WO2005079843A1

WO2005079843A1 - 新規リポソーム

Info

Publication number: WO2005079843A1
Application number: PCT/JP2005/001077
Authority: WO
Inventors: Takeshi Kobayashi; Akira Ito; Hiroyuki Honda
Original assignee: Ttc Co., Ltd.
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2005-09-01
Also published as: JPWO2005079843A1

Abstract

　抗ＨＥＲ２抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用に用いることができる製剤、医薬組成物及びその製造方法を提供する。抗ＨＥＲ２抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソーム、該リポソームを含む医薬組成物、及び磁性微粒子を含むリポソームを抗ＨＥＲ２抗体と接触させることを含む該リポソームを製造するための方法。

Description

明細書

新規リボソーム

技術分野

[0001] 本発明は、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソーム、それを含む医薬組成物、及びその製造方法に関する。

背景技術

[0002] 温熱療法は、有望ながん療法である（非特許文献 1及び 2)。しかし、周囲の健康な組織に損害を与えることのない温度にまで、局所の腫瘍領域だけを加熱することが困難であるという技術的な課題があった (非特許文献 3及び 4)。

[0003] この課題を克服するために、温熱療法には磁性微粒子が用いられている。磁性微粒子を腫瘍組織のみに蓄積させることができれば、ヒステリシスロスによって交番磁場 (AMF)において発熱を生じることによって、がんに特異的な温熱療法を達成することができる (非特許文献 5)。

[0004] そこで、細胞内温熱療法のメディエーターとして、マグネタイト陽イオン性リボソーム

(MCLs)が開発されている（非特許文献 6—8)。これらの陽イオン性リボソームは、腫瘍細胞への吸着および取込みが改善されており、中性に荷電したマグネタイトリポソームに比べて 10倍高い腫瘍細胞に対する親和性を有する（非特許文献 6)。

[0005] MCL介在温熱療法は、 B16マウスメラノーマ（非特許文献 9)、 T一 9ラット神経膠腫

(非特許文献 8)、 Os515ハムスター骨肉腫 (未発表の結果）およびゥサギ舌の VX— 7扁平上皮がん (非特許文献 10)を含む、数種類の腫瘍を有する動物において効果を示すことが知られている。

[0006] しかし、 MCL介在温熱療法が腫瘍の完全寛解を誘導するために非常に有効性が確認されているにもかかわらず、これらの陽イオン性 MCLsには、直接腫瘍組織に注入しなければならないという欠点があった。

[0007] この欠点を克服するために、磁性微粒子を含む抗体コンジユゲートリポソーム（ィムノリボソーム）が開発され、すでに、ヒト神経膠腫細胞に対するマウス G22モノクロ一ナル抗体 (MAb) (非特許文献 11)及びヒト腎細胞がん腫に対するマウス G250MA b (非特許文献 12)を用いるィムノリボソームが構築され、そして、動物モデルを用いてそれらの腫瘍特異的ターゲッティング能力を明らかにした。

[0008] ヒト上皮成長因子受容体一 2 (HER2)は、乳がんの 20— 30%において過剰発現するが、特定の正常組織においては低いレベルで発現する（非特許文献 13)。そして、下記の 2つの考察にもとづき、抗体ベース療法の可能な標的であると認められていた

[0009] 第一に、 HER2過剰発現が、腫瘍悪性度に関与することから、抗 HER2抗体は、腫瘍増殖の重要なメディエーターを妨害することができる。また、ネズミの抗 HER2 M Ab (muMAb4D5)は、インビトロ（非特許文献 14)及びインビボ（非特許文献 15)で HER2を過剰発現する乳がん細胞の増殖を阻害する。この抗体のヒト化修飾物であるハーセプチン（トラスッズマブ）は、免疫原性ポテンシャルを減らす (非特許文献 16 )、一方、細胞増殖阻害特性は保持しており、現在臨床で用いられている。

[0010] 第二に、安定的に過剰発現した腫瘍細胞表面上の HER2は、理想的な標的抗原として薬剤デリバリーシステム（DDS)のために利用することができる。

[0011] 抗 HER2ィムノリボソーム力腫瘍標的剤形として開発され、それらは HER2を過剰発現する腫瘍に特異的に結合し、そして、取り込まれる。抗 HER2ィムノリボソームは、乳がん療法での二つの役割、すなわち、細胞障害性薬物を運搬する DDSとしての役割と、それ自身が抗腫瘍活性を有するハーセプチンを含むことによる役割とがある

[0012] ハーセプチンは、それ自体で投与すると、抗増殖効果を有し、また、化学療法と組み合わせても有効である（非特許文献 17)。実際に、パークらは、ドキソルビシンを含む抗 HER2ィムノリボソーム力 HER2を過剰発現する腫瘍細胞を標的とし、ハーセプチンとドキソルビシンの細胞障害性効果を重ね合わせたことを報告してレ、る（非特許文献 18)。しかし、抗 HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用については、レ、まだ何らの報告もなされていない。

[0013] したがって、本発明は抗 HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法が同時に施行できる製剤を提供することを目的としている。

[0014] 非特許文献 1 :ジヱイ'バンダージー（J. Van der Zee)著、ァニユアルズ'ォブ'オンコロジー（Annals of oncology) , 13卷、 1173—1184頁、 2002年

非特許文献 2 :ピ^ ~ ·モローズら（P. Moroz et al)著、インターナショナル'ジャーナル' ォブ'ハイパーサーミア（International journal of hyperthermia)、 18卷、 267— 284頁、 2002年

非特許文献 3 :エ^ ~ ·ジョーダンら（A. Jordan et al)著、インターナショナル'ジャーナノレ'ォプ 'ノヽイノ " ~サ" ~ f (International journal of hyperthermia)、 9卷、 51— 68貝、 1993年

非特許文献 4 :ティー'ミナミムラら（T. Minamimura)著、ァニユアルズ 'ォブ 'オンコロジー（Annals of oncology)、 16卷、 1153— 1158頁、 2000年

非特許文献 5 :ェム 'シンカイら（M. Shinkai et al)著、日本ハイパーサーミア学会誌、 10卷、 168— 177頁、 1994年

非特許文献 6 :ェム 'シンカイら（M. Shinkai et al)著、日本癌学会誌、 87卷、 1 179— 1183頁、 1996年

非特許文献 7 :ェム 'ャナセら（M. Yanase et al)著、日本癌学会誌、 88卷、 630— 63 2頁、 1997年

非特許文献 8 :ェム 'ャナセら（M. Yanase et al)著、日本癌学会誌、 89卷、 463— 46 9頁、 1998年

非特許文献 9 :ェム 'スズキら（Μ· Suzuki et al)著、メラノーマ'リサーチ（Melanoma Research) , 13卷、 129—135頁、 2003年

非特許文献 10 :ェイチ'マツノら（H. Matsuno et al)著、日本ハイパーサーミア学会誌、 17卷、 141-150頁、 2001年

非特許文献 11 :ビー'レら（B. Le et al)著、化学工学会誌、 34卷、 66—72頁、 2001 年

非特許文献 12 :ェム 'シンカイら（M. Shinkai et al)著、日本癌学会誌、 92卷、 1 138— 1145頁、 2001年

非特許文献 13 :ェム'エフ'プレスら（M.F. Press et al)著、オンコジーン（Oncogene)、 5卷、 953— 962頁、 1990年

非特許文献 14 :ジ一'ディー'ノレイスら（G.D. Lewis et al)著、キャンサ一'ィムノロジー、ィムノセラピ¹ ~~ (Cancer immunology, immunotherapy)、 37卷、 255— 263頁、 1993 年

非特許文献 15 :ジエイ 'バセルガら（J. Baselga et al)著、ブレスト 'キャンサ^ ~ ·リサ一チ（Breast cancer research) , 29卷、 127— 138頁、 1994年

非特許文献 16 :ピ一'カーターら（P. Carter et al)著、プロシーデイング'ォブ 'ザ 'ナショナル ·ァカデミ一.ォブ ·サイエンス ·ォブ ·ザ ·ユナイテッド 'ステーッ'ォブ ·アメリカ (Proceedings of the National Academy of Sciences or the United States of America) 、 89卷、 4285— 4289頁、 1992年

非特許文献 17 :ェム 'ぺグラムら（Μ· Pegram et al)著、オンコジーン（Oncogene)、 18 卷、 2241— 2251頁、 1999年

非特許文献 18 :ジヱイ'ダブリュ一'パークら（J.W. Park et al)著、プロシーデイング' ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイエンス ·ォブ ·ザ ·ユナイテッド 'ステ一ツ- ォフ、 ·ノメリフ J (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) , 92卷、 1327— 1331頁、 1995年

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0015] 抗 HER2抗体療法と腫瘍特異性温熱療法との併用療法のための物及びその製造方法を提供する。

課題を解決するための手段

[0016] 本発明者等は、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームを構築し、抗 HER2抗体療法および腫瘍特異的温熱療法の併用の実現可能性を検討したところ、予想外にも、抗 HER2抗体療法および腫瘍特異性温熱療法の組み合わせが強い細胞傷害効果を有するという知見を得て、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、下記の（1)一（3)である。

(1)抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソーム。

(2)前記（1)に記載のリボソームを含む、医薬組成物。

(3)磁性微粒子を含むリボソームを抗 HER2抗体と接触させることを含む、前記（1) に記載のリボソームを製造するための方法。 [0017] 本発明は、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームに関する。

[0018] HER2(Human Epidermal Growth Factor Rec印 tor_2)タンパク質は、乳がん細胞表面に過剰発現している上皮細胞増殖因子（epidermal growth factor : EGF)のレセプターである。チロシンキナーゼ活性を有する分子量 185kDaの膜受容型タンパクで、上皮細胞の分化や増殖などにかかわる重要な因子である。この HER2タンパク過剰発現のある乳がん患者は予後不良であり、ホルモン療法の治療抵抗性、抗ガン剤への感受性が低い。

[0019] 本発明において、抗 HER2抗体とは、 HER2タンパク質を抗原として作製された抗体をいい、従来公知の任意の方法を用いて調製することができる。抗体は、モノクローン又はポリクローンのいずれも、本発明に用いることができる。

[0020] 本発明に用いる磁性微粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができる力特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく使用でき、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックあるいはパーマロイなどの強磁性金属等を例示できる。

なお、前記磁性微粒子は、 100 /i m以下、特に 1 μ m以下の粒径であることが望ましレ、。

[0021] また、本発明に用いる抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームとは、表面に抗 HER2抗体を結合したリボソームである。抗 HER2抗体を結合したリポソームは、 HER2をその表面上に発現する細胞、特に乳がん細胞の付近に選択的に集中するので、乳がん細胞以外を加熱することなく温熱療法を行うことができる。

[0022] したがって、本発明の医薬組成物は、乳がんの処置に適用することができる。

[0023] また、本発明は、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームを有効成分として含む医薬組成物にも関する。

[0024] 次に本発明のリボソーム製剤を乳がん治療に用いる際の処方や用法について詳しく説明する。

本発明のリボソーム製剤を分散する溶媒としては、水系溶媒、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液などを使用することができる。このような水系溶媒の pHは 5— 10が挙げられ、好ましくは 6 一 8である。

[0025] 本発明の薬剤の形態は特に限定されず、経口投与のための製剤としては例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては例えば、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経皮吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。本発明の薬剤の形態、使用すべき製剤用添加物、製剤の製造方法などは、いずれも当業者が適宜選択可能である。本発明の薬剤の投与量は、患者の性別、年齢または体重、症状の重症度、予防または治療といった投与目的、あるいは他の合併症状の有無などを総合的に考慮して適宜選択することができる。投与量は、一般的には、 0. 001 μ g/kg体重 Ζ日一 1000 μ g/kg体重 Ζ曰、好ましくは 0. 001 μ gZkg体重/曰一 100 μ g/kg体重/日である。

[0026] また、本発明は、磁性微粒子を含むリボソームを抗 HER2抗体と接触させることを含む、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームを製造するための方法にも関する。

[0027] 上記のように、本発明のリボソームは、抗 HER2抗原を、磁性微粒子を含むリポソ一ムの表面に結合していることが特徴であり、両者を結合させる方法としては、従来公知の方法を用いることができる力例えば、次の方法を挙げることができる：

抗体を N—スクシンィミジル一 3_ (2—ピリジルジチォ）プロピオナート (SPDP)によつて処理する。それから、 SPDP修飾抗体を 1, 4ージチオスレィトールも用いて還元する。還元した抗体を磁性微粒子担荷リボソームに添加する。続いて、ナトリウムリン酸緩衝液中でインキュベーションする。

図面の簡単な説明

[0028] [図 1]図 1は、磁性微粒子を含むィムノリボソーム上に固定されたハーセプチンによつて介在される抗増殖活性である。 SKBr3細胞を異なる濃度（0— 3 μ g抗体/ ml)の、リツキサンとコンジュゲートした磁性微粒子担荷ィムノリボソーム（黒丸）またはハーセプチンとコンジュゲートした磁性微粒子担荷ィムノリボソーム（黒三角）で処理した。 8 日間インキュベーション後、抗増殖効果を相対細胞数パーセントとして評価した。データおよびバーは、 3つの独立した実験の平均及び SDである。 HMLは 0. 5 μ g— 抗体/ mlまでは濃度依存的に抗がん作用を示し、 0. 5 / g—抗体/ ml以上では変わらなかった。この効果は固定化しないハーセプチンを添加した場合と同じだったこと力、固定化されたハーセプチンが持つ抗腫瘍効果であるといえる。 X軸は抗体濃度 [ μ g/ml]であり、 Y軸は相対的な細胞数[%]を表す。

[図 2]図 2は、 SKBr3細胞による抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリポソームの摂取である。 28. 6pgマグネタイト Z細胞の濃度で、 SKBr3細胞を、磁性微粒子担荷リボソーム（MLs (黒丸））又はハーセプチン（黒四角）とコンジュゲートしたィムノリボソームで処理した。「材料および方法」にて説明したように、マグネタイト摂取率を判断した。データおよびバーは、 3つの独立した実験の平均及び SDである。 HM Lは HER2抗原を過剰発現している悪性乳癌細胞（SKBr3細胞株）に特異的に結合した。 X軸は HML添加後の時間 [h]であり、 Y軸はがん細胞内へのマグネタイト取り込み量[% (添加した量を 100%ととする）]を表す。

園 3]図 3は、抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソームによって誘導される温熱療法の結果を示す。 28. 6pgマグネタイト/細胞の濃度で、 SKBr3細胞を磁性微粒子担荷リボソーム (MLs (黒丸））、リツキサン (RMLs (黒三角））を有するィムノリボソーム複合化またはハーセプチン（黒四角）で処理した。 4時間のインキュベーシヨンの後、細胞を回収し、交番磁場 (AMF)で 30分照射した。細胞ペレットの温度上昇を測定した (A)。 AMF照射の後、細胞を再播種した。次いで、 HMLsで処理した細胞を、 24時間の間隔で、もう一回、 AMF照射 (反復温熱療法（白四角））あるいはもう二回 AMF照射（黒三角）に付した。所定の日に、生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した（B)。データおよびバーは、 3つの独立した実験の平均及び SDである。 HMLを添加することで、マグネタイトが細胞に取り込まれ、磁場照射により発熱した (A)。その発熱に伴い、ハーセプチンと温熱療法の併用効果によって、顕著な殺細胞効果が引き起こされた (B)。 X軸は磁場照射時間 [min]であり、 Y軸は温度 [°C]を表す (A)。 X軸は磁場照射後の培養時間 [da y]であり、 Y軸は生細胞数 [10⁴ cells/well]を表す（B)。

実施例 [0029] 細胞培養および抗体

SKBr3ヒト乳がん細胞（ATCC)は、 1. 5mMの L グルタミン、 10%ゥシ胎仔血清および抗生物質（100U/mlペニシリン Gおよび 0· lmg/mlストレプトマイシン）添加マッコイ 5a培地（ギブコ BRL、ゲーサーズバーグ、メリーランド）中で培養した。糸田胞を 5%C〇を含む雰囲気中、 37°Cで増殖させた。

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[0030] SKBr3細胞を、フローサイトメトリー、 ELISAおよび免疫組織化学的アツセィによつて HER2発現について広範囲に特徴づけた。

臨床用として市販されている抗 HER2 MAb ハーセプチンおよび抗 CD20 MA b リツキサン（ノヽーセプチンのアイソタイプ照合コントロール MAb)を日本ロシュ（東京）から入手した。

[0031] 磁性微粒子を含むィムノリボソームの調製

ィムノリボソーム及び磁性微粒子を含むリボソーム（抗体なし）の調製方法はすでに記載されている。磁性微粒子（Fe O ；平均粒径、 10ナノメートル）は、戸田工業から

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供与された。

[0032] 磁性微粒子担荷リボソームをコロイド性マグネタイト、およびホスファチジルコリン/ ホスファチジルエタノールァミン（比、 2 : 1)および N— (6—マレイミドカプロィルォキシ） —ジパノレミトィルホスファチジノレエタノールァミンからなる脂質混合物を用いて調製した。

[0033] リボソーム上の抗体の固定化のために、抗体（ノ、ーセプチンまたはリツキサン）を N —スクシンィミジル 3_ (2—ピリジルジチォ）プロピオナート (SPDP)によって処理した。それから、 SPDP修飾抗体を 1, 4ージチオスレィトール（25mM) )も用いて還元した。還元した抗体を 70 μ g抗体/ mgマグネタイトの濃度で磁性微粒子担荷リボソームに添加した。続いて、リン酸ナトリウム緩衝液中で 4°Cで 20時間インキュベーションした。抗体およびマグネタイト濃度を、タンパク質アツセィ（BCA protein Assay Reagent, Pierce, Rockford, 111)によって、そして、チォシアン酸カリウム方法によって、それぞれ、測定した。ィムノリボソームのサイズを、動的光散乱分光光度計 (FRAR1000、大塚電子)を使用して測定した。

[0034] 磁性微粒子担荷ィムノリボソーム上のハーセプチンの抗増殖活性 SKBr3細胞を、指示濃度で抗体または磁性微粒子担荷ィムノリボソームを含む実験的培地を用いて 2 X 10⁴細胞/ゥエルで、 6ゥヱル細胞培養プレートに播種した。抗増殖活性を、 8日間のインキュベーション後に測定した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー色素排除法で測定し、そして、相対細胞数を算出した。

[0035] SKBr3細胞による、抗 HER2抗体を結合した磁性微粒子を含むリボソームの取り込み

SKBr3セノレを、 28. 6pgマグネタイト Zセル（0. 5 μ g抗体/ ml)の濃度で磁性微粒子担荷ィムノリボソームまたはリボソーム（抗体なし)を含む実験的培地を用いて 7 X 10⁵細胞/ゥエルで 6ゥヱル細胞培養プレートに播種し、往復シェーカー（SHK— 3 20、旭テクノグラス、 70rpm)によって 37°Cで穏やかに振盪しながらインキュベーションした。 1、 4、 8または 24時間インキュベーション後に、細胞を PBSで二回洗浄し、ラバーポリスマンを使用して回収し、そして、マグネタイト濃度を測定した。

[0036] 磁性微粒子誘導温熱療法

磁性微粒子を用レ、るインビトロの温熱療法実験を、先に記載された方法を使用して実行した。概略すると、 SKBr3細胞を、磁性微粒子担荷ィムノリボソームでの処理の前に、サブコンフルェントまで培養した。次に、細胞を、 28. 6pgのマグネタイト/セル (0. 5mg抗体/ ml)の濃度で磁性微粒子担荷ィムノリボソームを含む実験的培地で培養した。マグネタイト取込みの 4時間後に、細胞をマイクロ遠心チューブに集め、穏やかに遠心分離し、細胞ペレットを形成させた。チューブを、高周波磁場発生器（ 360kHz, 120Oe、第一高周波）のコイルの中央に配置した。細胞ペレットの温度を光ファイバ 'プローブ (安立計器）をその中央に挿入することで測定し、ペレットを手動で磁場強度を調整することによって恒温に維持した。交番磁場 (AMF)照射時間は、 30分であった。 AMF照射の間、周囲温度を 37°Cに維持した。処理した細胞を 2 X 1 0⁴細胞/ゥヱルで 6ゥヱル細胞培養プレートに再播種した。生細胞数を、血球計数盤を用いるトリパンブルー排除方法で測定した。

[0037] 磁性微粒子を含むィムノリボソームの調製

磁性微粒子（ハーセプチンーコンジュゲートマグネトリポソーム（HMLs) )を組み込んだ抗 HER2ィムノリボソームを構築し、 HMLsが抗 HER2抗体療法を温熱療法と組合わせることができるかどうか検討した。磁性微粒子を組み込んでレ、る抗 CD20ィムノリボソーム（リツキサンコンジュゲートマグネトリポソーム（RMLs) )をコントロールとして調製した。 HMLsの固定化密度および平均粒径は、それぞれ、 55. 6 ±4. 6 /i g 抗体/ mgマグネタイトおよび 138 ± 7. 6nmであった。これらの値は、 RMLsのそれと同様である（表 1)。マグネタイトナノパ一ティクルを含むィムノリポソ一ムの比較抗体の固定化密度

平均パーティクルサイズ

[ g ί几体/ mgマヮネタイト] [nm]

HML^a 55.6 ±4.6 138 ±7.6

RML^b 51.6± 10.3 143 ± 12.6

Aハ一セプチン一コンジユゲー卜マグネタイトリポソ一ム

Bリツキサン一コンジュゲ一トマグネタイドリポソ一ム

cデータは独立した 3回の実験の平均及び SDである。

[0039] 磁性微粒子を含むィムノリボソームの調製方法は、以前より報告されている。マウス MAbsの場合には、固定化密度は、約 40mg抗体/ mgマグネタイトであった。本研究において、同様の結果が、「ヒト化」抗体について得られた。先の研究において、磁性微粒子を含む Fab，フラグメントコンジユゲートイムノリボソームが調製され、全体抗体に比べて 2. 4倍高いモル固定化という結果となった。 Fab'フラグメント-コンジュゲートィムノリボソームは、 DDSのための有利な効果を有することができる。他方、ハーセプチンのヒト定常（Fc)ドメインは、 HER2を過剰発現するがんに対して、抗体依存性細胞障害 (ADCC)を示す。本研究において、インビトロで ADCCを与えることができる磁性微粒子を含む全ノヽーセプチンコンジユゲートイムノリボソームが調製された。

[0040] 磁性微粒子を含むィムノリボソームの調製

図 1は、異なる濃度での SKBr3細胞に対する HMLsの抗増殖効果を示す。遊離のハーセプチンのように、 HMLsは抗増殖効果を有した。用量反応曲線は、最大効果、 0. 5 μ g抗体 Zmlの濃度で達成され、約 50%の乳ガン細胞を殺した。対照的に、遊離のリツキサン又は RMLsが加えられたときには、抗増殖効果は観察されなかつた。これらの結果は、ハーセプチン一コンジユゲートイムノリボソーム力その抗増殖活性を保持してレ、ることを示唆する。

[0041] SKBr3細胞による磁性微粒子のィムノリボソーム介在摂取

その抗増殖効果に加えて、抗 HER2ィムノリボソームを腫瘍標的製剤として用いること力 Sできる。そこで、 HMLsが、 SKBr3セルに取り込まれるかどうかを検討した。 SK Br3細胞による磁性微粒子の摂取を図 2に示す。 HMLsについては、磁性微粒子は、急速に SKBr3細胞内に取り込まれ、最大摂取は 4時間後、総添加磁性微粒子（28 . 6pgマグネタイト/細胞（0. 5mg抗体/ ml) )の 56. 7% (16. 5 ± 0. 9pg_マグネタイト Z細胞）であった。他方、少量の抗体のない磁性微粒子担荷リボソーム（マグネトリポソーム（MLs) )だけ力 SKBr3セルに取り込まれた。 RMLsについては、総添加磁性微粒子の 11. 7%のみが、取り込まれた。

[0042] 我々は、以前、 G22 (G22MLs)および G250 (G250MLs)とコンジュゲートした磁性微粒子担荷ィムノリボソームを開発し、それらは、それぞれヒト U251神経膠腫細胞および MN抗原提示性マウス腎細胞がん細胞に特異的に取り込まれた。最大摂取量は、それぞれ、 G22MLsと G250MLsにつレヽて、約 80%と 60%であった。他方、これらの細胞による非特異的抗体コンジユゲートイムノリボソームの摂取は、 10— 20 %であった。この摂取実験の結果は、以前の研究と同様であった。 RMLの摂取は、抗体タンパクと標的細胞との間の非特異的相互作用により生じる非特異的摂取であると考えられる。この結果は、 HMLsの摂取力抗体依存性であり、 HER2を過剰発現するがん細胞に特異的だったことを示す。

[0043] 磁性微粒子を取り込んでいる抗 HER2ィムノリボソームによって誘導される温熱療法

次に、交番磁場（AMF)力 HMLsによって処理された SKBr3セルにおいて熱を生じるか否かを検討し、細胞内の温熱療法を観察した。図 3Aは、 360kHzおよび 12 OOeでの AMF照射の間の磁性微粒子担荷ィムノリボソームで処理された細胞ペレツトの温度を示す。熱は、 HMLsを取り込んでいる SKBr3細胞において発生した（16. 5pgマグネタイト Zセル；図 2)。これらの細胞の温度は急速に上昇し、 42. 5°Cに達した。そして、それは温熱療法に有効な温度であって、それ力 AMFの強さを制御することによって 30分の間のその温度に維持された。対照的に、未処理細胞（Opgマグネタイト/細胞）及び RMLsで処理された細胞（11 · 7pgマグネタイト/細胞）においては、 AMF照射の間の温度は、それぞれ 1及び 2°C増加したに過ぎなかった。図 3Bは、 AMF照射の後の生細胞数を示す。 SKBr3細胞が RMLsによって処理され、 AMFによって照射を受けるとき、未処置のコントロールと比較して、有意な成長阻止は観察されなかった。対照的に、細胞が HMLsによって処理されるとき、生細胞数はコントロールのそれの約 4分の 1に減少した。 HMLs処理だけの場合には約 2分の 1に減少したことから、温熱によって抗 HER2抗体の抗腫瘍効果が増強された。また、 HML処理 24時間後であっても SKBr3細胞には温熱療法に充分な量（15. 6 ± 0. 27pgマグネタイト/細胞）の磁性微粒子が残存していたことから反復温熱療法もおこなった（図 2)。 AMF照射を 24時間の間隔で 2回繰り返したとき、図 3Aに示すものと同様の温度プロフィールを示し (データは示さず）、生細胞数の激しい減少を引き起こし、そして細胞増殖が少なくとも 8日間強く抑制された。そして驚くべきことに、 3 回 AMF照射を繰り返すことで、 SKBr3細胞は死滅するとレ、う格別の効果が見られた。これらの結果は、 HMLsによって処理された HER2を過剰発現するがん細胞が A MF照射によって特異的に加熱され、そして、 HMLsによって介在されるその温熱療法が強レ、抗がん効果を有することを示唆する。

Claims

請求の範囲

[1] 抗 HER2抗体を結合した、磁性微粒子を含むリボソーム。

[2] 請求項 1に記載のリボソームを含む、医薬組成物。

[3] 磁性微粒子を含むリボソームを抗 HER2抗体と接触させることを含む、請求項 1に記載のリボソームを製造するための方法。