JP5529023B2 - 抗制御性ｔ細胞抗体と磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療用キット、及びその温熱治療法 - Google Patents

抗制御性ｔ細胞抗体と磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療用キット、及びその温熱治療法 Download PDF

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Description

本発明は、悪性腫瘍の温熱治療用キット、更に詳しくは、抗制御性Ｔ細胞抗体と磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療用キット、およびそれを用いた温熱治療法に関する。
これまで悪性腫瘍を治療するために、外科療法、放射線療法、抗がん剤による化学療法が主として用いられてきた。診断技術や治療技術も大きく進歩し、悪性腫瘍の治療は不可能ではなくなってきている。
しかし、現在でも死亡原因に占める悪性腫瘍の割合は３割を超えており、悪性腫瘍に対する新しい治療法の開発が求められている。転移巣に対する効果的な治療法の開発も望まれている。そのため、新たな治療法として、遺伝子療法、免疫細胞療法、温熱療法などの開発も始まっている。
このような悪性腫瘍の新たな治療法の中で、温熱療法は古代ギリシャから行われてきた古い治療法であり、悪性腫瘍細胞が、正常細胞に比較して、熱に弱いという性質を利用した治療法である。温熱療法として、日本国内では、悪性腫瘍の組織がある部位を全体的に加温する方法が用いられている。
悪性腫瘍の温熱療法として、腫瘍内部に、磁性微粒子を投与、あるいは、集積させた後、この磁性微粒子に交番磁場を照射することにより発熱を誘導して、腫瘍を選択的に加温する方法が知られている。悪性腫瘍の選択的な加温による治療効果の向上のために、磁性微粒子内の発熱体としてマグネタイトを用いること、悪性腫瘍細胞へのマグネタイトの取り込み効率を高めるために、正電荷をもった脂質膜でマグネタイトを被膜したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を用いることなどが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
悪性腫瘍の温熱療法において、磁性微粒子としてＭＣＬを用いる方法は、宿主の抗腫瘍免疫を誘導することが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。複数の癌病巣を有する動物固体において、特定の癌病巣を温熱治療することによって、全身性の抗腫瘍免疫作用が誘導されるため、温熱療法をしなかった癌病巣も縮小、あるいは完全退縮することが、限られた例で報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。しかしながら、この磁性微粒子を用いた温熱療法のみでは、種々の悪性腫瘍において、温熱治療をしなかった癌病巣を、すべて完全退縮させることは困難な場合が多い。従って、種々の悪性腫瘍において、より効果的に全身性の抗腫瘍免疫を誘導し、この温熱治療をしなかった癌病巣をも、退縮せしめることができる温熱療法の開発が求められている。
上記の磁性微粒子を用いる悪性腫瘍の温熱療法において、抗腫瘍免疫が誘導されることを述べたが、このような抗腫瘍免疫系に、制御性Ｔ細胞が関与していることが知られている。この制御性T細胞は、他のＴ細胞の活性化を抑制する作用をもつため、宿主のトータルな抗腫瘍免疫系の働きを抑制することが知られている（非特許文献７）。制御性Ｔ細胞は、細胞障害性Ｔリンパ球結合抗原（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen ; ＣＴＬＡ４）などを発現していることが知られているため、抗ＣＴＬＡ４抗体で、制御性T細胞の働きをブロックすることで、宿主が元来持っている抗腫瘍免疫をより有効に発揮させることができると考えられている（非特許文献８）。現在、この抗制御性Ｔ細胞抗体（抗ＣＴＬＡ４抗体）を、抗腫瘍剤として開発する試みがなされている。
新海ら、Jpn. J. Hyperthermic Oncol., 10, 168-177 (1994) 新海ら、 Biotech. Appl. Biochem, 21, 125-137 (1994) 井藤ら、Cancer Immunol Immunother., 52, 80-88 (2003) 井藤ら、Cancer Immunol Immunother., 55, 320-328 (2006) 柳瀬ら、Jpn. J. Cancer Res. 89, 775-782 (1998) 井藤ら、Jpn. J. Hyperthermic Oncol. 21(3), 139-149 (2005) Tomoyuki Yamaguchi and Shimon Sakaguchi, Seminars in Cancer Biology, 16, 115-123 (2006) Meloro I et. al, Nat Rev Cancer. 7, 95-106 (2007)
本発明が解決しようとする課題は、全身性の抗腫瘍免疫を誘導し、温熱治療をしなかった癌病巣をも、退縮せしめることができる温熱療法を提供することにある。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、悪性腫瘍の温熱療法、特に、磁性微粒子を使用する悪性腫瘍の温熱療法において、制御性Ｔ細胞に対する抗体（抗制御性Ｔ細胞抗体）を併用することより、温熱治療していない癌病巣に対する効果を飛躍的に改善することを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、抗制御性Ｔ細胞抗体と磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療剤とその温熱療法に関する。さらに本発明は、磁性微粒子が、正の電荷を持った脂質で被膜された磁性微粒子であることを特徴とする温熱治療用キットに関する。
さらに本発明は、磁性微粒子が、悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した脂質で被膜された磁性微粒子であることを特徴とする温熱治療用キットに関する。
さらに本発明は、抗制御性Ｔ細胞抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体であることを特徴とする温熱治療用キットに関する。
本発明は、抗制御性Ｔ細胞抗体投与と磁性微粒子を用いた温熱治療とを併用することより、全身性の抗腫瘍免疫を誘導し、温熱治療をしなかった癌病巣をも退縮せしめることができるものである。
本発明に用いる磁性微粒子内の発熱体としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波で発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックスあるいは、パーマロイなどの強磁性金属などが挙げられる。磁性微粒子のサイズは、５μｍ、特に１μｍ以下であることが望ましい。
本発明に用いる磁性微粒子として好ましいものは、正の電荷を持った脂質膜でマグネタイトを被膜して調製したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）である。ＭＣＬの構造を図１に示した。悪性腫瘍細胞の表面は負に帯電していることから、カチオニックなＭＣＬは、悪性腫瘍細胞に静電気的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる。そのため、悪性腫瘍に注入されたＭＣＬは、腫瘍内に長く滞留することが知られている。他に、本発明には、悪性腫瘍細胞に結合する抗体を脂質に結合させ、この脂質でマグネタイトを被膜して調製した磁性微粒子（antibody-conjugated magnetoliposome：ＡＭＬ）も使用できる。その構造を図１に示した。この磁性微粒子は、例えば、特開平３−１２８３３１号公報に記載されている方法、すなわち、磁性微粒子に二官能性架橋剤を結合させた後、これに悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を反応させることにより製造できる。
本発明で用いる電磁場としては、交番磁場を用いることが好ましく、特に、周波数が１ＫＨz〜１０ＭＨｚの電磁波による交番磁場であることが好ましい。
本発明に用いる抗制御性Ｔ細胞抗体は、他のＴ細胞の活性化を抑制する制御性Ｔ細胞の働きをブロックすることで、宿主の抗腫瘍免疫をより有効に発揮させることができる。抗制御性Ｔ細胞抗体は、本発明の効果を奏するものであれば、限定はないが、例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ２５抗体などがあげられる。また、本発明に用いる抗制御性Ｔ細胞抗体には、抗制御性Ｔ細胞抗体の機能を有するその断片およびその断片を含む蛋白質も含まれ、また、その製造法も公知の手法を含め、特に限定されるものではない。
本発明における悪性腫瘍には、あらゆる種類の悪性腫瘍が含まれる。本発明における悪性腫瘍は、例えば、悪性黒色腫などの皮膚癌、乳癌、頭頚部癌、骨肉腫、肺癌、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌であり、より好ましくは、悪性黒色腫などの皮膚癌、乳癌、頭頚部癌であり、さらに好ましくは、悪性黒色腫などの皮膚癌である。
本発明は、悪性腫瘍の温熱治療における抗制御性Ｔ細胞抗体の使用に関する。すなわち、本発明は、悪性腫瘍を有する個体に、抗制御性Ｔ細胞抗体を投与することと、当該悪性腫瘍を、磁性微粒子を用いて温熱治療することを含む悪性腫瘍の温熱治療法に関する。特に、複数の悪性腫瘍を有する個体に、抗制御性Ｔ細胞抗体を投与することと、当該複数の悪性腫瘍のいずれかを、磁性微粒子を用いて温熱治療することを含む悪性腫瘍の温熱治療法に関する。抗制御性Ｔ細胞抗体の投与と磁性微粒子を用いた温熱治療は、同時に、または、時間をおいて、更には、順序を変えて行うこともできる。抗制御性Ｔ細胞抗体は、全身にいきわたせるために静脈内注射が好ましく、一方、磁性微粒子は、悪性腫瘍に局部注射することが好ましいが、これらに限定されるものではない。さらに本発明は、抗制御性Ｔ細胞抗体と磁性微粒子とからなる悪性腫瘍の温熱治療剤に関するものである。
以下において、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ ＭＣＬの作製
ジラウロイルホスファチジルコリン（SIGMA）９mg、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（SIGMA）９mg、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（相互薬工）４．５mgを３mlのクロロホルムで溶解後、エバポレーターにて減圧乾燥し、ナス型コルベン内壁に脂質膜を作製した。これに、マグネタイト溶液（戸田工業社製）２０mg/２mlを加え、脂質膜が剥離するまで、約１０分間ボルテックスミキサーで処理した。これに対して、１分間の超音波処理と３０秒間の氷冷下放置を繰り返し、計１時間の超音波処理を行った。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にてpHを７．０に調節後、10,000Gで５０分間、４℃で遠心分離を行い、沈殿物としてＭＣＬを回収した後、超純水に懸濁した。
実施例２ 制御性T細胞抗体の精製
マウスＣＴＬＡ４抗体のハイブリドーマ細胞（American type culture collection (ATCC) Number HB-304）を培養し、その培養液を130Gで１０分間、４℃で遠心した。得られた上清を、再度、10,000Gで１５分間、４℃で遠心分離し上清を採取した。この上清を氷冷し、攪拌下に１００mlあたり２７．７ｇの硫酸アンモニウムを徐々に加え溶解し１時間放置した。これを、10,000Gで5分間、4℃で遠心し、得られた沈殿物をリン酸ナトリウム緩衝液約０．8〜１．２mlで溶解後、分子量10,000でカットされる透析膜を用いて、リン酸ナトリウム緩衝液 に対して透析を２時間行った。透析終了後、10,000G、１５分間、４℃で遠心し上清を得た。
次いで、プロテインＧカラム（ハイトラップ プロテインG HP、GE ヘルスケアー社）にて精製した。リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄したカラムに、４℃で保存したサンプルをアプライした。リン酸ナトリウム緩衝液10mlで洗浄後、グリシン−HCl緩衝液７mlを流してサンプルを溶出した。溶出液にトリス−ＨＣｌ緩衝液２００μlを添加後、透析膜を用いて、ＰＢＳに対して透析を２時間行った。
次いで、ＦＰＬＣ(GE ヘルスケアー社)で精製した。０．０７Ｍビストリス−０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液を用いてアプライし、２ＭＮａＣｌ溶液にて溶出した。ついで、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液を用いて、ゲルクロマトグラムカラム(GE ヘルスケアー社)にて精製した。得られたサンプルのタンパク濃度を測定後、精製モノクロナール抗体として動物実験に用いた。
実施例３ 動物実験モデル
悪性腫瘍の温熱治療において、より効果的に全身性の抗腫瘍免疫を誘導し、温熱治療をしていない癌病巣をも退縮せしめることを目指して、モデル実験系を作成した。
マウス悪性黒色腫（メラノーマ）細胞Ｂ１６Ｆ０（American type culture collection（ATCC）Number CRL-6322）を、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＰＢＳで培養皿を２度洗浄した後、トリプシン（０．１２５％）溶液で処理した。処理後、培地を添加し、ピペッティング操作で細胞を懸濁させた後、４℃、1,200rpmで１０分間遠心分離し細胞を集めた。更に、ＰＢＳで２回洗浄後、細胞濃度を１．０×１０６個／１００μlに調整した。この細胞懸濁液１００μlを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社）（７週齢、メス）の右背部皮下に注射針（29ゲージ×1/2”）を用いて移植した。右背部への接種から数え６日後に、左背部皮下に同細胞をまったく同様の方法で移植した。この腫瘍移植のスケジュールを図２に示した。マウスの腫瘍体積は、以下の式で算出した。
腫瘍体積（mm３）＝長径（mm）×短径（mm）×短径（mm）／２
このモデルにおける右左の腫瘍体積の変化を図３に示した。左右いずれの腫瘍も癌細胞の移植から数日後から目視・触診によって検出され、その後は増大の一途をたどった（図３）。
実施例４ 抗制御性Ｔ細胞抗体の投与を伴う温熱治療法とその温熱治療用キット
より効果的に全身性の抗腫瘍免疫を誘導せしめることにより、温熱治療をしていない癌病巣をも退縮せしめることができる温熱療法の開発を目指した。即ち、実施例３で示した動物モデルにおいて、右背部に出現した腫瘍を温熱治療することにより、温熱治療をしていない左の腫瘍に対する抗腫瘍効果を検討した。温熱治療と抗制御性Ｔ細胞抗体投与の併用治療を含む以下の４群（(1)無治療群、(2)抗体投与群、(3)温熱治療群、(4)温熱治療と抗制御性Ｔ細胞抗体投与の併用群）の比較実験を行った。
左背部へ腫瘍細胞を移植した翌日に、実施例２で調製した抗体６０μgを腹腔内に投与した（図２）。温熱治療は、その翌日から右背部の腫瘍に対して行った。ネンブタールで麻酔したマウスの右腫瘍（５〜７mm）に、実施例１で調製したＭＣＬ溶液１００μl（マグネタイト量として約３mg相当分）を、シリンジポンプを用いて１０分間〜３０分間かけて投与した。投与後、ただちに、交番磁場照射装置（第一高周波工業社）を用いて、１００ＫＨｚの交番磁場を右腫瘍に対して照射した。光ファイバー型温度計（FS600-2M型、安立計器社）を用いて右腫瘍表面の温度を測定し、温度が４６℃となるよう照射装置の出力を調整し、３０分間の温熱治療を右腫瘍に対して行った。磁場照射は、翌日及び翌々日にも同様に行った（図２）。ＭＣＬは腫瘍内に滞留するため、１回目の磁場照射直前に１回のみ投与した。この処理群を温熱治療と抗制御性Ｔ細胞抗体投与の併用群とした。
さらに、対照群として、全く治療をしない群（無治療群）、抗体投与のみをした群（抗体投与群）、温熱治療のみをした群（温熱治療群）を設けた。各群の左背部、及び、右背部の腫瘍体積の変化を、図３、図４、図５、図６に示した。無治療群はすでに、実施例３で説明した。抗体投与群（図４）では、左右いずれの腫瘍においても、その増大が認められた。幾分、左腫瘍の増大が、無治療群（図３）に比較して遅延する傾向が見られたが、大半の動物で、腫瘍の増大が認められた。右腫瘍の増大は、無治療群とほぼ同様であった。温熱治療群（図５）では、温熱治療した右腫瘍の退縮が温熱治療後に観察されたが、温熱治療をしていない左腫瘍に関しては、腫瘍の増大が約半数で顕著に認められた。一方、併用群（温熱治療＋抗体投与）（図６）では、全マウスにおいて、温熱治療をしていない左腫瘍の増大が認められなかった。また、温熱治療をした右腫瘍についても、顕著な腫瘍の退縮が全例で認められた。このことから、抗体投与と右腫瘍に対する温熱治療を併用することにより、温熱治療をしていない左腫瘍に対する抗腫瘍効果が認められた。また、温熱治療群（図５）との比較から、抗体の併用によって、温熱治療をした右腫瘍に対する効果も減弱されることなく、むしろ、増強される傾向が認められた。
図７に、右背部への腫瘍移植から数えて２１日目において、腫瘍を有する動物の匹数を左右の腫瘍ごとに示した。左腫瘍は出現した数であり、右腫瘍は残存する数を意味する。腫瘍の存在は、触診・目視により調べ、最小の検出サイズは、約１０mm3であった。図７の様に、温熱治療をしていない左腫瘍は、無治療群では全例（８例）で、抗体投与群では８例中６例で、温熱治療群では７例中３例で認められたが、併用群（温熱治療＋抗体投与）では全例（８例）で、その出現が認めらなかった。
このように、磁性微粒子を用いた温熱治療と抗制御性Ｔ細胞抗体投与の併用により、効果的に全身性の抗腫瘍免疫を誘導せしめることが可能となり、温熱治療をしていない癌病巣をも退縮せしめうることが示された。
本発明の悪性腫瘍の温熱治療剤および治療法は、従来の温熱療剤および温熱治療法に比べ、遠隔部位にある温熱治療をしない癌病巣に対しても、高い抗腫瘍効果を示す。
本発明に使用する磁性微粒子であるマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）と、抗体結合マグネタイトリポソーム（ＡＭＬ）の構造を示す。 治療の全体スケジュールを示す。右背部への癌移植、左背部への癌移植、抗体投与、及び、右背部の腫瘍に対する磁性微粒子を用いた温熱治療のスケジュールを示す。 無治療群の左右の腫瘍体積の変化を示す。 抗体投与群の左右の腫瘍体積の変化を示す。 温熱治療群の左右の腫瘍体積の変化を示す。 温熱治療と抗体投与を併用した群の左右の腫瘍体積の変化を示す。 ２１日目において、左右の腫瘍を有する動物の匹数を示す。

Claims (15)

  1. （ｉ）抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤；および
    （ｉｉ）マグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を含む薬剤、ここでＭＣＬは、Ｆｅ３Ｏ４の組成を有するマグネタイトを含み、少なくとも一つの脂質で被膜され、そしてここでＭＣＬは、交番磁場に暴露されると発熱する、
    を含む、悪性腫瘍の温熱治療用キット。
  2. 少なくとも一つの脂質が、正電荷脂質を含む、請求項１に記載のキット。
  3. ＭＣＬが、悪性腫瘍細胞に選択的に結合してＭＣＬを悪性腫瘍細胞に標的化する抗体を結合した少なくとも一つの脂質で被膜されたＦｅ３Ｏ４の組成を有するマグネタイトを含む、請求項１に記載のキット。
  4. 少なくとも一つの脂質が、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＩＰＥ）、およびＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）を含む、請求項１に記載のキット。
  5. 悪性腫瘍の温熱治療が、抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤の使用およびＭＣＬを含む薬剤の使用を含む、請求項１に記載のキット。
  6. 悪性腫瘍の温熱治療が、温熱治療をすることを含み、ここで温熱治療が対象の腫瘍にＭＣＬを含む薬剤を投与することおよび次に対象を交番磁場に暴露することを含む、請求項５に記載のキット。
  7. 悪性腫瘍の温熱治療が、抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤の投与および温熱治療をすることを同時に、または時間をおいて任意の順序で実施することを含む、請求項６に記載のキット。
  8. 悪性腫瘍の温熱治療が、ＭＣＬを含む薬剤を投与後、少なくとも三日、対象を交番磁場に暴露することを含む、請求項６に記載のキット。
  9. 悪性腫瘍の温熱治療が、ＭＣＬを含む薬剤を投与する前に抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤を対象に投与することを含む、請求項６に記載のキット。
  10. 悪性腫瘍の温熱治療が、ＭＣＬを含む薬剤を投与後および少なくとも一回の交番磁場の適用後に抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤を対象に投与することを含む、請求項６に記載のキット。
  11. 悪性腫瘍の温熱治療が、対象の交番磁場への初回暴露と同日に抗ＣＴＬＡ４抗体を含む薬剤およびＭＣＬを含む薬剤を対象に投与することを含む、請求項６に記載のキット。
  12. 悪性腫瘍の温熱治療が、対象を交番磁場に一回の暴露あたり３０分間暴露することを含む、請求項６に記載のキット。
  13. 悪性腫瘍の温熱治療が、対象を１００ＫＨｚの周波数を有する交番磁場に暴露することを含む、請求項６に記載のキット。
  14. 悪性腫瘍の温熱治療が、対象の交番磁場への暴露中に腫瘍の温度をモニタリングすることを含む、請求項６に記載のキット。
  15. 悪性腫瘍の温熱治療が、対象の交番磁場への暴露中に交番磁場の出力を調整して腫瘍の温度を４６℃に保つことを含む、請求項６に記載のキット。
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