CN102123986B

CN102123986B - 药物组合物

Info

Publication number: CN102123986B
Application number: CN2009801319261A
Authority: CN
Inventors: 梅泽一夫; 石川裕一; 西山繁; 橘行幸; 兼田亚弓
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: JPWO2009157515A1; US20110213001A1; WO2009157515A1; EP2308842A4; CN102123986A; JP5504158B2; EP2308842B1; EP2308842A1; US8524747B2

Abstract

本发明的目的在于提供一种不抑制NF-κB而抑制iNOS和COX-2的表达的药物组合物。该不抑制NF-κB而抑制iNOS和COX-2的表达的药物组合物含有式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺作为有效成分，结果可以抑制一氧化氮NO的产生和前列腺素的产生。

Description

药物组合物

技术领域

本发明涉及一种药物组合物。

背景技术

一氧化氮(NO)一方面是与各种生命体维持系统相关的必需的内源性物质，另一方面也可能成为炎症等的原因物质。NO合成酶(NOS)是以L-精氨酸为底物催化NO产生的酶，存在iNOS、eNOS、nNOS三种异形体。

诱导型NO合成酶iNOS与其他的异形体不同，通常不表现酶活性。然而，一旦细胞受到细胞活素或LPS等的刺激的时候，会诱导iNOS的产生，一过性地产生大量的NO。该NO是炎症介质，成为例如感染性休克(septic shock)、炎症引起的血管扩张或低血压症的原因等。

同样，作为被细胞活素或增殖因子等刺激而诱导的酶，已知环氧化酶2(COX-2)。该酶也通过产生前列腺素而发挥作为炎症反应的介质的作用。

这样，由于这两个诱导酶构成了炎症的主要反应路径，所以可以认为开发抑制iNOS和COX-2的化合物与新抗炎症药物的创制密切相关(MiniRev Med Chem vol.8，p.73-90，2008)。

一方面，已知iNOS和COX-2通过NF-κB转录因子被活化而在特别是巨噬细胞等中被诱导表达，所以，期待开发出通过抑制NF-κB而抑制iNOS和COX-2的表达的抗炎症剂。

并且，iNOS在以大肠癌和乳癌为首的各种癌症中显示出高表达，而且，由于该DTCM戊二酰亚胺可以抑制细胞的肿瘤性转化以及肿瘤转移，所以可以作为抗肿瘤剂使用。由于在肿瘤细胞中抑制COX-2可以抑制肿瘤细胞的增殖，所以iNOS或COX-2抑制剂也有望成为抗肿瘤剂。

然而，通过抑制NF-κB来抑制iNOS和COX-2的表达的药剂产生由抑制NF-κB引起的副作用的危险性。

发明内容

发明所要解决的技术问题

因此，本发明的目的在于提供一种不抑制NF-κB而抑制iNOS和COX-2的表达的药物组合物。

解决技术问题的手段

本发明的化合物如下式(I)所示，

其中，n是1～24中的任一整数。

并且，本发明的一氧化氮(NO)产生抑制剂、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)表达抑制剂、前列腺素产生抑制剂、破骨细胞分化抑制剂、COX-2表达抑制剂以及被iNOS或COX-2介入的疾病的治疗剂含有上述化合物(I)作为有效成分。上述疾病可以是免疫疾病、神经退行性疾病(神経変性疾患)、炎性疾病或肿瘤。

并且，本发明的被iNOS或COX-2介入的疾病的治疗方法包括向患有该疾病的患者投用含有上述化合物(I)作为有效成分的药物组合物。上述疾病可以是免疫疾病、神经退行性疾病、炎性疾病或肿瘤。例如可以是风湿症、骨关节炎(変形性関節症)、胶原病、巴塞多氏病、帕金森病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、感染症、关节炎、发热、腰痛症、痛经、牙周病、骨质疏松症、骨癌。

相关申请的交叉参照

本申请要求于平成20年6月25日提交的日本专利申请第2008-166290号的优先权，其全部内容结合于此作为参照。

附图说明

图1是示出在本发明一实施例中对RAW264.7细胞投用DTCM戊二酰亚胺-C12时的细胞生存率相对于各DTCM戊二酰亚胺浓度的图；

图2是示出在本发明一实施例中对RAW264.7细胞投用DTCM戊二酰亚胺-C12时的细胞增殖率相对于各DTCM戊二酰亚胺浓度的图；

图3是示出在本发明一实施例中对RAW264.7细胞投用DTCM戊二酰亚胺-C12时的DNA、RNA、蛋白质的合成抑制相对于各DTCM戊二酰亚胺浓度的图；

图4是示出在本发明一实施例中由巨噬细胞活化引起的NO的产生被DTCM戊二酰亚胺-C12抑制的图；

图5是示出在本发明一实施例中由巨噬细胞活化引起的NO的产生被DTCM戊二酰亚胺-C6抑制的图；

图6是示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12对由巨噬细胞活化引起的NO产生的抑制效果不是由DTCM戊二酰亚胺-C12的NO捕获活性引起的图；

图7是示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12抑制巨噬细胞活化中iNOS表达的图；

图8是示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12抑制巨噬细胞活化中COX-2基因表达的图；

图9是示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12不影响巨噬细胞活化中IL-6产生的图；

图10是以NF-κB的分解以及再诱导为指标示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12不影响巨噬细胞活化中的NF-κB活化的图；

图11是以NF-κB的DNA结合能为指标示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12不影响巨噬细胞活化中的NF-κB活化的图；

图12是示出在本发明的一实施例中DTCM戊二酰亚胺-C12不影响由巨噬细胞活化引起的MAPK活化的图；

图13是示出在本发明的一实施例中3.0μg/mL以下浓度的DTCM戊二酰亚胺-C12对源自小鼠骨髓的巨噬细胞不具有毒性；

图14是示出在本发明的一实施例中RANKL处理以及DTCM戊二酰亚胺-C12处理对从源自小鼠骨髓的巨噬细胞向破骨细胞的分化诱导的影响的显微镜照片；

图15是示出在本发明的一实施例中对源自小鼠骨髓的巨噬细胞进行RANKL处理以及DTCM戊二酰亚胺-C12处理时的分化的破骨细胞数的图；

图16是示出在本发明的一实施例中对F9细胞进行DTCM戊二酰亚胺-C12处理时的存活细胞率的图；以及

图17是示出在本发明的一实施例中对F9细胞进行DTCM戊二酰亚胺-C12处理时的细胞增殖的图。

具体实施方式

下面，在本发明的实施方式中列举实施例进行具体而详细的说明，但是本发明并不限制于此。

在实施方式及实施例中没有特别说明的情况下，使用J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual(3rdedition)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & SonsLtd.等标准治疗或实验方案集中记载的方法或其更改、改变后的方法。并且，在使用市售的试剂盒或测定装置的情况下，如果没有特别说明，使用其所附的治疗或实验方案。

本领域技术人员根据本说明书的记载可明确本发明的目的、特征、优点以及思想，本领域技术人员根据本说明书的记载能够容易再现本发明。以下记载的发明的实施方式以及具体的实施例等示出了本发明的优选实施方式，用于示例或说明，本发明并不限制于此。显然，对于本领域技术人员来说，在本说明书公开的本发明的意图以及范围内，可以根据本说明书的记载进行各种更改。

DTCM戊二酰亚胺(DTCM-glutarimide)

本发明的化合物是式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺。

其中，n没有特别的限定，优选是1～24中的任一整数，更加优选是1～18中的任一整数，进一步优选是1～12或6～18，最优选是6～12。

该DTCM戊二酰亚胺例如可如下述那样合成。

首先，将化合物(II)溶解在醋酸中，加入浓硫酸，加热回流。向反应混合物中加入水，进一步加热回流。用乙酸乙酯提取反应混合物，用饱和食盐水洗涤获得的有机层，用无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶剂，得到油状物质。将该油状物质溶解在二甲基甲酰胺中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、4-二甲基氨基吡啶、1-烷烃硫醇，在室温下搅拌。向获得的反应液中加入水，用氯仿提取，用饱和食盐水洗涤获得的有机层，用无水硫酸钠干燥。过滤后，用硅胶柱色谱法精制减压馏去溶剂后获得的残渣，得到无色固体化合物(I)。此处，通过选择1-烷烃硫醇的烷烃链的碳数，可以调整化合物(1)的n数。

iNOS表达抑制剂、COX-2表达抑制剂

本发明的iNOS表达抑制剂含有上述式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺作为有效成分，抑制iNOS的表达而不抑制NF-κB，从而可以抑制iNOS产生，结果抑制一氧化氮(NO)的产生。

并且，本发明的COX-2抑制剂含有上述式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺作为有效成分，抑制COX-2的表达而不抑制NF-κB，从而可以抑制COX-2产生，结果能够抑制前列腺素的产生、抑制破骨细胞的分化。

被iNOS或COX-2介入的疾病的治疗剂

iNOS产生的抑制以及COX-2产生的抑制分别与涉及iNOS或COX-2的疾病的治疗密切相关。因此，可以抑制iNOS表达或COX-2表达的式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺作为与iNOS或COX-2有关的疾病的治疗剂是有用的。

此处，所谓的被iNOS或COX-2介入的疾病是例如风湿性关节炎等风湿症；以骨关节炎、胶原病和巴塞多氏病(basedow病)等自身免疫疾病为首的免疫性疾病；帕金森病、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病；感染症、关节炎、发热、腰痛症和痛经等各种炎性疾病；乳癌、前列腺癌、结肠癌、大肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、偏平上皮癌、脑肿瘤、骨癌和多发性骨髓瘤等肿瘤等。并且，通过抑制前列腺素的产生，可以抑制血管新生，抑制炎症，通过抑制破骨细胞的分化，可以治疗牙周病、骨质疏松症和骨癌等，以及抑制骨髓瘤的发展。因此，式(I)所示的DTCM戊二酰亚胺作为抗免疫性疾病剂、抗神经退行性疾病剂、抗血管生成剂(antiangiogenic agent)、非甾体抗炎剂、解热镇痛剂以及抗肿瘤剂等是特别有用的。

药剂的制造方法以及给药方法

这些药剂除了DTCM戊二酰亚胺之外，还可以含有药学上容许的通常的载体、粘结剂(······)、稳定化剂、赋形剂、稀释剂、pH缓冲剂、崩解剂、增溶剂、助溶剂和等渗剂等各种制剂调配用混合成分。并且，在给患者投用这些药剂的时候，可以以权衡患者的性别、体重、症状的适当给药量及口服给药或非口服给药等适当的给药方法给药即可。

实施例

(1)DTCM戊二酰亚胺(DTCM-glutarimide)的合成

首先，如下所述地合成上述式(III)表示的DTCM戊二酰亚胺C-6。

将上述化合物(II)1g溶解在醋酸10mL中，加入浓硫酸1mL，加热回流两小时。向反应混合物中加入水5mL，进一步加热回流两小时。用乙酸乙酯提取反应混合物，用饱和食盐水洗涤获得的有机层，用无水硫酸钠干燥后，在减压下除去溶剂，得到油状物质0.85g。将该油状物质溶解在二甲基甲酰胺20mL中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺1.1g、4-二甲基氨基吡啶7.1g、1-己烷硫醇1.4mL，在室温下搅拌四小时。向获得的反应液中加入水，用氯仿提取，用饱和食盐水洗涤获得的有机层，用无水硫酸钠干燥。过滤后，用硅胶柱色谱法精制减压馏去溶剂后获得的残渣，得到无色固体化合物(III)0.69g。

¹H-NMR(270MHz，CDCl3)δ0.89(3H，t，J＝7.0Hz)，1.30(6H，complex)，1.55(2H，dd，J＝7.6，14.9Hz)，2.36(2H，complex)，2.73(5H，complex)，2.90(2H，t，J＝7.3Hz)；¹³C-NMR(67.8MHz，CDCl₃)14.1，22.5，27.7，28.5，29.3，29.4，31.3，37.1，47.9，166.8，171.12，171.15.

同样地，使用1-十二硫醇代替1-己硫醇进行反应，合成上述式(IV)表示的DTCM戊二酰亚胺C-12。

¹H-NMR(270MHz，CDCl3)δ0.88(3H，t，J＝7.0Hz)，1.27(18H，complex)，1.55(2H，dd，J＝6.5，13.2Hz)，2.36(2H，complex)，2.71(5H，complex)，2.93(2H，t，J＝7.0Hz)；¹³C-NMR(67.8MHz，CDCl₃)14.2，22.7，27.7，28.9，29.1，29.3，29.4，29.5，29.6，29.7，32.0，37.2，47.8，166.8，171.0.

(2)DTCM戊二酰亚胺对细胞的毒性的评价I

在本实施例中，以细胞生存率以及细胞增殖率为指标评价了DTCM戊二酰亚胺对RAW264.7细胞的细胞毒性。

使用含有10％FBS的DMEM培养基将RAW264.7细胞以1×10⁴cells/ml的方式接种在塑料皿中，以0、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mL的各浓度向培养基中添加DTCM戊二酰亚胺-C12，培养24小时及48小时后，用血球计数板计数全部细胞数，用台盼蓝染色排除法(Trypan blue dye exclusion assay)计数活细胞数。图1绘制了细胞生存率(活细胞数/全部细胞数)相对于各DTCM戊二酰亚胺浓度的图，图2绘制了全部细胞数相对于各培养时间的图。

如图1所示，在3.0μg/mL为止的DTCM戊二酰亚胺浓度下，即使48小时后细胞生存率也几乎不降低，没有检测出细胞致死效果。并且，如图2所示，在1.0μg/mL为止的浓度下，即使在48小时后全细胞数也几乎不减少，不能检测出细胞增殖抑制。

(3)DTCM戊二酰亚胺对细胞的毒性的评价II

在本实施例中，以对DNA、RNA和蛋白质的合成抑制为指标评价了DTCM戊二酰亚胺对RAW264.7细胞的细胞毒性。

在与(2)同样的条件下使用添加了各浓度(0、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mL)的DTCM戊二酰亚胺-C12的培养基培养RAW264.7细胞6小时之后，添加³H标记的0.1％胸腺嘧啶脱氧核苷、0.1％尿苷和0.1％亮氨酸，继续培养一小时。用液体闪烁计数器测定TCA不溶性部分········的放射能。以从没有添加DTCM戊二酰亚胺-C12的对照(············)获得的结果为100，将在各DTCM戊二酰亚胺-C12浓度下获得的测量值作为相对值如图3所示地作图。

如图3所示，在10.0μg/mL为止的DTCM戊二酰亚胺浓度下，对DNA、RNA和蛋白质中的任一个都没有检测出有意义的合成抑制活性。

(4)DTCM戊二酰亚胺对由巨噬细胞活化引起的NO产生的抑制

在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺对由巨噬细胞活化引起的NO产生的抑制。

在与(2)同样的条件下使用添加了各浓度(0、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL)的DTCM戊二酰亚胺-C12的培养基培养RAW264.7细胞2小时之后，添加3.0μg/mL的LPS，继续培养20小时。之后，通Griess反应测定NO产生量，并相对于各DTCM戊二酰亚胺-C12浓度作图(图4的柱状图)。

如图4所示，RAW264.7细胞在受到LPS刺激20小时后过量地产生NO，DTCM戊二酰亚胺-C12浓度依赖性地显著地抑制该NO的产生。使用未被LPS刺激的细胞作为不产生NO的阴性对照(在以下的图中用C表示)，使用代替DTCM戊二酰亚胺-C12添加了10μg/mL的(-)-DHMEQ(在以下的图中用D表示)的培养基培养的细胞作为抑制NO产生的阳性对照。

并且，同时用MTT法测量了活细胞，考察了细胞增殖抑制(图4的折线图)，相对于各DTCM戊二酰亚胺-C12浓度全部细胞数无变化，DTCM戊二酰亚胺-C12的添加对细胞增殖没有影响。这样，DTCM戊二酰亚胺-C12对由巨噬细胞活化引起的NO产生的抑制效果不是由细胞增殖抑制引起的。

使用DTCM戊二酰亚胺-C6进行了同样的实验，得到了与利用DTCM戊二酰亚胺-C12获得的结果几乎同样的结果(图5)。

进一步地，由于一旦NO从培养上清中放出，则迅速地代谢为亚硝酸盐(NO₂ ^-)，所以通过Griess法测定培养上清中的亚硝酸盐，作为DTCM戊二酰亚胺-C12的NO捕获活性的指标。使用亚硝酸钠制作了检量线。

在1.5mL的微量离心管(eppendorf tube)内，将亚硝酸钠溶解在蒸馏水中，准备0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL的亚硝酸钠水溶液，制作了检量线。之后，向这些亚硝酸钠水溶液中直接添加3.0μg/mL的DTCM戊二酰亚胺-C12，静置10分钟后，向96孔板中逐个添加100μL。向其中添加Griess试剂100μL反应10分钟，用酶标仪(························)测定了波长570nm处的OD值。

如图6所示，DTCM戊二酰亚胺-C12不具有NO捕获活性。

这样，DTCM戊二酰亚胺对由巨噬细胞活化引起的NO产生的抑制效果不是由DTCM戊二酰亚胺的NO捕获活性引起的。

(5)DTCM戊二酰亚胺对由巨噬细胞活化引起的iNOS表达的抑制

在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺抑制由巨噬细胞活化引起的iNOS基因表达。

在与(4)同样的条件下活化RAW264.7细胞，回收细胞，用常法提取蛋白质，使用抗iNOS抗体(Santa Cruz Biotechnology)以及抗α-微管蛋白抗体(Sigma Aldrich Japan)，稀释率为1/3000，进行了蛋白印迹分析。使用未被LPS刺激的细胞作为不表达iNOS的阴性对照，使用代替DTCM戊二酰亚胺-C12添加了10μg/mL的(-)-DHMEQ的培养基培养的细胞作为抑制iNOS表达的阳性对照。

如图7所示，RAW264.7细胞由于被LPS刺激而表达iNOS，DTCM戊二酰亚胺-C12浓度依赖性地显著地抑制该iNOS的表达。

这样，DTCM戊二酰亚胺抑制巨噬细胞活化中的iNOS基因表达，其抑制强度与DTCM戊二酰亚胺的浓度相关。

(6)DTCM戊二酰亚胺对巨噬细胞活化中COX-2表达的抑制

在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺抑制在巨噬细胞活化中的COX-2基因表达。

在与(4)同样的条件下活化RAW264.7细胞，回收细胞，用常法提取蛋白质，使用抗COX-2抗体(BD Bioscience)以及抗α-微管蛋白抗体(Sigma Aldrich Japan)，稀释率为1/3000，进行了蛋白印迹分析。使用未被LPS刺激的细胞作为不表达COX-2的阴性对照，使用代替DTCM戊二酰亚胺-C12添加了10μg/mL的(-)-DHMEQ的培养基培养的细胞作为抑制COX-2表达的阳性对照。

如图8所示，RAW264.7细胞由于被LPS刺激而表达COX-2，DTCM戊二酰亚胺-C12浓度依赖性地显著地抑制该COX-2的表达。

这样，DTCM戊二酰亚胺抑制巨噬细胞活化中的COX-2基因表达，其抑制强度与DTCM戊二酰亚胺的浓度相关。

(7)DTCM戊二酰亚胺不影响由巨噬细胞活化引起的IL-6产生

受到炎症性刺激而活化的巨噬细胞产生IL-6和TNF-α等炎症性细胞活素，在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺不影响由巨噬细胞活化引起的IL-6产生。

在与(4)同样的条件下活化RAW264.7细胞，回收细胞，用常法提取蛋白质，使用预先固定了抗IL-6抗体的96孔的聚苯乙烯微孔板进行了ELISA分析。使用未被LPS刺激的细胞作为不产生IL-6的阴性对照，使用代替DTCM戊二酰亚胺-C12添加了10μg/mL的(-)-DHMEQ的培养基培养的细胞作为抑制IL-6产生的阳性对照。图9示出了相当于10⁶细胞的IL的检测浓度。

如图9所示，RAW264.7细胞由于被LPS刺激而表达IL-6，DTCM戊二酰亚胺-C12在3.0μg/mL以下的浓度下对IL-6的产生完全不影响。

这样，DTCM戊二酰亚胺在不产生细胞毒性的浓度下不抑制巨噬细胞活化中的IL-6的表达。

(8)DTCM戊二酰亚胺不影响巨噬细胞活化中的NF-κB的活化

与从细胞内向核内的信号传导相关的NF-κB已知是与在免疫炎症反应中被刺激诱导的多数基因的表达诱导有关的转录因子。在RAW264.7细胞中，活化巨噬细胞的LPS刺激通过TLR4来活化NF-κB。并且，NF-κB通常与抑制蛋白质IκB形成复合体，以非活化的状态存在于细胞质中，如果受到LPS等的刺激，则IκB-α被磷酸化之后，被泛素化，并被蛋白酶体分解。而且，由于在IκB-α的启动子区域存在NF-κB的结合位点，所以NF-κB的活化导致IκB-α被再诱导。这样，NF-κB对巨噬细胞活化后的调节发挥着重要的作用，在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺不影响巨噬细胞活化中的NF-κB活化。

首先，在与(2)同样的条件下，使用未添加和添加了3.0μg/mL的DTCM戊二酰亚胺-C12的培养基培养RAW264.7细胞2小时之后，添加3.0μg/mL的LPS，进一步培养了0、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟的各时间。回收各细胞，用常法提取蛋白质，抗IκB-α抗体(Santa CruzBiotechnology)以稀释率1/500使用，抗α-微管蛋白抗体(Sigma AldrichJapan)以稀释率为1/3000使用，进行了蛋白印迹分析。

如图10所示，在未用DTCM戊二酰亚胺-C12处理的情况下，在LPS刺激15分钟后IκB-α的分解发生，30分钟后引起再诱导。而且，即使用DTCM戊二酰亚胺-C12进行前处理，在不产生细胞毒性的浓度下，也不对IκB-α的分解以及再诱导产生影响。

接着，在与(2)同样的条件下使用添加了各浓度(0、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL)的DTCM戊二酰亚胺-C12的培养基培养RAW264.7细胞2小时之后，添加3.0μg/mL的LPS，培养30分钟。之后，用常法调整核提取物，使用用³²P标记的探针3μL进行了凝胶迁移分析。

如下述那样进行探针的调制。首先，混合1.75pmol/mL寡聚核苷(Promega公司)(5′-ATGTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′，序列号1)4μL、10×T4PNK缓冲液(Takara)4μL以及核苷酸自由水(nucleotide free water)10μL，在此，加入2μL的[γ-32P]-ATP(Amarsham公司)，在37℃孵育10分钟后，加入80μL的TE缓冲液(10mM Tris-HCl∶1mM EDTA＝1∶1)，使反应停止。之后，除去填充的TE缓冲液，用蒸馏水洗净，向Nick Column(Amersham公司)装入100μL的反应液后，装入400μL的蒸馏水，将从柱流出的溶出液回收到1.5mL的微量离心管中，将其作为标记的DNA探针。

使用未被LPS活化的细胞作为不活化NF-κB的阴性对照，使用代替DTCM戊二酰亚胺-C12添加了10μg/mL的(-)-DHMEQ的培养基培养的细胞作为抑制NF-κB的活性的阳性对照。并且，通过在DHMEQ条件下消失以及发生基于抗p65抗体(Santa Cruz Biotechnology)的超迁移，鉴定了由结合了NF-κB的探针引起的信号。

如图11所示，通过LPS刺激观察到了NF-κB的活化，但是DTCM戊二酰亚胺-C12前处理在3.0μg/mL以下的浓度下不抑制NF-κB的DNA结合能。

这样，DTCM戊二酰亚胺在不产生细胞毒性的浓度下不抑制巨噬细胞活化中的NF-κB的活化。

(9)DTCM戊二酰亚胺不影响由巨噬细胞活化引起的MAPK活化

已知在由巨噬细胞活化诱导的NO产生不仅与NF-κB有关，还与包含ERK1/2、JNK以及p38的MAPK的活化有关。并且，报道了包含ERK1/2、JNK以及p38的MAPK的活化在炎症性细胞活素基因的表达中也是必须的。然而，在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺不影响巨噬细胞活化中的p38、ERK以及JNK的磷酸化。

首先，对与(8)同样调整后的蛋白质提取物，抗磷酸化p38抗体(CellSignaling Technology公司)、抗p38抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)、抗磷酸化ERK抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗ERK抗体(SantaCruz Biotechnology公司)、抗磷酸化JNK抗体(Cell Signaling Technology公司)、抗JNK抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)分别以稀释率为1/500的方式使用，抗α-微管蛋白抗体(Sigma Aldrich Japan公司)以稀释率为1/300的方式使用，进行了蛋白印迹分析。

如图12所示，在未使用DTCM戊二酰亚胺-C12处理的情况下，p38在细胞被LPS刺激后的10分钟后活化，60分钟后活化衰减。即使在DTCM戊二酰亚胺-C12前处理的情况下，该p38的活化模式也没有变化。

并且，ERK也是同样地，在未使用DTCM戊二酰亚胺-C12处理的情况下，在细胞被LPS刺激后的10分钟后活化，60分钟后活化衰减。即使在DTCM戊二酰亚胺-C12前处理的情况下，该ERK的活化模式也没有变化。

这样，DTCM戊二酰亚胺在不产生细胞毒性的浓度下不影响巨噬细胞活化中的MAPK的活化。

(10)DTCM戊二酰亚胺对源自小鼠骨髓的巨噬细胞的毒性的评价

在本实施例中，通过细胞生存率评价了DTCM戊二酰亚胺对源自第一代小鼠骨髓巨噬细胞的细胞毒性。

将通过颈椎脱臼法屠杀的8周龄的ICR小鼠(雄，从·················购入)在灭菌环境下解剖，从双足分离大腿骨和尺骨。使用连接有21G注射针的1mL的注射器，用α-MEM洗涤骨髓腔2、3次。将该洗净液(α-MEM)通过尼龙网(330目)以除去不需要的细胞，分离骨髓细胞。将这样获得的骨髓细胞的α-MEM悬浊液调制成1.25～3.75×10⁶细胞/mL。对该骨髓细胞悬浊液80mL添加用含有0.1％BSA的PBS调制过的10μg/mL的hM-CSF(和光纯药工业株式会社)80μL(终浓度10ng/mL)。将该细胞以500μ～1mL/well方式逐个接种到24孔板(Corning公司)中，在37℃、5％CO₂条件下培养两天。两天后，用α-MEM洗去非贴壁细胞后，更换成含有10ng/mL的hM-CSF的新的α-MEM，将获得的贴壁细胞作为源自小鼠骨髓的巨噬细胞。

将调制的源自小鼠骨髓的巨噬细胞接种在24孔板(Corning公司)中，每孔1mL(1.25～3.75×10⁶细胞/mL)。在各孔中添加1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mL或30.0μg/mL的DTCM戊二酰亚胺-C12，各实验组在37℃、5％CO₂条件下培养。对照组不添加DTCM戊二酰亚胺-C12但在同样条件下培养。

台盼兰染色的细胞存活率测量(Tripan blue dye exclusion assay)

在各实验组中，在DTCM戊二酰亚胺-C12添加24小时、48小时或72小时后，用细胞刮剥离细胞并悬浊在α-MEM中，将1mL细胞悬浊液回收到新的微量离心管中。对照组也同样地，在培养开始24小时、48小时或72小时后，回收细胞悬浊液。将他们以3500rpm离心5分钟使细胞沉淀。对于实验组，除去上清。对于对照组，回收上清。之后，向各实验组以及对照组的细胞沉淀中加入从对照组回收的上清80μL以及20μL台盼兰染色液(4mg台盼兰溶解在1mL的9mg/mL NaCl中调制而成)，并再悬浊，死细胞被台盼兰染成蓝色。

将该细胞悬浊液10μL滴在血球计数板(Erma公司)上，在倍率100倍的显微镜下计数全部细胞和死细胞。这时，在一片血球计数板上计数每一个视野约100个左右的细胞，算出从四个视野分别获得的细胞存活率的平均。用下式算出细胞存活率(％)。

存活率(％)＝(全部细胞数-死细胞数)÷全部细胞数×100

如图13所示，在DTCM戊二酰亚胺-C12为3.0μL的组中，源自小鼠骨髓细胞的巨噬细胞的生存率是80％以上并与培养时间无关。另一方面，在DTCM戊二酰亚胺-C12的10.0μL或30.0μL的组中，源自小鼠骨髓细胞的巨噬细胞的生存率降低并与培养时间无关。

结果，显示了3.0μL为止的DTCM戊二酰亚胺-C12对源自小鼠骨髓细胞的巨噬细胞不具有毒性。因此，使用了源自小鼠骨髓的巨噬细胞的下述的实施例中的DTCM戊二酰亚胺-C12设定为3.0μg/mL以下。

(11)DTCM戊二酰亚胺对源自小鼠骨髓的巨噬细胞的破骨细胞分化的抑制

在本实施例中，示出了DTCM戊二酰亚胺抑制源自小鼠骨髓的巨噬细胞的破骨细胞分化。

将实施例(10)调制的源自第一代小鼠骨髓的巨噬细胞以每孔500μL(1.25～3.75×10⁶细胞/mL)的方式逐个接种到24孔板(Corning公司)中。此处，添加各5μL的DTCM戊二酰亚胺-C12使终浓度为0、0.3μg/mL、1.0μg/mL或3.0μg/mL。将各实验组在37℃、5％CO₂条件下培养2小时。添加5μL用含有0.1％BSA的PBS调制过的10μg/mL hRANKL(和光纯药株式会社)(终浓度100ng/mL)，继续培养。已知RANKL是从巨噬细胞等诱导破骨细胞分化的因子(Kobayashi et al.Crit Rev Eukaryot Gene Expr.19(1)，61-72，2009)。并且，对照组除了没有添加RANKL及DTCM戊二酰亚胺外，在同样的条件下进行了培养。

培养5日后，除去培养液，用PBS洗涤细胞。向孔中加入3.5％多聚甲醛(paraformaldehyde)250μL将细胞固定5分钟之后，用PBS洗涤固定液。而且，加入丙酮∶乙醇(1∶1v/v)250μL静置30秒，进行脱脂。用PBS洗净后，每孔加入抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色液(将0.01％萘酚AS-MX磷酸、0.05％固红紫LB盐(Fast Red Violet LB Salt)用TRAP缓冲液(50mM L-酒石酸钠、90mM醋酸钠三水合物)调制而成)500μL，在室温下孵育5分钟～20分钟，如果确认到染色，则去除染色液，使反应停止。加入250μL的PBS，在显微镜下观察板。由于已知破骨细胞为TRAP阳性的，所以在显微镜下，将融合了三个核以上的TRAP阳性细胞作为成熟的破骨细胞，在整个视野下计测其数量。

如图14及图15所示，在没有加入RANKL的组中观察不到破骨细胞(图14A)，在加入了RANKL的组中诱导了破骨细胞的分化(图14B)。并且，在添加了DTCM戊二酰亚胺-C12的情况下，破骨细胞数量有意义地减少(图14C～E、图15)。

该结果显示DTCM戊二酰亚胺抑制从巨噬细胞向破骨细胞的分化。因此，可将DTCM戊二酰亚胺用于由破骨细胞发生骨破坏的各种疾病的治疗。

(12)由DTCM戊二酰亚胺引起的癌细胞的存活率下降以及增殖抑制

在本实施例中，显示了DTCM戊二酰亚胺具有降低癌细胞的存活率以及抑制增殖的效果。

使用含有15％FBS的DMEM培养基以1×10⁴细胞/mL的方式将源自小鼠胚性肿瘤的F9细胞(从理化学研究所筑波研究所生物资源中心细胞材料开发室购入)接种在塑料皿中，以0、0.1μg/mL、0.3μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mL、30.0μg/mL的各浓度将DTCM戊二酰亚胺-C12添加到培养基中，培养24小时、48小时或72小时。按照实施例(10)记载的“基于台盼兰染色的细胞存活率测量”来测量细胞的存活率。并且，同样地，使用呼叫计数器(················，Beckman coulter公司)对调制的培养细胞悬浊液计数悬浊液中的细胞数，检测细胞增殖。

如图16所示，在任一培养时间的组中，F9细胞的细胞存活率以依赖于DTCM戊二酰亚胺-C12浓度的方式有意义地降低(t检验)。并且，DTCM戊二酰亚胺-C12浓度是10μg/mL或30μg/mL的情况下，与24小时或48小时培养组相比，72小时培养组的细胞存活率有意义地降低。

并且，如图17所示，在添加了DTCM戊二酰亚胺-C12的培养组中，与未添加DTCM戊二酰亚胺-C12的组相比，细胞增殖受到了抑制。确认了DTCM戊二酰亚胺-C12浓度越高并且DTCM戊二酰亚胺-C12添加后的培养时间越长，该细胞增殖抑制效果越高。

结果显示DTCM戊二酰亚胺具有降低肿瘤细胞存活率的效果以及增殖抑制的效果。因此，DTCM戊二酰亚胺可用于各种癌症的治疗。

产业上利用可能性

根据本发明，可以提供不抑制NF-κB而抑制iNOS和COX-2的表达的药物组合物。