JPWO2005079843A1 - 新規リポソーム - Google Patents
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Abstract
抗HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用に用いることができる製剤、医薬組成物及びその製造方法を提供する。抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム、該リポソームを含む医薬組成物、及び磁性微粒子を含むリポソームを抗HER2抗体と接触させることを含む該リポソームを製造するための方法。
Description
本発明は、抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム、それを含む医薬組成物、及びその製造方法に関する。
温熱療法は、有望ながん療法である(非特許文献1及び2)。しかし、周囲の健康な組織に損害を与えることのない温度にまで、局所の腫瘍領域だけを加熱することが困難であるという技術的な課題があった(非特許文献3及び4)。
この課題を克服するために、温熱療法には磁性微粒子が用いられている。磁性微粒子を腫瘍組織のみに蓄積させることができれば、ヒステリシスロスによって交番磁場(AMF)において発熱を生じることによって、がんに特異的な温熱療法を達成することができる(非特許文献5)。
そこで、細胞内温熱療法のメディエーターとして、マグネタイト陽イオン性リポソーム(MCLs)が開発されている(非特許文献6−8)。これらの陽イオン性リポソームは、腫瘍細胞への吸着および取込みが改善されており、中性に荷電したマグネタイトリポソームに比べて10倍高い腫瘍細胞に対する親和性を有する(非特許文献6)。
MCL介在温熱療法は、B16マウスメラノーマ(非特許文献9)、T−9ラット神経膠腫(非特許文献8)、Os515ハムスター骨肉腫(未発表の結果)およびウサギ舌のVX−7扁平上皮がん(非特許文献10)を含む、数種類の腫瘍を有する動物において効果を示すことが知られている。
しかし、MCL介在温熱療法が腫瘍の完全寛解を誘導するために非常に有効性が確認されているにもかかわらず、これらの陽イオン性MCLsには、直接腫瘍組織に注入しなければならないという欠点があった。
この欠点を克服するために、磁性微粒子を含む抗体コンジュゲートリポソーム(イムノリポソーム)が開発され、すでに、ヒト神経膠腫細胞に対するマウスG22モノクローナル抗体(MAb)(非特許文献11)及びヒト腎細胞がん腫に対するマウスG250MAb(非特許文献12)を用いるイムノリポソームが構築され、そして、動物モデルを用いてそれらの腫瘍特異的ターゲッティング能力を明らかにした。
ヒト上皮成長因子受容体−2(HER2)は、乳がんの20〜30%において過剰発現するが、特定の正常組織においては低いレベルで発現する(非特許文献13)。そして、下記の2つの考察にもとづき、抗体ベース療法の可能な標的であると認められていた。
第一に、HER2過剰発現が、腫瘍悪性度に関与することから、抗HER2抗体は、腫瘍増殖の重要なメディエーターを妨害することができる。また、ネズミの抗HER2 MAb(muMAb4D5)は、インビトロ(非特許文献14)及びインビボ(非特許文献15)でHER2を過剰発現する乳がん細胞の増殖を阻害する。この抗体のヒト化修飾物であるハーセプチン(トラスツズマブ)は、免疫原性ポテンシャルを減らす(非特許文献16)、一方、細胞増殖阻害特性は保持しており、現在臨床で用いられている。
第二に、安定的に過剰発現した腫瘍細胞表面上のHER2は、理想的な標的抗原として薬剤デリバリーシステム(DDS)のために利用することができる。
抗HER2イムノリポソームが、腫瘍標的剤形として開発され、それらはHER2を過剰発現する腫瘍に特異的に結合し、そして、取り込まれる。抗HER2イムノリポソームは、乳がん療法での二つの役割、すなわち、細胞障害性薬物を運搬するDDSとしての役割と、それ自身が抗腫瘍活性を有するハーセプチンを含むことによる役割とがある。
ハーセプチンは、それ自体で投与すると、抗増殖効果を有し、また、化学療法と組み合わせても有効である(非特許文献17)。実際に、パークらは、ドキソルビシンを含む抗HER2イムノリポソームが、HER2を過剰発現する腫瘍細胞を標的とし、ハーセプチンとドキソルビシンの細胞障害性効果を重ね合わせたことを報告している(非特許文献18)。しかし、抗HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用については、いまだ何らの報告もなされていない。
したがって、本発明は抗HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法が同時に施行できる製剤を提供することを目的としている。
ジェイ・バンダージー(J.Van der Zee)著、アニュアルズ・オブ・オンコロジー(Annals of oncology)、13巻、1173−1184頁、2002年
ピー・モローズら(P.Moroz et al)著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ハイパーサーミア(International journal of hyperthermia)、18巻、267−284頁、2002年
エー・ジョーダンら(A.Jordan et al)著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ハイパーサーミア(International journal of hyperthermia)、9巻、51−68頁、1993年
ティー・ミナミムラら(T.Minamimura)著、アニュアルズ・オブ・オンコロジー(Annals of oncology)、16巻、1153−1158頁、2000年
エム・シンカイら(M.Shinkai et al)著、日本ハイパーサーミア学会誌、10巻、168−177頁、1994年
エム・シンカイら(M.Shinkai et al)著、日本癌学会誌、87巻、1179−1183頁、1996年
エム・ヤナセら(M.Yanase et al)著、日本癌学会誌、88巻、630−632頁、1997年
エム・ヤナセら(M.Yanase et al)著、日本癌学会誌、89巻、463−469頁、1998年
エム・スズキら(M.Suzuki et al)著、メラノーマ・リサーチ(Melanoma Research)、13巻、129−135頁、2003年
エイチ・マツノら(H.Matsuno et al)著、日本ハイパーサーミア学会誌、17巻、141−150頁、2001年
ビー・レら(B.Le et al)著、化学工学会誌、34巻、66−72頁、2001年
エム・シンカイら(M.Shinkai et al)著、日本癌学会誌、92巻、1138−1145頁、2001年
エム・エフ・プレスら(M.F.Press et al)著、オンコジーン(Oncogene)、5巻、953−962頁、1990年
ジー・ディー・ルイスら(G.D.Lewis et al)著、キャンサー・イムノロジー、イムノセラピー(Cancer immunology,immunotherapy)、37巻、255−263頁、1993年
ジェイ・バセルガら(J.Baselga et al)著、ブレスト・キャンサー・リサーチ(Breast cancer research)、29巻、127−138頁、1994年
ピー・カーターら(P.Carter et al)著、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)、89巻、4285−4289頁、1992年
エム・ペグラムら(M.Pegram et al)著、オンコジーン(Oncogene)、18巻、2241−2251頁、1999年
ジェイ・ダブリュー・パークら(J.W.Park et al)著、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)、92巻、1327−1331頁、1995年
抗HER2抗体療法と腫瘍特異性温熱療法との併用療法のための物及びその製造方法を提供する。
本発明者等は、抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを構築し、抗HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用の実現可能性を検討したところ、予想外にも、抗HER2抗体療法および腫瘍特異性温熱療法の組み合わせが強い細胞傷害効果を有するという知見を得て、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、下記の(1)〜(3)である。
(1)抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム。
(2)前記(1)に記載のリポソームを含む、医薬組成物。
(3)磁性微粒子を含むリポソームを抗HER2抗体と接触させることを含む、前記(1)に記載のリポソームを製造するための方法。
(1)抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム。
(2)前記(1)に記載のリポソームを含む、医薬組成物。
(3)磁性微粒子を含むリポソームを抗HER2抗体と接触させることを含む、前記(1)に記載のリポソームを製造するための方法。
本発明は、抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームに関する。
HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor−2)タンパク質は、乳がん細胞表面に過剰発現している上皮細胞増殖因子(epidermal growth factor:EGF)のレセプターである。チロシンキナーゼ活性を有する分子量185kDaの膜受容型タンパクで、上皮細胞の分化や増殖などにかかわる重要な因子である。このHER2タンパク過剰発現のある乳がん患者は予後不良であり、ホルモン療法の治療抵抗性、抗ガン剤への感受性が低い。
本発明において、抗HER2抗体とは、HER2タンパク質を抗原として作製された抗体をいい、従来公知の任意の方法を用いて調製することができる。抗体は、モノクローン又はポリクローンのいずれも、本発明に用いることができる。
本発明に用いる磁性微粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく使用でき、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックあるいはパーマロイなどの強磁性金属等を例示できる。
なお、前記磁性微粒子は、100μm以下、特に1μm以下の粒径であることが望ましい。
なお、前記磁性微粒子は、100μm以下、特に1μm以下の粒径であることが望ましい。
また、本発明に用いる抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームとは、表面に抗HER2抗体を結合したリポソームである。抗HER2抗体を結合したリポソームは、HER2をその表面上に発現する細胞、特に乳がん細胞の付近に選択的に集中するので、乳がん細胞以外を加熱することなく温熱療法を行うことができる。
したがって、本発明の医薬組成物は、乳がんの処置に適用することができる。
また、本発明は、抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを有効成分として含む医薬組成物にも関する。
次に本発明のリポソーム製剤を乳がん治療に用いる際の処方や用法について詳しく説明する。
本発明のリポソーム製剤を分散する溶媒としては、水系溶媒、例えば、蒸留水;生理的食塩水;リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液などを使用することができる。このような水系溶媒のpHは5〜10が挙げられ、好ましくは6〜8である。
本発明のリポソーム製剤を分散する溶媒としては、水系溶媒、例えば、蒸留水;生理的食塩水;リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液などを使用することができる。このような水系溶媒のpHは5〜10が挙げられ、好ましくは6〜8である。
本発明の薬剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、0.001μg/kg体重/日〜1000μg/kg体重/日、好ましくは0.001μg/kg体重/日〜100μg/kg体重/日である。
また、本発明は、磁性微粒子を含むリポソームを抗HER2抗体と接触させることを含む、抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームを製造するための方法にも関する。
上記のように、本発明のリポソームは、抗HER2抗原を、磁性微粒子を含むリポソームの表面に結合していることが特徴であり、両者を結合させる方法としては、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、次の方法を挙げることができる:
抗体をN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)によって処理する。それから、SPDP修飾抗体を1,4−ジチオスレイトールも用いて還元する。還元した抗体を磁性微粒子担荷リポソームに添加する。続いて、ナトリウムリン酸緩衝液中でインキュベーションする。
抗体をN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)によって処理する。それから、SPDP修飾抗体を1,4−ジチオスレイトールも用いて還元する。還元した抗体を磁性微粒子担荷リポソームに添加する。続いて、ナトリウムリン酸緩衝液中でインキュベーションする。
細胞培養および抗体
SKBr3ヒト乳がん細胞(ATCC)は、1.5mMのL−グルタミン、10%ウシ胎仔血清および抗生物質(100U/mlペニシリンGおよび0.1mg/mlストレプトマイシン)添加マッコイ5a培地(ギブコBRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド)中で培養した。細胞を5%CO2を含む雰囲気中、37℃で増殖させた。
SKBr3ヒト乳がん細胞(ATCC)は、1.5mMのL−グルタミン、10%ウシ胎仔血清および抗生物質(100U/mlペニシリンGおよび0.1mg/mlストレプトマイシン)添加マッコイ5a培地(ギブコBRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド)中で培養した。細胞を5%CO2を含む雰囲気中、37℃で増殖させた。
SKBr3細胞を、フローサイトメトリー、ELISAおよび免疫組織化学的アッセイによってHER2発現について広範囲に特徴づけた。
臨床用として市販されている抗HER2 MAb ハーセプチンおよび抗CD20 MAb リツキサン(ハーセプチンのアイソタイプ照合コントロールMAb)を日本ロシュ(東京)から入手した。
臨床用として市販されている抗HER2 MAb ハーセプチンおよび抗CD20 MAb リツキサン(ハーセプチンのアイソタイプ照合コントロールMAb)を日本ロシュ(東京)から入手した。
磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
イムノリポソーム及び磁性微粒子を含むリポソーム(抗体なし)の調製方法はすでに記載されている。磁性微粒子(Fe3O4;平均粒径、10ナノメートル)は、戸田工業から供与された。
イムノリポソーム及び磁性微粒子を含むリポソーム(抗体なし)の調製方法はすでに記載されている。磁性微粒子(Fe3O4;平均粒径、10ナノメートル)は、戸田工業から供与された。
磁性微粒子担荷リポソームをコロイド性マグネタイト、およびホスファチジルコリン/ホスファチジルエタノールアミン(比、2:1)およびN−(6−マレイミドカプロイルオキシ)−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンからなる脂質混合物を用いて調製した。
リポソーム上の抗体の固定化のために、抗体(ハーセプチンまたはリツキサン)をN−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオナート(SPDP)によって処理した。それから、SPDP修飾抗体を1,4−ジチオスレイトール(25mM))も用いて還元した。還元した抗体を70μg抗体/mgマグネタイトの濃度で磁性微粒子担荷リポソームに添加した。続いて、リン酸ナトリウム緩衝液中で4℃で20時間インキュベーションした。抗体およびマグネタイト濃度を、タンパク質アッセイ(BCA protein Assay Reagent,Pierce,Rockford,Ill)によって、そして、チオシアン酸カリウム方法によって、それぞれ、測定した。イムノリポソームのサイズを、動的光散乱分光光度計(FRAR1000、大塚電子)を使用して測定した。
磁性微粒子担荷イムノリポソーム上のハーセプチンの抗増殖活性
SKBr3細胞を、指示濃度で抗体または磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地を用いて2×104細胞/ウェルで、6ウェル細胞培養プレートに播種した。抗増殖活性を、8日間のインキュベーション後に測定した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー色素排除法で測定し、そして、相対細胞数を算出した。
SKBr3細胞を、指示濃度で抗体または磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地を用いて2×104細胞/ウェルで、6ウェル細胞培養プレートに播種した。抗増殖活性を、8日間のインキュベーション後に測定した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー色素排除法で測定し、そして、相対細胞数を算出した。
SKBr3細胞による、抗HER2抗体を結合した磁性微粒子を含むリポソームの取り込み
SKBr3セルを、28.6pgマグネタイト/セル(0.5μg抗体/ml)の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームまたはリポソーム(抗体なし)を含む実験的培地を用いて7×105細胞/ウェルで6ウェル細胞培養プレートに播種し、往復シェーカー(SHK−320、旭テクノグラス、70rpm)によって37℃で穏やかに振盪しながらインキュベーションした。1、4、8または24時間インキュベーション後に、細胞をPBSで二回洗浄し、ラバーポリスマンを使用して回収し、そして、マグネタイト濃度を測定した。
SKBr3セルを、28.6pgマグネタイト/セル(0.5μg抗体/ml)の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームまたはリポソーム(抗体なし)を含む実験的培地を用いて7×105細胞/ウェルで6ウェル細胞培養プレートに播種し、往復シェーカー(SHK−320、旭テクノグラス、70rpm)によって37℃で穏やかに振盪しながらインキュベーションした。1、4、8または24時間インキュベーション後に、細胞をPBSで二回洗浄し、ラバーポリスマンを使用して回収し、そして、マグネタイト濃度を測定した。
磁性微粒子誘導温熱療法
磁性微粒子を用いるインビトロの温熱療法実験を、先に記載された方法を使用して実行した。概略すると、SKBr3細胞を、磁性微粒子担荷イムノリポソームでの処理の前に、サブコンフルエントまで培養した。次に、細胞を、28.6pgのマグネタイト/セル(0.5mg抗体/ml)の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地で培養した。マグネタイト取込みの4時間後に、細胞をマイクロ遠心チューブに集め、穏やかに遠心分離し、細胞ペレットを形成させた。チューブを、高周波磁場発生器(360kHz、120Oe、第一高周波)のコイルの中央に配置した。細胞ペレットの温度を光ファイバ・プローブ(安立計器)をその中央に挿入することで測定し、ペレットを手動で磁場強度を調整することによって恒温に維持した。交番磁場(AMF)照射時間は、30分であった。AMF照射の間、周囲温度を37℃に維持した。処理した細胞を2×104細胞/ウェルで6ウェル細胞培養プレートに再播種した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した。
磁性微粒子を用いるインビトロの温熱療法実験を、先に記載された方法を使用して実行した。概略すると、SKBr3細胞を、磁性微粒子担荷イムノリポソームでの処理の前に、サブコンフルエントまで培養した。次に、細胞を、28.6pgのマグネタイト/セル(0.5mg抗体/ml)の濃度で磁性微粒子担荷イムノリポソームを含む実験的培地で培養した。マグネタイト取込みの4時間後に、細胞をマイクロ遠心チューブに集め、穏やかに遠心分離し、細胞ペレットを形成させた。チューブを、高周波磁場発生器(360kHz、120Oe、第一高周波)のコイルの中央に配置した。細胞ペレットの温度を光ファイバ・プローブ(安立計器)をその中央に挿入することで測定し、ペレットを手動で磁場強度を調整することによって恒温に維持した。交番磁場(AMF)照射時間は、30分であった。AMF照射の間、周囲温度を37℃に維持した。処理した細胞を2×104細胞/ウェルで6ウェル細胞培養プレートに再播種した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した。
磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
磁性微粒子(ハーセプチン−コンジュゲートマグネトリポソーム(HMLs))を組み込んだ抗HER2イムノリポソームを構築し、HMLsが抗HER2抗体療法を温熱療法と組合わせることができるかどうか検討した。磁性微粒子を組み込んでいる抗CD20イムノリポソーム(リツキサンコンジュゲートマグネトリポソーム(RMLs))をコントロールとして調製した。HMLsの固定化密度および平均粒径は、それぞれ、55.6±6μg抗体/mgマグネタイトおよび138±7.6nmであった。これらの値は、RMLsのそれと同様である(表1)。
磁性微粒子(ハーセプチン−コンジュゲートマグネトリポソーム(HMLs))を組み込んだ抗HER2イムノリポソームを構築し、HMLsが抗HER2抗体療法を温熱療法と組合わせることができるかどうか検討した。磁性微粒子を組み込んでいる抗CD20イムノリポソーム(リツキサンコンジュゲートマグネトリポソーム(RMLs))をコントロールとして調製した。HMLsの固定化密度および平均粒径は、それぞれ、55.6±6μg抗体/mgマグネタイトおよび138±7.6nmであった。これらの値は、RMLsのそれと同様である(表1)。
磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製方法は、以前より報告されている。マウスMAbsの場合には、固定化密度は、約40mg抗体/mgマグネタイトであった。本研究において、同様の結果が、「ヒト化」抗体について得られた。先の研究において、磁性微粒子を含むFab’フラグメント−コンジュゲートイムノリポソームが調製され、全体抗体に比べて2.4倍高いモル固定化という結果となった。Fab’フラグメント−コンジュゲートイムノリポソームは、DDSのための有利な効果を有することができる。他方、ハーセプチンのヒト定常(Fc)ドメインは、HER2を過剰発現するがんに対して、抗体依存性細胞障害(ADCC)を示す。本研究において、インビトロでADCCを与えることができる磁性微粒子を含む全ハーセプチン−コンジュゲートイムノリポソームが調製された。
磁性微粒子を含むイムノリポソームの調製
図1は、異なる濃度でのSKBr3細胞に対するHMLsの抗増殖効果を示す。遊離のハーセプチンのように、HMLsは抗増殖効果を有した。用量反応曲線は、最大効果が、0.5μg抗体/mlの濃度で達成され、約50%の乳ガン細胞を殺した。対照的に、遊離のリツキサン又はRMLsが加えられたときには、抗増殖効果は観察されなかった。これらの結果は、ハーセプチン−コンジュゲートイムノリポソームが、その抗増殖活性を保持していることを示唆する。
図1は、異なる濃度でのSKBr3細胞に対するHMLsの抗増殖効果を示す。遊離のハーセプチンのように、HMLsは抗増殖効果を有した。用量反応曲線は、最大効果が、0.5μg抗体/mlの濃度で達成され、約50%の乳ガン細胞を殺した。対照的に、遊離のリツキサン又はRMLsが加えられたときには、抗増殖効果は観察されなかった。これらの結果は、ハーセプチン−コンジュゲートイムノリポソームが、その抗増殖活性を保持していることを示唆する。
SKBr3細胞による磁性微粒子のイムノリポソーム介在摂取
その抗増殖効果に加えて、抗HER2イムノリポソームを腫瘍標的製剤として用いることができる。そこで、HMLsが、SKBr3セルに取り込まれるかどうかを検討した。SKBr3細胞による磁性微粒子の摂取を図2に示す。HMLsについては、磁性微粒子は、急速にSKBr3細胞内に取り込まれ、最大摂取は4時間後、総添加磁性微粒子(28.6pgマグネタイト/細胞(0.5mg抗体/ml))の56.7%(16.5±0.9pg−マグネタイト/細胞)であった。他方、少量の抗体のない磁性微粒子担荷リポソーム(マグネトリポソーム(MLs))だけが、SKBr3セルに取り込まれた。RMLsについては、総添加磁性微粒子の11.7%のみが、取り込まれた。
その抗増殖効果に加えて、抗HER2イムノリポソームを腫瘍標的製剤として用いることができる。そこで、HMLsが、SKBr3セルに取り込まれるかどうかを検討した。SKBr3細胞による磁性微粒子の摂取を図2に示す。HMLsについては、磁性微粒子は、急速にSKBr3細胞内に取り込まれ、最大摂取は4時間後、総添加磁性微粒子(28.6pgマグネタイト/細胞(0.5mg抗体/ml))の56.7%(16.5±0.9pg−マグネタイト/細胞)であった。他方、少量の抗体のない磁性微粒子担荷リポソーム(マグネトリポソーム(MLs))だけが、SKBr3セルに取り込まれた。RMLsについては、総添加磁性微粒子の11.7%のみが、取り込まれた。
我々は、以前、G22(G22MLs)およびG250(G250MLs)とコンジュゲートした磁性微粒子担荷イムノリポソームを開発し、それらは、それぞれヒトU251神経膠腫細胞およびMN抗原提示性マウス腎細胞がん細胞に特異的に取り込まれた。最大摂取量は、それぞれ、G22MLsとG250MLsについて、約80%と60%であった。他方、これらの細胞による非特異的抗体コンジュゲートイムノリポソームの摂取は、10〜20%であった。この摂取実験の結果は、以前の研究と同様であった。RMLの摂取は、抗体タンパクと標的細胞との間の非特異的相互作用により生じる非特異的摂取であると考えられる。この結果は、HMLsの摂取が、抗体依存性であり、HER2を過剰発現するがん細胞に特異的だったことを示す。
磁性微粒子を取り込んでいる抗HER2イムノリポソームによって誘導される温熱療法
次に、交番磁場(AMF)が、HMLsによって処理されたSKBr3セルにおいて熱を生じるか否かを検討し、細胞内の温熱療法を観察した。図3Aは、360kHzおよび120OeでのAMF照射の間の磁性微粒子担荷イムノリポソームで処理された細胞ペレットの温度を示す。熱は、HMLsを取り込んでいるSKBr3細胞において発生した(16.5pgマグネタイト/セル;図2)。これらの細胞の温度は急速に上昇し、42.5℃に達した。そして、それは温熱療法に有効な温度であって、それからAMFの強さを制御することによって30分の間のその温度に維持された。対照的に、未処理細胞(0pgマグネタイト/細胞)及びRMLsで処理された細胞(11.7pgマグネタイト/細胞)においては、AMF照射の間の温度は、それぞれ1及び2℃増加したに過ぎなかった。
次に、交番磁場(AMF)が、HMLsによって処理されたSKBr3セルにおいて熱を生じるか否かを検討し、細胞内の温熱療法を観察した。図3Aは、360kHzおよび120OeでのAMF照射の間の磁性微粒子担荷イムノリポソームで処理された細胞ペレットの温度を示す。熱は、HMLsを取り込んでいるSKBr3細胞において発生した(16.5pgマグネタイト/セル;図2)。これらの細胞の温度は急速に上昇し、42.5℃に達した。そして、それは温熱療法に有効な温度であって、それからAMFの強さを制御することによって30分の間のその温度に維持された。対照的に、未処理細胞(0pgマグネタイト/細胞)及びRMLsで処理された細胞(11.7pgマグネタイト/細胞)においては、AMF照射の間の温度は、それぞれ1及び2℃増加したに過ぎなかった。
図3Bは、AMF照射の後の生細胞数を示す。SKBr3細胞がRMLsによって処理され、AMFによって照射を受けるとき、未処置のコントロールと比較して、有意な成長阻止は観察されなかった。対照的に、細胞がHMLsによって処理されるとき、生細胞数はコントロールのそれの約4分の1に減少した。HMLs処理だけの場合には約2分の1に減少したことから、温熱によって抗HER2抗体の抗腫瘍効果が増強された。また、HML処理24時間後であってもSKBr3細胞には温熱療法に充分な量(15.6±0.27pgマグネタイト/細胞)の磁性微粒子が残存していたことから反復温熱療法もおこなった(図2)。AMF照射を24時間の間隔で2回繰り返したとき、図3Aに示すものと同様の温度プロフィールを示し(データは示さず)、生細胞数の激しい減少を引き起こし、そして細胞増殖が少なくとも8日間強く抑制された。そして驚くべきことに、3回AMF照射を繰り返すことで、SKBr3細胞は死滅するという格別の効果が見られた。これらの結果は、HMLsによって処理されたHER2を過剰発現するがん細胞がAMF照射によって特異的に加熱され、そして、HMLsによって介在されるその温熱療法が強い抗がん効果を有することを示唆する。
Claims (3)
- 抗HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム。
- 請求項1に記載のリポソームを含む、医薬組成物。
- 磁性微粒子を含むリポソームを抗HER2抗体と接触させることを含む、請求項1に記載のリポソームを製造するための方法。
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