TW202045163A - 具抗發炎活性之１，２，４－三氮唑衍生物之製備及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明涉及新穎的1,2,4-三氮唑衍生物及其製備方法，其係涉及一種具有抗發炎活性的1,2,4-三氮唑衍生物，該化合物係以腈基亞胺為起始物，經胺化和雜環化兩個反應步驟，以綠色化學方法合成出具有多取代基的1,2,4-三氮唑衍生物。該1,2,4-三氮唑衍生物經實驗證實對LPS誘導RAW 264.7細胞生成的一氧化氮具有顯著的抑制效果，本發明所製備的化合物可應用於製備治療各種炎症及其相關疾病的藥物。

Description

具抗發炎活性之1,2,4-三氮唑衍生物之製備及其用途

本發明係關於一種新穎三氮唑類化學合成物；詳言之，本發明係關於一種具有抗發炎活性之1,2,4-三氮唑化合物之製備及其用途。

發炎反應為體內遇到外來刺激，產生血管通透性變高、組織液和白血球局部聚集之防禦過程，進而出現紅、腫、熱、痛等症狀。接著，人體免疫系統將會啟動一系列之免疫相關路徑，如前列腺素(PGs)和環氧化酶(COXs)和一氧化氮合酶(iNOS)等並針對組織損傷處進行修復。根據已發表之研究表示，發炎反應與多種疾病間具有高度相關性，包含動脈粥狀硬化、癌症、感染、神經退化性疾病和類風溼性關節炎等(C.Nathan,Nature.2002,420,846-852.)。

目前抗發炎治療藥物可依藥物結構區分兩大類，分別為類固醇類(Steroid)和非類固醇消炎止痛藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAID)。類固醇為以四環脂質結構為主，為腎上腺素分泌之荷爾蒙之一，其功能可減緩免疫發炎反應，並調節蛋白質、醣類及脂肪之新陳代謝。類固醇之抗發炎治病機轉，主要透過穩定血管通透性及肥大細胞之細胞膜，減少組織胺之釋放、白血球於發炎部位之聚集現象和花生四烯酸之 生成。常見之類固醇市售藥物有Prednisolone、Betamethasone、Dexamethasone等，由於該類藥物的作用部位不具選擇性，若長期服用會產生皮膚變薄、有刺痛感、微血管擴張、庫欣氏症、月亮臉和水牛肩等常見之副作用，因此類固醇非為抗發炎治療之第一線用藥。

非類固醇止痛消炎藥物(NSAID)，為目前抗發炎治療之第一線用藥。其作用機轉為抑制環氧化酶(Cyclooxygenase，COX)之作用，進而阻止花生四烯酸(Arachidonic acid)代謝成前列腺素(Prostaglandins)及血栓素(Thromboxane)等促發炎物質所引起之發炎反應。市面上常見的藥物有：Aspirin、Indomethacin、Ibuprofen及Naproxen等。而此類藥物常見的副作用為腸胃道不適、潰瘍，因此若患者本身有消化性潰瘍病史或其他危險因素者，會在服用NSAID的同時，預防性地給予抗潰瘍藥物。

1,2,4-三氮唑類為五元雜環化合物，具有芳香性。據文獻指出，以1,2,4-三氮唑環為核心結構之類似物具有廣泛之生物活性，其最著名的為抗發炎和抗黴菌活性。(Q.Zhang；M.Keenan；Y.Peng；A.C.Nair；S.J.Yu；R.D.Howells；W.J.Welsh,J Med Chem.2006,49,4044-4047)

研究指出1,2,4-三氮唑環類衍生物對大鼠使用卡拉膠(Carrageenans)誘導之發炎反應，具有顯著的抗炎效果，且其抗發炎效果與市售藥物Indomethacin相當，其化合物活性測試列於表(1)(A.M.Megeed；H.M.Rahman；G.S.Alkaramany；M.A.Gendy,European Journal of Medicinal Chemistry.2009,44,117-123.

據他篇研究指出，1,2,4-三氮唑環類衍生物不僅有效地減少卡拉膠誘導的足墊水腫現象，還可減少滲出物中多型核白血球的總數，由此研究可知，1,2,4-三氮唑環類衍生物具有優於市售藥Indomethacin的抗發炎活性，如表(2)所示。

先前合成三氮唑環類化合物(triazole)之核心基礎架構的方法有三種。第一種公佈之合成方法所示如下列第(一)反應圖所示化合物之路徑I(K.S.Yeung；M.E.Farkas；J.F.Kadow；N.A.Meanwell,Tetrahedron letters.2005.46,3429-3432.)：利用微波反應方式，使用腈(nitriles)和醯肼(hydrazides)在鹼性條件下合成出二取代的1,2,4-三氮唑類化合物。第二種公佈之合成方法所示如下列第(一)反應圖所示化合物之路徑II(G.M.Castanedo；P.S.Seng；N.Blaquiere；S.Trapp：S.T.Staben,The Journal of organic chemistry.2011,76,1177-1179.)：利用羧酸(carboxylic acids)、脒(amidines)先行反應形成酰脒中間體(acylamidine intermediate)，再與醯肼(hydrazides)合成出多取代的1,2,4-三氮唑類化合物第三種公佈之合成方法所示如下列第(一)反應圖所示化合物之路徑III(M.M.Guru：T. Punniyamurthy,The Journal of organic chemistry.2012,77,5063-5073.)：係開發了以脒(amidines)為起始物，銅當作催化條件以提升1,2,4-三氮唑類化合物的產率之一鍋化反應。上述三種公佈合成方法所得到的產率表現不穩定，僅有少部分產物表現出高產率，大多產物的產率表現仍偏低，因此未來若進入製程放大過程，難以控管產率表現一致化。

近期，我們提出第四種公佈之合成方法第(二)反應圖所示之路徑(S.E.Tsai；K.H.Chiang；C.C.Tseng；N.W.Chen；F.F.Wong；C.Y.Chern,European Journal of Organic Chemistry,2019,8,1754-1762)：利用氰基亞胺(Nitrilimines)為起始物，藉以甲醯胺(Formamide)和三氯氧磷(Phosphorus oxychloride)之Vilsmeier試劑，一步化合成三氮唑環類化合物(triazole)。

綜合上述，可知1,2,4-三氮唑環類衍生物確有良好之抗發炎活性，可應用於製備治療各種炎症及其相關疾病的藥物。本發明係以腈基亞胺為起始物，經胺化和雜環化兩個反應步驟，以綠色化學方法合成出多取代的1,2,4-三氮唑化合物並應用於炎症及其相關疾病的藥物。

本發明提供治療發炎反應之方法，其包含投與治療上有效量之式(I)化合物，其立體化學異構物或其醫藥上可接受鹽類至有需求之個體：

其中，R¹為獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基。R²獨立地為氫、烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵素(氟、氯、溴或碘)、鹵烷基(-C_pH_qX_r，p=1~6，q+r=2p+1，p、q、r為正整數，X為氟、氯、溴或碘)、胺基、芳基、雜芳基、雜環基和脂肪環。R³獨立地為氫、烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵烷基(-C_pH_qX_r，p=1~6，q+r=2p+1，p、q、r為正整數，X為氟、氯、溴或碘)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基、酯類及醯胺。

本發明另提供一種具有抗發炎活性1,2,4-三氮唑衍生物之新穎製備方法，係以腈基亞胺為起始物，經胺化和雜環化兩個反應步驟之綠色化學方法，合成出多取代基與具有顯著的抗發炎活性1,2,4-三氮唑化合物，以應用於治療各種炎症及其相關疾病的藥物。

下列描述僅在說明本發明之各具體實施例。因此，本文所論及之特定具體實施例或改良不可解釋為侷限本發明之範疇。熟習本領域之技術人員可顯見的是，所進行的各種變更或等同物並未背離本發明之範疇。

為了使本發明更明確且易於理解，必須先定義特定術語。額外的定義係列於實施方式全文中。除非另有定義，本文所使用的技術性及科學性術語具有本發明領域之技術人員所能常規理解的意義。

本文所使用的冠詞「一」與「一者」是指一或大於一者(亦即，至少一者)的該冠詞語法對象。舉例而言，「一元件」是指一元件或大於一者之元件。

1.材料及方法

1.1 材料

本發明之所用化學品均為市售試藥級，分別購自Mallinckrodt Chemical Co.、Alfa Chemical Co、Fluka、Aldrich Chemical Co.、Merck Chemical Co.、Riedel-deHaënChemicalCo.、Tedia Chemical Co.、Showa Chemical Co.及Lancaster Chemical Co.。LPS(源自於大腸桿菌的內毒素，0127：B8)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽及吲哚美辛(Indomethacin)皆購自Sigma Chemical Co.。

1.2 細胞培養

將鼠巨噬細胞株Raw 264.7於含有10% FBS、100U/mL青黴素和100mg/mL鏈黴素的DMEM培養基中，於37℃，5% CO₂條件下進行培養。

1.3 一氧化氮生成抑制試驗

亞硝酸鹽之水平會反應細胞內NO合成酶之活性。收集細胞上清液與相同體積的Griess試劑(1%磺胺，0.1%萘乙二胺二鹽酸鹽和5%磷酸)混合。使用亞硝酸鈉獲得標準曲線，並且通過ELISA在540nm處測量每個樣品。

2.下面所列的例子為簡易便捷的製程合成1,2,4-三氮唑衍生物有關實例，用以更詳細地解釋本發明；但本發明不為這些實例所限。

3.實施案例一至七

本發明之實施實例一至三在尋求第一步胺化反應所需之氨水(NH₄OH)最適化當量數。其反應步驟如第(四)反應圖所示，以Methyl 2-chloro-2-phenylhydrazono acetate(2-氯-2-(苯基)肼基乙酸甲酯，1a)為起始物，並與1、3和5當量之氨水水溶液在冰浴條件下，靜置24小時以進行胺化反應。接著以薄層層析法監測反應進行，當反應終止後，經二氯甲烷萃取，收集有機層，再經飽和食鹽水洗滌，再經過濾和濃縮，最後進行層析純化得到產率73%、86%及92%的N-phenylacetohydrazonamide(苯基乙醯基肼醯胺化合物，2a)產物，如表3所示。

實施實例三至七為找尋最適化的溶劑系統，其反應步驟如第(一)反應圖所示，以Methyl 2-chloro-2-phenylhydrazono acetate(2-氯-2-(苯基)肼基乙酸甲酯，1a)為起始物，使用不同溶劑系統，如水、水/丙酮、水/甲醇、水/乙腈與水/四氫呋喃，在冰浴條件下，靜置24小時和5當量之氨水(NH₄OH)進行胺化反應。接著以薄層層析法監測反應進行，當反應終止後，經二氯甲烷萃取，收集有機層，再經飽和食鹽水洗滌，再經過濾和濃縮，最後進行層析純化得到產率81-92%的N-phenylacetohydrazonamide(N-苯基乙醯基肼醯胺化合物，2a)產物，如表3所示。

經由本發明之實施案例一至七，以Methyl 2-chloro-2-phenylhydrazono acetate(2-氯-2-(苯基)肼基乙酸甲酯，1a)分別與不同當量數之氨水(NH₄OH)和五種不同溶劑系統進行第一步胺化反應，依發明成果表3所示，以5當量之氨水(Nh₄OH)為最佳胺化反應試劑，以水為溶劑系統之條件下，可得到最佳產率之N-phenylaceto-hydrazonamide(N-苯基乙醯基肼醯胺化合物，2a)。

4.實施案例八至十二

本發明之實施實例八至十二，在尋求第二步雜環化反應所需之最適化之環合試劑及反應條件，如第(三)反應圖。以2-氯-2-(苯基)肼基乙酸甲酯(1a)為起始物，經第一步胺化反應後，得到苯基乙醯基肼醯胺之中間產物(2a)，接著分別探討添加1至3當量之氯乙醯氯和2至5當量之三乙胺等條件，在迴流溫度下，反應五小時，以找尋最適之環合條件來合成出1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物。

依發明成果表4所示，以2當量之氯乙醯氯和3當量之三乙胺為最佳環合試劑，可得到最佳產率之產物3a。

5.由本發明之實施案例一至十二結果顯示，1,2,4-三氮唑化合物之新穎製備方法，係結合胺化和雜環化兩個反應步驟之合成方法，合成出一系列多取代基且具有顯著的抗發炎活性的1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物，其反應步驟如第(三)反應圖所示。

本發明之實施案例十二至二十八，係Nitrilimines(腈基亞胺，1a-p)與5當量之氨水進行胺化反應，經薄層層析法監測反應已完全，經過萃取、乾燥、過濾及濃縮等操作程序，再與氯乙醯氯(2-chloroacetyl chloride)、溴乙醯氯(2-bromoacetyl chloride)和三乙胺(NEt₃)進行雜環化反應，可得到產率53%-83%之不同R¹取代之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物(3a-p和4)，如研究成果表5所示。

6.實施實例二十九至三十六

本發明之實施案例二十九至三十六，係Nitrilimines(腈基亞胺，1o)與氨水進行胺化反應，經薄層層析法監測反應已完全，經過萃取、乾燥、過濾及濃縮等操作程序，再與醯氯試劑包含苯甲醯氯、4-氯苯甲醯氯、苯乙醯氯、環丙烷甲醯氯、環丁烷甲醯氯、環己烷甲醯氯、2-噻吩甲醯氯、2-喹啉甲醯氯和三乙胺(NEt₃)進行雜環化反應，可得到產率45%-72%之不同R²取代之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物(5a-h)，其反應步驟如第(六)反應圖所示，研究成果如表7所示。

7.實施實例三十七與三十八

本發明之實施案例三十七與三十八，為探討式(I)中不同R³取代係由1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物(5b)與硼氫化鈉在四氫呋喃及甲醇為溶劑下進行還原反應，可得到產率89%之1,2,4-三氮唑-3-醇類雜環化合物(6)，再與三溴化磷和三乙胺，在二氯甲烷溶劑下進行溴化反應，可得到產率72%之1,2,4-三氮唑溴化雜環化合物(7)，其反應步驟如第(七)反應圖，研究成果如表8所示。

8.抗發炎活性測試

為了證實本發明之1,2,4-三氮唑雜環化合物對RAW 264.7細胞僅具有抗發炎作用，並無細胞毒殺作用，其以本領域的技術人員所熟知的MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)呈色試驗法進行，在此不再詳述，在1.25μg/mL濃度下，細胞存活率皆維持在87%以上。請參閱表9和圖八，給藥一系列之1,2,4-三氮唑雜環化合物，經給藥處理24h後，評估一系列之1,2,4-三氮唑雜環化合物對於鼠科巨噬細胞株Raw 264.7之抗發炎效果。如表9所示，化合物3-7可顯著減少LPS誘導之鼠巨噬細胞的NO產生，具有良好抗發炎效果。

圖八、1,2,4-三氮唑化合物在LPS誘導的細胞下之一氧化氮生成抑制率。

圖九、1,2,4-三氮唑化合物給藥後之細胞存活率

式(I)‧‧‧合成1,2,4-triazole之相關產物結構

式(II)‧‧‧合成1,2,4-triazole之相關起始物結構

式(III)‧‧‧合成1,2,4-triazole之相關中間產物結構

第(一)圖為傳統合成1,2,4-triazole的方法。

第(二)圖為實驗室先前合成1,2,4-triazole的方法。

第(三)圖為以綠色化學方法經胺化和雜環化合成多取代的1,2,4-三氮唑化合物。

第(四)圖為起始物nitrilimine 1a藉由氨水胺化成中間產物2a。

第(五)圖以綠色化學方法經胺化和雜環化合成多取代的1,2,4-三氮唑化合物3a-p和4。

第(六)圖以綠色化學方法經胺化和雜環化合成多取代的1,2,4-三氮唑化合物5a-h。

第(七)圖起始物5b還原得到醇類化合物6，溴化後得到溴化化合物7。

第(八)圖1,2,4-三氮唑化合物在LPS誘導的細胞下之一氧化氮生成抑制率。

第(九)圖1,2,4-三氮唑化合物給藥後之細胞存活率

第(五)圖以綠色化學方法經胺化和雜環化合成多取代的1,2,4-三氮唑化合物3a-p和4。

第(六)圖以綠色化學方法經胺化和雜環化合成多取代的1,2,4-三氮唑化合物5a-h。

Claims (6)

1. 一種具抗發炎之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物，如式(I)。

   

   其中，R¹獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基。R²獨立地為氫、烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵素(氟、氯、溴或碘)、鹵烷基(-C_pH_qX_r，p=1~6，q+r=2p+1，p、q、r為正整數，X為氟、氯、溴或碘)、胺基、芳基、雜芳基、雜環基和脂肪環。R³獨立地為氫、烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵烷基(-C_pH_qX_r，p=1~6，q+r=2p+1，p、q、r為正整數，X為氟、氯、溴或碘)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基、酯類及醯胺。
2. 一種具抗發炎之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物之前驅物nitrilimine，如式(II)。

   

   其中，R¹為獨立地為鹵素。R²獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵素(氟、氯、溴或碘)、烷氧基(-OC_nH_2n+1，n=1~6)、四級胺。R³獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基。
3. 一種具抗發炎之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物之中間產物nitrilimine，如式(III)。

   

   其中，R¹、R²分別獨立地為氫、烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)。R³獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、鹵素(氟、氯、溴或碘)、烷氧基(-OC_nH_2n+1，n=1~6)。R⁴獨立地為烷基(-C_nH_2n+1，n=1~6)、環烷基、芳基、雜芳基、雜環基。
4. 一種用於抗發炎之藥物組合物之製備方法，包括胺化和雜環化兩步驟：其中胺化反應為在水為溶劑系統，使用Nitrilimines(腈基亞胺)為起始物與氨水進行胺化反應，形成一系列N-苯基乙醯基肼醯胺化合物。
5. 申請專利範圍第1項所述之雜環化反應，以一系列N-苯基乙醯基肼醯胺化合物為起始物，與一系列醯胺試劑和三乙胺進行雜環化反應，以形成一系列之1,2,4-三氮唑-3-羧酸甲酯類雜環化合物，如專利範圍第一項所述。
6. 一種具抗發炎之組合物，其包含如申請專利範圍第1項所述之產物及鹽類及稀釋劑、賦型劑或載體。

Images