JP5442925B2 - ポリ塩化ビフェニル類の分析方法 - Google Patents
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Description
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法を提供するものである。
方法により濃縮されてもよい。また、通常は、該疎水性試料からPCB類をジメチルスルホキシド、アセトンなどの極性有機溶媒に転溶させる。極性有機溶媒に転溶させる方法としては、例えば疎水性試料を溶媒留去し、残渣に上記の極性有機溶媒に加えて溶解させる方法が挙げられるが、疎水性試料に残存する他の共存物質のうち、極性有機溶媒に不溶のものをPCB類と分離し、除去できることから、疎水性試料に対して不溶性の極性有機溶媒を加え、疎水性溶媒層と極性有機溶媒層との2層に層分離させたのち、分液により親水性溶媒層を得る方法が好ましく用いられ、分液前に溶媒留去などの方法により疎水性試料を濃縮してから分液してもよい。
極性有機溶媒としては、上記したと同様のものが挙げられる。親油性吸着剤とは、少なくとも表面が油性の物質と親和性のある材料で構成された固形の吸着剤であって、通常は粒状のものが用いられる。かかる親油性吸着剤としては、例えばカラムクロマトグラフ用充填剤、固相抽出用充填剤、逆相液体クロマトグラフィーのカラム充填剤として広く用いられているものが挙げられ、例えばジーエルサイエンス社からカラムクロマト充填剤「C18」、米国ウォーターズ(Waters)社から「SEP−PAK−C18」、「SEP−PAK−tC18」、「SEP−PAK−Vac tC18」などの商品名で市販されているものを用いることができる。
(1)前処理工程で得られるPCB類に、該PCB類に対する1次抗体を過剰量加えて混合することにより、当該1次抗体を抗原抗体反応により該PCB類と結合させたのち、
(2)該1次抗体との抗原抗体反応能力を有し、蛍光物質で標識化された標識化2次抗体を過剰量加えて混合し、PCB類の類似化合物であるハプテン抗原が担体に固定化された抗原固定化担体と接触させることにより、上記でPCB類と結合しなかった過剰分の1次抗体を抗原固定化担体のハプテン抗原に結合させると共に、この結合した1次抗体に標識化2次抗体を結合させ、
次いで、
(3)このようにして1次抗体を介して抗原固定化担体に担持され標識化2次抗体の担持量を求めればよい。
細孔容積は、MICROMETRICS社製社製「自動ポロシメーター オートポアIII 9420」を用いて細孔半径0.001μm〜100μmの範囲の細孔容積として求めた。
〔模擬絶縁油の調製〕
PCB類を含まない市販の絶縁油に、添加後のPCB類含有量が0.1ppmとなるように市販の標準PCB類を加えて、模擬絶縁油1を調製した。
BET比表面積252m2/g、細孔容積2.58cm 3 /gのシリカゲルを250℃で一晩乾燥させた。このシリカゲル1質量部に、遊離SO3濃度25質量%の発煙硫酸〔和光純薬工業社製、試薬一級〕2質量部を天秤ではかりとって加え、密栓容器中で20分間以上振とうして、内容物を十分に混合して、発煙硫酸含浸シリカゲルを調製した。この発煙硫酸含浸シリカゲルは、互いに固着していない流動性の粉末状であった。この発煙硫酸含浸シリカゲル2gを、一端を溶封した内径5mm、長さ146mmのガラス管に投入し、開口部を溶封して発煙硫酸含浸シリカゲル密封アンプルを作製した。
容量10mLのポリプロピレン製ディスポシリンジをカラムとして用い、その底部にガラス繊維ろ紙〔ADVANTEC社製、GA−100〕を敷き、シリカゲル〔和光純薬工業社製、「ワコーゲルDX」〕0.5gを充填した。
上記で回収した流出液の全量に、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕0.25mLを加えたのち、ロータリーエバポレーターにより、減圧下、30℃の温浴中で、n−ヘキサンが留出しなくなるまで濃縮し、次いで残渣を5分間遠心分離することによりn−ヘキサン層(上層)とジメチルスルホキシド層(下層)との2層に層分離させ、分液操作によりジメチルスルホキシド層(下層)を取り出して、ジメチルスルホキシド試料を得た。
塩化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、残留農薬試験用〕8.0g、
リン酸水素二ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕2.9g、
塩化カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕2.0g、
リン酸二水素カリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕0.2g、
アジ化ナトリウム〔和光純薬工業(株)製、試薬特級〕0.1gおよび
牛血清アルブミン〔SIGMA社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕1.0gをイオン交換水1Lに溶解して緩衝水溶液を調製した。
PRMI1640培地〔Invitrogen社製〕78質量部にHAT混合物〔「HATサプリメント」Invitorogen社製、ヒポキサンチン5ミリモル/L、アミノプテリン20マイクロモル/L、チミジン0.8ミリモル/Lを含む〕2質量部および牛胎児血清20質量部を加えて調製したHAT培地にて、37℃、CO25容量%と空気95容量%との混合雰囲気下に、細胞の密度が106Cells/mLに達するまで、抗体産生細胞〔独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託、微生物寄託番号:FERM P-20744〕を培養した。
上記で調製した緩衝水溶液に、上記で得た1次抗体含有PBS緩衝液を、1次抗体の濃度が1.0nmol/Lとなるように加え、溶解させて1次抗体水溶液を調製した。
上記で得たジメチルスルホキシド試料40μLに、ジメチルスルホキシド〔和光純薬工業社製、生化学用試薬〕40μLを加え、次いで上記で調製した緩衝水溶液3.12mLを加え、、さらに1次抗体水溶液0.4mLを加えて、測定試料を調製した。
2次抗体〔「Cy5標識モノクローナル ヤギ抗マウス抗体」生化学工業製〕を2.0nmol/Lとなるように上記緩衝水溶液に溶解して、2次抗体水溶液を調製した。
式(1)
で示されるジクロロベンゼン誘導体(ハプテン抗原)1gをジメチルスルホキシド1mLと混合し、さらにメタノール100mLを加えて混合した。得られた溶液から16mLを採取し、濃度1質量%の牛血清アルブミン水溶液〔SIGMA社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕10mLを加え、生理食塩水〔滅菌した食塩水であり、100mL中にNaCl約0.9gを含む〕74mLを加えて一晩、振盪した。振盪後の溶液1mLを採取し、ビーズ状の担体〔アガロースビーズ、NHS-activatedSepharoseTM 4 fast flow、Amercham Bosciences社製、粒子径約0.1mm〕を容積で5mL加え、さらに生理食塩水10mLを加えて2時間振盪した。その後、濃度10質量%の牛血清アルブミン水溶液〔SIGMA社製、Albumin Bovine Serum Fraction V〕1mLを加えて、さらに2時間振盪したのち、担体を取り出し、生理食塩水で洗浄して、ジクロロベンゼン誘導体を担体に固定化した抗原固定化担体を得た。
透明管からなり、出口側に篩が設けられた測定セル(内容積1.8μm3)を備えた蛍光強度測定装置〔米国Sapidyne社製、「KinExA3000」〕を用意した。
上記で得た測定試料1.0mLを流速0.25mL/分で、測定セルに送液して通過させた。
実施例1で用いたと同じ市販の絶縁油に、添加後のPCB類含有量が、それぞれ0.5ppm〔模擬絶縁油2〕、1ppm〔模擬絶縁油3〕、2ppm〔模擬絶縁油4〕、10ppm〔模擬絶縁油5〕となるように市販の標準PCB類を加えた以外は実施例1と同様に操作して模擬絶縁油2〜模擬絶縁油5を調製した。また、実施例1で用いたと同じ市販の絶縁油をそのまま模擬絶縁油0とした。
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模擬絶縁油 PCB類濃度 信号強度 CV SD
番号 (ppm) (V) (%)
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
1 0.1 1.74 1.77 1.79 1.4 0.025
2 0.5 1.06 0.94 1.10 8.1 0.083
3 1 0.74 0.75 0.78 2.8 0.021
4 2 0.42 0.41 0.43 2.4 0.010
5 10 0.19 0.19 0.20 3.0 0.006
───────────────────────────────────────
0 0 2.07 2.06 2.06 0.3 0.006
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Claims (5)
- ポリ塩化ビフェニル類を含む疎水性試料中のポリ塩化ビフェニル類を定量するに際し、
(1)前処理工程として、前記疎水性試料を、以下の条件を満足する発煙硫酸含浸シリカゲルと接触時間3分〜10分で接触させる工程、および
(2)当該前処理を付した後のポリ塩化ビフェニル類と抗体との抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ工程
を含むことを特徴とする前記ポリ塩化ビフェニル類の分析方法。
発煙硫酸含浸シリカゲル:BET比表面積250m2/g〜450m2/g、細孔容積1.4cm3/g〜2.6cm3/gのシリカゲルに遊離SO3濃度5質量%〜40質量%の発煙硫酸が含浸された発煙硫酸含浸シリカゲル - 発煙硫酸含浸量が、前記シリカゲルに対して0.5質量倍〜5質量倍である請求項1に記載の分析方法。
- カラムに充填された発煙硫酸含浸シリカゲルと接触させる請求項1または請求項2に記載の分析方法。
- 前記発煙硫酸含浸シリカゲルが収容されてなる携帯密封容器を開封し、該発煙硫酸含浸シリカゲルをカラムに充填する請求項3に記載の分析方法。
- 携帯密封容器がアンプルである請求項4に記載の分析方法。
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