CN104725398A - 一种jak/stat3磷酸化抑制剂及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种JAK/STAT3磷酸化抑制剂及其制备方法与用途。结构式如式I所示，式I中，X选自S或O；Y和Z独立地选自N或CH；R₁为C3-C6环烷基。以式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物为活性成分制备的JAK/STAT3磷酸化抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肿瘤的药物、预防和/或治疗炎症药物、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物或预防和/或治疗病毒感染药物均属于本发明的保护范围。活性实验研究表明，本发明式I所示化合物具有优异的JAK/STAT3磷酸化抑制活性，可用于预防和治疗肿瘤，预防和治疗炎症、预防和治疗自身免疫性疾病和预防和治疗病毒感染。

Description

一种JAK/STAT3磷酸化抑制剂及其制备方法与用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种JAK/STAT3磷酸化抑制剂及其制备方法与用途。

背景技术

信号转导及转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)是细胞信号转导及转录激活因子家族中的一员，是细胞因子及生长因子受体信号下游效应器，受上游受体激酶以及JAKs家族激酶的影响。STAT3的活化依赖于酪氨酸705位(Tyr705)的磷酸化，磷酸化的STAT3与另一个STAT3的SH2结构域相互作用形成二聚体，进而转入细胞核与特异性的DNA启动子序列结合从而调控与细胞增殖及凋亡等重要功能基因的表达。JAK/STAT3在许多癌症和免疫性疾病中都持续性的高表达，阻断JAK/STAT3的功能可以导致肿瘤细胞的死亡，有效抑制肿瘤组织的生长，还可以改善自身免疫相关疾病的症状。近年来，JAK/STAT3已经成为一个治疗疾病重要的靶点。

JAK/STAT3途径在其它疾病中的重要性：已经在多种自身免疫和炎性疾病中证明了JAK/STAT3被多种细胞因子如白细胞介素6(IL6)激活。近来已经揭示：JAK/STAT3途径通过其在产生TH17T细胞响应中的基本作用促进了病理学免疫应答。此外，JAK/STAT3途径介导的炎症是动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、高血压、骨质疏松症(osteroprorosis)、2型糖尿病和痴呆的常见起因。因此，JAK/STAT3抑制剂可用于预防和治疗自身免疫疾病和炎性疾病以及由炎症引起的上文所列的其它疾病。

另外，最近研究表明JAK/STAT3可以作为一个比较重要的抗病毒靶点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种化合物及其制备方法。

本发明所提供的化合物，其结构式如式I所示：

上述式I中，X选自S或O；Y和Z独立地选自N或CH；R₁为C3-C6环烷基，如环丙基、环戊基或环己基。

具体地，所述式I所示化合物为下述化合物：

上述式I所示化合物药学上可接受的盐或水合物也属于本发明的保护范围。

其中，所述盐为无机酸盐或有机酸盐。

所述无机酸盐选自下述任意一种无机酸形成的盐：盐酸、硫酸和磷酸。

所述有机酸盐选自下述任意一种有机酸形成的盐：乙酸、三氟乙酸、丙二酸、柠檬酸和对甲苯磺酸。

本发明所提供的式I所示化合物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

在缚酸剂存在下，将式Ⅲ所示化合物与式Ⅳ所示化合物进行反应，得到式I所示化合物；

上述式Ⅲ中，R₁为C3-C6环烷基，如环丙基、环戊基或环己基。

上述式Ⅳ中，L表示离去基团如Cl、Br、I、OTos(对甲苯磺酰氧基)或OTf(三氟甲磺酸基)；

X选自S或O；Y和Z独立地选自N或CH。

上述方法中，所述缚酸剂为有机胺，如N,N-二异丙基乙胺。

所述缚酸剂与式Ⅳ所示化合物的摩尔比为1.5-1:1，如1.1:1。

所述式Ⅲ所示化合物与式Ⅳ所示化合物的摩尔比为1:1-1.5。

所述反应的温度为100℃-150℃，所述反应的时间为1h-5h。

本发明的另一个目的是提供式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物的用途。

本发明所提供的式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物的用途是其在下述方面的应用：

1)在制备JAK/STAT3磷酸化抑制剂中的应用；2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；3)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用；4)在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用；5)在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病药物中的应用；6)在制备预防和/或治疗病毒感染药物中的应用。

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞可为血液肿瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、横纹肌瘤细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞或神经胶质瘤细胞。

所述癌细胞具体可为人肝胚细胞瘤细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549、人恶性胚胎横纹肌瘤细胞RD和人宫颈癌细胞株HeLa。

所述肿瘤为癌；所述癌具体可为血液癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、横纹肌癌、前列腺癌和神经胶质瘤。

所述病毒具体可为肝炎病毒、人巨细胞病毒、新城疫病毒、疱疹病毒，具体可为丙型肝炎病毒。

以式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物为活性成分制备的JAK/STAT3磷酸化抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肿瘤的药物、预防和/或治疗炎症药物、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物或预防和/或治疗病毒感染药物也均属于本发明的保护范围。

所述JAK/STAT3磷酸化抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肿瘤的药物、预防和/或治疗炎症药物、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物或预防和/或治疗病毒感染药物中，所述式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物的质量含量为0.1-90％。

所述JAK/STAT3磷酸化抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肿瘤的药物、预防和/或治疗炎症药物、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物或预防和/或治疗病毒感染药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以式I所示化合物及其药学上可接受的盐或水合物为活性成分制备的JAK/STAT3磷酸化抑制剂、真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂、预防和/或治疗肿瘤药物、预防和/或治疗炎症药物、预防和/或治疗自身免疫性疾病药物或预防和/或治疗病毒感染药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的积极进步效果在于：本发明的式I所示化合物具有优异的STAT3磷酸化抑制活性，可以用于预防和治疗肿瘤、预防和治疗炎症、预防和治疗自身免疫性疾病和预防和治疗病毒感染。

附图说明

图1为式Ⅱ所示化合物(SI-56)的合成路线。

图2为式Ⅱ所示化合物(SI-56)的¹H NMR谱。

图3为化合物SI-56抑制STAT3磷酸化活性。其中，图3A为化合物SI-56抑制组成型STAT3磷酸化的活性，图3B为化合物SI-56抑制IL-6诱导型STAT3磷酸化的活性。

图4为化合物SI-56在HepG2，A549，RD和HeLa细胞上的细胞毒性。

图5为化合物SI-56抑制含荧光素酶报告基因的2a型HCVcc的体外感染。

图6为化合物SI-56抑制HCV复制子。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、式Ⅱ所示化合物(SI-56)的制备

按照图1所示的合成路线制备式Ⅱ所示化合物(SI-56)。

第一步：250ml反应瓶中依次加入50g 2-氨基-噻吩-3-羧酸甲酯(SM1)，65.6g醋酸甲脒和125ml乙二醇单甲醚，加热到120℃左右，回流3小时送检，原料反应完毕。冷却至室温，次日过滤，滤饼用水洗三次，烘干得产品(CP0763A)45g。Yield:94％。

第二步:250ml单口瓶中加入CP0763A 45g，三氯氧磷75ml和N,N-二甲基苯胺7.5ml,升温回流2小时送检，原料反应完毕。旋蒸除去大部分三氯氧磷后，加冰水淬灭。再加氨水调节pH为6-7，过滤，滤饼用水洗三次。固体用EA溶清后加活性炭脱色。干燥后旋干得产品(CP0763 B)34g。Yield:68％；Purity>99％。

第三步:500mL反应瓶中加入镁屑4g和THF，氮气保护下加入约20％的溴-环丙烷(SM2)的THF溶液(20gSM2)，加三粒碘，升温至回流，反应引发。再滴加剩余的SM2。加完后降温，滴加30mL苯甲腈，保温30min后再升温回流3h(加甲苯做参比，送GC反应不变)，降温，滴加甲醇，搅拌30min后分批次加入22g硼氢化钠，室温搅拌三天后，反应不变。旋干反应液，加盐酸调pH为1，用DCM萃取，水相再用碳酸钠调至pH为9-10，DCM萃取，有机相用NaCl洗两次，干燥。旋干得粗品(CP0763 E)14.5g。

第四步:500mL单口瓶中CP0763E 14.5g，CP0763B 18g，N,N-二异丙基乙胺14g和正丁醇300ml，升温至120℃，回流三小时送样，原料CP0763E反应完。降温后，75℃旋干反应液，拌硅胶过柱，收集产品点，旋干得11g，送检，纯度合格。

图2为目标化合物的¹H NMR谱。

经结构鉴定所合成的化合物确为式II所示目标化合物。

实施例2、化合物抑制STAT3磷酸化活性实验

为了检测化合物SI-56抑制STAT3磷酸化活性，进行了以下实验。

材料和试剂

1.细胞株：

Huh7.5.1和HCV复制子细胞系用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂条件下常规培养。

2.药物：

按实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)。

3.试剂：

DMEM培养基和胎牛血清购自Gibico公司；STAT3(Tyr705)和STAT3抗体购自CST公司；actin抗体购自sigma公司；IL-6购自义翘神州公司。

4.主要仪器：

蛋白电泳仪和转膜仪购自Bio-Rad公司。

5.操作步骤：

(1)SI-56抑制组成型STAT3(Tyr705)活性

1)细胞接种。将Huh7.5.1或HCV复制子细胞系以约30,000个细胞的密度分配到24-孔板的每个孔中，继续在37℃的CO₂培养箱中培养8小时。培养基是含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM细胞培养基。

2)药物处理。制备的化合物(SI-56)以培养基梯度稀释，每孔中加入20μl，每个浓度设立3个复孔，并设立空白对照组和0.5％DMSO对照组，继续培养24小时。

3)检测。利用常规的方法提取蛋白，进行定量western-bloting实验。结果如图3A所示。

由图3A可知：实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)以剂量依赖的方式抑制组成型STAT3磷酸化的活性。

(2)SI-56抑制诱导性型STAT3(Tyr705)活性

1)细胞接种。将Huh7.5.1或HCV复制子细胞系以约30,000个细胞的密度分配到24-孔板的每个孔中，继续在37℃的C0₂培养箱中培养8小时。培养基是含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM细胞培养基。

2)药物处理。制备的化合物(SI-56)以培养基梯度稀释，每孔中加入20μl，每个浓度设立3个复孔，并设立空白对照组和0.5％DMSO对照组，处理2小时后，用终浓度为30ng/ml的IL-6处理细胞15分钟。

3)检测。利用常规的方法提取蛋白，进行定量western-bloting实验。结果如图3B所示。

由图3B可知：实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)以剂量依赖的方式抑制IL-6诱导型STAT3磷酸化的活性。

实施例3、细胞毒性试验

为了检验式Ⅱ所示化合物是否显示细胞毒性，利用HepG2细胞系将式Ⅱ所示化合物在体外进行MTT检测。

材料和试剂

1.细胞株：

HepG2：人肝胚细胞瘤细胞株，DMEM培养基培养；A549:人肺癌细胞株，DMEM培养基培养；RD：人恶性胚胎横纹肌瘤细胞，DMEM培养基培养；HeLa：人宫颈癌细胞株，DMEM培养基培养。在37℃、5％CO₂条件下常规培养。

2.药物：

按实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)。

3.试剂：

DMEM培养基购自Gibico公司。

4.主要仪器：

酶标仪为Thermo Multiskan FC；96孔板为Costar公司。

4.操作步骤：

将对数生长期的肿瘤细胞以0.25％胰酶消化下来；

细胞计数，并调整细胞浓度为3×10⁴个/mL；

细胞接种，于96孔板中加入调整浓度后的细胞培养液，每孔180μl，周边以无血清培养基封闭；

将细胞置于培养箱中培养24小时，使细胞贴壁；

将实施例1制备的化合物(SI-56)以培养基梯度稀释，每孔中加入20μl，每个浓度设立3个复孔，并设立空白对照组和0.5％DMSO对照组，继续培养48小时；

取出96孔板，每孔中加入20μl MTT，继续培养4小时；

取出96孔板，小心吸去各孔内液体后，每孔中加入150μl DMSO，平板摇床震摇10min使紫色小颗粒溶解，酶标仪测定各孔的光吸收，波长为570nm；

按照下列公式计算各浓度组细胞存活率：

细胞存活率％＝(OD加药组－OD本底)/(OD空白对照组－OD本底)×100％

各浓度组细胞增殖抑制率＝100％－细胞存活率％；

以细胞增殖抑制率为纵坐标，化合物浓度为横坐标，OrigenPro 7.5软件拟合抑制曲线，并计算化合物的CC₅₀值。结果如图4所示。

由图4可知：实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)以剂量依赖的方式抑制常见肿瘤细胞的生长。

实施例4、化合物抑制含荧光素报告基因(是将荧光素酶Luciferase导入HCVcc得到的表达荧光素酶的重组病毒)的2a型HCVcc体外感染实验

为了检验式Ⅱ所示化合物对含荧光素报告基因的2a型HCVcc的抑制活性，进行下列实验。

材料和试剂

1.细胞株：

Huh7.5.1细胞系用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂条件下常规培养。

2.药物：

按实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)。

3.试剂：

DMEM培养基和胎牛血清购自Gibico公司；荧光素酶底物检测试剂盒购自Promega公司。

4.主要仪器：

48孔板购自Costar；发光检测仪为Promega Glomax 2020单光型发光检测仪。

4.操作步骤：

实验于48孔板中进行。HCVcc感染实验详细步骤如下：

1)感染细胞的准备：转染前18～24小时用含10％FBS的DMEM培养基在48孔板内接种Huh7.5.1细胞，37℃，恒温CO₂(5％)培养箱培养过夜。

2)病毒感染：为准备好的细胞更换新鲜培养基200μl/孔，加入含有含荧光素酶报告基因的2a型HCVcc的培养基，200μl/孔，于37℃培养箱中感染8小时或者过夜。

3)化合物处理：制备的化合物(SI-56)以培养基梯度稀释，每孔中加入20μl，每个浓度设立3个复孔，并设立空白对照组和0.5％DMSO对照组，继续培养48小时。

3)报告基因检测：用无菌PBS洗细胞一次，弃掉残留液体。加入1×被动细胞裂解液80μl/孔，室温下轻晃，裂解20分钟。将裂解液转移到不透光的96孔白板，加入Luciferase Assay Reagent 70～100μl/孔，在化学发光检测仪上检测荧光素酶的活性，从而指示HCVcc病毒感染的水平。结果如图5所示。

由图5可知：实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)以剂量依赖的方式抑制常见病毒感染。

实施例5、化合物抑制H CV复制子实验

为了检验由式Ⅰ所示化合物对HCV亚复制子的抑制活性，进行下列实验。

本实验用HCV 1b型亚复制子细胞系进行检测。

材料和试剂

1.细胞株：

本实验用HCV 1b型亚复制子细胞系进行检测。HCV 1b型亚复制子细胞系用含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下常规培养。

2.药物：

按实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)。

3.试剂：

DMEM培养基购自Gibico公司；Tizol购自Invitrogen公司；定量PCR试剂盒购自Qiangen公司。

4.主要仪器：

定量PCR仪为Bio-Rad公司的CFX96实时荧光定量PCR仪；生物安全柜为Nuare公司；CO₂细胞培养箱为Thermo公司；倒置显微镜为：XDS-1B；24孔板为Costar公司。

4.操作步骤：

1)细胞接种。将含有丙型肝炎病毒复制子的肝癌细胞系Huh-7以约30,000个细胞的密度分配到24-孔板的每个孔中，继续在37℃的C0₂培养箱中培养8小时。培养基是含有10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM细胞培养基。

2)药物处理。制备的化合物(SI-56)以培养基梯度稀释，每孔中加入20μl，每个浓度设立3个复孔，并设立空白对照组和0.5％DMSO对照组，继续培养48小时。

3)检测。利用常规的方法提取RNA，进行定量PCR检测。结果如图6所示。

由图6可知：实施例1制备的式Ⅱ所示化合物(SI-56)以剂量依赖的方式抑制HCV复制子中的RNA复制。

Claims (8)

1.式I所示化合物或其药学上可接受的盐或水合物：

式I中，X选自S或O；Y和Z独立地选自N或CH；R₁为C3-C6环烷基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述式I所示化合物为下述化合物：

3.一种制备权利要求1或2所述的化合物的方法，包括下述步骤：在缚酸剂存在下，将式Ⅲ所示化合物与式Ⅳ所示化合物进行反应，得到式I所示化合物；

式Ⅲ中，R₁为C3-C6环烷基；

式Ⅳ中，L表示离去基团；X选自S或O；Y和Z独立地选自N或CH。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述离去基团选自下述任意一种：Cl、Br、I、对甲苯磺酰氧基和三氟甲磺酸基。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述缚酸剂为有机胺；

所述缚酸剂与式Ⅳ所示化合物的摩尔比为1.5-1:1；

所述式Ⅲ所示化合物与式Ⅳ所示化合物的摩尔比为1:1-1.5；

所述反应的温度为100℃-150℃，所述反应的时间为1h-5h。

6.权利要求1或2所述的化合物及其药学上可接受的盐或水合物在制备下述产品中的应用：

1)在制备JAK/STAT3磷酸化抑制剂中的应用；2)在制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；3)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用；4)在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用；5)在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病药物中的应用；6)在制备预防和/或治疗病毒感染药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为血液肿瘤细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、横纹肌瘤细胞、宫颈癌细胞、前列腺癌细胞或神经胶质瘤细胞；

所述肿瘤为癌；所述癌为血液癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、横纹肌癌、前列腺癌或神经胶质瘤；

所述病毒为肝炎病毒、人巨细胞病毒、新城疫病毒或疱疹病毒。

8.一种产品，其活性成分为权利要求1或2所述的化合物，其中，所述产品为：1)JAK/STAT3磷酸化抑制剂；2)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；3)预防和/或治疗肿瘤的药物；4)预防和/或治疗炎症药物；5)预防和/或治疗自身免疫性疾病药物；6)预防和/或治疗病毒感染药物。