TWI531368B

TWI531368B - 減輕內毒素所引發全身性發炎反應之醫藥組成物及其用途

Info

Publication number: TWI531368B
Application number: TW103114635A
Authority: TW
Inventors: 卓貴美; 林昭成; 周善行; 劉榮森; 呂昌霖; 龍芳; 楊泮池
Original assignee: 輔仁大學學校財團法人輔仁大學; 國立臺灣大學
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2014-04-23
Publication date: 2016-05-01
Also published as: TW201540302A

Description

減輕內毒素所引發全身性發炎反應之醫藥組成物及其用途

本發明係關於一種發炎抑制劑，尤係關於一種用於治療內毒素所引發的全身性發炎反應之發炎抑制劑。

敗血症是一種嚴重和複雜的綜合病症，而敗血症所引發急性肺損傷是臨床最常見的危險因素，儘管醫療照顧的進步也無法有效改善病人的死亡率。目前認為致死的原因係在感染過程中發生嚴重的發炎反應而產生促炎性細胞因子(pro-inflammatory cytokine)過度釋放所導致，該促炎性細胞因子包括白細胞介素-1 β(interleukin-1 β，以下簡稱IL-1 β)、白細胞介素-6(interleukin-6，以下簡稱IL-6)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，以下簡稱TNF α)。脂多醣(lipopolysaccharide，以下簡稱為LPS)屬於內毒素(endotoxin)，係格蘭氏陰性菌外膜的主要成分，被廣泛應用在刺激免疫細胞產生細胞激素(cytokine)和誘發發炎反應的實驗上。動物實驗以腹腔內注射方式給予脂多醣，透過單核球細胞及巨噬細胞引起促炎性細胞因子釋放的過程，會導致內毒素血症併發敗血症反應。先前的研究指出，在急性感染下利用專一性免疫抑制劑減弱全身性的發炎反應(systemic inflammation)如糖皮質素(glucocorticoid 及活化蛋白C(activated protein C)，在動物實驗中可以有效的減輕敗血症之症狀並提高其存活率，部分的臨床實驗亦證實可改善敗血症的存活率，但只侷限於血壓依賴的病人身上。目前臨床上所使用具有不同抗發炎機制的免疫抑制藥物，如環孢素A(cyclosporine A)、雷帕黴素(rapamycin)及他克莫司(tacrolimus，FK-506)已被證實可抑制巨噬細胞中的發炎反應，但無法完全抑制誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，以下簡稱iNOS)及第二型環氧化酶(cyclooxygenase-2，以下簡稱COX2)的表現及其活性。然而，巨噬細胞在全身性發炎反應的早期所釋出的這些促炎性細胞因子，造成欲發展針對發炎調節因子的治療方法有其困難。

因此，以抗發炎作用來改善敗血症與急性肺損傷患者的存活率的策略是可行的，但是目前臨床用抗發炎藥物需要進一步的改善並且需要開發新成分與新作用機制的抗發炎藥物。

一種減輕內毒素所引發全身性發炎反應之醫藥組成物，係包含式(I)之化合物或其鹽以及醫藥上可接受之賦形劑，其中，Ph係苯基：

於本發明之一具體實施例中，該醫藥組成物係用以抑制免疫細胞之活化，並抑制全身性發炎反應。

於本發明之一具體實施例中，該免疫細胞係為巨噬細胞。

於本發明之一具體實施例中，該醫藥組成物係對巨噬細胞不具毒性。

於本發明之一具體實施例中，該醫藥組成物係用以抑制誘導型一氧化氮合成酶、第二型環氧化酶及促炎性細胞因子的表現，並抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，以下簡稱MAPKs)的磷酸化，另外，抑制核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，以下簡稱NF-κ B)由細胞質移動至細胞核中，用以抑制全身性發炎反應。

於本發明之一具體實施例中，該促炎性細胞因子係選自由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，以下簡稱TNF α)、白細胞介素-1 β(interleukin-1 β，以下簡稱IL-1 β)及白細胞介素-6(interleukin-6，以下簡稱IL-6)所組成之群組之至少一者。

本發明復提供一種該醫藥組成物的用途，其係用於製造減輕內毒素所引發全身性發炎反應的藥物。

第1圖係顯示不同FJU系列化合物對於Raw264.7小鼠巨噬細胞中iNOS及COX2表現之抑制效果；第2圖係顯示化合物FJU-C4對於Raw264.7小鼠巨噬細胞活化之抑制作用；(A)分別以1μM及5μMFJU-C4與100ng/ml脂多醣共同處理該細胞後以顯微鏡觀察的細胞型態變化(400倍)；(B)以西方墨點法分析以不同濃度之FJU-C4共同處理該細胞後其誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)及第二型環氧化酶(COX2)之蛋白質表現；(C)以MTT試驗分析FJU-C4對於該細胞存活率的影響；第3圖係顯示FJU-C4抑制促炎性細胞因子之轉錄含量，其中，第3A圖係以反轉錄酶聚合酶連鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction，以下簡稱RT-PCR)分析iNOS、COX2、IL-1 β、IL-6及TNF α，在以不同濃度FJU-C4處理時的mRNA表現；第3B圖係以定量即時反轉錄酶聚合酶連鎖反應(quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction，以下簡稱qRT-PCR)分析誘導型iNOS、COX2、IL-1 β、IL-6及TNF α、在以不同濃度之FJU-C4處理時的mRNA相對表現量；第4圖係顯示FJU-C4抑制IL-6、IL-1 β及TNF α的含量；第5圖係顯示FJU-C4在Raw264.7小鼠巨噬細胞中對於脂多醣所引發TNF α、IL-1 β及IL-6之表現的影響，其中，第5A圖係以RT-PCR偵測於全細胞裂解液中TNF α、IL-6及IL-1 β之mRNA含量，第5B圖係以qRT-PCR分析共同處理FJU-C4後IL-1 β、IL-6及TNF α於不同時間點的相對比率；第6圖係顯示FJU-C4在Raw264.7小鼠巨噬細胞培養中對於脂多醣所引發不同絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)之磷酸化影響及對NF-κ B的影響；(A)以西方墨點法分析15到60分鐘共同處理FJU-C4後p38、胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，以下簡稱ERK)及JNK(c-Jun N-terminal kinase)的磷酸化情形；(B)在15分鐘下共同處理不同濃度之FJU-C4後p38、胞外信號調節激酶及JNK的磷酸化情形；(C)以西方墨點法分析p38下游作用標的-ATF-2(activating transcription factor 2)及MSK1(mitogen- and stress-activated protein kinase-1)之活化情形；(D)共同處理FJU-C4後NF-κ B在細胞質及細胞核之分布情形；第7圖係顯示FJU-C4抑制促炎性細胞因子的分泌以避免小鼠死亡；(A)以ELISA試驗測量共同處理FJU-C4後小鼠血清中的TNF α及IL-1 β含量；(B)共同處理FJU-C4後小鼠的存活率。

以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。

實施例1 6-烯丙基-1-(2-甲基丙烯醯基)-4-(苯硫基)-5,6-二氫-2-吡啶酮(式(I)化合物)的合成

首先，本發明進行2-吡啶酮衍生化合物之篩選以確認較佳之減輕內毒素所引發全身性發炎反應的化合物。以下列反應流程1合成式(4)之化合物：

a：(1)BuLi(1.3eq),HMPA(4eq),THF,-78℃,30分鐘(2)(4eq),-78℃,2小時

b：(1)Ts-N=C=O(4eq),NaHCO₃(1eq),HQ(催化劑)，迴流6小時

(2)Et₃N

c：Bu₃SnH(1.2eq),AIBN(0.6eq)迴流2小時

由3-苯硫基碸環戊-3-烯(1)開始，在低溫-78℃進行烷化，得到式(2)化合物。與對甲苯碸基異氰酸酯進行氮雜雙烯狄爾斯-阿爾德反應(aza-Diels-Alder)反應，得到式(3)化合物。再利用自由基切除氮上的對甲苯磺醯基(tosyl group)，可得到式(4)化合物。

再秤取式(4)化合物(200毫克(mg),0.8毫莫耳(mmol))於乾燥的25毫升(mL)單頸瓶中，於氮氣下以5mL四氫呋喃(tetrahydrofuran)溶解，降溫至-78℃後以針筒緩慢滴入丁基鋰(n-Butyllithium)(0.42mL,2.5M,1.04mmol)，反應30分鐘後以針筒一次加入甲基丙烯醯氯(methacryloyl chloride)(0.33mL,3.2mmol)，將反應瓶緩慢回室溫並於室溫下反應1小時。減壓抽去四氫呋喃，以20mL乙酸乙酯萃取，分別以5%、20mL氫氯酸水溶液、20mL飽和碳酸氫鈉水溶液、20mL飽和食鹽水洗滌有機層。有機層以硫酸鎂乾燥並過濾，減壓抽乾溶液，殘留物以乙酸乙酯/正己烷=1/6、1/1為沖提液，經由驟沸塔(flash column)分離出產物6-烯丙基-1-(2-甲基丙烯醯基)-4-(苯硫基)-5,6-二氫-2-吡啶酮(以下稱為FJU-C4)(179.5mg,70%)。

白色固體；mp 63.2-65.0℃(再結晶CH₂Cl₂)

IR(ATR)3075,2923,1679,1656,1591,1335cm^-1

1H NMR(CDCl3)δ 7.55-7.42(5H,m),5.85-5.72(1H,m),5.35(1H,d,J=2.4Hz),5.16-5.09(4H,m),4.63-4.56(1H,m),2.84(1H,ddd,J=17.4,6.0,2.4Hz),2.55-2.30(3H,m),1.95(3H,s)

13C NMR(CDCl3)δ 174.3,162.9,159.0,142.9,135.4,133.8,130.5,130.0,127.6,118.9,116.4,114.2,52.0,36.6,31.7, 19.2

此外，本發明測試FJU系列化合物(未顯示FJU-C4以外的化合物)對於發炎反應的抑制效果，將FJU系列化合物以10μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)購買的脂多醣以100ng/mL加入並共同處理24小時，將該細胞收集後以西方墨點法分析。

其結果顯示，在FJU系列化合物中，FJU-C4顯著地抑制iNOS及COX2的蛋白質表現(參見第1圖)，確認FJU-C4為一種新穎之用於減輕內毒素所引發全身性發炎反應的化合物。

實施例2 FJU-C4抑制小鼠巨噬細胞株中iNOS及COX2的產生

本實施例測試FJU-C4是否對於藉由脂多醣刺激發炎反應具有抑制效果，將FJU-C4以10μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔6×10⁵個細胞之Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)購買的脂多醣以100ng/mL加入並共同處理24小時，將該細胞收集後以西方墨點法分析。

分別將FJU-C4以0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM及10μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔以6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將脂多醣以100ng/mL加入並共同處理24小時，將該細胞收集後以顯微鏡(400倍)觀察其細胞型態並以西方墨點法分析iNOS及COX2的蛋白質表現情形，另以MTT試驗分析該細胞的存活率。

其結果顯示，以LPS刺激活性之Raw264.7小鼠巨噬細胞改變其細胞型態成為細胞質中具有空泡之樹突狀細胞，當該巨噬細胞以不同濃度之FJU-C4預處理時，可大量減少經脂多醣所刺激之巨噬細胞的細胞形態改變，其改變程度係依FJU-C4處理濃度的增加而減弱(參見第2A圖)，且該細胞中的iNOS及COX2的蛋白質表現亦隨著FJU-C4處理濃度的增加而減少(參見第2B圖)。

此外，為了說明抑制iNOS及COX2的產生是否係藉由細胞死亡所造成，在有/無LPS刺激下以新穎之FJU-C4處理條件下，以MTT試驗檢測細胞存活率。其結果發現，FJU-C4對於Raw264.7小鼠巨噬細胞表現低細胞毒殺(cytotoxicity)效果，相反地，保護該小鼠巨噬細胞免於LPS所誘發之細胞凋亡(apoptosis)(參見第2C圖)，此表示FJU-C4並不是因為造成細胞凋亡而導致該細胞中之iNOS及COX2的表現下降。

實施例3 FJU-C4抑制小鼠巨噬細胞中促炎性細胞因子的基因表現

為了測試FJU-C4是否係藉由抑制促炎性細胞因子而抑制免疫反應的效果。分別將FJU-C4以0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM及10μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將脂多醣以100ng/mL加入並共同處理20小時，將該細胞收集後以RT-PCR分析該細胞中促炎性細胞因子-TNF α、IL-1 β及IL-6的mRNA表現情形。

其結果顯示，當以增加濃度之FJU-C4處理時，隨著劑量改變而下調iNOS及COX2基因之mRNA表現(參見第3A圖)，此結果係與由西方墨點法所偵測到蛋白質含量一致(參見第2B圖)。而該促炎性細胞因子(例如：TNF α、IL-1 β及IL-6)基因的mRNA表現亦經由FJU-C4處理後顯著地被抑制(參見第3A圖及第3B圖)

在以濃度1μM之FJU-C4處理時，抑制該促炎性細胞因子基因的mRNA表現，並在濃度約5μM時完全抑制。此外，本發明亦藉由ELISA試驗分析是否成熟促炎性細胞因子分泌於細胞培養中，此結果顯示FJU-C4會抑制TNF α、IL-1 β及IL-6的分泌，且係依其處理濃度的增加而顯著地減少(參見第4圖)。

實施例4 FJU-C4係藉由抑制p-38及NF-κ B的訊息傳導路逕而抑制發炎反應

本實施例測試FJU-C4是否係藉由抑制p38及NF-κ B的訊息傳導路逕(signaling pathway)而造成抑制促炎性細胞因子的效果。將FJU-C4以10μM的濃度溶解於DMSO中，加入一孔6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將脂多醣以100ng/mL分別加入並共同處理0.5、1、2、4及6小時，將該細胞收集後以反轉錄酶聚合酶連鎖反應(PCR)及RT-PCR分析該細胞中促炎性細胞因子-TNF α、IL-1 β及IL-6的mRNA表現情形。此外，將FJU-C4以10μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將脂多醣以100ng/mL分別加入並共同處理15、30、60及120分鐘，將該細胞收集後以西方墨點法分析p38、胞外信號調節激酶及JNK的磷酸化情形。另外，分別將FJU-C4以1μM及5μM的濃度溶解於DMSO中，將一孔6×10⁵個細胞的Raw264.7小鼠巨噬細胞培養於24孔盤中，先預處理該小鼠巨噬細胞30分鐘，再將脂多醣以1μg/mL加入並共同處理60分鐘，將該細胞收集後以西方墨點法分析NF-κ B在細胞質及細胞核中的蛋白質表現情形。

其結果顯示，當Raw264.7小鼠巨噬細胞曝露於LPS刺激時，FJU-C4普遍地抑制TNF α、IL-1 β及IL-6的mRNA在各時間點的表現(參見第5A圖及第5B圖)。

另外，p38、ERK及JNK的磷酸化(phosphorylation)情形約在以FJU-C4處理15分鐘時達到高峰(參見第6A圖)，因此選擇此時間點的細胞樣本作進一步分析。此結果發現，以5μM及10μM濃度的FJU-C4共同處理時會明顯地抑制脂多醣所引發的p38磷酸化，但對於ERK及JNK只有些微的影響(參見第6B圖)，且p38的下游標的包括ATF-2及MSK1之活化亦只受些微的影響(參見第6C圖)。此外，FJU-C4抑制脂多醣所造成的NF-κ B從細胞質移入細胞核之情形，且此情形隨著其處理濃度的增加而減少(參見第6D圖)。

實施例5 FJU-C4抑制小鼠中促炎性細胞因子的產生並抑制脂多醣所引發的小鼠死亡

本實施例測試FJU-C4在小鼠中對於內毒素所所引發的全身性發炎反應具有抑制效果。分別將1mg/kg及5mg/kg濃度之FJU-C4溶解於PBS中並施予小鼠，再將15mg/kg脂多醣溶解於PBS中並注射入小鼠腹腔內，最後以ELISA試驗分析該小鼠血清中TNF α及IL-1 β的蛋白質含量。

其結果顯示，以FJU-C4處理時，藉由減少TNF α及IL-1 β的分泌而減輕脂多醣所引發的全身性發炎反應(參見第7A圖)。另外，以濃度超過5mg/kg之FJU-C4處理時可避免脂多醣所引發的死亡，且在72小時，該小鼠之存活率幾乎均高達50%，而控制組小鼠均在48小時即已死亡(參見第7B圖)。

本發明提供一種新穎的抗發炎化合物FJU-C4，已在小鼠中發現其可以抑制小鼠血液中促炎性細胞因子的釋放及降低小鼠因脂多醣引發敗血症的死亡率。因此認為FJU-C4可以藉由不同作用機制調控引發敗血症的急性發炎反應，進一步改善因內毒素引發敗血症患者的症狀及存活率。

Claims

一種減輕內毒素所引發全身性發炎反應之醫藥組成物，係包含式(I)之化合物或其鹽以及醫藥上可接受之賦形劑，其中，Ph係苯基，該式(I)之化合物之濃度係大於0.1μM。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制免疫細胞之活化，並抑制全身性發炎反應。
如申請專利範圍第2項所述之醫藥組成物，其中，該免疫細胞係為巨噬細胞。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該醫藥組成物係對巨噬細胞不具毒性。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制第二型環氧化酶(COX2)。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制促炎性細胞因子的表現。
如申請專利範圍第7項所述之醫藥組成物，其中，該促炎性細胞因子係選自由TNF α、IL-1 β 及IL-6所組成群組之至少一者。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化。
如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，係用以抑制核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NF-κ B)由細胞質移動至細胞核中，用以抑制全身性發炎反應。
一種如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物的用途，其係用於製造減輕內毒素所引發全身性發炎反應的藥物。