KR20150042709A

KR20150042709A - 메트포민 및 스타틴의 복합제를 이용한 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150042709A
Application number: KR20140134451A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 박성환; 박민정; 전주연; 이성희; 변재경; 정정희; 이정아; 곽승기; 이주하; 주지현; 양철우; 나현식; 이은정
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2014-10-06
Publication date: 2015-04-21
Also published as: KR101627045B1

Abstract

본 발명은 메트포민 및 스타틴의 복합제를 이용한 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 포함하는 복합제인 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있고, 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 활성을 감소시킬 수 있으며, 파골세포의 분화를 억제하고 관절파괴를 억제하는 효과를 가지며 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell)의 생성 억제 효과가 뛰어나 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 하는 복합제는 자가면역질환의 치료제로서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

메트포민 및 스타틴의 복합제를 이용한 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating autoimmune disease comprising metformin and statin}

본 발명은 메트포민 및 스타틴의 복합제를 이용한 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다. 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용으로 인해 비경제적이고 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성, 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 시급한 실정이다.

한국공개특허 제2011-0052990호

본 발명은 보다 효과적인 자가면역질환 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 메트포민 및 스타틴을 병용 처리할 경우, 자가면역질환의 치료 효과가 매우 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 메트포민(Metformin) 및 스타틴(statin)을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 스타틴 및 메트포민을 1:30 ~ 1:70의 몰비로 포함하는 면역질환 치료용 복합제제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에는 스타틴 및 메트포민을 1:30 ~ 1:70의 몰비로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제시키고, 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 활성을 감소시켜 자가면역 질환의 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고 관절파괴를 억제하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell)의 생성을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 IL-17, IFN-r, IL-6 및 TNF-α일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 메트포민(Metformin) 및 스타틴(statin)을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공한다.

나아가 본 발명은 스타틴 및 메트포민을 1:30 ~ 1:70의 몰비로 포함하는 면역질환 치료용 복합제제를 제공한다.

도 1은 Th17 세포 분화 조건 하에서 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 세포내에서 IL-17과 IFN-r의 생성정도를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 TCR 자극 조건 하에서 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 세포내에서 IL-17, IL-6 및 IFN-r의 생성정도를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 TCR 자극 조건 하에서 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 세포내에서 TNF-α 생성정도를 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 관절염 유발 마우스 모델을 대상으로 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 관절염 지수 분석 및 혈청 내 IgG,IgG2a 의 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 메트포민 및 로수바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 비만관절염 치료 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 관절염 유발 마우스 모델을 대상으로 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 마우스의 혈액을 분리하고 혈액세포 CD4+T 세포를 분리한 후, 상기 세포내에서 IFN-r와 IL-17의 발현정도를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 LPS를 처리하여 B 세포를 활성화 시킨 후, 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 다음, plasma B 세포수를 측정한 결과와 배양액에서의 IgG,IgG1,IgG3의 항체분비 정도를 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 LPS를 처리하여 B 세포를 활성화 시킨 후, 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 다음, 배양액에서의 IgG2a의 항체분비 정도를 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 RANKL 처리에 따른 파골세포 분화 조건에서 메트포민 및 로슈바스타틴을 단독 및 복합 처리한 후, 파골세포 마커인 TRAP, MMP9, β3 intergrin을 PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 인간 대식세포주인 THP-1 세포에 PMA(phorbol 12'-myristate 13'-acetate)를 처리하여 세포를 활성화 시킨 후, 메트포민과 로슈바스타틴의 단독 처리에 따른 거품 세포 생성 억제 정도를 Oil Red O 용액 염색방법을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 인간 대식세포주인 THP-1 세포에 PMA(phorbol 12'-myristate 13'-acetate)를 처리하여 세포를 활성화 시킨 후, 메트포민과 로슈바스타틴의 병용 처리에 따른 거품 세포 생성 억제 정도를 Oil Red O 용액 염색방법을 수행하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 효과적인 자가면역질환의 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 메트포민과 스타틴 계열의 약물을 복합처리하는 경우, 매우 효과적으로 자가면역질환을 치료할 수 있음을 규명한 점에 특징이 있다.

따라서 본 발명은 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 조성물에 함유된 복합제의 성분 중, 메트포민은 당뇨병 치료효과가 있다고 알려진 화합물로서 한국공개특허 제2009-0005513호에 메트포민 말론산염에 항당뇨활성이 있다는 것이 개시되어 있으나 메트포민을 자가면역질환의 예방 및 치료에 사용한다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다.

또한 본 발명의 복합제의 성분 중 다른 유효성분인 스타틴(statin) 계열의 약물은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증과 같은 이상지질혈증 또는 심혈관계 질환 치료제로 사용되고 있으나, 본 발명과 같이 자가면역질환의 예방 및 치료에 사용한다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다.

본 발명에서 사용할 수 있는 스타틴 계열의 약물은 실라스타틴 (cilastatin), 나이스타틴 (nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴 (somatostatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 심바스타틴 (simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴 (cervastatin), 울리나스타틴 (ulinastatin) 및 로슈바스타틴(rosuvastatin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있고, 바람직하게는 로슈바스타틴을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물에 함유된 메트포민 대 스타틴의 혼합은 1:3~1:10의 농도비로 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에서 규명한 메트포민과 스타틴의 복합제가 자가면역질환 치료에 효과적임을 실험을 통해 입증하였는데, 본 발명의 일실시에에 따르면, 이들 복합제는 이들 성분을 단독으로 사용한 경우에 비해 염증성 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제시켰고, 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 활성을 감소시키는 활성도 우수한 것으로 나타났다.

또한, 메트포민과 스타틴의 복합제는 이들 단독 처리군에 비해 파골세포 분화를 효과적으로 억제하고 관절파괴를 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 규명하였고, 나아가 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell)의 생성도 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 상기 복합제가 억제할 수 있는 염증성 사이토카인은 이에 제한되지는 않으나, IL-17, IFN-r 및 IL-6일 수 있다.

또한, 본 발명의 복합제가 치료할 수 있는 상기 자가면역질환은 이에 제한되지는 않으나, 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이 및 소동맥 질환일 수 있다.

상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 자가면역질환의 치료또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 자가면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 자가면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 자가면역질환을 경감시킴.

(4) 자가면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 자가면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 메트포민 및 스타틴 화합물 또는 이들의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 메트포민 및 스타틴 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 각각 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 자가면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공할 수 있다.

나아가 본 발명은 인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 메트포민 및 스타틴을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법을 제공할 수 있다.

앞에서도 기술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 면역질환의 치료방법은 메트포민 및 스타틴을 함유하는 복합제제를 투여하는 방법 또는 이들 성분을 모두 병용 투여하는 방법을 통해 수행할 수 있는데, 즉, 메트포민 및 스타틴의 2가지 성분이 하나의 캡슐에 포함된 단일 조성물(single composition)의 형태로 사용될 수 있고 또는 각 성분이 개별적으로 포장된 개별적인 조성물(separate composition)을 함께 투여하는 형태로 사용될 수 있다.

그리고 상기 조성물이 개별적인 조성물인 경우에는, 상기 조성물을 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여할 수 있다.

또한, 적절한 투여 경로는, 예를 들어, 경구, 비강, 투과점막, 또는 장 투여 격막내, 직접 심실내, 복강내, 또는 안내 주사뿐만 아니라, 근육내, 피하, 정맥, 골수 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있다.

이하 본원을 하기 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본원은 어떤 이유로든 이로 제한되지 않는다.

< 실시예 1>

메트포민 및 스타틴 병용처리에 따른 Th1 / Th17 조절효과

본 발명자들은 메트포민과 스타틴의 병용처리가 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는지 확인하기 위해 이들 성분을 병용 처리하였을 때, 세포내에서 Th1/Th17 조절효과를 분석하였다. 즉, 이를 위해 Th17 조건(CD3 1ug/ml, CD28 1ug/ml, anti-IL-4 2ug/ml, anti-IFN-r 2ug/ml, TGF-beta 2ng/ml, IL-6 20ng/ml)하에서 C57BL/6 정상마우스로부터 분리한 CD4+T 세포를 3일간 배양한 후, 세포들을 대상으로 메트포민 1mM, 로슈바스타틴(Rosuvastatin) 20uM을 각각 단독 및 복합처리한 후, 세포내에서 IL-17과 IFN-r양을 FACS로 분석하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 아무것도 자극하지 않은 Th17 분화 조건에서는 염증성 사이토카인인 IFN-r와 IL-17의 양이 증가되어 있는 것으로 나타난 반면, 메트포민이나 스타틴을 단독처리한 군의 경우, 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 IFN-r와 IL-17의 양이 감소된 것으로 나타났으나, 메트포민이나 스타틴을 병용처리한 군의 경우, 이들을 단독 처리한 군에 비해 더 우수한 효율로 IFN-r와 IL-17의 양이 감소되어 있는 것으로 나타났으며, 특히, 병용처리 했을때는 IFN-r는 메트포민 또는 스타틴 단독 처리군에 비해 4-20배 이상 더 의미있게 생성이 억제되었고, IL-17은 단독 대비 I 2.5-6배 더 감소되는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 TCR 자극 조건(CD3 1ug/ml, CD28 1ug/ml) 또는 LPS(100ng/ml)조건 하에서 메트포민 1mM, 로슈바스타틴(Rosuvastatin) 20uM로 단독 또는 복합 처리를 하여 3일간 배양한 후 배양액을 얻어 IFN-r와 IL-17, IL-6양을 ELISA로 측정하여 이들 사이토카인의 발현양을 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 메트포민이나 스타틴을 단독처리한 군에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 처리한 조건에서 의미있게 염증성 사이토카인인 IFN-r(2-3배)와 IL-17(3-10배), IL-6(1.5배)의 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

메트포민 및 스타틴 병용처리에 따른 TNF -α조절효과

본 발명자들은 메트포민과 스타틴의 병용처리가 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있는지 확인하기 위해 이들 성분을 병용 처리하였을 때, 세포내에서 염증성사이토카인 중 하나인 TNF-α의 조절효과를 분석하였다.

즉, 이를 위해 TCR 자극 조건(CD3 1ug/ml, CD28 1ug/ml) 또는 LPS(100ng/ml)조건 하에서 메트포민 1mM, 로슈바스타틴(Rosuvastatin) 20uM로 단독 또는 복합 처리를 하여 3일간 배양한 후 배양액을 얻어 TNF-α양을 ELISA로 측정하여 이들 사이토카인의 발현양을 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 메트포민이나 스타틴을 단독처리한 군에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 처리한 조건에서 의미있게 TNF-α양이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

동물모델을 대상으로 메트포민 및 스타틴 병용처리에 따른 자가면역질환 치료효과 분석

메트포민과 스타틴의 병용처리가 실제로 자가면역질환이 유발된 마우스 동물에게 투여할 경우, 효과적인 치료 효능이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 관절염이 유발된 마우스를 제조하기 위해 CIA로 유도하여 관절염 발병 마우스를 제조한 후, 1주일에 3회 복강 내 메트포민(50mg/kg)과 스타틴(10mg/kg)을 투여한 후, 2주일이 지난 시점에 관절염 지수를 측정하였다.

분석 결과, 관절염이 유발된 마우스를 대상으로 메트포민과 스타틴을 단독 투여한 군에 비해 이들을 병용투여한 군의 경우, 관절염 유도가 거의 억제되어 관절염이 발병되지 않는 것으로 나타났다(도 4 참조). 또한, 2주간 약물을 투여 후 마우스로부터 채혈하고 혈청을 수득한 후, IgG,IgG2a의 양을 ELISA로 측정하였다.

측정결과, 메트포민이나 스타틴 단독처리에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 투여한 관절염 유발 마우스에서는 IgG 및IgG2a의 수준이 유의하게 감소되는 것으로 나타났다(도 4 참조).

나아가 관절염 유도 마우스에 각각의 약물투여를 2주간 진행한 후 마우스의 혈액을 분리하여 혈액세포 CD4+T cell에서 IFN-r와 IL-17의 양을 FACS로 분석한 결과, 이전의 in vitro 결과와 마찬가지로 메트포민이나 스타틴 단독처리에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 처리한 조건에서 의미있게 염증성 사이토카이 레벨이 감소되는 것으로 나타났다(도 6 참조).

< 실시예 4>

동물모델을 대상으로 메트포민 및 스타틴 병용처리에 따른 난치성 비만관절염 치료효과 분석

비만은 당뇨병이나 동맥경화 등 각종 성인병의 원인이 될 뿐만 아니라 관절염에도 악영향을 미친다는 것은 이미 널리 알려져 있는 사실이다. 본 발명자들은 메트포민 및 로수바스타틴 병용처리가 비만에서 유발된 난치성 비만관절염에도 효과가 있는지를 확인하기 위하여 5주령의 DBA/1J마우스에 60Kcal 고지방 식이를 유도하여 비만을 유도하였다.

또한, 비만 유도와 함께 관절염을 유도하기 위하여, 제 2형 콜라겐 (Cll) 을 2㎎/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액 (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N Nacl)으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스 (tuberculosis) 를 함유하는 complete Freund's adjuvant (CFA, Chondrex)와 동량으로 섞은 후 상기 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕ (즉 100㎕/100㎍) 으로 주사하였다(1차 주사). 이로부터 2주 후 동일한 CII를 동량의 incomplete Freud's adjuvant(IFA, Chondrex) 와 섞은 후 100㎕ (즉 100㎕/100㎍) 를 꼬리에 주사하였다 (2차 주사).

2차 주사를 통한 2차 면역 후 매일 3주동안 메트포민(20mg/kg)과 스타틴(10mg/kg)을 각각 주입하였고, 각 군은 5마리씩을 대상으로 진행하였고 관절염 평가를 진행하였다. 첫 번째 접종을 시작점으로 하여 3주 후부터 실험의 내용을 알고 있지 않은 관찰자 세 명이 일주일에 두 번씩 관절 염증의 위중도를 평가하여 61일까지 관찰하였다. 이 때 관절염 평가는 마리당 2차 접종 때 CII/CFA 를 투여한 다리를 제외한 나머지 세 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 3 으로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 동물 모델에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.

-평가 기준-

0점: 부종이나 종창이 없다.

1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적

2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적

3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적

4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우

각각의 처리군을 대상으로 난치성 비만관절염에 대한 관절염 평가점수를 확인한 결과, 아무것도 처리되지 않은 대조군에서는 관절염지수가 높게 나타났으나, 메트포민 또는 로수바스타틴을 각각 처리한 군에서는 관절염 평가 지수가 낮아졌으며, 본 발명의 메트포민과 로수바스타틴을 병용 처리한 군에서는 메트포민 또는 로수바스타틴을 각각 처리한 군보다 더 월등한 비만관절염 치료 효과가 있음을 알 수 있었다(도 5 참조).

< 실시예 5>

메트포민과 스타틴 병용처리에 의한 B 세포 활성 및 자가항체 생산 조절 효과

메트포민과 스타틴의 병용투여가 B 세포의 항체 분비에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, LPS를 처리하여 B 세포를 활성화 시키는 조건을 만든 후, 상기 활성화된 B 세포에 메트포민과 스타틴을 단독처리 또는 병용처리 하여 3일간 배양한 다음, plasma B cell(B220-CD138+ cell)의 활성을 FACS로 관찰하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 메트포민이나 스타틴 단독처리에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 처리한 조건에서 의미있게 plasma B cell(%)가 감소되는 것으로 나타났고, 또한 배양조건에서 얻은 배양액에서 항체 양을 ELISA로 측정한 결과에서도 IgG,IgG1,IgG3,IgG2a의 항체분비가 메트포민이나 스타틴 단독처리에 비해 메트포민과 스타틴을 같이 처리한 조건에서 현저히 감소되는 것으로 나타났다(도 7 및 8 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 메트포민과 스타틴을 병용처리 할 경우, B 세포에 의한 자가항체 생산을 억제하여 면역반응을 효과적으로 조절할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

메트포민과 스타틴 병용처리에 의한 파골세포 분화 및 관절파괴 제어 효과분석

메트포민과 로슈바스타틴의 복합처리에 따른 파골세포 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해 RAW 264.7 세포주를 대상으로 파골세포로 분화 시킬 수 있는 RANKL을 50ng을 처리하고 이와 동시에 메트포민 1uM과 로슈바스타틴 5uM을 각각 단독 및 메트포민 0.2uM과 로슈바스타틴 1uM을 병용 처리하여 Osterocast의 마커를 확인 하였다. 구체적으로는, 24-웰에 48시간 배양시킨 세포로부터 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성한 후 파골세포 마커인 TRAP, MMP9, β3 intergrin을 PCR로 조사하였다. RT-PCR은 LightCycler FastStart DNAmaster SYBR green I (Takara) 형광 염료로 ABI PCR 장치를 이용하여 수행하였고, 이를 위한 반응 화합물은 1㎍으로 합성한 cDNA를 1/3로 희석한 것 1㎕, LightCycler FastStart DNAmaster SYBR green I (Takara) 10㎕, Taqman probe(Applied biossystems) 1㎕를 혼합한 후 증류수로 최종 부피를 20㎕로 만들어 사용하였다. 반응 조건은 TRAP은 57℃ 30초, MMP9 64℃ 30초, β3 intergrin 60℃ 30초를 40회 반응시켰다. Cycle thereshold(Ct) 값을 분석 하여 TRAP, MMP9, β3 intergrin의 mRNA의 발현양을 house keeping gene인 β-actin의 mRNA 발현양과의 상대정량으로 나타내었다. 상기 RT-PCR에서 사용한 프라이머는 MMP9 (Forward : 5-CTG TCC AGA CCA AGG GTA CAG CCT-3/ Reverse : 5-GAG GTA TAG TGG GAC ACA TAG TGG-3), TRAP(Forward : 5-TCC TGG CTC AAA AAG CAG TT-3/ Reverse : 5-ACA TAG CCC ACA CCG TTC TC-3), beta3 intergrin(Forward :5-CCA CAC GAG GCG TGA ACT-3/ Reverse : 5-CTT CAG GTT ACA TCG GGG TGA-3) 을 사용하였다.

분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 파골세포 분화인자들의 생성을 메트포민과 로슈바스타틴을 단독 처리한 군에 비해 병용처리한 군에서 보다 효과적으로 억제하고 있는 것으로 나타났다.

< 실시예 7>

메트포민 및 스타틴 단독처리에 의한 Foam cell 제어 효과 조사

나아가 본 발명자들은 인간 대식세포주인 THP-1 세포에 160nM 농도의 PMA(phorbol 12'-myristate 13'-acetate)를 처리하여 세포를 활성 시킨 후 PAF(platelet-activating factor)를 10ug/ml 처리함과 동시에 메트포민(0.2. 1μM)과 로슈바스타틴(1,5,20μM)을 각각 또는 병용 처리한 후, 동맥경화를 유발시키는 것으로 알려진 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell) 생성 정도를 Oil Red O 용액 (Sigma aldrich - 시그마 알드리치) 염색을 통해 측정하였다.

그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 메트포민과 로슈바스타틴을 처리함에 따라 거품세포의 생성은 억제되는 것으로 나타났다.

< 실시예 8>

메트포민 및 스타틴 병용처리에 의한 Foam cell 제어 효과 조사

인간 대식세포주인 THP-1 세포에 160nM 농도의 PMA(phorbol 12'-myristate 13'-acetate)를 처리하여 세포를 활성 시킨 후 PAF (platelet-activating factor)를 10ug/ml 처리와 동시에 메트포민(1, 5, 20μM)과 로슈바스타틴(5,20μM)과 병용투여(Metformin 1μM + Rosuvastatin 5μM), (Metformin 1μM + Rosuvastatin 20μM)로 처리하여 동맥경화를 유발하는 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell) 생성 정도를 Oil Red O 용액 (Sigma aldrich - 시그마 알드리치) 염색을 통해 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 메트포민이나 로슈바스타틴 단독 처리 군에 비해 병용 처리 했을 때 거품 세포의 생성이 2~2.5배 정도로 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

메트포민 및 스타틴을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물에는 스타틴 및 메트포민을 1:30 ~ 1:70의 몰비로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 염증성 사이토카인의 생성을 억제시키고, 항체 생산 B 세포의 생성을 저해 또는 활성을 감소시켜 자가면역 질환의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 파골세포의 분화를 억제하고 관절파괴를 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 동맥경화반(Artherosclerotic plaque) 전구세포를 형성하는 거품세포(Foam cell)의 생성을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서,
상기 염증성 사이토카인은 IL-17, IFN-r, IL-6 및 TNF-α인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 스타틴은 실라스타틴 (cilastatin), 나이스타틴 (nystatin), 로바스타틴(lovastatin), 소마토스타틴 (somatostatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 심바스타틴 (simvastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴 (atorvastatin), 세르바스타틴 (cervastatin), 울리나스타틴 (ulinastatin) 및 로슈바스타틴(rosuvastatin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 자가면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
인간을 제외한 면역질환이 유발된 개체에 메트포민(Metformin) 및 스타틴(statin)을 병용 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 치료방법.
스타틴 및 메트포민을 1:30 ~ 1:70의 몰비로 포함하는 면역질환 치료용 복합제제.