JP5558353B2 - Ｌｃｋｓｈ２ドメイン結合の小分子阻害剤 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年８月１７日出願の米国仮特許出願第６０／９５６，４７１号の優先権を主張し、その内容全体を本願に引用して具体的に援用する。

連邦政府による委託研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所からの契約番号第ＣＡ０９５２００号の下に米国政府の支援で成し遂げた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。

Ｔ細胞活性化におけるＬｃｋキナーゼの役割は、充分に解明されている。Ｌｃｋによって媒介されるＴＣＲ近位活性化シグナルにおける重要な工程は、ＣＤ３鎖の細胞質尾部に存在する免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化、およびＺＡＰ−７０キナーゼのリン酸化である。Ｌｃｋ作用の阻害により、ＩＬ−２生産および抗原特異的Ｔ細胞増殖に必要とされる複数のシグナリング系の活性化を妨げ、従って免疫応答を妨害する、これらの初発事象が妨害される。Ｔ細胞活性化におけるその中心的役割により、かつその制限的発現により、Ｌｃｋは新規な免疫応答阻害剤の開発に絶好の分子標的となる。

Ｌｃｋは、いくつかの特有な機能ドメイン、キナーゼ、ＳＨ２およびＳＨ３ドメインで構成されるＳｒｃファミリーキナーゼである。これらの機能ドメインのうち、キナーゼおよびＳＨ２ドメインは、触媒作用におけるそれらの役割、および特異性の限定におけるそれらの役割から、絶好の標的となる。治療結果を得るために、Ｌｃｋキナーゼドメインの化学的標的指向が用いられている。これまでに開発されたＬｃｋキナーゼ触媒阻害剤は、望ましい特異性を欠き、かつ深刻な毒性をインビボで呈したことから、さらなる薬物開発に不適なものとなっている。ＦｙｎおよびＬｙｎなどの類似のＳｒｃファミリーキナーゼは、リンパ球により発現されるので、特異的にＬｃｋキナーゼを標的指向する阻害剤化合物の開発が必須である。キナーゼ触媒阻害剤はすべてＡＴＰ類似体であり、密接に関連する他のＳｒｃファミリーキナーゼ（特にＬｙｎ）に対する望ましいレベルの特異性を欠いている。

ＳＨ２は、タンパク質の特異的チロシンリン酸化部位に結合する機能ドメインであるので、研究の焦点はＳＨ２ドメイン構造の関連部分、すなわち、リン酸化チロシン（ｐＹ）標的ペプチドが結合する領域に当てられている。３Ｄ構造解析で、結合ドメインは、伸展コンホメーションにおいてリンペプチドが結合する当該タンパク質の表面に沿って凹部を備えることが示されている。凹部には、ｐＹ残基に対するものと、ｐＹ＋３残基に対するものとの、２つの詳細に明らかにされた結合ポケットが含まれる。ＳＨ２ドメインの結合特異性は、ｐＹのＣ末端側にあるアミノ酸残基、特に第３の残基（ｐＹ＋３部位）と相互作用する結合部位によって主に決定付けられる。Ｌｃｋは、ζ鎖ＩＴＡＭ−２Ｃ末端ホスホチロシン残基と、最大の親和性で結合することが示されている。ＳＨ２ドメインのこのような選択性は、適切な細胞性活性化に必須であり、ＳＨ２ドメインが、選択したシグナル伝達系路を特異的に阻害する化合物の設計の潜在的な標的となりうることを示唆している。Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインとＣＤ３ ＩＴＡＭとの会合の遮断により、Ｔ細胞活性化が防止される。従って、Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインは、免疫抑制薬開発の潜在的な標的である。

ＳＨ２ドメイン３Ｄ構造およびＳＨ２ドメインの配列特異性の膨大な知見に基づき、個々のＳＨ２ドメインに特異的なペプチドおよびペプチド擬似体の合理的な設計が実施されている。しかし、これらのペプチド擬似体は、安定性および浸透性が問題となり、治療薬へのそれらのさらなる開発が制限されるものであった。この制限を打開するために、その細胞標的タンパク質へのＳＨ２ドメイン結合を特異的に遮断する、ｐＹ＋３結合ポケットに対して標的指向される低分子量非ペプチド化合物の発見が、新規な免疫抑制剤の開発のためのアプローチとして行われている。

ＳＨ２ドメインは、多数の３Ｄ構造研究や、分子シミュレーションを介した計算試験の標的となっている。現在、単独、および種々のペプチドと複合してＳＨ２ドメインを含む、２２０を超える構造がＮＣＢＩタンパク質データバンクで入手可能である。データベースからのＬｃｋ ＳＨ２ドメインの入手可能な構造情報を使用し、ｐＹ＋３結合ポケットを標的指向するＬｃｋ ＳＨ２の小分子阻害剤（ＳＭＩＬＳ）を同定するのに、コンピュータ援用薬品設計（ＣＡＤＤ）が用いられた。３つの化合物が、ＣＤ３ζ鎖ＩＴＡＭへのＬｃｋ ＳＨ２ドメイン結合の阻害に選択的であると同定された。これらＳＭＩＬＳは、ＩＬ−２生産、混合リンパ球反応をインビトロで、また膝窩リンパ節アッセイをインビボで阻害した。

関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性の多系Ｔ細胞自己免疫疾患である。ラットアジュバント関節炎（ＡＡ）実験モデルでの研究から得られたいくつかの系列の証拠で、ＡＡとヒトにおける慢性炎症性ＲＡとの病因の関係が裏付けられている。例えば、ａ）ＲＡ患者で、ミコバクテリアのｈｓｐ６５（Ｂｈｓｐ６５）に対するＴ細胞応答と、関節炎の初期段階との間の関連が認められており；ｂ）Ｂｈｓｐ６５に対するＴ細胞応答が、血液と比較してＲＡ滑液にて上昇しており；ｃ）ＲＡ患者では、天然のＢｈｓｐ６５だけでなくそのペプチド１８０〜１８８（ＬｅｗｉｓラットにおけるＡＡに対する関節炎誘発性決定因子）に対してもＴ細胞応答が上昇しており；ｄ）若年型慢性関節炎の関節炎患者でもＢｈｓｐＢ５および自己のｈｓｐ６５に対する激しいＴ細胞応答が上昇している。このように、Ｈｓｐ抗原に対するＴ細胞応答は、ＲＡにおける疾患経過に関与している。Ｔ細胞のサブセットのうちＴｈ１細胞は、Ｔ細胞自己免疫疾患の病原に関与していると考えられる。自己反応性Ｔ細胞の分化の、Ｔｈ２エフェクター表現型への移行は、ＲＡの好転に関わっている。

主にＴ細胞によって媒介される疾患経過の性質、ヒトＲＡに酷似した、ＬｅｗｉｓラットにおけるＡＡの充分に確立された実験モデル、Ｂｈｓｐ６５内の詳細に明らかにされた病原性エピトープ、詳細に特徴付けられた病原性エピトープ特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）サブセット、および抗Ｂｈｓｐ６５抗体のＡＡ保護特質で、ＳＭＩＬＳの作用機構の検証および解析の独特な機会が提供される。

抗原が媒介する活性化が起こると、Ｔ細胞抗原受容体複合体は、ＩＴＡＭ残基でリン酸化されることになる。Ｔ細胞にはＳＨ２ドメインを備えた多数のシグナリングタンパク質があるが、それらのＳＨ２ドメインを介してＩＴＡＭに結合するものはわずかである。このため、ホスホチロシンに基づくシグナリング事象において、その特異性はＳＨ２ドメインによって決定される。ＣＡＤＤおよびインビトロ固相ＥＩＡスクリーニング法の組み合わせを用い、ＳＨ２ドメインｐＹ＋３結合ポケットを標的指向する、小分子阻害性化合物の同定の良好なストラテジーが開発されている。スクリーニングプロセスで選択された化合物のうち、Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインのＣＤ３ζ鎖ＩＴＡＭとの会合のみ阻害するが、ＦｙｎおよびＬｙｎなどのＳｒｃファミリーに属するＬｃｋの類縁体は阻害しない、限局的特異性を有する化合物が同定されている。このような密接に関連したＳＨ２ドメイン同士を判別できる、小分子阻害剤の同定は新規である。Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインに対するこれらの化合物の顕著な特異性、それらの浸透性および低毒性から、それらは免疫抑制剤として絶好なものとなっている。

本発明は、ＣＤ３鎖のチロシンリン酸化ＩＴＡＭとの、Ｌｃｋ ＳＨ２の会合を遮断する、特異的非ペプチド小分子阻害剤を提供する。これらの化合物（Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインの小分子阻害剤：ＳＭＩＬＳ）は、Ｌｃｋ機能を特異的に妨害し、かつ活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２生産、インビトロの混合リンパ球反応や、インビボの膝窩リンパ節アッセイの局所同種応答、およびラットにてミコバクテリアで誘発される（Ｍｔｂ誘発性）アジュバント関節炎を妨害する。化合物は細胞透過性であり、非細胞毒性で、目に見える毒性作用なく動物に充分な耐容性を示した。これらの化合物は、Ｔ細胞活性化を特異的に抑制し、関節炎のラットにおける関節の炎症を低減した。重症の関節リウマチを処置する際に、免疫抑制剤を使用することができる。

１つの実施形態で、本発明は、免疫調節作用を得る必要がある患者で免疫調節作用を得る方法であって、有効量の１以上の本発明の化合物を投与することを含む方法に関する。本発明の化合物には、以下にさらに詳説するような化合物７２、８７、および２４１が含まれる。免疫調節作用は、免疫応答の刺激、または免疫応答の抑制でありうる。１つの実施形態で、本発明の化合物は、望ましくない免疫応答を抑制するために、その必要がある患者に投与してもよい。

１つの実施形態で、本発明は、Ｌｃｋキナーゼの活性を調節する必要がある患者でＬｃｋキナーゼの活性を調節する方法を提供する。かかる方法は、化合物７２、８７、および２４１からなる群より選択される有効量の化合物を、前記患者に投与することを含みうる。Ｌｃｋキナーゼ活性の調節としては、限定しないが、キナーゼ活性を阻害すること、およびＬｃｋキナーゼのＳＨ２ドメインのＩＴＡＭへの結合を阻害することが挙げられる。

１つの実施形態で、本発明は、患者の自己免疫疾患を処置するための材料および方法を提供する。かかる方法は、化合物７２、８７、および２４１からなる群より選択される有効量の化合物を、前記患者に投与することを含みうる。本発明の化合物を使用して、任意の自己免疫疾患を処置しうる。本発明の化合物を使用して処置することができる自己免疫疾患の例として、限定しないが、関節リウマチ、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、多発硬化症、Ｔ細胞白血病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、クローン病、グレーブス病、およびセリアック病が挙げられる。

１つの実施形態で、本発明は、例えば関節リウマチなどの疾病に関わる関節の腫脹を処置する材料および方法を提供する。このような方法は、有効量の本発明の化合物、例えば、化合物７２、８７、および２４１からなる群より選択される化合物を投与することを含みうる。

１つの実施形態で、本発明は、Ｔ細胞の活性化を阻害する方法を提供する。かかる方法は、Ｔ細胞を化合物７２、８７、および２４１からなる群より選択される化合物に接触させることを含みうる。この接触させられるＴ細胞は、例えば患者の中などのインビボでも、または例えば患者から取り出されていても、および／もしくは培養液中で生育されていてもよいなどのインビトロでもよい。

本発明の化合物での、ＭＬＲの用量依存的阻害を示す棒グラフである。ＣＤ−１およびＣ３ＨマウスＬＮＣ（各株より５×１０^５細胞）の培養液に異なる濃度の化合物を０時間、２４時間および４８時間に添加し、^３［Ｈ］−チミジン（１ｍＣｉ／ウェル）を、７２時間培養の最後の１８時間添加した。細胞を収集して、放射活性を液体シンチレーションカウンターで計数した。化合物の非存在下（溶媒のみ）に培養した細胞を陽性対照として用いた。同数の非同種細胞を陰性対照として用い、ＣｓＡ（１μＭ）をさらなる対照として使用した。その結果を、阻害パーセントとして表した。 細胞毒性アッセイの結果を示す線グラフである。ＲＰＭＩ１６４８＋１０％ＦＢＳで４８ウェルプレート（１×１０^４細胞／ウェル、第０日）にて培養したＪｕｒｋａｔ細胞に、ＳＭＩＬＳ化合物（１０μＭ）を第２、３、および４日に添加した。各ウェルの細胞数を毎日計数した。エラーバーは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。シクロスポリンＡを、１μＭの用量で対照として使用した。第５日での化合物８７を除き、いずれの日でも対照と実験群の間で細胞数に有意差（ｐ＞０．１）は認められなかった。 膝窩リンパ節（ＰＬＮ）アッセイの結果を示す棒グラフである。第０日に１×１０^６のＣ３Ｈマウスリンパ節細胞（ＬＮＣ）の足蹠注射をしたＩＣＲマウス（ｎ＝３）に、ＳＭＩＬＳ（１ｍｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇ体重）を第０〜４日に毎日腹腔内注射した。マウスを第６日に屠殺し、そのＰＬＮを集めて重量を求めた。陽性対照群（Ｐ）には、ＬＮＣの足蹠注射とＰＢＳの腹腔内注射を、陰性対照（Ｎ）には、足蹠および腹腔内の両方にＰＢＳのみの注射をした。ＣｓＡ対照には、１ｍｇ／ｋｇ体重のシクロスポリンＡを与えた。エラーバーは、６種のＰＬＮの平均±ＳＤを表す。実験は２回繰り返した。ＳＭＩＬＳおよびＣｓＡ処置は、陽性対照に比較して、全用量でＰＬＮを有意に阻害した（＊ｐ＜０．０５）。ＳＭＩＬＳ（１ｍｇ／ｋｇ体重）およびＣｓＡ処置および陰性対照間に、有意差（†（十字形）ｐ＞０．０５）は観察されなかった。 予防処置の投薬計画でのＳＭＩＬＳの効果を示す線グラフである。ＳＭＩＬＳ注射（第−３、−２、−１、および０日、矢印で示す）は、発症を遅延させ、Ｍｔｂ誘発性ＡＡにおける関節腫脹を顕著に低減した。Ｍｔｂは、第０日に注射した。□−未処置群、○−ＳＭＩＬＳ処置群。 治療−１処置の投薬計画でのＳＭＩＬＳの効果を示す線グラフである。ＳＭＩＬＳ注射（第０、１、２、３、４日、矢印で示す）は、Ｍｔｂ誘発性ＡＡにおける関節腫脹を顕著に低減した。Ｍｔｂは、第０日に注射した。◇−未処置群、○−ＳＭＩＬＳ処置群（３ｍｇ／ｋｇ体重）、●−ＳＭＩＬＳ（１ｍｇ／ｋｇ体重）処置群。 治療−２処置の投薬計画でのＳＭＩＬＳの効果を示す線グラフである。ＳＭＩＬＳ注射（第１２、１３、１４、および１５日、矢印で示す）は、Ｍｔｂ誘発性ＡＡにおける関節腫脹を顕著に低減した。Ｍｔｂは、第０日に注射した。◇−未処置群、●−ＳＭＩＬＳ（３ｍｇ／ｋｇ体重）処置群。 （Ａ）未処置対照ラットの後足関節の顕微鏡写真である。２つの矢印の間に示す関節腔は、炎症性細胞で満たされている（白色矢印）。軟骨のほとんどが浸食され、パンヌス形成により骨が破壊されている（◆）ことに注目されたい。（Ｂ）未処置ラットの顕微鏡写真である。軟骨は全体的に浸食され、骨の破壊が明らかである。関節空間の狭小化は、滑膜の肥厚（黒色矢印）および炎症性細胞の浸潤（白色矢印）に起因する。（Ｃ）化合物２４１処置ラットの顕微鏡写真である。軟骨への損傷、および炎症性細胞がないことに注目されたい。（Ｄ）化合物２４１処置ラットの顕微鏡写真である。滑膜の肥厚は軟骨の多少の部分（矢印）にあるが、他の領域は無傷のままであることに注目されたい。関節空間内に炎症性細胞の浸潤は観察されない。

本願明細書の「疾病の処置」は、その疾病および／またはその疾病の少なくとも１つの徴候もしくは症状の予防、その発症の緩徐化、および／または寛解を意味する。

本発明は、本発明の化合物のすべての医薬上許容できる塩類およびプロドラッグなど、本願明細書に開示の化合物の有用な形態に関する。医薬上許容できる塩類としては、塩基として機能する主化合物を、塩を形成させるべく無機または有機酸と反応させることによって得られるもの、例えば、塩酸、硫酸、リン酸、メタン硫酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸の塩類が挙げられる。

医薬上許容できる塩類としては、主化合物が酸として機能し、適切な塩基と反応して、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、および塩素塩類を形成したものも挙げられる。当業者は、数多くの任意の既知方法により前記化合物を前記の適切な無機または有機酸と反応させることによって、特許請求の範囲にかかる化合物の酸添加塩を調製してもよいことをさらに認識するであろう。あるいは、アルカリおよびアルカリ土類金属塩類は、様々な既知方法により前記本発明の化合物を前記適切な塩基と反応させることによって調製される。

以下に、無機または有機酸との反応によって得ることができる酸塩類のさらなる例を挙げる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩（ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｉｏｎａｔｅｓ）、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩、ウンデカンサン酸塩。

好ましくは、形成される塩類は、哺乳類、例えばヒトへの投与のために医薬上許容できるものである。しかし、前記化合物の医薬上許容できない塩類は、例えば、塩として前記化合物を単離し、その後この塩をアルカリ性試薬での処理により遊離の塩基化合物に戻すように変換するためなどの、中間体として好適である。この遊離塩基は次いで、所望の場合、医薬上許容できる酸添加塩に変換できる。

本発明の化合物は、単独で、または、例えば、製剤などの組成物中の有効成分等といった配合成分として投与することができる。従って、本発明には、例えば１以上の医薬上許容できる担体を含有する、本発明の化合物またはその塩の医薬組成物も含まれる。

本発明に係る化合物の投与に好適な種々の製剤を調製するための手順に関して説明する、多数の標準参考文献が利用可能である。潜在的な製剤および調剤の例は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（現行版）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｌａｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ編）現行版、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，出版や、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｒｔｈｕｒ Ｉｓｏｌ編）、１５５３−１５９３（現行版）に挙げられている。

Ｌｃｋキナーゼに対する高度の選択性に鑑み、本発明の化合物はＬｃｋキナーゼ調節を必要とする任意対象に投与できる。投与は患者の要求に従って、例えば、経口的に、経鼻的に、非経口的に（皮下に、静脈内に、筋肉内に、胸骨内に（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、および注入により）吸入により、直腸に、経膣的に、局所的におよび眼内投与により成し遂げてもよい。注射としては、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内等が可能である。

本発明の化合物を投与するために、錠剤、ジェルキャップ、カプセル、カプレット、顆粒、舐剤および混合散剤などの固体剤形を含む種々の固体経口剤形を使用できる。本発明の化合物は、単独で、または種々の医薬上許容できる担体、希釈剤（スクロース、マンニトール、乳糖、デンプンなど）および当該技術分野で既知の賦形剤（懸濁剤、可溶化剤、緩衝剤、結合剤、崩壊剤、保存剤、着色剤、香味剤、滑沢剤等を含むがこれらに限定しない）と組み合わせて投与できる。徐放性カプセル、錠剤およびゲルも、本発明の化合物を投与するのに有利である。

本発明の化合物を投与するために、水性および非水性液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む種々の液体経口剤形も使用できる。このような剤形は、水などの当該技術分野で既知の好適な不活性希釈剤、ならびに保存剤、湿潤剤、甘味料、香味剤や、本発明の化合物を乳化および／または懸濁するための薬剤などの、当該技術分野で既知の好適な賦形剤も含有できる。本発明の化合物は、例えば静脈内に、等張無菌溶液の形態にて注射してもよい。他の調剤も可能である。

本発明の化合物の直腸投与用の坐剤は、前記化合物を、カカオバター、サリチル酸塩およびポリエチレングリコールなどの好適な賦形剤と混合することによって調製できる。経膣投与用の製剤としては、有効成分に加えて当該技術分野で既知のような好適な担体を含有する、腟坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡状剤、または噴霧式製剤の形態とすることが可能である。

局所投与用には、前記医薬組成物は、皮膚、目、耳または鼻への投与に好適な、クリーム剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、乳剤、懸濁剤、ゲル剤、液剤、ペースト剤、散剤、噴霧剤、および滴剤の形態とすることが可能である。局所投与には、経皮パッチなどの手段を介した経皮投与も含まれうる。

吸入を介した投与に好適なエアロゾル製剤の製造も可能である。例えば、呼吸器の障害の処置のために、本発明に係る化合物を、粉末（例えば、微粒子化粉末）の形態での、または霧化溶液もしくは懸濁液の形態での吸入によって投与できる。エアロゾル製剤は、許容できる加圧プロペラントに入れることができる。

前記化合物は、単独の活性薬剤として、またはチロシンキナーゼ、シグナル伝達プロセス、細胞増殖および／もしくは免疫応答を阻害もしくは刺激する他の薬剤などの、他の医薬製剤と組み合わせて投与できる。阻害的薬剤としては、例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、レフルノミド、ブテナミンド（ｂｕｔｅｎａｍｉｎｄｅｓ）、コルチコステロド、アトメリック酸（ａｔｏｍｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、ジリンペプチド誘導体、チルホスチン、ドキソルビシン等が挙げられる。このような組み合わせにおいて、各有効成分はその通常の用量範囲に従うか、またはその通常の用量範囲を下回る用量のいずれかで投与することができる。

本発明の化合物の用量は、他の検討事項のうち、処置すべき特定の症候群、症状の重症度、患者の年齢、性および体調、投与の経路、投与間隔の頻度、利用される特定の化合物、有効性、毒性プロファイル、その化合物の薬物動態プロファイル、および任意の有害な副作用の存在を含む種々の因子に依存する。

本発明の方法、例えば免疫応答を調節する方法にいう「有効量」とは、任意の病態、例えば異常な免疫応答に関わるものの予防、その発症の緩徐化、寛解および／または処置に充分な量である。例えば、１）自己免疫障害を処置するのに有効な量とは、以下の結果：その疾病の症状の１以上を阻止または寛解させる；その障害に関与する細胞の進行性変性を阻害する；その障害に起因する不快感を軽減する；およびその障害に罹った患者の生命を延ばすという結果の１以上をもたらすのに充分な量をいい、２）組織または臓器移植を行っている患者を処置するのに有効な量とは、以下の結果：移植した材料の拒絶を阻止または予防する；移植の拒絶に起因する不快感を軽減する；および移植を受けている患者の生命を延ばすという結果の１以上をもたらすのに充分な量をいい、３）免疫抑制患者を処置するのに有効な量とは、以下の結果：Ｔ細胞の数または活性化Ｔ細胞の数を増やす；患者の免疫抑制状態を低減する；その障害に起因する不快感を軽減する；およびその障害に罹った患者の生命を延ばすという結果の１以上をもたらすのに充分な量をいう。

本発明の化合物は、Ｌｃｋキナーゼ阻害剤もしくは刺激剤、または前記したもののような他の類似の薬物に通例の用量レベルおよび方法で投与される。例えば、シクロスポリンは（移植用に）約７．９５±２．８１ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（医師用卓上参考書））参照）で投与され、ＦＫ５０６は（移植用に）約０．１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇ／日（ＰＤＲ参照）で投与され、またラパマイシンは（移植用に）約２〜６ｍｇ／日、例えば８１ｋｇの成人に約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／日（Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｓｔａｒｇｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトを参照されたい）で投与される。例えば、米国特許第５６８８８２４号、第５９１４３４３号、第５２１７９９９号、第６１３３３０１号およびそれらに引用される出版物での開示も参照されたい。

例えば、本発明の化合物またはその塩は、単回または複数回投与で、例えば１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（患者体重）／日、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ／日から２５ｍｇ／ｋｇ／日の間の用量レベルで投与可能である。用量は、所望のとおりに免疫調節作用を生じさせるように調整することができる。低用量は、約１μｇ／ｋｇ／日から７５０μｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日から５００ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。高用量は、約１ｍｇ／ｋｇ／日から７５０ｍｇ／ｋｇ／日の間、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ／日から４５０ｍｇ／ｋｇ／日の間であることができる。

使用方法

本発明の組成物は、異常な免疫応答に関わる任意の疾病を予防する、その発症を緩徐化する、寛解するおよび／または処置するために使用することができる。

１つの実施形態で、本発明には、例えば、化学療法処置、放射線処置、放射線宿酔、またはＨＩＶ／ＡＩＤｓに起因する免疫系機能低下；一次Ｂ細胞欠損（例えば、ブルートン先天性ａ−γ−グロブリン尿症または分類不能型免疫不全など）または一次Ｔ細胞欠損（例えば、ディジョージおよびネゼロフ症候群、毛細血管拡張性運動失調症またはウィスコット・アルドリッチ症候群など）に関わる病態；重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）等に罹っている患者を、本発明の化合物で処置する方法が含まれる。前記化合物は、ワクチン（例えば、抗細菌、抗真菌、抗ウイルスまたは抗原虫感染症）と併せて、特に免疫無防備状態にある患者に対して使用することもできる。

別の好ましい実施形態で、本発明には、例えば、関節リウマチ、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、多発硬化症、Ｔ細胞白血病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、クローン病、グレーブス病、セリアック病などの自己免疫障害等に罹っている患者を、本発明の化合物で処置する方法が含まれる。本発明の化合物はまた、組織または臓器移植拒絶、例えば、超急性または慢性の移植片対宿主病、同種移植片もしくは異種移植片拒絶等を処置するためにも有用である。

いくつかの実施形態で、本発明の組成物は、長期間にわたって繰り返し与えてもよく、すなわち慢性的に投与してもよい。典型的には、組成物は、毎日１回以上、基礎疾患病態の発作を予防する、その可能性を低減する、またはその発作の重症度を低減するために好適な量で投与してもよい。このような組成物は、慢性的に、例えば何日もにわたって、１日１回以上投与してもよい。

いくつかの実施形態で、本発明の組成物は、基礎疾患の急性発作を処置するために使用してもよい。典型的に、この型の実施形態では、発作を起こしている患者に、その発作の重症度を低減するのに好適な量で本発明の組成物を投与することが必要となるであろう。１以上の投与を用いてもよい。

以下の実施例は、例示目的のみで提供するものであり、本発明の範囲を限定することは一切意図しない。

実施例１
ＣＤ３ζ鎖ｐＹ−ＩＴＡＭとのＬｃｋ ＳＨ２ドメイン会合を遮断するＳＭＩＬＳの同定

ＣＤ３ζ鎖ＩＴＡＭペプチドへのＬｃｋ ＳＨ２ドメイン結合を阻害する化合物を、本発明者らの研究室で開発した固相ＥＩＡアッセイを使用する生物学的アッセイおよびＣＡＤＤを併用して同定している。このスクリーニングを用い、１９０の供試化合物のうち４２が、１００μＭの濃度で、６０％より強くＬｃｋ ＳＨ２ドメインのＩＴＡＭ結合を阻害した（データは示さず）。

Ｌｃｋキナーゼは、βＤ５、βＥ４、ＥＦ１およびβＧ４部位（ここでこれらのアミノ酸がｐＹ＋３結合ポケットを形成している）で有意な配列相同性を併せ持つＳＨ２ドメインを有する、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、およびＨｃｋを含む、Ｓｒｃファミリーキナーゼのメンバーである。従って、これらのＳｒｃキナーゼおよびＴＣＲ近位シグナリングに関与する他のシグナル伝達分子のＳＨ２ドメインに対する化合物の阻害特異性を試験することが重要であった。前記アッセイにて同定した４２の化合物をすべて、７つの異なるＧＳＴ−ＳＨ２ドメイン（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ、ＳｈｅおよびＧｒｂ２）を用いた固相ＥＩＡアッセイを使用する特異性スクリーニングに付した。化合物７２、８７および２４１の３つの化合物が、Ｌｃｋ ＳＨ２ドメインに対する特異性を示したが、他のＳＨ２ドメインに対する阻害活性は、１００μＭのスクリーニング濃度でほとんどまたは全く認められなかった。

これらの化合物の構造を以下に示す。

使用した固相特異性スクリーニングによって、ＬｃｋキナーゼＳＨ２ドメイン結合を選択的に阻害する化合物の選択が可能となった。細胞アッセイで４０％を上回る阻害効果を有した化合物をすべて、前記固相特異性スクリーニングアッセイで試験し、７２、８７および２４１の３つの化合物がＬｃｋに特異的であることが同定された。これらの化合物がＬｃｋ ＳＨ２ドメインに特異的であるという事実から、これら３つの化合物を使用して下記のインビトロおよびインビボアッセイを行った。

実施例２
混合リンパ球反応の阻害

同定した３つの特異的なＳＭＩＬＳを先ず、Ｔ細胞の同種応答をインビトロで評価する一般的なアッセイである、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を阻害するそれらの能力について試験した。Ｃ３ＨおよびＣＤ−１マウス由来のリンパ節リンパ球単細胞懸濁液（各株から、５×１０^５細胞）を、前記供試化合物の存在下または非存在下に２００μｌの培養培地中で７２時間培養した。図１に示すように、同種刺激に応答したＴ細胞増殖は、前記化合物によって用量依存的に阻害された。３０μＭで、阻害の率は１μＭのシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）と同等であった。化合物は、ＬｅｗｉｓおよびＷｉｓｔｅｒラット由来のリンパ球を用いたＭＬＲを、同等に良好に阻害した。

実施例３
細胞毒性試験

試験した化合物のうち、Ｊｕｒｋａｔ細胞増殖アッセイにおいて何らかの細胞毒性を示したものはなかった。化合物７２および２４１には、細胞増殖に対する効果がなかったが、８７には、わずかな細胞分裂停止効果があったと考えられる。これに対し、培養液に１μＭのＣｓＡを添加すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞は完全に死滅した（図２）。さらに、ＭＬＲアッセイでは、化合物を与えた細胞の生存度は、対照の培養液のものと同様であった。これらの結果は、選択した化合物には、インビトロで細胞毒性作用がないことを示唆している。

実施例４
膝窩リンパ節局所同種応答の阻害

これらの化合物がＴ細胞活性化をインビボで妨害する能力を試験するために、膝窩リンパ節（ＰＬＮ）アッセイを行った。ＰＬＮアッセイにより、マウスの足蹠に注射した同種脾細胞に対して惹起された局所同種応答の数量化が可能になる。２種の濃度（１ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇ体重）の３種のリード化合物を、第０、１、２、３、および４日に腹腔内注射した。ＰＬＮは、第７日に収集し、重量を求めた。

供試化合物はすべて、用量依存的にＰＬＮの同種応答を阻害した（図３）。陽性対照として、ＣｓＡ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を用いた。１ｍｇ／ｋｇの用量では、供試化合物もＣｓＡと同様、陰性対照のレベルまでＰＬＮを阻害した（陰性対照と統計的有意差なし）。３ｍｇ／ｋｇ体重では、ＣｓＡは致死的であった。これに対し、供試化合物を与えた動物は化合物に充分に耐容性を示すようであり、運動／活動低下、下痢、体重減少および毛皮の粗化などの副作用を全く示さなかった。

実施例５
ラットにおけるＭｔｂ誘発性ＲＡのＳＭＩＬＳによる阻害

主にＴ細胞によって媒介される疾患経過の性質、ヒトＲＡに酷似した、ＬｅｗｉｓラットにおけるＡＡの充分に確立された実験モデル、Ｂｈｓｐ６５内の詳細に明らかにされた病原性エピトープ、詳細に特徴付けられた病原性エピトープ特異的Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）サブセット、および抗Ｂｈｓｐ６５抗体のＡＡ保護特質で、ＳＭＩＬＳの作用機構の検証および解析の独特な機会が提供される。

Ｍｔｂ誘発性ＡＡに対するＳＭＩＬＳの効果を評価するために、Ｌｅｗｉｓラットを用いたパイロット実験を行った。ここで記載する最初の実験は、化合物２４１を用いて行った。３種の処置の投薬計画、すなわち、予防：（Ｍｔｂ注射前、第−３、−２、−１、０日にＳＭＩＬＳを注射）；治療−１：ＡＡ誘発時（Ｍｔｂ注射後、第０、１、２、３、４日にＳＭＩＬＳを注射）；および治療−２：臨床症状出現時（Ｍｔｂ注射後、第１０、１１、１２、１３日にＳＭＩＬＳを注射）の投薬計画にて実験を行い、ＳＭＩＬＳ（３ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内注射）の有効性を試験した。図４Ａに示すように、予防の投薬計画では、関節腫脹の発症が遅延し、関節腫脹の重症度が低減した。ＳＭＩＬＳは、治療−１および２の両処置の投薬計画でも有効であり、すべてのラットで関節腫脹を有意に低減した（図４、ＢおよびＣ）。

関節腫脹の目視スコアリングに加えて、疾病のピーク時に集めた４本の足からの関節の組織学的検査を行った。図５ＡおよびＢに示すように、滑膜肥厚、軟骨の浸食、パンヌス形成による骨の破壊、および関節空間への炎症性細胞の浸潤が、未処置ＡＡラットすべての関節で観察されたが、炎症性細胞は関節腔に存在せず、またいくつかの関節における滑膜のみでの限局的肥厚がＳＭＩＬＳ処置ラットで観察された（図５ＣおよびＤ）。

これらの結果は、Ｍｔｂ誘発性ＡＡでのＳＭＩＬＳの治療上の有効性を明確に示し、またヒトにおける関節リウマチの治療可能性を示唆している。

実施例６
生体臓器に対するＳＭＩＬＳの効果

前記の実験を終了する際に、３ｍｇ／ｋｇ体重のＳＭＩＬＳで処置したラットから、臓器（肝臓、腎臓、脾臓、リンパ節および心臓）も採取した。臓器を固定して埋設し、パラフィン切片を調製してヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。対照とＳＭＩＬＳ処置ＡＡラットとの間で細胞充実性および組織構造に差は観察されなかった（データは示さず）。これらの臓器は、ＳＭＩＬＳを注射した後、異なる日にＡＡ症状のピーク時に（予防、治療−１および治療２の処置の投薬計画で、それぞれ１６、１２および３日）ラットから単離したので、追加実験を行って、これらの臓器に対するＳＭＩＬＳ効果を、マウスで５回連続の腹腔内注射直後（３および３０ｍｇ／ｋｇ体重）、および溶媒対照（ＰＢＳ中の０．０１％ＤＭＳＯ）について調べた。

ラットでの場合のように、マウスはＳＭＩＬＳ処置に充分な耐容性を示し、処置を被った動物の目に見える徴候（すなわち、病的状態、体重減少、下痢、毛皮の粗化等）は、全く観察されなかった。組織学的検査のために、前記の生体臓器を取り出した。溶媒対照と、３ｍｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ体重のいずれかの用量でのＳＭＩＬＳ処置マウスとの間で、細胞充実性および組織構造に有意差は観察されなかった（データは示さず）。

ＣＤ３ζ鎖ＩＴＡＭペプチドとのＬｃｋ ＳＨ２ドメイン会合の阻害に対する特異性を示す、３種のＳＭＩＬＳ化合物が同定されている。これらのＳＭＩＬＳは、インビトロでＭＬＲを、そしてインビボで膝窩リンパ節アッセイを妨害し、インビトロおよびインビボの双方で、検出可能な毒性を何ら有さないと考えられた。最後に、ＲＡに対する動物モデルである、ラットにおけるＡＡにて、ＳＭＩＬＳは治療有効性を示した。これらの結果は確証的に、ＳＭＩＬＳがインビトロおよびインビボの双方でＴ細胞活性化を阻害し、また臨床症状の発症後でもＲＡを阻止することを示唆している。

本発明を詳細に、かつその特定の実施形態を挙げて記載しているが、その趣旨および範囲を逸脱することなく種々の変更および修飾をそれに施すのが可能なことは当業者に明らかなはずであり、このような変更および修飾は、特許請求の範囲内で実施してもよい。本願明細書における特許および出版物はすべて、個々の出版物の各々が明確にかつ個々に引用してその全体を援用すべきと示されていたような場合と同程度に、これらを引用して援用する。

Claims (15)

1. 以下の化合物７２、８７、および２４１
   
   
   及び
   
   からなる群より選択される化合物の使用であって、免疫応答を調節するための自己免疫疾患の治療薬の製造のための使用。
2. 前記免疫応答が抑制される、請求項１記載の使用。
3. 前記化合物が、患者の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１記載の使用。
4. 自己免疫疾患の治療のための医薬組成物であって、
   以下の化合物７２、８７、および２４１
   
   
   及び
   
   からなる群より選択される化合物を含み、Ｌｃｋキナーゼの活性を調節する、医薬組成物。
5. 前記調節がＩＴＡＭへの結合の阻害を含む、請求項４記載の医薬組成物。
6. 前記調節がキナーゼ活性を阻害することを含む、請求項４記載の医薬組成物。
7. 前記化合物が、患者の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの量である、請求項４記載の医薬組成物。
8. 以下の化合物７２、８７、および２４１
   
   
   及び
   
   からなる群より選択される化合物を含む、自己免疫疾患治療剤。
9. 前記自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項８記載の自己免疫疾患治療剤。
10. 前記自己免疫疾患が、糸球体腎炎、橋本甲状腺炎、多発硬化症、Ｔ細胞白血病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、１型糖尿病、クローン病、グレーブス病、およびセリアック病からなる群より選択される、請求項８記載の自己免疫疾患治療剤。
11. 前記化合物が、患者の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項８記載の自己免疫疾患治療剤。
12. 前記化合物が、患者におけるＴ細胞の活性化を阻害する、請求項８記載の自己免疫疾患治療剤。
13. 前記Ｔ細胞が患者の外で接触させられる、請求項１２記載の自己免疫疾患治療剤。
14. 前記化合物が、関節の腫脹を抑制する、請求項８に記載の自己免疫疾患治療剤。
15. 前記自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項８に記載の自己免疫疾患治療剤。