KR20110027314A

KR20110027314A - ＴＮＦ-α 매개성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110027314A
Application number: KR1020090085346A
Authority: KR
Inventors: 박웅양; 성혜윤; 채민주
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2011-03-16
Also published as: KR101146010B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 매개성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 HuR 단백질이 TNF-α mRNA에 존재하는 ARE(AU-rich element)영역에 결합하는 것을 억제하여 mRNA 반감기를 감소시킴으로써 TNF-α의 분비를 효과적으로 억제하므로 TNF-α가 매개하는 질환의 치료 및 예방제로 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

상기 식에서,

R1는

이며,

R2는

이다.

TNF-α(tumor necrosis factor-α), HuR 단백질, ARE(AU-rich element)

Description

ＴＮＦ-α 매개성 질환의 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING TNF-α MEDIATED DISEASES}

본 발명은 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 TNF-α 매개성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Hu 단백질 (Hu family of RNA-binding proteins)은 mRNA의 3'-비번역부위(3'-UTR)에 존재하는 ARE(AU-rich element)에 결합하여 해당 mRNA의 안정성 조절, 핵 방출, 및 번역에 관계하는 단백질로서, 그 종류로는 HuR (HuA), HuB (Hel-N1), HuC 및 HuD 등이 있으며, 이들 단백질은 초파리의 ELVA (embryonic lethal abnormal vision) 단백질과 상동성을 갖고 있다. 신경조직에서만 발견되는 다른 ELVA 패밀리의 구성원 (HuB, HuC 및 HuD)과 달리 HuR은 여러 조직에서 발현된다.

HuR 단백질은 대부분 핵 내에 존재하나, 특정 사건에 의해 세포질로 이동한다. HuR에 의한 특이적 mRNA의 안정화는 세포 외부의 자극과 관련되어 있다. 예를 들어, 마크로파아지 세포에 LPS 투여 또는 만성적 에탄올 노출이 있으면, HuR은 이에 반응하여 TNF-α mRNA의 안정성을 유도한다. 또한, HuR은 UV 광에 의해 p21 mRNA 안정성을 조절하고, 저산소에 의해 VEGF (vascular endothelial growth factor) mRNA 안정성을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 유전물질에 악영향을 주는 스트레스에 대한 반응으로 HuR는 전사물질을 안정화하기 위해 p53 mRNA의 3’-UTR에 결합할 수 있다. UV 광(UVC)에 노출시 p53 단백질의 레벨의 증가가 일어나고, RKO 세포들에서의 HuR의 과발현의 결과 웨스턴 블랏 분석 방법를 이용하여 p53 레벨의 상승을 관찰할 수 있었으나 HuR 레벨이 감소한 세포는 p53의 레벨도 감소함을 보였다. 이외에도 HuR는 p53 mRNA에 결합하여 전사를 촉진하는 것이 밝혀져 있으며, HuR은 ARE를 포함하는 다양한 mRNA의 핵 방출의 어댑터 (adaptor) 단백질로서 작용할 수 있다고 알려져 있다(Brennan, C.M., and Steitz, J.A. (2001). HuR and mRNA stability. Cell Mol Life Sci 58, 266-277. ).

한편, TNF-α는 중요한 염증성 사이토카인으로 염증 반응을 개시한다. TNF-α mRNA는 일반적으로 3'-UTR에 ARE 서열을 포함하고 있다. 정상적인 조건하에서, ARE는 번역을 차단하거나 또는 전사체를 빠르게 교체(turnover)시킨다.

TIA-1(T-cell intracellular antigen-1)은 RNA 인식 모티프(RNA recognition motif, RRM) 패밀리 단백질의 하나로 TNF-α mRNA의 번역 억제제이다. 또한, 트리스테트라프롤린 (tristetraprolin, TTP)은 일반적으로 TNF-α mRNA의 불안정제 (destabilizer)로 알려져 있다. 반면에, Hu 단백질은 표적 mRNA의 반감기를 증가시 킨다고 알려져 있다 (Seko, Y., Cole, S., Kasprzak, W., Shapiro, B.A., and Ragheb, J.A. (2006). The role of cytokine mRNA stability in the pathogenesis of autoimmune disease. Autoimmun Rev 5, 299-305. ).

TNF-α는 다수의 제약 계획의 주요 표적이 되고 있다. 대표적으로, 에타너셉트 (Enbrel™), 인플리시맙 (Remicade™), 아달리무맙 (Humira™)이 TNF-α의 항체를 중화하는 기능을 한다. 그러나 Grattendick와 공동연구자들은 분비된 TNF-α의 레벨, 세포와 연합된 TNF-α의 레벨에 대한 세 가지 항-TNF-α 약품의 시험관 내(in vitro)에서의 영향을 연구한 결과, 그들은 TNF-α의 생체활성을 부분적으로 중화시키는 단백질에 기초한 항-TNF-α 약제들이 많은 부작용을 가진자는 것을 증명하였다. 따라서, TNF-α mRNA의 안정화를 조절하는 약제의 개발은 만성 염증성 질환의 치료에 있어 더 나은 치료적 전략을 제공할 것으로 기대된다.

또한, TNF-α, IL-1, IL-6의 생성을 억제하는 항-염증 활성물로서 SB-242235와 RWJ-67657 같은 화합물들이 알려져 있었으나, 염증성 매개체들의 전사 후 조절에서 이 억제제들의 작용 매카니즘은 아직 조사된 바 없다. 또한, 본 발명자들은 이전의 보고서에서 플라보노이드(flavonoid)가 안정화 요소인 HuC와 주요한 염증성 사이토카인(cytokine)인 TNF-α mRNA의 결합을 방해한다는 것을 증명하였다 (Kwak, H., Jeong, K.C., Chae, M.J., Kim, S.Y., and Park, W.Y. (2009). Flavonoids inhibit the AU-rich element binding of HuC. BMB Rep 42, 41-46. ).

본 발명자들은 ARE 포함 단백질의 mRNA와 HuR 단백질의 상호작용을 억제할 수 있는 화학적 억제제를 동정하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 ARE 포함 단백질 중 하나인 TNF-α mRNA와 HuR의 상호작용을 방해할 수 있는 화합물들을 스크리닝하고, ARE 포함 단백질의 mRNA와 HuR의 결합을 강하게 억제하는 화합물을 찾아냈다. 이러한 결과는 전사후 조절 (post-transcriptional regulation) 및 새로운 항-염증 약의 개발 연구에 있어서 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, TNF-α mRNA의 안정성에 작용하는 화합물 억제제의 사용은 만성적 염증 질환을 치료하기 위해 항-TNF-α 항체를 사용하는 현재의 치료 방법의 대안이 될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 목적은 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 TNF-α 매개성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,

일 양태로, 본 발명은 하기 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 TNF-α 매개성 질환 예방 및 치료용 조성물 조성물을 제공한다.

화학식 Ⅰ

여기서,

R1은

이고,

R2는

이다.

상기 화합물에는 전구 화합물도 포함되며, 본원에서의 용어, "전구 화합물"은 투여 후에, 몇몇 화학적 또는 생리학적 과정을 통해, 예를 들어 생리학적 pH에 도달하거나 효소작용을 통해 원하는 화합물 형태로 전환되는 활성 또는 비활성 화합물을 말한다. 전구 화합물의 제조 및 사용에 관련된 적합성 및 그 기술은 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 화합물들 역시 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 다양한 방법으로 제조될 수 있다.

본원에서의 용어, "약학적으로 허용가능한 염" 은 통상적인 방법으로 제조한 염을 의미하며, 당업자에게 공지되어 있다. "약학적으로 허용가능한 염" 은 다음 무기산과 유기산의 염기성 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다 : 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 말산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 말레산, 실리실산, 벤조산, 페닐아세트산, 만델산 등. "약학적으로 허용가능한 염"의 다른 예는 하기 내용 및 Berge 등의 J. Pharm. Sci. 66, 1(1977) 문헌을 참조하는 것으로 대신한다.

본원의 조성물은 HuR 단백질이 ARE(AU-rich element)를 포함하는 mRNA, 보다 구체적으로 TNF-α mRNA의 ARE에 결합하는 것을 억제하여 mRNA 반감기를 감소시킴으로써 TNF-α mRNA의 분해(degradation)를 유도하고 궁극적으로는 TNF-α mRNA가

코딩하는 단백질의 분비를 억제한다.

본원에서의 용어, "ARE(AU-rich element)"는 mRNA 내 A 및 U 염기가 많은 영역으로 mRNA 분해(degradation)의 타겟이 되는 부분이며 일반적으로 3' UTR에 존재한다. 인간 mRNA의 5-8%는 ARE를 포함할 것으로 추정되며, 특히 사이토카인 및 전사인자의 mRNAs에 ARE가 포함되어 있다. ARE의 특징 중 하나는 U가 많은 서열 내 AUUUA 중심 서열(예를 들어, WWWU(AUUUA)UUUW , W 는 A 또는 U)을 가진다는 것이다. 기능 발휘를 위해 중심 AUUUA element의 반복이 필요하다. 많은 단백질들이 ARE에 결합하여 mRNA를 안정화시키거나 불안정화시킨다.

진핵세포에서, mRNA는 스플라이싱 (splicing), 핵 방출 (nuclear export), 안정화 (stabilization) 및 위치결정 (localization)을 포함한 여러 유형의 전사후 조절 (post-transcriptional regulation)을 거치게 되고, mRNA의 반감기는 다양한 자극에 대한 반응인 mRNA의 안정성에 의해 결정된다. mRNA의 안정성은 생체의 항상성, 분화, 발달, 및 분화된 세포의 성장에 중요한 역할을 한다. mRNA 반감기 (half-life)는 대략 15분부터 24시간 이상까지로 mRNA의 안정성은 다양하다. 특히, TNF-α, IL-2, IL-6, 및 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인의 합성은 이들 mRNA 안 정성 수준에 따라 조절된다. mRNA의 cis-element (예를 들어, ARE) 및 trans-acting RNA-결합 단백질 (예를 들어, Hu 단백질)이 mRNA 반감기를 조절한다. steady state에서, 사이토카인 mRNA는 전형적인 AUUUA 펜타머 모티프 (pentamer motif)의 다양한 카피를 포함하는 3'-비번역부위 (3'-untranslated region, 3'-UTR) 내 ARE의 존재로 인해 불안정하다.

HuR 단백질은 ARE에 강한 친화성을 가지는 두 개의 N-터미날의 RRM 및 폴리 (A) 테일을 인식하는 C-터미날 RRM으로 구성되어 있다. HuR 단백질은 ARE를 포함하는 mRNA(예를 들어, TNF-α)에 결합하여 복합체를 형성함으로써 이들 mRNA를 안정시키고 궁극적으로 이들의 발현을 증가시킨다.

본원의 화합물은 바람직하게는 2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴 (2-amino-4-(4-(benzyloxy)phenyl)-6-(2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxoethylthio)pyridine-3,5-dicarbonitrile(이하, b-40)) 또는 2-(6-아미노-3,5-디시아노-4-(4-메톡시페닐)피리딘--2-일티오)-N-(4-클로로페닐)아세트아마이드(2-(6-amino-3,5-dicyano-4-(4-methoxyphenyl)pyridin-2-ylthio)-N-(4-chlorophenyl)acetamide(이하, b-41)) 이다.

보다 구체적으로 b-40 및 b-41의 화학식은 하기와 같다.

b-40은

이고,

b-41은

이다.

2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴(이하, b-40) 및 2-(6-아미노-3,5-디시아노-4-(4-메톡시페닐)피리딘--2-일티오)-N-(4-클로로페닐)아세트아마이드(이하, b-41)은 HuR 단백질이 TNF-α mRNA의 ARE 영역에 결합하는 것을 저해함으로써 TNF-α mRNA의 안정화를 저해하므로, 궁극적으로는 TNF-α 매개성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실험예에 따르면, b-40 및 b-41의 HuR:ARE 복합체 안정성에 대한 IC₅₀(The half-maximal inhibitory concentration)를 측정한 결과 b-40은 0.38 μM, b-41은 6.21 μM을 나타냈는바, 낮은 농도로도 HuR:ARE 복합체 형성을 효과적으로 저해함을 알 수 있었다(표 1).

또한, 가장 바람직하게는 상기 화합물은 2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴(b-40)이다.

본 발명의 구체적인 실험예에 따르면, b-40을 LPS 처리한 RAW264.7 세포(LPS-treated RAW264.7 cell)에 첨가한 결과, 첨가하지 않은 경우와 비교하여 IL-6 mRNA의 분해(degradation) 속도가 증가하였다(도 3b). 즉, b-40은 HuR:ARE(IL-6) 복합체 형성을 억제하여 IL-6 mRNA의 안정도를 감소시킨 것이다. 또한, 0.25 μM의 b-40를 처리한 경우, 복합체 HuR:ARE(TNF-α) 및 HuR:ARE(cFos)의 형성을 효과적으로 억제하였다(도 4).

또한, TNF-α의 분비를 억제하기 위해 바람직한 화합물 억제제의 농도는 상기 2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴(b-40)의 경우 바람직하게는 4μM 이하이고, 더욱 바람직하게는 1-4μM이다.

본 발명의 구체적인 실험예에 따르면, b-40을 처리한 후 RAW264.7 세포의 배양액(medium) 내에 분비된 TNF-α 단백질의 수준을 측정한 결과 b-40는 4 μM이하로 처리할 때 TNF-α의 합성을 효과적으로 억제하였다(도 3d).

본원에서 용어, "TNF-α"는 인간을 포함하는 동물의 대식 세포가 세균의 독 성물질인 내독소를 포함하는 다양한 면역 자극체에 반응하여 생산하는 사이토카인으로, 면역 체계에 중요한 역할을 담당하고 있는 물질이다. 동물 또는 인간에게 TNF-α를 투여하는 경우, 급성 감염 및 쇼크 상태에서와 유사한 염증, 열, 심혈관 작용, 출혈, 응집 및 급성 상반응 등이 일어나게 되는데, 체내에서 TNF-α의 생산이 지나치거나 조절되지 않으면 여러 질병이 유발되는 것으로 알려져 있다.

"TNF-α 매개성 질환" 은 TNF-α가 질환의 징후를 유도하는 1차적 매개인자인, 국소적 및/또는 전신적 생리학적 장애를 의미한다. 보다 구체적으로 TNF-α 매개성 질환의 예를 들면 하기와 같다.

A. 패혈증

TNF-α는 저혈압증, 심근 억압, 혈관 누출 증후군, 기관 괴사, 독성 2차 매개인자 방출의 자극 및 응고 연쇄증폭반응의 활성화를 포함한 생물학적 효과를 갖는 점에서, 패혈증의 병리생리학에 있어서 정립된 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패혈성 쇼크, 내독소 쇼크, 그램 네가티브 패혈증 및 독소 쇼크 증후군을 포함한 임의의 임상적 환경에서 패혈증을 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 패혈증을 치료하기 위하여, 본 발명의 조성물은, 패혈증을 더욱 완화시킬 수 있는 하나 이상의 추가적 치료제, (예를 들면 인터루킨-1 억제제), 사이토킨 인터루킨-6 또는 혈소판 활성화 인자의 길항제와 함께 공동투여될 수 있다.

B. 자가면역 질환

TNF-α는 각종 자가면역 질환의 병리생리학에 있어서 일정한 역할을 수행하는데 관련된다. 예를 들면, 류마티스 관절염에 있어서 조직 염증을 활성화하고 관절 파괴를 야기하는데 관련된다. TNF-α는 또한 당뇨병에 있어서 소도 세포의 사멸을 촉진하고 인슐린 내성을 매개하는데 관련된다. TNF-α는 또한 다발성 경화증에 있어서 세포독성을 희소돌기아교세포로 매개하고 염증성 플라크 유도와 관련이 있다.

본 발명의 조성물은 자가면역 질환, 특히 염증이 수반되는 자가면역 질환, 예를 들면 류마티스 관절염, 류마티스양 척추염, 골관절염 및 통풍 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 자가면역성 포도막염 및 신 증후군을 치료하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 당해 조성물은 전신 투여 되나, 특정 질환에 대하여는 염증 부위에 당해 조성물을 국소 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 류마티스 관절염의 경우 관절에 국소 투여하거나 당뇨성 궤양의 경우 단독으로 또는 사이클로헥산-일리덴 유도체와 함께 국부 적용한다.

C. 감염성 질환

TNF-α는 각종 감염성 질환에서 관찰된 생물학적 효과의 매개와 관련이 있다. 예를 들면, TNF-α는 말라리아에 있어서 뇌 염증, 모세혈관 혈전증 및 경색증을 일으킨다. TNF-α는 또한 수막염에 있어서 뇌 염증을 매개하고, 혈뇌 장벽의 붕괴를 유도하고, 패혈성 쇼크를 촉발하고, 정맥 경색을 활성화한다. TNF-α는 또한 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)에 있어서 악액질을 유도하고, 바이러스 증식을 자극하고, 중추신경계 손상을 매개한다.

따라서, 본 발명의 조성물은 감염성 질환, 예를 들면 세균성 수막염, 뇌 말라리아, AIDS 및 AIDS-관련 증후군(ARC), 및 이식에 부수적인 사이토메갈로바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 감염성 질환과 관련된 증상, 예를 들면 감염(예: 인플루엔자)으로 인한 열 및 근육통 및 감염에 부수적(예: AIDS 또는 ARC에 부수적)인 악액질을 완화하는데 사용될 수 있다.

D. 이식 거부

TNF-α는 동종이식 거부증 및 이식-대-숙주 질환(GVHD)의 주요 매개인자로서, T 세포 수용체 CD3 복합체에 대해 유도되는 랫트 항체 OKT3을 사용하여 신장 이식체의 거부를 억제하는 경우에 관찰되는 부작용을 매개하는데 관련된다.

따라서, 본 발명의 조성물은 이식 거부증, 예를 들면 동종이식 및 이종이식의 거부증을 억제하고, GVHD를 억제하는데 사용될 수 있다. 비록 당해 조성물이 단독으로 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 이는 동종이식에 대한 면역 반응을 억제하거나 GVDH를 억제하는 하나 이상의 제제와 함께 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 OKT3-유도된 반응을 억제하기 위하여 OKT3과 함께 사용될 수 있다. 또한, 면역 반응을 조절하는데 관련된 다른 표적, 예를 들면 세포 표면 분자 CD25(인터루킨-2 수용체-α), CD11a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1) 및/또는 CD86 (B7-2)에 지시된 하나 이상의 항체와 함께 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 면역억제제, 예를 들면 사이클로스포린 A 또는 FK506과 함께 사용될 수도 있다.

E. 악성종양

TNF-α는 악성종양에 있어서 악액질을 유도하고, 종양 성장을 자극하고, 전이 잠재성을 증가시키고, 세포독성을 매개한다. 따라서, 본 발명의 조성물는 악성 종양을 치료하는데 사용되어, 종양 성장 또는 전이를 억제하고/하거나 악성종양에 부수적인 악액질을 완화시킬 수 있다. 당해 조성물은 전신 투여되거나 종양 부위에 국소 투여될 수 있다.

F. 폐 질환

TNF-α는, 백혈구-내피 활성화를 자극하고, 세포독성을 폐포세포로 유도하고, 혈관 누출 증후군을 유도하는 등의 성인 호흡 곤란 증후군의 병리생리학에 관련된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 각종 폐 질환, 예를 들면 성인 호흡 곤란 증후군, 호흡 쇼크폐, 만성 폐 염증 질환, 폐 유육종증, 폐 섬유증 및 규폐증을 치료하는데 사용될 수 있다. 당해 조성물은, 예를 들면 에어로졸로서 전신 투여되거나 폐 표면에 국소 투여될 수 있다.

G. 장 질환

TNF-α는 염증성 장 질환의 병리생리학에 관련된다. 본 발명의 사람 조성물 은, 두가지 증후군, 크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는 장 질환, 예를 들면 특발성 염증성 장 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

H. 심장 질환

본 발명의 조성물은 또한 각종 심장 질환, 예를 들면 심장의 허혈 및 심부전(심장 근육의 약화)을 치료하는데 사용될 수 있다.

I. 기타

본 발명의 조성물은 또한 TNF-α이 매개된 각종 기타 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. TNF-α활성이 병리생리학에 관련되므로, 본 발명의 조성물을 사용하여 치료할 수 있는 기타 질환 및 장애의 예로는 염증성 골 질환 및 골 흡수 질환, 간염, 예를 들면 알콜성 간염 및 바이러스성 간염, 응고 장애, 화상, 재관류 손상, 켈로이드 형성, 반흔 조직 형성 및 발열이 포함된다.

그러므로, 본 발명의 조성물이 적용가능한 상기 TNF-α 매개성 질환으로는 패혈증, 자가면역질환, 감염성 질환, 동종이식 거부증, 이식-대-숙주 질환(GVHD), 악성종양, 폐 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 심장 질환, 골 질환, 골 흡수 질환, 간염, 알콜성 간염, 바이러스성 간염, 응고 장애, 화상, 재관류 손상, 켈로이드 형성, 반흔 조직 형성 및 발열 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 용어, "치료 및 예방"은 질병, 질병의 증상 또는 질병의 소인을 치료하는(cure), 낫게하는(heal), 완화시키는(alleviate), 경감하는(relieve), 바꾸는(alter), 고치는(remedy), 향상시키는(ameliorate), 개선시키는(improve) 또는 영향을 주는(effect)것을 목적으로 상기 언급된 질환, 질환의 증상 또는 질병의 소인 중 하나를 가지는 환자에게 화합물을 포함한 조성물을 투여하는 것을 말한다.

본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 담체, 부형제 또는 매질(medium)로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘, 광물유 등을 들 수 있다. 경우에 따라서, 제형은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포 함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 조성물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 같은 활성 성분의 투여량은 처리되는 대상, 질병 또는 상태의 심각도, 투여의 속도 및 처방 의사의 판단에 따른다. 본원에서 용어, "유효량"은 바람직한 효과를 주기 위해 요구되는 화합물의 양이다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 투여의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 치료방법을 실행하기 위해, 경구적으로, 직장으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해 또는 식재된 리저버(reservoir) 등을 통해 투여(처리)될 수 있다.

비경구적은 피하의, 피하 내의, 정맥 내의, 근육 내의, 관절 내의, 동맥 내의, 활액 내의, 흉골 내의, 경막 내의, 병변 내의 및 두개 내의 주사 또는 주입기법을 포함한다.

경구투여용 조성물은 정제, 캡슐, 유제 및 수용성 현탁액, 분산제 및 용액을 포함하는 어떠한 경구적으로 허용가능한 투약 형태일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 사용된 정제용 담체는 락토오스 및 콘 스타치를 포함한다. 스테아릭산 마그네슘과 같은 윤활제(lubricating agents) 또한 전형적으로 정제에 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여에 유용한 희석제는 락토오스 및 건조된 콘 스타치를 포함한다. 수용성 현탁액 또는 유제가 경구적으로 투여될 때, 활성 분은 유화 또는 현탁제와 조합되어 유상(oil phase)에서 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 만일 필요하다면 약간의 감미료, 향료 또는 착색제가 첨가될 수 있다. 무균의 주사가능한 조성물은(예를 들어 수용성 또는 유질의 현탁액) 적합한 분산 또는 습윤제(예를 들어, Tween 80과 같은) 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 무균의 주사가능한 조제품은 또한 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 용액과 같은 무균의 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 허용가능한 비히클 및 용매 중에서 사용될 수 있는 것은 만니톨, 물, 링거액 및 등장의 염화나트륨 용액이다. 게다가, 무균의 고정유는 전통적으로 용매 또는 분산매(예를 들어, 합성의 모노- 또는 디-글리세라이드)로서 사용된다. 올레익산 및 그것의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 특히 그들의 폴리옥시에틸화 형태인 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 약제학적으로 허용가능한 오일로서 주사제의 제조에 유용하다. 이러한 오일용액 또는 현탁액은 또한 긴사슬 알콜 희석제 또는 분산제, 또는 카복시메틸 셀룰로오스 또는 유사 분산제를 포함할 수 있다.

흡입 조성물은 약제학적 제형의 공지된 기술에 따라 제조될 수 있으며, 벤질알콜 또는 다른 적합한 방부제, 생물학적이용가능성을 강화시키는 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 다른 공지된 용해제 또는 분산제를 사용하여 염류의 용액으로서 제조될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 활성 화합물은 직장으로 투여될 수 있다. 한 예로는 좌약 기제(suppository base)와 함께 활성 화합물을 포함하는 좌약이다. 적합한 좌약 기제는 예를 들어, 천연 또는 합성 트리글리세라이드 또는 파라핀 탄화수소이다. 또 다른 예로는 활성 화합물 및 기제를 포함하는 젤라틴 직장 캡슐이 있다. 사용 가능한 기제 물질은 예를 들어, 액체 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다.

피부에 적용되는 조성물은 오일, 크림, 로션, 연고 및 기타의 형태로 제조될 수 있다. 조성물에 적합한 담체는 식물 또는 광유, 흰 바셀린 연고(흰 연성 파라핀), 분지쇄 지방 또는 오일, 동물성 지방 및 고분자량 알콜(C12보다 높음)을 포함한다. 바람직한 담체는 활성 성분이 가용성인 것이다. 유화제, 안정제, 습윤제 및 항산화제는 또한 만일 필요하다면, 색의 발현제또는 방향제를 포함한다. 게다가 피부침투 증강제가 이러한 국소 제형에 사용될 수 있다.

크림은 바람직하게는 아몬드유와 같은 소량의 오일에 용해된 활성 성분의 혼합물이 뒤섞인 광유, 자기유화형 밀랍 및 물의 혼합물로부터 조제된다. 이러한 크림의 예로서 하나는 물 약 40, 밀랍 약 20, 광유 약 40 및 아몬드유 약 1의 비율을 포함한다.

연고는 따뜻한 연성 파라핀 및 혼합물을 냉각시키는 것과 함께 아몬드유와 같은 식물성 유지에 활성 성분 용액을 혼합함으로써 제조된다. 이러한 연고의 예로서 하나는 아몬드유 30중량% 및 흰 연성 파라핀 70중량%를 포함한다.

또한, 다른 양태로 본 발명은 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물을 처리하여 TNF-α의 분비를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물은 HuR 단백질이 TNF-α mRNA에 결합하는 것을 억제하여 mRNA 반감기를 감소시킴으로써 TNF-α의 분비를 효과적으로 억제하는바, TNF-α에 의해 매개되는 질환의 치료 및 예방제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 준비 및 방법

1-1. 화합물

본 발명자들이 사용한 대표적인 화합물들은 한국 화학 연구원 (유성구, 대전, 한국)의 한국 화합물은행에서 제공받았다.

1-2. DNA 제조

전체-길이의 마우스 재조합 HuR 및 TTP 유전자를 pGEX4T1벡터로 클로닝하였다. Kang et al., 2002에 개시된 방법대로 상기 벡터를 Escherichia coli (E. coli) BL21 균주에 형질전환시켜서 단백질을 발현시켰다. TNF-α-ARE 전사체의 시 험관내 합성 (in vitro synthesis)을 위해서, 센스 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 5'에 5'-GGGAGATACGGTCCACTACC-3'서열 및 3'에 5'-CGAAGTCTGAGTGATGCATG-3'서열을 포함하고 있다. PCR 주형들은 정방향 프라이머인 5'-GCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACGGTCCACTACC-3' 및 역방향 프라이머인 3'-GCTTCAGACTCACTACGTAC-5'를 사용하여 증폭시켰다.

1-3. 재조합 HuR 및 TTP 단백질의 제조

마우스 재조합 HuR 및 TTP 유전자를 포함한 콜로니들을 LB 배양배지 (10 g/L 트립톤, 10 g/L 효모 추출물, 5 g/L 염화나트륨)에서 37 ℃ 온도로 A600 값이 0.4가 될 때까지 교반하면서 배양하였다. 이후, IPTG를 최종 배양액 기준으로 0.5 mM 농도가 되도록 배양액에 첨가한 후, 4시간 더 배양하였다. 그런 다음 세포를 모으고, 차가운 5 ml의 용해 버퍼 (lysis buffer, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM NaCl 및 5 mM DTT)로 재현탁시킨 후, 상기 세포들을 소니케이션 (30 W, 90 s)을 통해 세포를 파괴시켰다. 상기 용해물 (lysate)을 4 ℃에서 30분간 배양한 후, 12,000 x g, 4 ℃에서 30분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상등액과 글루타티온 세파로즈 4B (Glutathione Sepharose 4B, GE Healthcare, Sweden)와 혼합한 후, 90분간 상온에서 부드럽게 교반하면서 배양하였다. 세파로즈 배지는 TBS (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM 염화나트륨)로 3번 세척한 후, 융합 단백질은 용출 버퍼 (elution buffer, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM reduced glutathione)를 이용 하여 용출시켰다.

1-4. RNA 프로브의 시험관내 전사 ( In vitro transcription )

RNA 프로브를 T7 RNA 전사효소 프로모터 부위를 포함하는 PCR 주형으로부터 제작하였다. 상기 주형은 제조사의 지시에 따라 [α-³²P] UTP (GE Healthcare, Sweden) 및 T7 MEGAscript kit (Ambion, TX, USA)를 이용하여 전사시켰다. 상기 전사된 프로브에 37 ℃에서 15분간 DNaseI을 처리한 후, 페놀:클로로포름으로 추출 후, 아이소프로판올 침전시켰다.

1-5. RNA EMSA ( RNA electrophoretic mobility gel shift assay )

표지화된 RNA 프로브와 GST-HuR 단백질을 결합 버퍼 (binding buffer, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 120 mM NaCl)에 혼합시킨 후, DMSO 용액에 녹인 각각의 화합물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 20분간 반응시켰다. 단백질-RNA 결합체를 6 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 해리 RNA와 분리시켰다. 0.5x TBE 버퍼 (44.5 mM Tris, 44.5 mM boric acid, 1 mM EDTA)에서 전-전기영동하였다. 0.5x TBE 버퍼에서 8 mA로 1시간 동안 전기영동하였다 (Jung, K.C., Park, C.H., Hwang, Y.H., Rhee, H.S., Lee, J.H., Kim, H.K., and Yang, C.H. (2006). Fatty acids, inhibitors for the DNA binding of c-Myc/Max dimer, suppress proliferation and induce apoptosis of differentiated HL-60 human leukemia cell. Leukemia 20, 122-127. ). 밴드를 BAS2500 자동 검출 시스템 (BAS2500 automated detector system ,Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 시각화하였고, 각 밴드의 강도 (intensity)를 이미지 분석 소프트웨어 (image analysis software, Multi-Gauge V3.0, Fujifilm, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다.

1-6. 단백질- RNA 필터 결합 분석 ( Protein - RNA filter binding assay )

³²P-표지화된 RNA 및 GST-HuR 또는 GST-TTP 단백질을 결합 버퍼에서 반응물의 총 부피가 100 ㎕가 되도록 하여 상온에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응 후, 30분간 결합 버퍼에서 미리 끓인 반응 용액을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 디스크 필터 (Millipore, MA, USA)를 통과시켜 여과시켰다. 상기 필터를 결합 버퍼로 두 번 세척한 후, Tri-Carb 2900TR 리퀴드 신틸레이션 카운터 (Tri-Carb 2900TR liquid scintillation counter, Perkin Elmer, CT, USA)로 분석하였다.

1-7. 세포 배양

마우스 마크로파아지 세포주인 RAW264.7를 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, Hyclone Laboratories, UT, USA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, CA, USA)을 포함하는 DMEM 배지 (Welgene, Daegu, South Korea)에서 5% CO₂, 37 ℃ 배양조건에서 배양하였다.

1-8. mRNA 안정성 연구

RNA 안정성 분석을 위해서, RAW264.7 세포에 악티노마이신 D (5 ㎍/㎖)를 전사를 억제하기 위해 첨가하였다. 악티노마이신 D 및/또는 쿼세틴 (0, 5, 20 M) 또는 화합물 b-40 (0, 1 및 4 μM)를 시간 차이를 두고 처리한 후 상기 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA (200 ng)를 TRIZOL을 사용하여 준비하였고, 역전사 효소 및 올리고-dT 프라이머를 사용하여 상기 RNA를 역전사시켜서, cDNA를 제조하였다. 1 또는 2 ㎕의 cDNA와 특이적 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행하였다.

1-9. RT - PCR

oligo-dT 프라이머(oligo-dT primer)(Invitrogen, CA, USA)를 수반하는 역전사효소(Reverse transcriptase)는 0.1㎍ 전체 RNA를 cDNA를 만드는데 사용되어 왔다. 0.1 ㎕의 cDNA를 이용하여 특별한 프라이머를 수반한 PCR이 작동되었다.

프라이머 세트는 다음과 같다:TNF-α: 포워드(forward) 5'-CCAGGCAGTCAGATCATCTTC-3' 및 리버스(reverse) 5'-TTGATGGCAGAGAGGAGGTT-3'; IL-6: 포워드(forward) 5'-AACGATGATGCACTTGCAGA-3' 및 리버스(reverse) 5'-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3'; 및 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase): 포워드(forward) 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' 및 리버스(reverse) 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'.

PCR의 조건은 다음과 같다: 30초 동안 95℃에서 디네튜레이션(denaturation: DNA변성) 이어서 30초 동안 55℃에서 어닐링(annealing: 프라이머 결합) 및 30초 동안 72℃에서 익스텐션(extension: DNA합성)을 30회 반복(cycle); 그리고 10분 동안 72℃에서 마지막 단계를 밟는다.

PCR 생성물은 0.1 ㎍/ml의 EtBr(ethidium bromide)을 함유하는 1.5% 아가로스겔(agarose gel) 상에서 전기영동(electrophoresis)에 의해 분리되었고, 바이오이미징-시스템(bioimaging system)으로 자외선(UV light) 하에 시각으로 인식되었다.(Syngene, Cambridge, United Kingdom)

실험예 1. TNF -α mRNA 의 ARE 에의 HuR 및 tristetraprolin ( TTP )의 결합 친화도 분석

HuR과 TTP로 유전자재조합 GST 융합단백질(recombinant GST fusion protein)을 만들었고 (도1a), 이러한 융합단백질 및 TNF-α 유래의 ARE 서열을 포함하는 방사선 표지된 RNA를 사용하여 RNA EMSA를 이행하였다 (도 1b). 두 다른 분자량을 가지는 HuR:ARE 복합체는 농도 의존적 방식(concentration-dependent manner)으로 형성되었다. RNA EMSA을 통해 관찰한 결과, HuR이 TTP 보다 강하게 ARE시퀀스에 결합되었다. 두 단백질의 결합 효율은 또한 동일한 유전자 재조합 단백질 및 RNA 프루브(RNA probe)를 이용하여 필터 결합 분석(filter binding assay)에 의해 정량화하였다. HuR의 TNF-α mRNA 결합 친화도는 TTP보다 높았다. 또한, 단백질:RNA 복합체(protein:RNA complex)의 총량은 HuR:ARE가 더 많았다.

실험예 2. HuR : ARE 복합체 형성을 억제하는 억제제( inhibitor ) 분석

2-1. HuR : ARE 복합체 형성을 억제하는 억제제( inhibitor )의 스크리닝( Screening )

RNA EMSA 및 필터 결합 분석(filter binding assay)에 기초하여 HuR:ARE 결합에 대한 화학적 억제제를 스크리닝하였다. 우리는 한국화학연구원(Korea Research Institute of Chemical Technology)으로부터 용이하게 이용될 수 있는 화합물 라이브러리의 서브세트를 얻었고, 유전자재조합 HuR를 이용하여 전기영동이동 겔시프트법(electrophoretic mobility gel shift)을 통하여 179개의 다른 화합물을 스크리닝하였다. 최초 스크리닝에서, 우리는 HuR:ARE 복합체에 100-μM농도로 화합물을 적용하였다. 화합물 중에서, 9개 후보는 HuR의 ARE에 대한 결합에 대하여 강한 억제효과(cut-off =25% 억제)를 나타냈다.

2-2. 후보 화합물의 IC ₅₀ 결과

HuR:ARE 복합체의 안정성에 따른 각 화합물의 IC₅₀ 을 측정하기 위하여 화합물의 양을 조절하여 필터 결합 분석을 통해 RNA-단백질 복합체의 형성 정도를 측정하였다. IC₅₀(The half-maximal inhibitory concentration)는 그래프패드프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정된다(도 2). 표 1에 요약된 바에 따르면, IC₅₀ 값은 b-40이 0.38 μM, 그리고 b-41이 6.21 μM 였다.

실험예 3. 쿼세틴 및 b-40에 의한 mRNA 안정도의 조절

쿼세틴 및 b-40은 HuR:ARE(TNF-α) 복합체 형성을 억제할 수 있기 때문에, 이러한 두 화합물은 TNF-α mRNA의 안정도에 미친다. 액티노마이신 D의 첨가 후 LPS를 처리한 RAW264.7(LPS-treated RAW264.7) 마우스 대식세포(macrophage)에서 TNF-α 및 IL-6 mRNA를 검사하였다. 쿼세틴을 넣지 않은 경우, TNF-α 및 IL-6 mRNA의 수준(level)은 액티노마이신의 첨가로 감소된다. 쿼세틴을 LPS 처리 RAW264.7 세포(LPS-treated RAW264.7 cell)에 첨가한 결과, 첨가하지 않은 경우와 비교하여 TNF-α 및 IL-6 mRNA의 degradation 속도가 증가하였다(도 3a). b-40는 IL-6 mRNA의 빠른 degradation을 유도하였다(도 3b).

쿼세틴 및 b-40의 효과를 확고히 하기 위하여, LPS 처리 RAW264.7 세포의 배양액(medium) 내에 분비된 TNF-α 단백질의 수준을 측정하였다. 도 3c에 도시한 바와 같이, 쿼세틴 처리 세포에서의 TNF-α 단백질의 양은 쿼세틴 양에 비례하여 감소하였다. b-40는 4 μM이하로 처리할 때 TNF-α의 합성을 효과적으로 억제하였다(도 3d).

실험예 4. HuR : ARE 복합체의 화합물 억제제의 특이성

HuR과 TNF-α mRNA의 ARE를 이용하여 화합물을 스크리닝 하더라도, HuR은 다른 ARE 서열에 결합할 수 있고, TNF-α의 ARE는 TTP에 의해 결합될 수도 있다. 그러므로 RNA 결합 단백질에 대한 b-40 및 쿼세틴의 억제활성(inhibitory activity)의 특이성을 평가하기 위하여, 하기와 같은 실험을 하였다.

4-1. 화합물 억제제의 TNF -α mRNA ARE 에의 HuR 및 tristetraprolin ( TTP )의 결합 억제 효과 분석

HuR 대신에 TTP로 치환하고 TNF-α ARE [ARE(TNF-α)]를 수반하는 복합체를 형성한 상태에서 화합물 억제제의 억제효과를 분석했다(도 4). 도 1b에 도시된 바와 같이, TTP:ARE (Kd = 2.194 x 10-7 M) 결합은 HuR:ARE (Kd = 0.677 x 10-7 M) 보다 낮고, TTP:ARE 결합은 쿼세틴이나 b-40 중 어느 것으로도 억제되지 않았다.

4-2. 화합물 억제제의 다양한 표적 ARE 서열에 대한 억제 활성 효과 분석

또한, COX2, IL-6 및 cFOS을 이용하여 표적 ARE 서열에 대한 억제 활성의 특성을 시험했다(도 4). 0.5μM의 쿼세틴 처리한 결과, HuR:ARE(TNF-α)를 제외하고 임의의 RNA-단백질 상호작용을 효과적으로 억제할 수 없었다. 0.25 μM의 b-40를 처리한 결과, 복합체 HuR:ARE(TNF-α) 및 HuR:ARE(cFos)의 형성을 억제하였다.

도 1은 TNF -α mRNA 의 ARE 서열에 대한 HuR 와 TTP 의 결합 친화도를 나타낸 것이다.

구체적으로, 도 1a는 본원에서 사용한 huR(NP_034615) 또는 TTP(NP_035886)와 GST의 융합 단백질의 구조, 및 TNF-α, COX-2, IL-6, cFos mRNA의 ARE 서열을 나타낸다(RRM, RNA-recognition motif; ZnF, Zn2+-finger binding motif) .

도 1b는 RNA EMSA analysis을 통해 HuR (상단)와 TTP (하단)가 TNF-α mRNA의 ARE서열에 결합한 것을 확인한 결과이다.

도 1c는 필터 결합 분석 (filter binding assay)을 통해 TNF-α에 대한 HuR, TTP, GST의 친화도를 확인한 결과이다.

도 2는 TNF -α mRNA 의 ARE 서열에 결합하는 b-40 및 b-41의 억제 활성을 필터 결합 분석을 통하여 확인한 결과이다. 점선은 각 화합물의 IC₅₀ 값을 나타낸다.

도 3은 LPS -처리 RAW264 .7 세포에서 TNF-α 및 IL -6 발현에 대한 쿼세틴 및 b-40의 효과를 나타낸 것이다.

구체적으로, RAW264.7 세포를 1시간 동안 1 ㎍/ml LPS로 전처리한 후, 액티노마이신 D (5 mg/ml) 및 쿼세틴(a) 또는 b-40(b)을 처리했을 때, TNF-α 및 IL-6 mRNA의 분해(degradation) 속도를 나타내며, 또한, LPS 활성화된 RAW264.7 세 포(LPS-activated RAW264.7 cell)에서 쿼세틴(c) 또는 b-40(d)으로 처리했을 때, TNF-α 및 IL-6 단백질이 분비된 수준을 나타낸 것이다.

도 4는 쿼세틴 (A) 과 b-40(B)의 억제 활성의 특이성을 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 TNF-α 매개성 질환 예방 및 치료용 조성물:

화학식 Ⅰ

상기 식에서,

R1는
이며,

R2는
이다.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 HuR 단백질이 TNF-α mRNA에 존재하는 ARE(AU-rich element) 영역에 결합하는 것을 저해하여 TNF-α mRNA 반감기를 감소시키는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴 또는 2-(6-아미노-3,5-디시아노-4-(4-메톡시페닐)피리딘--2-일티오)-N-(4-클로로페닐)아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 2-아미노-4-(4-(벤질옥시)페닐)-6-(2-(3,4-디하이드록시페닐)-2-옥소에틸티오)피리딘-3,5-디카본니트릴의 농도가 1μM-4μM인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 TNF-α 매개성 질환은 패혈증, 자가면역질환, 감염성 질환, 동종이식 거부증, 이식-대-숙주 질환(GVHD), 악성종양, 폐질환, 크론병, 궤양성 결장염, 심장 질환, 골 질환, 골 흡수 질환, 간염, 알콜성 간염, 바이러스성 간염, 응고 장애, 화상, 재관류 손상, 켈로이드 형성, 반흔 조직 형성 및 발열으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 화학식Ⅰ로 표시되는 화합물을 처리하여 TNF-α의 분비를 억제하는 방법:

화학식 Ⅰ

상기 식에서,

R1는
이며,

R2는
이다.