界面電圧が測定される。
特開２０１０−２８６４２３号公報
本発明の目的は、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法を提供することにある。
本発明は、１×１０-8Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を含む測定系を用意する工程、ここで
ゲル被覆電極は、第２作用電極と電気的に等価であり、
ゲル被覆電極は、電極本体およびゲルを具備しており、
ゲルは、電極本体の表面を被覆しており、
ゲルは、基準電解質およびイオン液体を含有し、
ゲルは水を含有せず、
イオン液体は疎水性かつ不揮発性であり、
イオン液体は陽イオンおよび陰イオンから構成され、
基準電解質は、陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
（ｂ）対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を試料溶液に接触させる工程、ここで、
試料溶液は、化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
（ｃ）ポテンショスタットを用いて、第１作用電極および第２作用電極に、第１所定期間ｔ１、それぞれ、第１参照電極を基準としてＶ１ボルトおよびＶ２ボルトの電圧（Ｖ１＞Ｖ２）を印加して、第１作用電極の表面および第２作用電極の表面において、それぞれ、以下の化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）によって表される化学反応を生じさせる工程、
第１作用電極：
酸化還元物質（還元体）n+ → 酸化還元物質（酸化体）(n+m)+＋ ｍ・ｅ-
（Ｉ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
第２作用電極：
酸化還元物質（酸化体）(n+m)+ ＋ ｍ・ｅ- → 酸化還元物質（還元体）n+ （ＩＩ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
（ｄ）第１所定期間ｔ１が経過した時に、第２作用電極およびゲル被覆電極への電圧の印加を停止する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の後、第２所定期間ｔ２の間、試料溶液を放置する工程、
（ｆ）工程（ｅ）の後、第２作用電極および第２参照電極の間の電圧差ΔＥを測定する工程、および
（ｇ）化学物質の濃度を以下の式（ＩＩＩ）に基づいて算出する工程
ΔＥ＝Ｃ１・ｌｏｇ10（化学物質の濃度）＋Ｃ２ （ＩＩＩ）
Ｃ１：比例定数
Ｃ２：定数。
他の本発明は、１×１０-8Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ）対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を含む測定系を用意する工程、ここで
ゲル被覆電極は、第２作用電極と電気的に等価であり、
ゲル被覆電極は、電極本体およびゲルを具備しており、
ゲルは、電極本体の表面を被覆しており、
ゲルは、基準電解質およびイオン液体を含有し、
ゲルは水を含有せず、
イオン液体は疎水性かつ不揮発性であり、
イオン液体は陽イオンおよび陰イオンから構成され、
基準電解質は、陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
（ｂ）対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、およびゲル被覆電極を試料溶液に接触させる工程、
ここで、試料溶液は、化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
第２参照電極は試料溶液に接触されず、
（ｃ）ポテンショスタットを用いて、第１作用電極および第２作用電極に、第１所定期間ｔ１、それぞれ、第１参照電極を基準としてＶ１ボルトおよびＶ２ボルトの電圧（Ｖ１＞Ｖ２）を印加して、第１作用電極の表面および第２作用電極の表面において、それぞれ、以下の化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）によって表される反応を生じさせる工程、
第１作用電極：
酸化還元物質（還元体）n+ → 酸化還元物質（酸化体）(n+m)+＋ ｍ・ｅ-
（Ｉ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
第２作用電極：
酸化還元物質（酸化体）(n+m)+ ＋ ｍ・ｅ- → 酸化還元物質（還元体）n+ （ＩＩ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
（ｄ）第１所定期間ｔ１が経過した時に、第２作用電極およびゲル被覆電極への電圧の印加を停止する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の後、第２所定期間ｔ２の間、試料溶液を放置する工程
（ｆ）第２参照電極が試料溶液に接触される工程、
（ｇ）工程（ｆ）の後、第２作用電極および第２参照電極の間の電圧差ΔＥを測定する工程、および
（ｈ）化学物質の濃度を以下の式（ＩＩＩ）に基づいて算出する工程
ΔＥ＝Ｃ１・ｌｏｇ10（化学物質の濃度）＋Ｃ２ （ＩＩＩ）
Ｃ１：比例定数
Ｃ２：定数。
工程（ｃ）における電圧Ｖ１およびＶ２の間の電圧差は、０．３ボルト以上０．６ボルト以下であり得る。
第１所定期間ｔ１は、１０秒以上６００秒以下であり得る。
第２所定期間ｔ２は、１０秒以上６００秒以下であり得る。
酸化還元物質は、フェロセン誘導体であり得る。
フェロセン誘導体が、フェロセンカルボン酸であり得る。
化学物質は、抗体であり得る。
陽イオンおよび陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩから選択され得る。
群Ｉ：下記式ＩＶ-(1)〜ＩＶ-(6)で表される陽イオン。
Figure 0005637255
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、同一又は異なって、水素原子、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又若しくは分岐鎖状アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を示し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、同一又は異なって、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖若しくは分岐鎖状脂肪族炭化水素基、アラルキル基、又はアリール基を示す）。
群ＩＩ：下記式Ｖ-(1)又はＶ-(2)で表される陰イオン。
Figure 0005637255
（式中、Ｒｆ１およびＲｆ２は同一又は互いに異なって、炭素数１〜４のペルフルオロアルキル基を示す）。
イオン液体は、以下から選択され得る：
１，３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド
１，３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１，３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート
１−ブチル−３−エチルイミダゾリウムトリフレート
１，２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−イロプロピル−３−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
または
Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド。
本発明は、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法を提供する。
実施形態１における工程（ａ）〜工程（ｃ）を概念的に示す図 実施形態１における工程（ａ）〜工程（ｃ）を概念的に示す図 実施形態１における工程（ｆ）を概念的に示す図 実施形態１における工程（ｆ）を概念的に示す図 ゲル被覆電極１５の一実施形態を概念的に示す図 図３Ａに含まれるＡ−Ａ線の断面図を示す図 ゲル被覆電極１５の他の実施形態を概念的に示す図 図３Ｃに含まれるＡ−Ａ線の断面図を示す図 実施例１の結果を示すグラフ グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの酸化を示す図
本発明の実施形態が、以下、説明される。
（実施形態１）
（工程（ａ））
図１Ａは、実施形態１において用いられる測定系を示す。測定系は、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第２参照電極１４、およびゲル被覆電極１５を含む。対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、およびゲル被覆電極１５は、ポテンショスタット１８に接続されている。スイッチ１７が、ポテンショスタット１８および第２作用電極１１ｂの間に設けられている。工程（ｂ）および工程（ｃ）において、スイッチ１７はオンである。
第１作用電極１１ａおよび第２作用電極１１ｂは、櫛形電極であることが望ましい。これら２つの櫛形電極は、互い違いに係合することが望ましい。
対極１３の例は、パラジウム電極である。第１参照電極１２の例は、銀／塩化銀電極である。
第１作用電極１１ａの例は、金電極である。第２作用電極１１ｂの例もまた、金電極である。金電極はアルカンチオールからなる自己組織化膜により被覆されていることが望ましい。第１作用電極１１ａおよび第２作用電極１１ｂは、一対の同一の電極から構成されることが望ましい。
図３Ａに示されるように、ゲル被覆電極１５は、電極本体３１およびゲル３４を具備する。電極本体３１は、ゲル３４によって被覆されている。より詳細には、ゲル被覆電極１５は、導電線３２ａ、絶縁層３３、および絶縁性基板３５を具備している。図３Ｂに示されるように、導電線３２ａは、絶縁層３３および絶縁性基板３５の間に挟まれている。好ましくは、導電線３２ａは銀から形成される。
導電線３２ａの主な部分は絶縁層３３によって被覆されている。しかし導電線３２ａの先端は絶縁層３３に被覆されていない。導電線３２ａの先端は、ゲル３４によって被覆されている。言い換えれば、導電線３２ａの先端は、電極本体３１である。導電線３２ａの他端も、絶縁層３３に被覆されていない。導電線３２ａの他端は、電極本体３１をポテンショスタット１８に電気的に接続するために用いられる。
図３Ｃは、ゲル被覆電極１５の他の実施形態を示す。図３Ｃに示されるゲル被覆電極は、導電板３２ｂ、絶縁層３３、ゲル３４、および絶縁性基板３５を具備している。好ましくは、導電板３２ｂは銀から形成される。図３Ｄに示されるように、導電板３２ｂは、絶縁層３３および絶縁性基板３５の間に挟まれている。開口部が絶縁層３３に設けられている。ゲル３４がリード板３２に接するように、ゲル３４がこの開口部に設けられている。ゲル３４に接している導電板３２ｂの部分が、電極本体３１である。このようにして、電極本体３１はゲル３４に被覆されている。
リード板３２の周囲は、絶縁体（図示せず）によって囲まれている。ゲル３４によっても絶縁層３３によっても被覆されていないリード板の部分は、電極本体３１をポテンショスタット１８に電気的に接続するために用いられる。
次に、ゲル３４が詳細に説明される。
ゲル３４は、基準電解質とイオン液体とを含有する。イオン液体は支持電解質として機能する。ゲル３４は、基準電解質およびイオン性液体が、試料溶液と混合しない様に設定される。ゲル３４の設定方法は特に制限されない。一例は、疎水性ポリマー中に、基準電解質及びイオン液体を担持および／又は封入することである。当該疎水性ポリマーの例は、フッ化ビニリデン‐ヘキサフルオロプロピレン共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリブチルアクリレートである。
イオン液体は疎水性である。疎水性のイオン液体は、以下の陽イオンおよび以下の陰イオンから構成される。
陽イオン：下記式ＩＶ-(1)〜ＩＶ-(6)により表される陽イオン。
Figure 0005637255
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、同一又は異なって、水素原子、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖若しくは分岐鎖状アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を示し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、同一又は異なって、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖若しくは分岐鎖状脂肪族炭化水素基、アラルキル基、又はアリール基を示す）。
式ＩＶ-(1)で表されるイミダゾリウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ１はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、およびｔ−ブチル基からなる群より選択され、Ｒ２は水素原子、又はメチル基であり、Ｒ３はヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ４およびＲ５は水素原子である。
式ＩＶ-(2)で表されるイソキノリウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ２は炭素数１〜６のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素原子であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は水素原子である。
式ＩＶ-(3)で表されるピリジニウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ１はヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は水素原子である。
式ＩＶ−(4)で表されるピロリジニウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ１はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、およびｔ−ブチル基からなる群より選択され、Ｒ２は炭素数１〜６のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は水素原子である。
式ＩＶ−(5)で表されるピペリジニウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ１はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、およびｔ−ブチル基からなる群より選択され、Ｒ２は炭素数１〜６のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素原子であり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は水素原子である。
式ＩＶ-(6)で表されるアンモニウムイオンにおいて、好ましくは、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２は、同一又は互いに異なって、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数１〜６のアルキル基、フェニル基、又はベンジル基である。
陰イオン：下記式Ｖ-(1)又はＶ-(2)で表される陰イオン。
Figure 0005637255
（式中、Ｒｆ１およびＲｆ２は同一又は互いに異なって、炭素数１〜４のペルフルオロアルキル基を示す）。
式Ｖ-(1)で表される陰イオンにおいて、好ましくは、Ｒｆ１およびＲｆ２はともに、ペルフルオロメチル基、又はペルフルオロエチル基である。
式Ｖ-(2)で表される陰イオンにおいて、好ましくはＲｆ１は、トリフルオロメチル基である。
より具体的には、イオン液体は、以下に例示される。
１，３−ジメチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニルイミド）
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド１−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビス（ペンタフルオロエタンスルフォニル）イミド
１，３−ジエチルイミダゾリウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
１，３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート
１−ブチル−３−エチルイミダゾリウムトリフレート
１，２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
１−イロプロピル−３−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニル）イミド
１，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
プロピルトリメチルアンモニウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド
Ｎ−ブチルピリジニウム ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド。
基準電解質は、上記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成される。ハロゲン化物イオンとは、塩化物イオン、臭化物イオン、またはヨウ化物イオンである。
溶解度の観点から、基準電解質は、陽イオンは、イオン液体と同一または類似の陽イオンから構成されることが好ましい。『類似の陽イオン』とは、イオン液体の陽イオンが式ＩＶ-(1)で表される陽イオンである場合は、式ＩＶ-(1)で表されるいずれかの陽イオンである。具体的には、イオン液体が１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミドである場合は、基準電解質は１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムハライドであることが好ましい。基準電解質は１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドであることがより好ましい。
ゲル被覆電極１５は、第２作用電極１１ｂと電気的に等価である。用語「電気的に等価」とは、ゲル被覆電極１５は、第２作用電極１１ｂに直接的にかつ電気的に接続されており、かつ抵抗器、キャパシタ、またはコイルが、ゲル被覆電極１５および第２作用電極１１ｂの間に電気的に配置されていないことを意味する。図１Ａに示されるように、ゲル被覆電極１５は、電線を用いて第２作用電極１１ｂに接続されていることが望ましい。
（工程（ｂ））
工程（ｂ）が、工程（ａ）の後に行われる。工程（ｂ）では、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第２参照電極１４、およびゲル被覆電極１５が、試料溶液１６に接触される。より具体的には、図１Ｂに示されるように、試料溶液１６が、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第２参照電極１４、およびゲル被覆電極１５を被覆するように、試料溶液１６が基板１０上に滴下される。これに代えて、図１Ａに示されるように、容器２０に含有される試料溶液１６に、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第２参照電極１４、およびゲル被覆電極１５が浸漬される。試料溶液１６は水溶液であることが望ましい。試料溶液１６は緩衝液であることがより望ましい。
図１Ａおよび図１Ｂでは、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第２参照電極１４、およびゲル被覆電極１５は、１枚の絶縁性基板１０上に形成されている。従って、基板１０上に試料溶液１６が滴下されるか、または基板１０が試料溶液１６に浸漬される。しかし、基板１０を用いずに、これらの６つの電極１１〜１５が別々に試料溶液１６に接触され得る。
ここで、本実施形態によって定量される化学物質が説明される。試料溶液１６は、化学物質および酸化還元物質を含有する。これに代えて、試料溶液１６は、酸化還元物質によって修飾された化学物質を含有する。後述される実験例では、試料溶液１６は、フェロセンカルボン酸によって修飾された抗体を含有する。
酸化還元物質は、酸化体または還元体のいずれか一方の状態で試料溶液１６に含有される。電子の交換を伴う化学反応、すなわち、酸化還元反応により、化学物質が他の化学物質に変化する際に、酸化還元物質は酸化体から還元体に、または還元体から酸化体に変化する。
化学物質の例は、糖および抗体である。酸化還元物質の例は、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下、「ＦＡＤ」という）、フェロシアン化カリウム（還元体）、フェリシアン化カリウム（酸化体）、フェロセン（およびその誘導体）、またはキノン（およびその誘導体）である。酸化還元物質は、一般に、「電子メディエータ」と呼ばれる。
一例として、グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの酸化が説明される。図５に示されるように、グルコースおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドが、それぞれ、化学物質および酸化還元物質として用いられる。グルコースは、グルコースデヒドロゲナーゼにより、グルコノラクトンに変化する。同時に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化体（以下、「ＮＡＤ＋」という）が、還元体（以下、「ＮＡＤＨ」という）に変化する。
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。工程（ｃ）では、ポテンショスタット１８を用いて、Ｖ１ボルトおよびＶ２ボルトの電圧（Ｖ１＞Ｖ２）が、それぞれ、第１作用電極１１ａ、および第２作用電極１１ｂに、第１所定期間ｔ１の間、印加される。Ｖ２ボルトの電圧は、ゲル被覆電極１５にも印加される。この電圧印加は、第１作用電極１１ａの表面に、以下の化学式（Ｉ）によって表される化学反応を生じさせる。
酸化還元物質（還元体）ｎ＋ → 酸化還元物質（酸化体）（ｎ＋ｍ）＋ ＋ ｍ・ｅ− （Ｉ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
同時に、この電圧印加は、第２作用電極１１ｂの表面に、以下の化学式（ＩＩ）によって表される反応を生じさせる。
酸化還元物質（酸化体）（ｎ＋ｍ）＋ ＋ ｍ・ｅ− → 酸化還元物質（還元体）ｎ＋ （ＩＩ）
（ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
工程（ｃ）においては、第１作用電極１１ａおよび第２作用電極１１ｂは、それぞれ、アノード電極およびカソード電極として機能する。
電圧Ｖ１は、０．３ボルト以上０．６ボルト以下であることが望ましい。電圧Ｖ１が０．３ボルト未満である場合には、化学式（Ｉ）によって表される化学反応が充分に生じ得ない。電圧Ｖ１が０．６ボルトを超える場合には、水の電気分解反応が起こり得る。
Ｖ２ボルトは、−０．２ボルト以上０ボルト以下であることが望ましい。Ｖ２ボルトが−０．２ボルト未満である場合には、水の電気分解反応が起こり得る。Ｖ２ボルトが０ボルトを超える場合には、化学式（ＩＩ）によって表される反応が充分に生じ得ない。
電圧差（Ｖ１−Ｖ２）は、０．２ボルト以上０．８ボルト以下であることが望ましい。電圧差（Ｖ１−Ｖ２）が０．２ボルト未満である場合には、酸化還元反応サイクルが充分に形成され得ない。電圧差（Ｖ１−Ｖ２）が０．８ボルトを超える場合には、水の電気分解反応が起こり得る。
一例として、電圧Ｖ１およびＶ２は、それぞれ、０．３ボルト（ｖｓ第１参照電極１２）および０ボルト（ｖｓ第１参照電極１２）である。
第１所定期間ｔ１は、１０秒以上６００秒以下であることが望ましい。第１所定期間ｔ１が１０秒未満である場合には、化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）によって表される化学反応が十分に生じ得ない。第１所定期間ｔ１が６００秒を超える場合には、試料溶液１６に含有される溶媒（水）が蒸発し、試料溶液１６の濃度が変化し得る。工程（ｃ）においては、第２参照電極１４は、フローティング状態にあることが望ましい。
（工程（ｄ））
第１所定期間ｔ１が経過した時に、第２作用電極１１ｂおよびゲル被覆電極１５への電圧Ｖ２の印加が停止される。より具体的には、スイッチ１７がオフにされる。スイッチ１７のオフにより、第２作用電極１１ｂおよびゲル被覆電極１５の電気的状態は、フローティング状態になる。工程（ｄ）においては、電圧Ｖ１が第１作用電極１１ａに維持されることが望ましい。
（工程（ｅ））
工程（ｄ）の後、工程（ｅ）が行われる。工程（ｅ）では、試料溶液１６が、第２所定期間ｔ２の間、放置される。
第２所定期間ｔ２は、１０秒以上６００秒以下であることが望ましい。第２所定期間ｔ２が１０秒未満である場合には、工程（ｄ）におけるスイッチングによって生じたノイズが、後述する電圧差ΔＥに誤って含まれ得る。第２所定期間ｔ２が６００秒を超える場合には、試料溶液１６に含有される溶媒（水）が蒸発し、試料溶液１６の濃度が変化し得る。
（工程（ｆ））
第２所定期間ｔ２が経過した時に、第２作用電極１１ｂおよび第２参照電極１４の間の電圧差ΔＥが測定される。具体的には、図２Ａおよび図２Ｂに示されるように、電圧計１９が、第２作用電極１１ｂおよび第２参照電極１４の間に電気的に挟まれる。言うまでもないが、工程（ｆ）においては、第２作用電極１１ｂ、ゲル被覆電極１５、および第２参照電極１４は、試料溶液１６に接触されている。
本発明者らは、試料溶液１６に含有される化学物質が、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度を有していても、電圧差ΔＥが、試料溶液に含有される化学物質の濃度に比例することを見出した。本発明は、この知見によって特徴付けられる。濃度の下限は１×１０−１２Ｍであり得る。
（工程（ｇ））
最後に、工程（ｆ）において測定された電圧差ΔＥに基づいて、化学物質の濃度が以下の式（ＩＩＩ）に従って算出される：
ΔＥ＝Ｃ１・ｌｏｇ１０（化学物質の濃度）＋Ｃ２ （ＩＩＩ）
Ｃ１：比例定数
Ｃ２：定数
言うまでもないが、工程（ｆ）において測定された電圧差ΔＥに基づいて、化学物質の濃度が算出される際には、検量線が用いられる。
言い換えれば、異なる既知の濃度で化学物質を含有する複数の試料溶液を用いて、複数の電圧差ΔＥが測定される。測定された複数の電圧差ΔＥおよび化学物質の濃度に基づいて、検量線が作成される。検量線は、所定の比例定数Ｃ１および定数Ｃ２を有する。
次に、未知の濃度で化学物質を含有する試料溶液を用いて、電圧差ΔＥが測定される。検量線を用いて、測定された電圧差ΔＥから、化学物質の濃度が計算される。
式（ＩＩＩ）は、以下の式（ＩＶ）と等価である。
（化学物質の濃度）＝１０＾｛（ΔＥ−ｄ）／ｅ）｝ （ＩＶ）
ここで、ｄおよびｅは定数である。
（実施形態２）
実施形態２は、以下の項目（Ａ）および（Ｂ）を除き、実施形態１と同じである。
（Ａ） 工程（ｂ）において、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、およびゲル被覆電極１５が、試料溶液１６に接触される。第２参照電極１４は、試料溶液１６に接触されない。
（Ｂ） 工程（ｆ）の前に、第２参照電極１４が、試料溶液１６に接触される。
実施形態２では、基板１０は用いられなくてもよい。個別の６つの電極１１〜１５が別々に試料溶液１６に接触され得る。あるいは、基板１０は、対極１３、第１参照電極１２、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、およびゲル被覆電極１５を具備してもよい。しかし、この基板１０は、第２参照電極１４を具備しない。
（実施例）
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
実施例は、実施例１ａ、実施例１ｂ、実施例１ｃ、実施例１ｄ、および実施例１ｅから構成される。
（実施例１ａ）
図１Ｂに示される電気化学測定系が用意された。この測定系は、基板１０、スイッチ１７、ポテンショスタット１８、およびｐＨメータ（不図示）を具備していた。基板１０は、第１作用電極１１ａ、第２作用電極１１ｂ、第１参照電極１２、対極１３、第２参照電極１４、および図３Ｃおよび図３Ｄに示されるゲル被覆電極１５を具備していた。ポテンショスタット１８は、ＢＡＳ社より商品名「デュアルポテンショスタット ＡＬＳ−８３２Ｃ」として入手した。ｐＨメータは、ＨＯＲＩＢＡ社より商品名「Ｆ−７２Ｔ」として入手した。
第１作用電極１１ａおよび第２作用電極１１ｂは、アルカンチオールから構成される自己組織化膜によって被覆された金からなる櫛形電極であった。これら２つの櫛形電極は、互い違いに係合していた。櫛形電極は、２マイクロメートルの電極幅を有していた。一対の櫛形電極の間の間隔、すなわち、電極間隔は２マイクロメートルであった。
第１参照電極１２は、銀／塩化銀電極であった。対極１３は、パラジウム電極であった。第２参照電極１４は、第１参照電極１２と同様に、銀／塩化銀電極であった。
(ゲル被覆電極１５の作製)
ゲル被覆電極１５は、以下のように作製された。
密閉容器中において、５０ミリグラムのポリメチルメタクリレート(和光純薬工業から入手、平均分子量：およそ１０万、５０ミリグラム)が、１ミリリットルのアセトンに溶解され、アセトン溶液を調製した。アセトン溶液の調製の間には、超音波がアセトンに印加され、かつアセトンは氷冷された。
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドが、基準電解質として、和光純薬工業株式会社より購入された。１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミドが、イオン液体として、東京化成工業株式会社より購入された。
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドが１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミドに溶解され、１ｍＭの濃度を有する１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを含有する１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド溶液（５０マイクロリットル、以下、「イミド溶液」という）を得た。
次に、イミド溶液が、アセトン溶液に添加され、かつよく攪拌された。このようにして、ストック溶液が調製された。
１．５マイクロリットルの容量を有するストック溶液が、図３Ｄに示される開口部に滴下された。このようにして、ゲル３４が、開口部の底面から露出する金属層３２の部分から構成されている電極本体３１上に形成された。本実施例においては、銀からなる金属層３２が、絶縁性基板３５上に形成されていた。金属層３２および絶縁性基板３５のいずれもが、１０５ｍｍ２の面積を有していた。絶縁層３３が、金属層３２上に形成されていた。絶縁層３３の材料はエポキシ系樹脂であった。開口部は円筒状であった。開口部は、およそ０．０７ｍｍ２の断面積を有していた。
次に、試料溶液１６が基板１０に滴下された。このようにして、図１Ｂに示されるように、基板１０は、試料溶液１６によって被覆された。
試料溶液１６は、以下の表１に示される試薬を含有していた。
Figure 0005637255
スイッチ１７がオンにされ、０．３ボルトおよび０ボルト（ｖｓ．第１参照電極１２）の電圧Ｖ１およびＶ２を、６０秒間、第１作用電極１１ａおよび第２作用電極１１ｂに、それぞれ印加した。電圧Ｖ２は、ゲル被覆電極１５にも印加された。
このようにして、第１作用電極１１ａ上では、以下の化１によって表される化学反応が生じた。
Figure 0005637255
第２作用電極１１ｂ上では、以下の化２によって表される化学反応が生じた。
Figure 0005637255
その後、スイッチ１７がオフにされた。
１８０秒間、試料溶液１６は放置された。１８０秒が経過した時に、図２Ｂに示されるように、第２作用電極１１ｂおよび第２参照電極１４の間の電圧差ΔＥが、電圧計１９により測定された。結果は、１回目に測定された電圧差ΔＥとして表２に示される。この間、第１作用電極１１ａの電圧は、０．３ボルトに維持された。
実施例１ａが繰り返され、電圧差ΔＥがもう一度測定された。結果は、２回目に測定された電圧差ΔＥとして表２に示される。
（実施例１ｂ）
フェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度が１０−９ Ｍであったこと以外は、実施例１ａと同様の実験が行われた。
（実施例１ｃ）
フェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度が１０−１０ Ｍであったこと以外は、実施例１ａと同様の実験が行われた。
（実施例１ｄ）
フェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度が１０−１１ Ｍであったこと以外は、実施例１ａと同様の実験が行われた。
（実施例１ｅ）
フェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度が１０−１２ Ｍであったこと以外は、実施例１ａと同様の実験が行われた。
Figure 0005637255
図４は、表２に基づいて作成された、電圧差ΔＥの平均値およびフェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度の間の関係を表すグラフである。図４から明らかなように、電圧差ΔＥの平均値は、フェロセン標識化抗ヒト血清アルブミン抗体の濃度の常用対数に比例する。実施例１では、以下の式が充足された。
電圧差ΔＥの平均値＝６．５８・ｌｏｇ１０（抗体の濃度）＋８２．９１
従って、図４に示されるグラフは、検量線として機能し得る。この検量線を用いて、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質が、酸化還元物質（例えば、フェロセン誘導体）を用いて正確に定量される。言い換えれば、化学物質が１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有されると予想されるが、しかしその正確な濃度が知られていない場合、本発明の方法を利用することによって化学物質の濃度が正確に測定される。
もし本発明の方法が開示されなければ、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に測定することは、当業者にとって困難であろう。
本発明は、１×１０−８Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法を提供する。
１１ａ 第１作用電極
１１ｂ 第２作用電極
１２ 第１参照電極
１３ 対極
１４ 第２参照電極
１５ ゲル被覆電極
１６ 試料溶液
１７ スイッチ
１８ ポテンショスタット
１９ 電圧計
２０ 容器
３１ 電極本体
３２ａ 導電線
３２ｂ 導電板
３３ 絶縁層
３４ ゲル
３５ 絶縁性基板

Claims (18)

  1. １×１０-8Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法であって、以下の工程を具備する：
    （ａ） 対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を含む測定系を用意する工程、ここで
    前記ゲル被覆電極は、前記第２作用電極と電気的に等価であり、
    前記ゲル被覆電極は、電極本体およびゲルを具備しており、
    前記ゲルは、前記電極本体の表面を被覆しており、
    前記ゲルは、基準電解質およびイオン液体を含有し、
    前記ゲルは水を含有せず、
    前記イオン液体は疎水性かつ不揮発性であり、
    前記イオン液体は陽イオンおよび陰イオンから構成され、
    前記基準電解質は、前記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
    （ｂ） 対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を前記試料溶液に接触させる工程、ここで、
    前記試料溶液は、前記化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
    （ｃ） ポテンショスタットを用いて、第１作用電極および第２作用電極に、第１所定期間ｔ１、それぞれ、前記第１参照電極を基準としてＶ１ボルトおよびＶ２ボルトの電圧（Ｖ１＞Ｖ２）を印加して、第１作用電極の表面および第２作用電極の表面において、それぞれ、以下の化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）によって表される化学反応を生じさせる工程、
    第１作用電極：
    酸化還元物質（還元体）n+ → 酸化還元物質（酸化体）(n+m)+＋ ｍ・ｅ-
    （Ｉ）
    （ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
    第２作用電極：
    酸化還元物質（酸化体）(n+m)+ ＋ ｍ・ｅ- → 酸化還元物質（還元体）n+ （ＩＩ）
    （ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
    （ｄ） 第１所定期間ｔ１が経過した時に、第２作用電極およびゲル被覆電極への電圧の印加を停止する工程、
    （ｅ） 工程（ｄ）の後、第２所定期間ｔ２の間、試料溶液を放置する工程、
    （ｆ） 工程（ｅ）の後、第２作用電極および第２参照電極の間の電圧差ΔＥを測定する工程、および
    （ｇ） 前記化学物質の濃度を以下の式（ＩＩＩ）に基づいて算出する工程
    ΔＥ＝Ｃ１・ｌｏｇ10（前記化学物質の濃度）＋Ｃ２ （ＩＩＩ）
    Ｃ１：比例定数
    Ｃ２：定数。
  2. 工程（ｃ）における前記電圧Ｖ１およびＶ２の間の電圧差が、０．３ボルト以上０．６ボルト以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１所定期間ｔ１が、１０秒以上６００秒以下である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第２所定期間ｔ２が、１０秒以上６００秒以下である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記酸化還元物質が、フェロセン誘導体である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記フェロセン誘導体が、フェロセンカルボン酸である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記化学物質が、抗体である、請求項１に記載の方法。
  8. 請求項１に記載の方法であって、
    前記陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩから選択される：
    群Ｉ：下記式ＩＶ-(1)〜ＩＶ-(6)で表される陽イオン
    Figure 0005637255
     （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、同一又は異なって、水素原子、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又若しくは分岐鎖状アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を示し、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は、同一又は異なって、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖若しくは分岐鎖状脂肪族炭化水素基、アラルキル基、又はアリール基を示す）。
    群ＩＩ：下記式Ｖ-(1)又はＶ-(2)で表される陰イオン
    Figure 0005637255
     （式中、Ｒｆ1およびＲｆ2は同一又は互いに異なって、炭素数１〜４のペルフルオロアルキル基を示す）。
  9. 請求項１に記載の方法であって、
    イオン液体は、以下から選択され得る：
    １，３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド
    １，３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １，３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート
    １−ブチル−３−エチルイミダゾリウムトリフレート
    １，２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
    １−イロプロピル−３−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
    または
    Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド。
  10. １×１０-8Ｍ以下の非常に低い濃度で試料溶液に含有される化学物質を正確に定量する方法であって、以下の工程を具備する：
    （ａ） 対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、第２参照電極、およびゲル被覆電極を含む測定系を用意する工程、ここで
    前記ゲル被覆電極は、前記第２作用電極と電気的に等価であり、
    前記ゲル被覆電極は、電極本体およびゲルを具備しており、
    前記ゲルは、前記電極本体の表面を被覆しており、
    前記ゲルは、基準電解質およびイオン液体を含有し、
    前記ゲルは水を含有せず、
    前記イオン液体は疎水性かつ不揮発性であり、
    前記イオン液体は陽イオンおよび陰イオンから構成され、
    前記基準電解質は、前記陽イオンおよびハロゲン化物イオンから構成され、
    （ｂ） 対極、第１参照電極、第１作用電極、第２作用電極、およびゲル被覆電極を前記試料溶液に接触させる工程、
    ここで、前記試料溶液は、前記化学物質および酸化還元物質を含有するか、または酸化還元物質により修飾された化学物質を含有し、
    前記第２参照電極は前記試料溶液に接触されず、
    （ｃ） ポテンショスタットを用いて、第１作用電極および第２作用電極に、第１所定期間ｔ１、それぞれ、前記第１参照電極を基準としてＶ１ボルトおよびＶ２ボルトの電圧（Ｖ１＞Ｖ２）を印加して、第１作用電極の表面および第２作用電極の表面において、それぞれ、以下の化学式（Ｉ）および化学式（ＩＩ）によって表される反応を生じさせる工程、
    第１作用電極：
    酸化還元物質（還元体）n+ → 酸化還元物質（酸化体）(n+m)+＋ ｍ・ｅ-
    （Ｉ）
    （ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
    第２作用電極：
    酸化還元物質（酸化体）(n+m)+ ＋ ｍ・ｅ- → 酸化還元物質（還元体）n+ （ＩＩ）
    （ｎは整数を表し、ｍは正の整数を表す）
    （ｄ） 第１所定期間ｔ１が経過した時に、第２作用電極およびゲル被覆電極への電圧の印加を停止する工程、
    （ｅ） 工程（ｄ）の後、第２所定期間ｔ２の間、試料溶液を放置する工程
    （ｆ） 前記第２参照電極１４が前記試料溶液に接触される工程、
    （ｇ） 工程（ｆ）の後、第２作用電極および第２参照電極の間の電圧差ΔＥを測定する工程、および
    （ｈ） 前記化学物質の濃度を以下の式（ＩＩＩ）に基づいて算出する工程、
    ΔＥ＝Ｃ１・ｌｏｇ10（化学物質の濃度）＋Ｃ２ （ＩＩＩ）
    Ｃ１：比例定数
    Ｃ２：定数。
  11. 工程（ｃ）における前記電圧Ｖ１およびＶ２の間の電圧差が、０．３ボルト以上０．６ボルト以下である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第１所定期間ｔ１が、１０秒以上６００秒以下である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記第２所定期間ｔ２が、１０秒以上６００秒以下である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記酸化還元物質が、フェロセン誘導体である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記フェロセン誘導体が、フェロセンカルボン酸である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記化学物質が、抗体である、請求項１０に記載の方法。
  17. 請求項１０に記載の方法であって、
    前記陽イオンおよび前記陰イオンは、それぞれ以下の群Ｉおよび群ＩＩから選択される：
    群Ｉ：下記式ＩＶ-(1)〜ＩＶ-(6)で表される陽イオン
    Figure 0005637255
     （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、およびＲ8は、同一又は異なって、水素原子、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖又若しくは分岐鎖状アルキル基、アラルキル基、又はアリール基を示し、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、およびＲ12は、同一又は異なって、ヘテロ原子を含んでいてもよい直鎖若しくは分岐鎖状脂肪族炭化水素基、アラルキル基、又はアリール基を示す）。
    群ＩＩ：下記式Ｖ-(1)又はＶ-(2)で表される陰イオン
    Figure 0005637255
     （式中、Ｒｆ1およびＲｆ2は同一又は互いに異なって、炭素数１〜４のペルフルオロアルキル基を示す）。
  18. 請求項１０に記載の方法であって、
    イオン液体は、以下から選択され得る：
    １，３−ジメチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
    １−エチル−３−メチルイミダゾリウム ビスペンタフルオロエタンスルフォニルイミド
    １，３−ジエチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １，３−ジエチルイミダゾリウム トリフレート
    １−ブチル−３−エチルイミダゾリウムトリフレート
    １，２−ジメチル−３−エチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １−ブチル−３−メチルイミダゾリウム トリフレート
    １−イロプロピル−３−メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    １，２−ジメチル−３−プロピルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    Ｎ，Ｎ−プロピルメチルピロリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    プロピルトリメチルアンモニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド
    Ｎ，Ｎ−メチルプロピルピペリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド、
    または
    Ｎ−ブチルピリジニウム ビストリフルオロメタンスルフォニルイミド。
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