JP5504158B2 - 医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は医薬組成物に関する。

一酸化窒素（ＮＯ）は、各種生体維持機構に関わる必須な内因性物質である一方、炎症等の原因物質にもなり得る。ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）は、L-アルギニンを基質としてＮＯ生成を触媒する酵素であり、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ｎＮＯＳという３つのアイソフォームが存在する。

誘導型ＮＯ合成酵素ｉＮＯＳは、他のアイソフォームと異なって、通常酵素活性は見られない。しかし、細胞がサイトカインやＬＰＳなどの刺激を受けると、ｉＮＯＳの産生が誘導され、大量のＮＯが一過性に産生される。このＮＯは、炎症のメディエーターであり、例えば、敗血症性ショックや、炎症による血管拡張や低血圧症の原因等になる。

同様に、サイトカインや増殖因子などの刺激により誘導される酵素として、シクロオキシナーゼ２（ＣＯＸ−２）が知られている。この酵素もまた、プロスタグランジンの産生を通じ、炎症反応のメディエーターとして機能する。

このように、これら２つの誘導酵素は、炎症の主な反応経路を構成するため、ｉＮＯＳやＣＯＸ−２を阻害する化合物を見出すことは、新規抗炎症薬の創製につながると考えられている（Mini Rev Med Chem vol.8, p.73-90, 2008）。

一方、ｉＮＯＳとＣＯＸ−２はＮＦ−κBという転写因子が活性化されることにより、特にマクロファージ等で発現が誘導されることが知られているため、ＮＦ−κBを阻害することによってｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現を阻害する抗炎症剤の開発が期待されてきた。

また、ｉＮＯＳは、大腸癌や乳癌をはじめとする種々の癌で高発現を示し、更に、このＤＴＣＭグルタルイミドは、細胞の腫瘍性トランスフォーメーション及び腫瘍転移を阻害し得るので、抗腫瘍剤として使用できる。腫瘍細胞においてＣＯＸ−２を阻害すると腫瘍細胞の増殖が抑制されることなどから、ｉＮＯＳやＣＯＸ−２の阻害剤は、抗腫瘍剤としても期待されている。

しかし、ＮＦ−κBを阻害することによってｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現を阻害する薬剤は、ＮＦ−κBを阻害することによる副作用の危険性が生じる。

そこで、本発明は、ＮＦ−κＢを阻害せずにｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現を阻害する医薬組成物を提供することを目的としてなされた。

本発明の化合物は、下式（Ｉ）で示される。
（式中、ｎは１〜２４のいずれかの整数である。）
また、本発明の、一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害剤、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）発現阻害剤、プロスタグランジン産生阻害剤、破骨細胞分化抑制剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２が介在する疾患の治療剤は、上記化合物（Ｉ）を有効成分として含有する。前記疾患が、免疫性疾患、神経変性疾患、炎症性疾患、または腫瘍であってもよい。

また、本発明の、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２が介在する疾患の治療方法は、該疾患を有する患者に、上記化合物（Ｉ）を有効成分として含有する医薬組成物を投与する工程を含む。前記疾患が、免疫性疾患、神経変性疾患、炎症性疾患、または腫瘍であってもよい。例えば、リウマチ、変形性関節症、膠原病、バセドー氏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、感染症、関節炎、発熱、腰痛症、月経困難症、歯周病、骨粗鬆症、骨がんであってもよい。

＝＝関連出願へのクロスリファレンス＝＝
本出願は、平成２０年６月２５日付で出願した日本国特許出願第２００８−１６６２９０に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。

本発明の一実施例において、ＲＡＷ２６４．７細胞にＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を投与した時の、各ＤＴＣＭグルタルイミド濃度に対する細胞生存率を示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＲＡＷ２６４．７細胞にＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を投与した時の、各ＤＴＣＭグルタルイミド濃度に対する細胞増殖率を示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＲＡＷ２６４．７細胞にＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を投与した時の、各ＤＴＣＭグルタルイミド濃度に対するＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質に対する合成阻害を示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化によるＮＯ産生を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ６が、マクロファージ活性化によるＮＯ産生を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２の、マクロファージ活性化によるＮＯ産生抑制効果は、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のＮＯ捕捉活性によるものではないことを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化におけるｉＮＯＳ発現を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化におけるＣＯＸ−２遺伝子発現を抑制することを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化によるＩＬ−６産生には影響しないことを示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化におけるＮＦ−κＢ活性化には影響しないことを、ＩκＢ−αの分解および再誘導を指標にして示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化におけるＮＦ−κＢ活性化には影響しないことを、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能を指標にして示すグラフである。 本発明の一実施例において、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マクロファージ活性化によるＭＡＰＫ活性化には影響しないことを示すグラフである。 本発明の一実施例において、３．０μｇ／ｍＬ以下の濃度のＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２が、マウス骨髄由来マクロファージに対して毒性を持たないことを示すグラフである。 本発明の一実施例において、マウス骨髄由来マクロファージからの破骨細胞への分化誘導におけるＲＡＮＫＬ処理およびＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２処理の影響を示す顕微鏡写真である。 本発明の一実施例において、マウス骨髄由来マクロファージをＲＡＮＫＬ処理あるいはＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２処理した場合の、分化した破骨細胞数を示すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｆ９細胞をＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２処理した場合の、生細胞率を示すグラフである。 本発明の一実施例において、Ｆ９細胞をＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２処理した場合の、細胞増殖を示すグラフである。

以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

＝＝ＤＴＣＭグルタルイミド（DTCM-glutarimide）＝＝
本発明の化合物は、式（Ｉ）で示されるＤＴＣＭグルタルイミドである。
式中、ｎは特に限定されないが、１〜２４のいずれかの整数であれば好ましく、１〜１８のいずれかの整数であればより好ましく、１〜１２または６〜１８であることがさらに好ましく、６〜１２であることがもっとも好ましい。

このＤＴＣＭグルタルイミドは、例えば、以下のようにして合成できる。
まず、化合物（ＩＩ）を酢酸に溶解させ、濃硫酸を加え、加熱還流する。反応混合物に水を加え、さらに加熱還流する。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去すると、油状物質が得られる。この油状物質をジメチルホルムアミドに溶解し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド、４−ジメチルアミノピリジン、１−アルカンチオールを加え、室温で撹拌する。得られた反応液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物（Ｉ）が無色固体として得られる。ここで、１−アルカンチオールのアルカン鎖のＣの数を選択することで、化合物（Ｉ）のｎの数を調整できる。

＝＝ｉＮＯＳ発現阻害剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤＝＝
本発明のｉＮＯＳ発現阻害剤は、有効成分として、上記式（Ｉ）で示されるＤＴＣＭグルタルイミドを含有し、ＮＦ−κBを阻害せずにｉＮＯＳの発現を阻害することにより、ｉＮＯＳ産生を阻害し、結果的に一酸化窒素（ＮＯ）の産生を阻害することができる。

また、本発明のＣＯＸ−２阻害剤は、有効成分として、式（Ｉ）で示されるＤＴＣＭグルタルイミドを含有し、ＮＦ−κBを阻害せずにＣＯＸ−２の発現を阻害することにより、ＣＯＸ−２産生を阻害し、結果的にプロスタグランジンの産生を阻害したり、破骨細胞の分化を抑制したりすることができる。

＝＝ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２が介在する疾患の治療剤＝＝
ｉＮＯＳ産生の抑制及びＣＯＸ−２産生の抑制は、それぞれｉＮＯＳ及びＣＯＸ−２が介在する疾患の治療につながる。したがって、ｉＮＯＳ発現やＣＯＸ−２発現を抑制することにできる、式（Ｉ）で示されるＤＴＣＭグルタルイミドは、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２が介在する疾患の治療剤として有用である。

ここで、ｉＮＯＳまたはＣＯＸ−２が介在する疾患とは、例えば、関節リウマチ等のリウマチ、変形性関節症、膠原病、バセドー氏病などの自己免疫疾患をはじめとする免疫性疾患、パーキンソン病・アルツハイマー病・多発性硬化症・筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、感染症・関節炎・発熱・腰痛症・月経困難症などの様々な炎症性疾患、乳がん・前立腺がん・結腸がん・大腸癌・胃ガン・食道がん・肺がん・肝がん・膵がん・扁平上皮がん・脳腫瘍・骨がん・多発性骨髄腫などの腫瘍、等である。また、プロスタグランジンの産生を阻害することにより、血管新生を阻害したり、炎症を抑制したりすることができ、破骨細胞の分化を抑制することにより、歯周病、骨粗鬆症、骨がんなどの治療や骨髄腫の進行抑制が可能になる。従って、式（Ｉ）で示されるＤＴＣＭグルタルイミドは、特に抗免疫性疾患剤、抗神経変性疾患剤、血管新生阻害剤、非ステロイド系抗炎症剤、解熱鎮痛剤、抗腫瘍剤、等として有用である。

＝＝薬剤の製造方法及び投与方法＝＝
これらの薬剤は、ＤＴＣＭグルタルイミドの他、薬学的に許容しうる通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を含有することができる。またこれらの薬剤を患者に投与するに際しては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量で、また、経口投与又は非経口投与などの適切な投与方法で投与すれば良い。

《実施例》
（１） ＤＴＣＭグルタルイミド（DTCM-glutarimide）の合成
まず、上記式（ＩＩＩ）で表されるＤＴＣＭグルタルイミドＣ−６を以下のようにして合成した。

上記化合物（ＩＩ）１ｇを酢酸１０ｍＬに溶解させ、濃硫酸１ｍＬを加え、２時間加熱還流した。反応混合物に水５ｍＬを加え、さらに２時間加熱還流した。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で溶媒を除去すると、油状物質０．８５ｇが得られた。この油状物質をジメチルホルムアミド２０ｍＬに溶解し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド １．１ｇ、４−ジメチルアミノピリジン ７，１ｇ、１−ヘキサンチオール １．４ｍＬを加え、室温で４時間撹拌した。得られた反応液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、化合物（ＩＩＩ）が無色固体として０．６９ｇ得られた。
¹H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 0.89 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.30 (6H, complex), 1.55 (2H, dd, J = 7.6, 14.9 Hz), 2.36 (2H, complex), 2.73 (5H, complex), 2.90 (2H, t, J = 7.3 Hz); ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃) 14.1, 22.5, 27.7, 28.5, 29.3, 29.4, 31.3, 37.1, 47.9, 166.8, 171.12, 171.15.
同様に、１−ヘキサンチオールの代わりに、１−ドデカンチオールを用いて反応させ、上記式（ＩＶ）で表されるＤＴＣＭグルタルイミドＣ−１２を合成した。
¹H-NMR (270 MHz, CDCl3) δ 0.88 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.27 (18H, complex), 1.55 (2H, dd, J=6.5, 13.2 Hz), 2.36 (2H, complex), 2.71 (5H, complex), 2.93 (2H, t, J=7.0 Hz); ¹³C-NMR (67.8 MHz, CDCl₃) 14.2, 22.7, 27.7, 28.9, 29.1, 29.3, 29.4, 29.5, 29.6, 29.7, 32.0, 37.2, 47.8, 166.8, 171.0.
（２）ＤＴＣＭグルタルイミドが細胞に与える毒性の評価 Ｉ
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがＲＡＷ２６４．７細胞に与える細胞毒性を、細胞生存率及び細胞増殖率を指標として評価した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いてプラスティックディッシュに１×１０^４cells/mlで播種し、０、０．１、０．３、１．０、３．０、１０．０μｇ／ｍＬの各濃度でＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を培地に添加し、２４時間及び４８時間培養した後、血球計算盤を用いて全細胞数を調べ、Trypan blue dye exclusion assayを用いて生細胞数を調べた。図１には各ＤＴＣＭグルタルイミド濃度に対する細胞生存率（生細胞数／全細胞数）を、図２には各培養時間に対する全細胞数をプロットした。

図１に示すように、３．０μｇ／ｍＬまでのＤＴＣＭグルタルイミド濃度では、４８時間後も細胞生存率がほぼ減少せず、細胞致死効果が検出されなかった。そして、図２に示すように、１．０μｇ／ｍＬまでの濃度では、４８時間後も全細胞数がほぼ減少せず、細胞増殖抑制が検出されなかった。

（３）ＤＴＣＭグルタルイミドが細胞に与える毒性の評価 ＩＩ
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがＲＡＷ２６４．７細胞に与える細胞毒性を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質に対する合成阻害を指標として評価した。
（２）と同様の条件で各濃度（０、０．１、０．３、１．０、３．０，１０．０μｇ／ｍＬ）のＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を添加した培地を用いてＲＡＷ２６４．７細胞を６時間培養後、^３Ｈ標識の０．１％チミジン、０．１％ウリジン、０．１％ロイシンを添加し、さらに１時間培養した。細胞を回収し、ＴＣＡ不溶性画分の放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２添加無しのコントロールで得られた結果を１００とし、各ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２濃度で得られた計測値を相対値として図３のようにグラフ化した。

図３に示すように、１０．０μｇ／ｍＬまでのＤＴＣＭグルタルイミド濃度で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質のいずれに対しても、有意な合成阻害活性が検出されなかった。

（４）ＤＴＣＭグルタルイミドによる、マクロファージ活性化によるＮＯ産生の抑制
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化によるＮＯ産生を抑制することを示す。
（２）と同様の条件で各濃度（０、０．１、０．３、１．０、３．０μｇ／ｍＬ）のＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を添加した培地を用いてＲＡＷ２６４．７細胞を２時間培養後、３．０μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加して、さらに２０時間培養した。その後、ＮＯ産生量をGriess反応によって測定し、各ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２濃度に対してグラフ化（図４の棒グラフ）した。

図４に示すように、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬＰＳを刺激した２０時間後に過剰にＮＯを産生しており、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２は、このＮＯの産生を濃度依存的に顕著に抑制した。なお、ＮＯを発現しないネガティブコントロール（以下、図中ではＣと示す。）として、ＬＰＳによって刺激していない細胞を用い、ＮＯ発現を抑制するポジティブコントロールとして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のかわりに、１０μｇ／ｍＬの（−）−ＤＨＭＥＱ（以下、図中ではＤと示す。）を添加した培地で培養した細胞を用いた。

また、同時にＭＴＴ法により生細胞を計測し、細胞増殖抑制について調べた（図４の折れ線グラフ）が、各ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２濃度に対して全細胞数は変わらず、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２の添加は細胞増殖には影響を与えなかった。このように、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２の、マクロファージ活性化によるＮＯ産生の抑制効果は、細胞増殖抑制によるものではない。

同様の実験をＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ６で行ったところ、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２で得られたのとほぼ同じ結果が得られた（図５）。

さらに、ＮＯは培養上精中に放出されると、速やかにnitrite（ＮＯ_２ ^-）に代謝されることから、培養上清中のnitriteをGriess法により測定し、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のＮＯ捕捉活性の指標とした。なお、検量線は亜硝酸ナトリウムを用いて作成した。

１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で、亜硝酸ナトリウムを蒸留水に溶かし、０．００１、０．０１、０．１、１．０μｇ／ｍＬ亜硝酸ナトリウム水溶液を用意して検量線を作成した。その後、これらの亜硝酸ナトリウム水溶液に３．０μｇ／ｍＬのＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を直接添加し、１０分間静置した後、それぞれを１００μＬずつ９６ウエルプレートにとった。そこにGriess試薬を１００μＬ添加して１０分間反応させ、マイクロプレートリーダーで波長５７０nmにおけるＯＤ値を測定した。

図６に示すように、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２はＮＯ捕捉活性を有さなかった。
このように、ＤＴＣＭグルタルイミドの、マクロファージ活性化によるＮＯ産生抑制効果は、ＤＴＣＭグルタルイミドのＮＯ捕捉活性によるものではない。

（５）ＤＴＣＭグルタルイミドによる、マクロファージ活性化におけるｉＮＯＳ発現の抑制
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化におけるｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制することを示す。
（４）と同様の条件でＲＡＷ２６４．７細胞を活性化し、細胞を回収して常法によってタンパク質を抽出し、抗ｉＮＯＳ抗体（Santa Cruz Biotechnology）及び抗α−チューブリン抗体（Sigma Aldrich Japan）を希釈率１／３０００で用いて、ウエスタン・ブロッティングを行った。なお、ｉＮＯＳを発現しないネガティブコントロールとして、ＬＰＳによって刺激していない細胞を用い、ｉＮＯＳ発現を抑制するポジティブコントロールとして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のかわりに、１０μｇ／ｍＬの（−）−ＤＨＭＥＱを添加した培地で培養した細胞を用いた。

図７に示すように、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬＰＳで刺激することによりｉＮＯＳを発現するようになるが、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２はこのｉＮＯＳの発現を濃度依存的に顕著に抑制した。
このように、ＤＴＣＭグルタルイミドは、マクロファージ活性化におけるｉＮＯＳ遺伝子発現を抑制し、その抑制の強さはＤＴＣＭグルタルイミドの濃度に相関する。

（６）ＤＴＣＭグルタルイミドによる、マクロファージ活性化におけるＣＯＸ−２発現の抑制
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化におけるＣＯＸ−２遺伝子発現を抑制することを示す。
（４）と同様の条件でＲＡＷ２６４．７細胞を活性化し、細胞を回収して常法によってタンパク質を抽出し、抗ＣＯＸ−２抗体（BD Bioscience）及び抗α−チューブリン抗体（Sigma Aldrich Japan）を希釈率１／３０００で用いて、ウエスタン・ブロッティングを行った。ＣＯＸ−２を発現しないネガティブコントロールとして、ＬＰＳによって刺激していない細胞を用い、ＣＯＸ−２発現を抑制するポジティブコントロールとして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のかわりに、１０μｇ／ｍＬの（−）−ＤＨＭＥＱを添加した培地で培養した細胞を用いた。

図８に示すように、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬＰＳで刺激することによりＣＯＸ−２を発現するようになるが、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２はこのＣＯＸ−２の発現を濃度依存的に顕著に抑制した。
このように、ＤＴＣＭグルタルイミドは、マクロファージ活性化におけるＣＯＸ−２遺伝子発現を抑制し、その抑制の強さはＤＴＣＭグルタルイミドの濃度に相関する。

（７）ＤＴＣＭグルタルイミドは、マクロファージ活性化によるＩＬ−６産生には影響しない
炎症性刺激によって活性化されたマクロファージは、ＩＬ−６やＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインを産生するが、本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化によるＩＬ−６産生には影響しないことを示す。

（４）と同様の条件でＲＡＷ２６４．７細胞を活性化し、細胞を回収して常法によってタンパク質を抽出し、抗ＩＬ−６抗体があらかじめ固定化されている９６wellのポリスチレンマイクロプレートを用いて、ＥＬＩＳＡ法を行った。なお、ＩＬ−６を産生しないネガティブコントロールとして、ＬＰＳによって刺激していない細胞を用い、ＩＬ−６産生を抑制するポジティブコントロールとして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のかわりに、１０μｇ／ｍＬ（−）−ＤＨＭＥＱを添加した培地で培養した細胞を用いた。図９に、１０^６細胞あたりのＩＬ−６の検出濃度を示す。

図９に示すように、ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬＰＳで刺激することによりＩＬ−６を発現するようになり、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２は、３．０μｇ／ｍＬ以下の濃度では、このＩＬ−６の産生には全く影響を与えなかった。
このように、ＤＴＣＭグルタルイミドは、細胞毒性の生じない濃度では、マクロファージ活性化におけるＩＬ−６の発現を阻害しない。

（８）ＤＴＣＭグルタルイミドはマクロファージ活性化におけるＮＦ−κＢ活性化には影響しない
細胞内から核内へのシグナル伝達に関与するＮＦ−κＢは、免疫・炎症反応において刺激誘導される多くの遺伝子の発現誘導に関わっている転写因子として知られている。ＲＡＷ２６４．７細胞において、マクロファージを活性化するＬＰＳ刺激は、ＴＬＲ４を介してＮＦ−κＢを活性化する。また、ＮＦ−κＢは通常、抑制タンパク質ＩκＢと複合体を形成し、不活化された状態で細胞質中に存在するが、ＬＰＳなどの刺激を受けると、ＩκＢ−αはリン酸化された後、ユビキチン化を受け、プロテアソームによって分解される。さらに、ＩκＢ−αのプロモーター領域にはＮＦ−κＢの結合サイトが存在するため、ＮＦ−κＢの活性化によってＩκＢ−αは再誘導される。このように、マクロファージ活性化後の調節にＮＦ−κＢが重要な役割を果たしているが、本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化におけるＮＦ−κＢ活性化には影響しないことを示す。

まず、（２）と同様の条件で、３．０μｇ／ｍＬのＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を添加しない培地と添加した培地を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞を２時間培養後、３．０μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加して、さらに０、５、１５、３０、６０分の各時間培養した。それぞれの細胞を回収して常法によってタンパク質を抽出し、抗ＩκＢ−α抗体（Santa Cruz Biotechnology）を希釈率１／５００で、抗α−チューブリン抗体（Sigma Aldrich Japan）を希釈率１／３０００で用いて、用いて、ウエスタン・ブロッティングを行った。

図１０に示すように、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２未処理では、ＬＰＳを刺激した１５分後にＩκＢ−αの分解がおこり、３０分後から再誘導が起こった。そして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２で前処理しても、細胞毒性の生じない濃度では、ＩκＢ−αの分解および再誘導には影響を与えなかった。

次に、（２）と同様の条件で、各濃度（０、０．１、０．３、１．０、３．０μｇ／ｍＬ）のＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２を添加した培地を用いてＲＡＷ２６４．７細胞を２時間培養後、３．０μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加して、３０分間培養した。その後、核抽出物を常法により調整し、^３２Ｐでラベルしたプローブ３μＬを用いてゲルシフトアッセイを行った。

プローブの調製は、以下のように行った。まず、１．７５ｐmol／mL oligonucleotide（Promega社）（5'-ATGTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' 配列番号１）を４μＬ、１０×Ｔ４ ＰＮＫ バッファー（Takara）を４μＬ、nucleotide free waterを１０μＬ混ぜ、ここに２μＬの［γ−^３２Ｐ］−ＡＴＰ（Amarsham社）を加えて３７℃で１０分間インキュベートした後、８０μＬのＴＥ バッファー（１０ｍＭ Tris-HCl：１ｍＭ EDTA＝１：１）を加え、反応を停止させた。その後、充填されていたＴＥ バッファーを除去して蒸留水で洗浄した後、Nick Column（Amersham社）に１００μＬの反応液をのせた後、４００μＬの蒸留水をのせ、カラムからの溶出液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに回収した。さらに蒸留水を４００μＬのせ、再びカラムから出てきたフラクションを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに回収し、これを標識されたＤＮＡプローブとした。

なお、ＮＦ−κＢを活性化しないネガティブコントロールとして、ＬＰＳで活性化しない細胞を用い、ＮＦ−κＢの活性を抑制するポジティブコントロールとして、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２のかわりに、１０μｇ／ｍＬの（−）−ＤＨＭＥＱを添加した培地で培養した細胞を用いた。また、ＮＦ−κＢが結合したプローブによるシグナルは、ＤＨＭＥＱで消失することと、抗ｐ６５抗体（Santa Cruz Biotechnology）によるスーパーシフトが生じることにより、同定した。

図１１に示すように、ＬＰＳ刺激によりＮＦ−κＢの活性化が観察されたが、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２前処理は、３．０μｇ／ｍＬ以下の濃度では、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合能を抑制しなかった。
このように、ＤＴＣＭグルタルイミドは、細胞毒性の生じない濃度では、マクロファージの活性化におけるＮＦ−κＢの活性化を阻害しない。

（９）ＤＴＣＭグルタルイミドはマクロファージ活性化によるＭＡＰＫ活性化には影響しない
マクロファージ活性化によって誘導されるＮＯ産生には、ＮＦ−κＢだけでなく、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８を含むＭＡＰＫの活性化が関わっていることが知られている。また、炎症性サイトカイン遺伝子の発現にも、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫおよびｐ３８を含むＭＡＰＫの活性化が必須であるということも報告されている。しかし、本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージ活性化におけるｐ３８、ＥＲＫおよびＪＮＫのリン酸化には影響しないことを示す。

まず、（８）と同様に調整したタンパク質抽出物に対し、抗リン酸化ｐ３８抗体（Cell Signaling Technology社）、抗ｐ３８抗体（Santa Cruz Biotechnology社）、抗リン酸化ＥＲＫ抗体（Cell Signaling Technology社）、抗ＥＲＫ抗体（Santa Cruz Biotechnology社）、抗リン酸化ＪＮＫ抗体（Cell Signaling Technology社）、抗ＪＮＫ抗体（Santa Cruz Biotechnology社）をそれぞれ希釈率500分の1で用い、抗α−チューブリン抗体（Sigma Aldrich Japan社）を希釈率300分の1で用いて、ウエスタン・ブロッティングを行った。

図１２に示すように、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２未処理では、ｐ３８は、ＬＰＳで細胞を刺激した１０分後に活性化され、６０分後には活性化が減衰している。ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２前処理においても、このｐ３８の活性化のパターンには変化はない。

また、ＥＲＫについても同様に、ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２未処理では、ＬＰＳで細胞を刺激した１０分後に活性化され、６０分後には活性化が減衰している。ＤＴＣＭグルタルイミド−Ｃ１２前処理においても、このＥＲＫの活性化のパターンには変化はない。

このように、ＤＴＣＭグルタルイミドは、細胞毒性の生じない濃度では、マクロファージの活性化におけるＭＡＰＫの活性化には影響しない。

（１０）ＤＴＣＭグルタルイミドがマウス骨髄由来マクロファージに与える毒性の評価
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドが初代マウス骨髄由来マクロファージに与える細胞毒性を、細胞の生存率によって評価した。

頸椎脱臼法により屠殺した８週齢のＩＣＲマウス（オス、チャールズ・リバーより購入）を滅菌環境下で解剖し、大腿骨および尺骨を両足から単離した。２１Ｇ注射針を接続した１ｍＬシリンジを用い、骨髄腔をα―ＭＥＭで２、３回洗浄した。この洗浄液（α―ＭＥＭ）をナイロンメッシュ（３３０ ｍｅｓｈ）に通過させて不要な細胞を除去し、骨髄細胞を単離した。このようにして得られた骨髄細胞のα―ＭＥＭ懸濁液を１．２５〜３．７５×１０^６細胞／ｍＬに調製した。この骨髄細胞懸濁液８０ｍＬに対して０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した１０μｇ／ｍＬのｈＭ−ＣＳＦ（和光純薬工業株式会社）を８０μＬ添加した（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）。この細胞を、２４ウェルプレート（Corning社）に５００μ〜１ｍＬ／ウェルずつ播種し、２日間３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。２日後、非付着性細胞をα―ＭＥＭで洗い流した後、１０ｎｇ／ｍＬのｈＭ−ＣＳＦを含む新しいα―ＭＥＭに交換し、得られた付着性細胞をマウス骨髄由来マクロファージとした。

調製されたマウス骨髄由来マクロファージを、２４ウェルプレート（Corning社）に１ｍＬずつ播種した（１．２５〜３．７５×１０^６細胞／ｍＬ）。各ウェルに、１．０、３．０、１０．０、あるいは３０．０μｇ／ｍＬのＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を添加し、各実験群を３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。対照群にはＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を加えずに同条件下で培養した。

＝＝トリパンブルー染色による細胞生存率計側（Tripan blue dye exclusion assay）＝＝
各実験群において、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２添加２４時間、４８時間あるいは７２時間後に、細胞をセルスクレーパーで剥離してα―ＭＥＭに懸濁し、１ｍＬの細胞懸濁液を新しいエッペンドルフチューブに回収した。対照群でも同様にして、培養開始から２４時間、４８時間、あるいは７２時間後に細胞懸濁液を回収した。これを、３５００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を沈殿させた。実験群については、上清を除去した。対照群について、上清を回収した。その後、各実験群および対照群の細胞沈殿に、対照群から回収した上清を８０μＬ、および、２０μＬトリパンブルー染色液（４ｍｇトリパンブルーを１ｍＬの９ｍｇ／ｍＬ ＮａＣlに溶解して調製）を加えて再懸濁することにより、トリパンブルーによって死細胞が青く染色される。この細胞懸濁液１０μＬを、血球計算盤（エルマ社）に滴下し、倍率１００倍の顕微鏡下で全細胞と死細胞を計数した。この時、１枚の血球計算盤において一視野あたりおよそ１００個前後の細胞を計数し、４視野から各々得られた細胞死生存率の平均を算出した。細胞生存率（％）の算出には下記式を用いた。

生存率（％）＝（全細胞数−死細胞数）÷全細胞数×１００
図１３に示すように、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２が３．０μＬの群では、培養時間に関わらずマウス骨髄細胞由来マクロファージの生存率は８０％以上であった。一方、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２が１０．０あるいは３０．０μＬの群では、培養時間に関わらずマウス骨髄細胞由来マクロファージの生存率は低下した。

この結果は、マウス骨髄細胞由来マクロファージに対し、３．０μＬまでのＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２が毒性を有さないことを示している。従って、マウス骨髄由来マクロファージを用いた下記実施例におけるＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２は３．０μｇ／ｍＬ以下に設定した。

（１１）ＤＴＣＭグルタルイミドによるマウス骨髄由来マクロファージの破骨細胞分化の抑制
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドが、マウス骨髄由来マクロファージの破骨細胞分化を抑制することを示す。

実施例（１０）で調製した初代マウス骨髄由来マクロファージを、２４ウェルプレート（Corning社）に５００μＬずつ播種した（１．２５〜３．７５×１０^６細胞／ｍＬ）。ここに、最終濃度０、０．３、１．０、あるいは、３．０μｇ／ｍＬになるように各５μＬのＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を添加した。各実験群を３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２時間培養した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで調製した１０μｇ／ｍＬ ｈＲＡＮＫＬ（和光純薬株式会社）を５μＬ添加し（最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）、培養を続けた。なお、ＲＡＮＫＬはマクロファージ等からの破骨細胞分化を誘導する因子として知られている（Kobayashi et al. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 19(1), 61-72, 2009）。また、対照群は、ＲＡＮＫＬおよびＤＴＣＭグルタルイミドを添加しないこと以外は同条件で培養を行った。

５日間培養後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。ウェルに３．５％パラホルムアルデヒドを２５０μＬ加えて細胞を５分間固定した後、固定液をＰＢＳで洗浄した。さらに、アセトン：エタノール（１：１ｖ／ｖ）を２５０μＬ加えて３０秒静置し、脱脂を行った。ＰＢＳで洗浄後、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色液（０．０１％ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸、０．０５％ファストレッドバイオレットＬＢソルトをＴＲＡＰ緩衝液（５０ｍＭ Ｌ−酒石酸ナトリウム、９０ｍＭ 酢酸ナトリウム三水和物）で調製）を１ウェルあたり５００μＬ加えて室温で５〜２０分間インキュベートし、染色が確認されたら染色液を除去し、反応を停止した。２５０μＬのＰＢＳを加えてプレートを顕微鏡下で観察した。破骨細胞は、ＴＲＡＰ陽性であることが知られているので、顕微鏡下で、３核以上が融合したＴＲＡＰ陽性細胞を成熟した破骨細胞とし、その数を全視野で計測した。

図１４および図１５に示すように、ＲＡＮＫＬを加えない群では破骨細胞は観察されないが（図１４Ａ）、ＲＡＮＫＬを加えた群では破骨細胞の分化が誘導された（図１４Ｂ）。そして、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を添加した場合に、破骨細胞数が有意に減少した（図１４Ｃ〜Ｅ、図１５）。

この結果は、ＤＴＣＭグルタルイミドがマクロファージからの破骨細胞の分化を抑制することを示している。従って、ＤＴＣＭグルタルイミドを破骨細胞によって骨破壊の生じる各種疾病の治療に用いることができる。

（１２）ＤＴＣＭグルタルイミドによる癌細胞の生存率低下および増殖抑制
本実施例では、ＤＴＣＭグルタルイミドが癌細胞の生存率を低下させ、増殖を抑制する効果を有することを示す。

マウス胚性腫瘍由来Ｆ９細胞（理化学研究所 筑波研究所バイオリソースセンター 細胞材料開発室より購入）を、１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いてプラスティックディッシュに１×１０^４細胞／ｍＬで播種し、０、０．１、０．３、１．０、３．０、１０．０、３０．０μｇ／ｍＬの各濃度でＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を培地に添加し、２４、４８、あるいは７２時間培養した。実施例（１０）に記載の「トリパンブルー染色による生細胞率計測」に従い、細胞の生存率を計測した。また同様にして調製した培養細胞懸濁液を、懸濁液における細胞数をコールカウンター（Beckman coulter社）で計数し、細胞増殖を検出した。

図１６に示すように、いずれの培養時間の群においても、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２濃度依存的にＦ９細胞の細胞生存率が有意に低下した（ｔ検定）。また、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２濃度が１０あるいは３０μｇ／ｍＬの場合には、２４時間あるいは４８時間培養群と比較して７２時間培養群におい細胞生存率が有意に低下した。

また、図１７に示すように、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２を添加して培養した群では、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２無添加の群と比較して細胞増殖が抑制された。この細胞増殖抑制は、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２濃度が高いほど、また、ＤＴＣＭグルタルイミド―Ｃ１２添加後の培養時間が長いほどより高い効果が認められた。

この結果は、ＤＴＣＭグルタルイミドが腫瘍細胞の生存率を低下させる効果、および、増殖抑制の効果を有していることを示している。従って、ＤＴＣＭグルタルイミドを各種癌の治療に用いることができる。

本発明によって、ＮＦ−κBを阻害せずにｉＮＯＳとＣＯＸ−２の発現を阻害する医薬組成物を提供することが可能となった。

Claims (10)

1. 下式（Ｉ）で示される化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
   （式中、ｎは６〜２４のいずれかの整数である）
2. 請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有する一酸化窒素（ＮＯ）産生阻害剤。
3. 請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有する誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）発現阻害剤。
4. 請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現阻害剤。
5. 請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有するプロスタグランジン産生阻害剤。
6. 請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有する破骨細胞分化抑制剤。
7. 誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）またはシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）が介在する疾患の治療剤であって、
   請求項１に記載の医薬組成物を有効成分として含有する治療剤。
8. 前記疾患が、自己免疫性疾患、神経変性疾患、炎症性疾患、または腫瘍であることを特徴とする請求項７に記載の治療剤。
9. リウマチ、変形性関節症、膠原病、バセドー氏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、感染症、関節炎、発熱、腰痛症、月経困難症、歯周病、骨粗鬆症、骨がんであることを特徴とする請求項７に記載の治療剤。
10. 下式（Ｉ）で示される化合物。
    （式中、ｎは６〜１８のいずれかの整数である）