JP5422841B2 - 生体分子とセラミックスとの生体適合性を判定する判定方法及び判定装置 - Google Patents

Description

本発明は、セラミックスの生体適合性を判定する装置及び方法に関し、さらに詳しくは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）素子を使用してセラミックスの生体適合性を判定する装置及び方法に関する。

近年、わが国を含む先進国では高齢化社会を迎え、人工骨や人工関節の需要は益々高まっている。こうした製品は人体（人体中の生体分子）と適合可能な生体適合性の材料であることが要求される。生体適合性材料として有望な材料にセラミックスがある。

生体と材料との生体適合性を評価する手法として、生体と材料との巨視的な適合性を評価する手法と、微視的な適合性を評価する手法と、がある。

生体（骨）へのチタン製インプラント材を例にとると、「巨視的な適合性」とはチタンと骨との相互作用を意味するが、実際にはチタン表面には酸化チタンが存在しその周辺には生体液が介在している（すなわち、チタン−酸化チタン−生体液−骨）ため、この酸化チタンと生体液（タンパク質）との微視的な相互作用を把握する必要があり、これを「微視的な適合性」と呼ぶ。

前者の巨視的な適合性を評価する手法として、国際標準化機構（ＩＳＯ，International Organization for Standardization）のＩＳＯ１０９９３が知られており、また、米国材料試験協会（ＡＳＴＭ，American Society of Testing and Materials）のＡＳＴＭ７５０が知られている。しかしながら、これらの方法は数日〜数ヶ月の長期間にわたる試験方法であるとともに、臨床前段階の試験方法である。

後者の微視的な試験方法は、生体適合性材料を検討する初期段階における試験方法であり、前者の試験方法に比べて未だ確立された方法は存在していないが、例えば、非特許文献１及び２に開示されているように、セラミックス材料に吸着したバクテリアを一定期間培養しコロニーを形成させて、そのコロニー数をカウントする方法や、セラミックス材料に吸着したタンパク質を緩衝液中に脱離させた後、遠心分離によって吸着したタンパク質量を分光分析又は熱分析によって定量する方法を使用していた。

しかしながら、このような従来の微視的な生体適合性を評価する方法では、材料に吸着したバクテリア等のコロニー数を目視でカウントする等の手作業が必要となり、評価者への肉体的負担が掛かる点や評価の精度が必ずしも高くない点といった問題があった。

一方、ＤＮＡ、タンパク質、糖鎖などを検出するバイオセンサーとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，Surface Plasmon Resonance）を用いる技術が知られている。

この技術は、通常、ガラス上に貴金属（金あるいは銀）を蒸着し、このガラスの当該貴金属を蒸着した面と反対側の面とを、屈折率調節オイルを介して光学プリズムと密着させた構造からなり、レーザー光あるいは白色光を、プリズムを通してガラス上の金属に照射し、その反射光の強度を検出するものである。

入射光はガラスに対して全反射となる条件で入射され、このとき、光が入射された側と逆側の金属表面側に染み出すエバネッセント波によって、ある入射角でＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）が発現する。ＳＰＲが起こると、エバネッセント波は表面プラズモン波によって吸収されるので、その入射角付近では反射光の強度が著しく減少する。

ＳＰＲが発現する入射角や、ＳＰＲが発現している入射角付近における反射光強度は、金属の表面上の付着物の厚さ、屈折率又は誘電率等によって変化する。このことを利用し、金属の表面上に被検出試料と結合あるいは吸着する物質（生体認識基、抗体、結合物質とも呼ばれる）を修飾し、被検出試料が生体認識基付近に結合あるいは吸着した際に生じる入射角や反射率の変化を検出し、被検出試料の結合量（膜厚あるいは質量）を得るのが、ＳＰＲセンサーである（例えば、特許文献１参照）。

本発明者等は従来のＳＰＲセンサーを改善することにより、つまりセンサーの金属（金，Ａｕ）表面上にさらにセラミックス材料を積層させた構造やこのセラミックス材料の上にさらに金属（Ａｕ）を積層させてこのセラミックス材料を中間層とした構造とすることにより、ＳＰＲセンサーの高感度化が期待できることを報告している（非特許文献３〜５）。

しかしながら、これらのＳＰＲセンサーは、上述の通り、一方の生体分子（生体認識基）９を金属３の表面上に修飾させ、他方の生体分子８を被検出試料としてセンサー近傍のセル内に注入して金属３の表面上に接触させて、生体分子８，９間の相互作用を検出するものである（図１２（ａ）参照）が、セラミックス材料４と生体分子８との相互作用を検出するもの（図１２（ｂ）参照）ではなかった。
特開２００２−３５７５４２号公報（第７−９頁，第９図） ヘレン・ラーセリックドッター（Helen Larsericsdotter）、外２名、「ジャーナル・オブ・コロイド・アンド・インターフェイス・サイエンス（Journal of Colloid and Interface Science）」、（U.S.A）、アカデミック・プレス（Academic Press）、2001年5月1日、第237巻、第1号、p.99 シー・リウ（C. Liu）、外４名、「コロイズ・アンド・サーフェイシーズ・ビー：バイオインターフェイシーズ（Colloids and Surfaces B: Biointerfaces）」、（U.S A）、エルゼビア社（Elsevier B. V.）、2008年2月15日、第61巻、第2号、p.184 岸本、外２名、「ＳＰＲセンサーの高感度化を目指した大気開放型ＣＶＤ法による薄膜中間層の効果」、第６８回応用物理学会学術講演会講演予稿集、第２分冊、平成１９年９月４日、p.661 小西、外３名、「表面プラズモン共鳴を利用したアモルファスＳｉＯ２薄膜の評価」、第６８回応用物理学会学術講演会講演予稿集、第２分冊、平成１９年９月４日、p.662 長尾、外３名、「表面プラズモン共鳴を用いたＴｉＯ２薄膜の構造解析」、第６８回応用物理学会学術講演会講演予稿集、第２分冊、平成１９年９月４日、p.662

従って、本発明はこれらの従来技術の問題点を解消し、生体分子とセラミックス材料との微視的な生体適合性を高精度に評価できる評価方法及び評価装置を安価に提供することを目的とする。

本発明者等は鋭意検討した結果、金属表面上にセラミックス材料をさらに積層させたＳＰＲ素子を作成し、この素子上に被検出試料の生体分子が注入されるセルを配置した構成のＳＰＲ生体適合性評価装置にＳＰＲ測定やＸＲＲ測定を含んだ光学特性解析を行うことによって、上記課題が解決されることを発見し、本発明を完成させたものである。

すなわち、本発明では次の構成を採用する。
１．光学プリズムに金属薄膜を積層し、ＳＰＲ素子を作成するＳＰＲ素子作成ステップと、
前記金属薄膜の表面上に２ｎｍ〜２５ｎｍの膜厚を有したセラミックス薄膜を積層する最表層積層ステップと、
前記セラミックス薄膜の表面上に生体分子注入セルを配置するセル配置ステップと、
前記生体分子注入セル内に緩衝液のみを注入してＳＰＲ角を測定する第１のＳＰＲ角測定ステップと、
前記生体分子注入セル内に生体分子溶液を溶かした緩衝液を注入してＳＰＲ角を測定する第２のＳＰＲ角測定ステップと、
前記生体分子注入セル内に再び緩衝液のみを注入してＳＰＲ角を測定する第３のＳＰＲ角測定ステップと、
上記ステップにより測定されたＳＰＲ角を比較する比較ステップと、
を含み、かつ、
前記セラミックス薄膜は、水素化アモルファス炭素薄膜又はアモルファス炭素薄膜であることを特徴とする生体分子とセラミックスとの生体適合性を判定する判定方法。
２．前記ＳＰＲ素子作成ステップにはスパッタリング法が使用され、かつ、
前記最表層積層ステップには大気開放型ＣＶＤ法が使用されることを特徴とする前記１に記載の判定方法。
３．前記最表層積層ステップの後に、前記セラミックス薄膜の表面を改質するか否かを選択するステップをさらに含み、かつ、
前記ステップで前記表面を改質する選択した場合には疎水化処理又は親水化処理を施すことを特徴とする前記１又は２に記載の判定方法。
４．前記ＳＰＲ素子作成ステップと最表層積層ステップとを用いて、前記セラミックス薄膜の膜厚が異なったＳＰＲ素子を複数作製するステップと、
前記作製されたＳＰＲ素子に対してＸ線反射率測定とＳＰＲ角測定とを行う解析ステップと、
前記解析ステップから得られた測定結果から生体適合性判定に最適な膜厚のセラミックス薄膜を特定する特定ステップと、
を含んだ予備光学特性解析ステップをさらに含み、かつ、
前記予備光学特性解析ステップを行った後に、最適な膜厚のセラミックス薄膜を有するＳＰＲ素子を用いて、前記判定方法の各ステップを実行することを特徴とする前記１〜３のいずれかに記載の判定方法。
５．前記ＳＰＲ素子作成ステップと最表層積層ステップとを用いて、前記セラミックス薄膜の密度が異なったＳＰＲ素子を複数作製するステップと、
前記作製されたＳＰＲ素子に対してＸ線反射率測定とＳＰＲ角測定とを行う解析ステップと、
前記解析ステップから得られた測定結果から生体適合性判定に最適な密度のセラミックス薄膜を特定する特定ステップと、
を含んだ予備光学特性解析ステップをさらに含み、かつ、
前記予備光学特性解析ステップを行った後に、最適な密度のセラミックス薄膜を有するＳＰＲ素子を用いて、前記判定方法の各ステップを実行することを特徴とする前記１〜３のいずれかに記載の判定方法。
６．前記１〜５のいずれかに記載の生体分子とセラミックスとの生体適合性を判定する判定方法に用いられる判定装置であって、
光学プリズムに中間層の金属薄膜と最表層のセラミックス薄膜とが積層されたクレッシュマン配置のＳＰＲ素子と、
前記セラミックス薄膜の表面を覆うように配置された生体分子注入セルと、を備え、
前記生体分子注入セルには、生体分子を注入する注入口と排出口とが設けられ、かつ、
前記セラミックス薄膜は、水素化アモルファス炭素薄膜又はアモルファス炭素薄膜であることを特徴とする判定装置。

本発明の生体適合性判定方法及びこれに用いられる生体適合性判定装置は次のような顕著な効果を奏するものである。
（１）セラミックス薄膜と生体分子との適合性判定にＳＰＲ角測定を使用しているため、評価者の評価作業負担（目視確認等）を排除するとともに、評価精度を高めることが可能となる。
（２）セラミックス薄膜の積層ステップに大気開放型ＣＶＤ法を使用することで、真空引き等に要する複雑な装置構成、コスト及び時間を掛けることなく薄膜を合成することができる。つまり、簡素な設備により、セラミックス薄膜の種類や膜厚等の試験条件が異なる多くの供試材料を用いて迅速に生体適合性評価が行うことができる。
（３）セラミックス薄膜の表面を改質するか（例えば、親水性表面又は疎水性表面のいずれか）を選択することにより、同一セラミックス材料における表面状態の違いが生体適合性に影響するかを検討でき、評価対象の生体分子に対して好適な表面を特定することができる。
（４）セラミックス薄膜と生体分子との生体適合性を判定する前（すなわち、セラミックス薄膜を備えたＳＰＲ素子と生体分子とを接触させた状態のＳＰＲ角測定を行う前）に、セラミックス薄膜を備えたＳＰＲ素子のみに対して、予備的に光学特性解析を行うことにより、生体適合性判定方法に最適なセラミックス薄膜の構造パラメータ（膜厚、密度等）を特定することができる。

以下、本発明を図面に示す実施の形態に基づき説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。

図１は本発明の生体適合性判定方法に用いられる判定装置の概略を示す図、図２は本発明の生体適合性を判定する判定方法の主要なステップを示すフローチャート、図３は本発明の予備光学特性解析ステップを示すフローチャート、図４は本発明の実施例１（チタニア薄膜付きＳＰＲ素子）の素子自体のＳＰＲ角測定結果の一例を示した図、図５は本発明の実施例１の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図、図６は本発明の実施例１の生体適合性判定結果を示す図、図７は本発明の実施例２（シリカ薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図、図８は本発明の実施例２の生体適合性判定結果を示す図、図９は本発明の実施例３（アルミナ薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図、図１０は本発明の実施例３の生体適合性判定結果を示す図、図１１は本発明の実施例４（水素化アモルファス炭素薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図、図１２は従来のＳＰＲ素子と本発明のＳＰＲ素子の構成及び検出対象を示した図である。なお、各図において同一又は対応する部材には同一符号を用いる。

図１は本発明の生体適合性判定方法に用いられる判定装置１を示す。判定装置１は、光学プリズム２の一面に金属薄膜３及びセラミックス薄膜４が配置されたＳＰＲ素子５を備える。図１に示すようなＳＰＲ素子５の配置はクレッシュマン（Kretschmann）配置と呼ばれる。セラミックス薄膜４の表面上には、緩衝液７及び生体分子溶液８が注入される生体分子注入セル６が配置されており、このセル６にはこれらの液体を注入又は排出させるための注入口６ａ又は排出口６ｂを有する。この生体分子注入セル６が配置されたＳＰＲ素子５はゴニオメーター（図示せず）に装着される。ここで、ゴニオメーターは角度計、測角器などとも言い、入射光の角度を測定するのに使われる角度計である。励起光光源１０から発生される入射光１３は絞り１１及び偏光子１２によってｐ偏光の光波とする。これは表面プラズモンがｐ偏光の光波のみと結合するためである。

以上の操作によってｐ偏光となった入射光１３は光学プリズム２に入射する。本発明では、被分析対象であるＳＰＲ素子５の薄膜３，４及び溶液７，８に全反射した光を検出する全反射減衰法（ＡＴＲ，Attenuated Total Reflectance）を採用しているため、入射光１３は薄膜３，４の表面で全反射する角度範囲で、入射角度を変化させながら入射されるが、ある特定の角度で表面プラズモン波を励起してそのときの反射光１４の強度を低下させる。ここで、生体分子８とセラミックス薄膜４との相互作用（例えば、セラミックス薄膜４への生体分子８の吸着）が起こり、被分析対象の屈折率、誘電率等が変化した場合には、表面プラズモン波が励起される前記入射角度（共鳴角）が変化するため、生体分子８がセラミックス薄膜４の表面上に吸着したかどうかを確認できる。

光学プリズム２から出射した反射光１４は光検出器１５に入射され、前記入射角度の変化に対応する反射光１４の反射光強度が測定される。

生体分子８とは、多数の単量体が脱水縮合によって結合した分子（高分子も含む）であり、例えば、糖質、タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等がある。本発明の評価においては、「微視的な適合性」を評価するためタンパク質が好ましい。

図２は、本発明のセラミックス薄膜と生体分子との生体適合性を判定する判定方法の主要なステップ（以下、メインフロー１００と呼ぶ。）を示すフローチャートである。

本発明の前記判定方法を実行するには、まず、セラミックス薄膜４の種類を設定する（ステップ１０１）。ここで、セラミックス薄膜４の材料には、シリカ（ＳｉＯ_２）、チタニア（ＴｉＯ_２）、アルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）、イットリア（Ｙ_２Ｏ_３）、及びジルコニア（ＺｒＯ_２）等の酸化物系セラミックスを用いるのが好ましいが、必ずしもこれに限定されず、炭化物系セラミックスや窒化物系セラミックスを用いてもよいし、非晶質（アモルファス）のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）を用いてもよい。なお、ＤＬＣには水素化アモルファス炭素薄膜又はアモルファス炭素薄膜が含まれ、本発明の判定方法にはどちらの材料を使用してもよい。

次のステップ１０２では、光学プリズム２上に金属薄膜３を積層する。ここで、金属薄膜３には、金（Ａｕ）あるいは銀（Ａｇ）が用いられる。金属薄膜３の積層方法としては、公知の真空蒸着法やスパッタリング法等がある。

次のステップ１０３では、金属薄膜３の表面上にセラミックス薄膜４を積層する。これにより金属薄膜３は光学プリズム２とセラミックス薄膜４とに挟まれた中間層となり、セラミックス薄膜４はＳＰＲ素子５の最も外側の表面層（最表層）となる。セラミックス薄膜４の積層方法には、金属薄膜３の積層技術と同様に公知の技術を使用できるが、大気開放型有機金属化学気相析出法（以下、大気開放型ＣＶＤ法と呼ぶ。）を用いることが好ましい。大気開放型ＣＶＤ法を使用すれば、簡素な設備で済み、真空引き等を行う必要が無いため、コストや時間を掛けずに数ｎｍ（ナノメートルサイズ）のセラミックス薄膜４を形成することができるからである。

次のステップ１０４では、セラミックス薄膜４の表面を改質するか（ここでは親水性表面又は疎水性表面のいずれか）否かを選択する。表面の改質を選択した場合には、ステップ１０４ａに進み、疎水化処理又は親水化処理を施す。ここで、疏水化処理には、例えばシランカップリング反応による処理が挙げられる。

ステップ１０５では、セラミックス薄膜４の表面上に生体分子注入セル６を配置する。以上の操作により、本発明の判定方法に用いられる装置構成の準備がほぼ整ったことになり、次のステップ１０６から実際の測定が開始される。

ステップ１０６では、生体分子注入セル６内に緩衝液７のみを注入した状態でＳＰＲ角の測定を行う。その後のステップ１０７では、生体分子注入セル６内に生体分子８を溶かした緩衝液７を注入した状態でＳＰＲ角の測定を行う。更にステップ１０８では、生体分子注入セル６内に再び緩衝液７のみを注入した状態でＳＰＲ角の測定を行う。この各ステップ１０６，１０７，１０８で測定されたＳＰＲ角を、光学分析ソフトウェアを使用して互いに比較することにより、ステップ１０１で選択したセラミックス薄膜４での生体適合性の判定が可能となる。

ステップ１０８を終了すると、ステップ１０９において、生体適合性を評価すべき他のセラミックス薄膜４が存在するか否かを選択する。存在する場合にはステップ１０１に戻り、上述のステップ１０１〜１０８を繰り返す。無い場合は、ステップ１１０に進み、各々のセラミックス薄膜４毎に得られたデータ（ＳＰＲ角）を基に、生体分子８と各セラミックス薄膜４との生体適合性を評価し、生体分子８に対して所望の生体適合作用（吸着または剥離）を有するセラミックス材料を特定することが可能となる。

以上が本発明の生体適合性判定方法のメインフロー１００の操作であるが、次に、このメインフロー１００に先んじて実行可能な予備光学特性解析ステップ２００を説明する。

図３は、予備光学特性解析ステップ２００の各ステップを示すフローチャートである。まず、ステップ２０１にて評価すべきセラミックス薄膜４の種類を設定する。次のステップ２０２では、メインフロー１００のステップ１０２，１０３と同様な操作（すなわち、光学プリズム２に金属薄膜３、セラミックス薄膜４の順番で薄膜層を形成すること）を繰り返し、同一材質のセラミックス薄膜４の膜厚や密度の異なるＳＰＲ素子５を複数用意する。

そして、その後のステップ２０３では、これらのＳＰＲ素子５のみ（生体分子８等を含んだセル６をＳＰＲ素子５に結合させない状態）に対して、ＳＰＲ角を測定するＳＰＲ測定と、Ｘ線反射率（ＸＲＲ，X-ray Reflectivity）を測定するＸＲＲ測定と、を行う。

ここで、ＸＲＲ測定について説明する。Ｘ線に対する物質の屈折率は１よりもわずかに小さいため、基板上の薄膜・多層膜に対して非常に浅い角度で入射すると全反射を起こす。入射Ｘ線強度に対する全反射Ｘ線強度（反射率）の薄膜表面への入射角度依存性を測定することにより、薄膜の構造パラメータを非破壊で評価することが可能となる。つまり、ＸＲＲ測定は、各薄膜層の密度、膜厚、ラフネス等を非破壊で評価できる手法である。

次のステップ２０４に進むと、ステップ２０３で求められたＳＰＲ測定及びＸＲＲ測定の予備光学特性解析結果から、選択したセラミックス薄膜４における構造パラメータ（膜厚、密度等）の影響を検討する。これにより、生体適合性判定（メインフロー１００の判定評価）を行う上で最適な膜厚や密度のセラミックス薄膜を特定することが可能となる。

次に、本発明をさらに具体的な実施例に基づき説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。

実施例１（チタニア薄膜とリゾチームとの生体適合性判定）
（装置構成）
実施例１のセラミックス薄膜４として酸化物系セラミックスであるチタニア（ＴｉＯ_２）を使用した。本発明の装置構成として、光学プリズム２には屈折率１．５１のガラスプリズム（ＢＫ７）を用い、金属薄膜３には金（Ａｕ）薄膜を用いた。金薄膜３及びチタニア薄膜４は、それぞれスパッタリング法及び大気開放型ＣＶＤ法により光学プリズム２上に形成した。光源１０には可視光半導体レーザー光源を用い、励起されたレーザーの波長は６３５ナノメートル（ｎｍ）とした。また、光検出器１５に光パワー・メータを用いてプリズム２から反射されたレーザー強度を測定した。また、ＳＰＲ測定角度範囲はＡｕ膜３でＳＰＲ現象が観測できる範囲を考慮し、４０°〜８９°に設定した。

次に生体分子注入セル６の構成方法について例示する。緩衝液７や生体分子溶液８をＳＰＲ素子５の表面上に流すために、光学プリズム２の寸法に合わせてアルミニウム製の板を４０ｍｍ×８０mmの寸法に切り出して、この板の中心付近にドリルでφ4mmの孔を2か所開ける。細管接続専用のコネクターで、この板の前記２つの孔にシリコンチューブを接続することで、注入口及び排出口６ａ，６ｂを形成する。次に、25 mm×25 mm、厚さ1 mmの寸法を有するシリコンゴムの中心に穴を開けた後に、このシリコンゴムをＳＰＲ素子５の上に置き、さらにこのシリコンゴムの上に加工したアルミニウム板を配置して両端をC字形クランプで固定する。各溶液７，８の注入・排出方法については、チューブ状の注入口６ａからマイクロシリンジで溶液７，８をチタニア薄膜４上へ流し込み、排出口６ｂから排出されるようにした。

（チタニア薄膜付きＳＰＲ素子への予備光学特性解析）
図４に、本発明の実施例１（チタニア薄膜４付きＳＰＲ素子５）のＳＰＲ素子自体のＳＰＲ角測定結果を示す。図４中、公知のＳＰＲ素子５（Ａｕ／ＢＫ７）のＳＰＲ角を破線で示し、本発明のチタニア薄膜４付きＳＰＲ素子５（ＴｉＯ_２／Ａｕ／ＢＫ７）のＳＰＲ角を実線で示している。チタニア薄膜４の膜厚は、ＸＲＲ測定により１５．０ｎｍであった。図４より、チタニア薄膜４の存在によりＳＰＲ角がシフトしていることがわかる。詳しくは、金薄膜のみのＳＰＲ素子のＳＰＲ角は４５．０７°であり、一方、チタニア薄膜４付のＳＰＲ素子のＳＰＲ角は約５１．１９°であり、このときのＳＰＲ角シフト量は６．１２°である。

次に、膜厚の異なるチタニア薄膜４を形成したＳＰＲ素子５を用いて予備光学特性解析（ＸＲＲ測定、ＳＰＲ測定）を行った結果を図５に示す。

図５中、●印は実験値を示し、実線はチタニア薄膜４の屈折率を２．３０と仮定した場合のフレネル反射式を応用し計算された理論線である。この予備解析結果より、金属薄膜３上に合成したチタニア薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角の角度シフトは、チタニア薄膜４が厚くなるにつれてシフト量が増大することがわかる。また、図５から実験値と理論線とは良く一致している。このことは、屈折率１．００である空気に触れているチタニア薄膜４が、理論通りＳＰＲ現象を観測できる範囲に影響を及ぼすことを示している。加えて、前記理論計算に従えば、空気に替わりチタニア薄膜４に触れる緩衝液７の屈折率（おおよそ１．３３〜１．４０）もまた、ＳＰＲ現象を観測できる範囲に影響を及ぼすことになる。そこで、本発明におけるＳＰＲ角の角度測定範囲と、チタニア薄膜４が影響を及ぼす前記ＳＰＲ現象を観測できる範囲との関係から、緩衝液７中のチタニア薄膜４を用いて生体分子８との生体適合性の判定を行うに際して最適な膜厚範囲を決定することができ、そのチタニア薄膜４の膜厚の範囲は、２〜５ｎｍで、好ましくは３〜４ｎｍとなる。

（生体適合性判定評価）
以上の解析により、チタニア薄膜４付きＳＰＲ素子５自体のＳＰＲ特性がわかったので、本発明の生体分子注入セル６を、膜厚３ｎｍのチタニア薄膜４の表面上に配置し、チタニア薄膜４と生体分子８とを接触させることで両者間の生体適合性の判定を行った。緩衝液７としてはリン酸緩衝液（ＰＢ，Phosphate buffer solution、水素イオン指数ｐＨ＝７）を用い、生体分子８にはタンパク質の一種であるリゾチームを使用した。ここで、リゾチームとは細菌細胞壁を加水分解する酵素で唾液や卵白などに存在しており、分子量１４３００、等電点１１、分子の大きさは４．５×３×３ｎｍ ^３である。

上記生体適合性判定方法のステップ１０６に際しては、体積モル濃度１．８ｍＭ（Ｍ×１０^−３、ここで、Ｍ（モーラー）＝ｍｏｌ／Ｌ（モル毎リットル））のリン酸緩衝液（ＰＢ）７をマイクロシリンジでチタニア薄膜４上に１ｍＬ（ミリリットル）だけ流し込み、その時のＳＰＲ角を測定した。

その後のステップ１０７において、本実施例では、リゾチーム濃度を７μＭ（Ｍ×１０^−６）、２１μＭ、３５μＭ、及び７０μＭにして（つまり注入するリゾチーム８を高濃度にして）、その都度、ＳＰＲ測定を行った。

なお、前記設定した濃度のうち、ある濃度条件でのＳＰＲ測定を終了して濃度を変化させる際には、一旦、使用されたリゾチーム溶液８を除去し、新たなリン酸緩衝液７だけを注入して、ＳＰＲ測定を行った（ステップ１０８）。これは、ＳＰＲ素子５上にリン酸緩衝液７だけが注入された時のＳＰＲ角から、リゾチーム溶液８が注入されている間にＳＰＲ角が増加した場合、その後、リゾチーム溶液８を除去した時にＳＰＲ角が減少し元のＳＰＲ角に戻れば、リゾチーム８がチタニア薄膜４に吸着していないと判断でき、一方、リゾチーム８溶液を除去してもＳＰＲ角が変化しなければ、リゾチームの分子８がチタニア薄膜４に吸着したと判断できる。

図６は実施例１の生体適合性判定結果を示し、横軸に経過時間を縦軸に測定されたＳＰＲ角を示す。図６より、まずリン酸緩衝液７のみをセル６に注入した時のＳＰＲ角（図６中、最も左側の○印）は７４．４６°であり、リゾチーム８の濃度が７μＭの溶液を更に流し込んだ時のＳＰＲ角は７４．９０°（図６中、最も左側の●印）であった。その後、リゾチーム８の濃度を増加させても、ＳＰＲ角は僅かに増加する傾向はみられるが約７５°の値に留まった。

また、各々の濃度条件終了後にリゾチーム溶液８を除去してリン酸緩衝液７のみにしてもＳＰＲ角（図６中、最も左側の点を除いた○印）は、リゾチーム溶液８を注入した状態のＳＰＲ角からほとんど変化せず、元に戻らなかった。これにより、チタニア薄膜４の表面上にリゾチーム８の分子が吸着（結合）していることが確認できた。

実施例２（シリカ薄膜とリゾチームとの生体適合性判定）
（装置構成）
実施例２の装置構成は、ＳＰＲ素子５上のセラミックス薄膜４にシリカ（ＳｉＯ_２）を採用した以外の基本的構成は、実施例１の装置構成と同様であり、説明を省略する。

（シリカ薄膜付きＳＰＲ素子への予備光学特性解析）
実施例１の場合と同様に、シリカ薄膜４付きＳＰＲ素子５の素子自体に対して予備光学特性解析を行った。図７はシリカ薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角のシフト量を示す。

図７中、●印は実験値を示し、実線はシリカ薄膜４の屈折率を１．４８と仮定した場合の理論線である。この予備解析結果より、金属薄膜３上に合成したシリカ薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角の角度シフト量は、シリカ薄膜４が厚くなるにつれてシフト量が増大することがわかる。また、実験値と理論線とは良く一致している。加えて、実施例１と同様に、本発明におけるＳＰＲ角の角度測定範囲と、シリカ薄膜４が影響を及ぼす前記ＳＰＲ現象を観測できる範囲（フレネル反射式を応用した計算により算出）との関係から、緩衝液７中のシリカ薄膜４を用いて生体分子８との生体適合性の判定を行うに際して最適なシリカ薄膜４の膜厚範囲を決定することができ、そのシリカ薄膜４の膜厚の範囲は、２〜２５ｎｍで、好ましくは１０〜２０ｎｍとなる。

（生体適合性判定評価）
以上の解析により、シリカ薄膜４付きＳＰＲ素子５自体のＳＰＲ特性がわかったので、本発明の生体分子注入セル６を膜厚１５ｎｍのシリカ薄膜４の表面上に配置し、シリカ薄膜４と生体分子８とを接触させることで両者間の生体適合性の判定を行った。

なお、使用した緩衝液７及び生体分子溶液８は実施例１と同様に、それぞれリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ＝７）及びリゾチームである。実施例２では、注入するリゾチーム８の濃度は一定とし、１００μＭ（０．１ｍＭ）に設定した。

また、実施例２の生体適合性判定においては、親水性表面及び疎水性表面のシリカ薄膜４を用意して、上述の本発明のステップ１０４ａの場合も実行した。本発明の疎水化処理にはシランカップリング反応による表面処理を施した。

図８は実施例２の生体適合性判定結果を示し、横軸に経過時間を縦軸に測定されたＳＰＲ角を示す。ここで、判定試験開始及び終了時の○印又は◇印は、シリカ薄膜４の親水性表面又は疎水性表面上にリン酸緩衝液７のみが存在した状態（つまり生体分子たるリゾチーム８を注入していない状態）のＳＰＲ角であり、開始後から終了までの●印又は◆印は、シリカ薄膜４の親水性表面又は疎水性表面上にリン酸緩衝液７及びリゾチーム溶液８が注入され、前記表面に接触した状態でのＳＰＲ角を示す。

図８より、シリカ薄膜４とリゾチーム溶液８が接触している間、ＳＰＲ角は、疎水性表面では約１．５°、表面にＯＨ基を有する親水性表面では約０．１°シフトしており、疎水性表面のシリカ薄膜４を用いた方がＳＰＲ角のシフト量が増加していることがわかる。ＳＰＲ角のシフト量は、シリカ薄膜４の表面におけるリゾチーム８の分子数に比例することから、疎水性表面のシリカ薄膜４上には、より多くのリゾチーム８が存在するといえる。言い換えれば、リゾチーム８とシリカ薄膜４との生体適合性には、疎水性相互作用が大きく寄与することが推定された。

実施例３（アルミナ薄膜とヒト血清アルブミンとの生体適合性判定）
（装置構成）
実施例３の装置構成は、ＳＰＲ素子５上のセラミックス薄膜４にアルミナ（アモルファスＡｌ_２Ｏ_３）を採用した以外の基本的構成は、前記実施例１及び２の装置構成と同様であり、説明を省略する。

（アルミナ薄膜付きＳＰＲ素子への予備光学特性解析）
前記実施例の場合と同様に、アルミナ薄膜４付きＳＰＲ素子５の素子自体に対して予備光学特性解析を行った。図９はアルミナ薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角のシフト量を示す。

図９中、●印は実験値を示し、実線はアルミナ薄膜４の屈折率を１．５８と仮定した場合の理論線である。この予備解析結果より、金属薄膜３上に合成したアルミナ薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角の角度シフトは、アルミナ薄膜４が厚くなるにつれてシフト量が増大することがわかる。また、実験値と理論線とは良く一致している。加えて、本発明におけるＳＰＲ角の角度測定範囲と、アルミナ薄膜４が影響を及ぼす前記ＳＰＲ現象を観測できる範囲（フレネル反射式を応用した計算により算出）との関係から、緩衝液７中のアルミナ薄膜４を用いて生体分子８との生体適合性の判定を行うに際して最適なアルミナ薄膜４の膜厚範囲を決定することができ、そのアルミナ薄膜４の膜厚の範囲は、２〜１０ｎｍで、好ましくは３〜５ｎｍとなる。

（生体適合性判定評価）
以上の解析により、アルミナ薄膜４付きＳＰＲ素子５自体のＳＰＲ特性がわかったので、本発明の生体分子注入セル６を膜厚２ｎｍのアルミナ薄膜４の表面上に配置し、アルミナ薄膜４と生体分子８とを接触させることで両者間の生体適合性の判定を行った。

なお、実施例３に使用した緩衝液７は実施例１と同様にリン酸緩衝液（ＰＢ、ｐＨ＝７）であるが、生体分子８にはタンパク質の一種であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，human serum albumin）を使用した。ここで、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とは、血漿タンパク質中に最も多い成分であり（約６０％を占める）、分子量６９０００、等電点４．９、分子の大きさは１８．７×１８．７×８．１ｎｍ^３である。また、ＨＳＡは肝臓中で作られ、血漿膠質浸透圧の維持や輸送タンパク質として生体内物質などと結合し標的器官へ物質を輸送する機能を有するものである。

本実施例のステップ１０６に際しては、体積モル濃度５０ｍＭのリン酸緩衝液７をマイクロシリンジでアルミナ薄膜４上に１ｍＬだけ流し込み、その時のＳＰＲ角を測定した。

その後のステップ１０７において、本実施例では、濃度を５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１２５μＭ、及び１５０μＭにした（つまり注入するＨＳＡを高濃度にした）ＨＳＡ溶液８をリン酸緩衝液に加えて、その都度ＳＰＲ測定を行った。

なお、実施例１と同様に、ある濃度条件でのＳＰＲ測定を終了して濃度を変化させる際には、一旦、使用されたＨＳＡ溶液８を除去し、新たなリン酸緩衝液７だけを注入して、ＳＰＲ測定を行った（ステップ１０８）。

図１０は実施例３の生体適合性判定結果を示し、横軸に経過時間を縦軸に測定されたＳＰＲ角を示す。図１０より、まずリン酸緩衝液７のみをセル６に注入した時のＳＰＲ角（図１０中、最も左側の○印）は７４．９５°であり、ＨＳＡ溶液８の濃度が５μＭの溶液を流し込んだ時のＳＰＲ角は７４．９８°（図１０中、最も左側の●印）であった。その後、ＨＳＡ溶液８の濃度を増加させると、ＳＰＲ角は増加する傾向はみられ、１５０μＭの溶液を流し込んだ時のＳＰＲ角は７５．２８°（図１０中、最も右側の●印）であった。

また、各々の濃度条件終了後にＨＳＡ溶液８を除去してリン酸緩衝液７のみにするとＳＰＲ角（図１０中、最も左側の点を除いた○印）は顕著に減少して約７４．９６°となり、判定評価開始時のリン酸緩衝液７のみのＳＰＲ角（図１０中、最も左側の○印）とほぼ同じ値になった。これにより、アルミナ薄膜４の表面上にＨＳＡ溶液８の分子が吸着しなかったことが確認できた。

実施例４（酸化物系セラミックス以外のセラミックス薄膜の検討）
上述した具体的な実施例１〜３はいずれも酸化物系セラミックス薄膜４を使用した。本実施例では、酸化物系セラミックス薄膜４以外でも本発明の適用可能性を検討するため、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）の一種である水素化アモルファス炭素（ａ−Ｃ：H)薄膜を適用して予備的な光学解析特性評価を行った。

（装置構成）
実施例４の装置構成は、ＳＰＲ素子５上のセラミックス薄膜４に水素化アモルファス炭素を採用した以外の基本的構成は、前記実施例１〜３の装置構成と同様であり、説明を省略する。

なお、実施例４に供される水素化アモルファス炭素薄膜４は、Ａｕ薄膜３上に高周波マグネトロンスパッタリング（ＭＳ，magnetron sputtering）法と電子サイクロトロン共鳴プラズマ化学気相析出（ECR-ＣＶＤ，Electron Cyclotron Resonance−ＣＶＤ)法を使用することにより２種類作製した

（水素化アモルファス炭素薄膜付きＳＰＲ素子への予備光学特性解析）
前記実施例１〜３の場合と同様に、水素化アモルファス炭素薄膜４付きＳＰＲ素子５の素子自体に対して予備光学特性解析（ＸＲＲ測定及びＳＰＲ測定）を行った。ＸＲＲ測定より得られた水素化アモルファス炭素薄膜４の真密度は、ＭＳ法作製の膜で１．６ｇ／ｃｍ^３であり、ＥＣＲ−ＣＶＤ法作製の膜で１．４ｇ／ｃｍ^３であった。

図１１は水素化アモルファス炭素薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角のシフト量を示す。図１１中、●印はＭＳ法作製の膜に対する実験値を示し◆印はＥＣＲ−ＣＶＤ法作製の膜に対する実験値を示す。実線はＭＳ法作製の膜及びＥＣＲ−ＣＶＤ法作製の膜の屈折率を１．９３及び１．６５と仮定した場合の理論線である。この予備解析結果より、どちらの方法で作製されたアモルファス炭素薄膜４を用いても、薄膜４の膜厚変化に対するＳＰＲ角の角度シフトは、水素化アモルファス炭素薄膜４が厚くなるにつれてシフト量が高角度側に増大することがわかる。また、密度の高かったＭＳ法作製薄膜４の方が膜厚に対する変化量が増大している。従って、ＳＰＲ角シフト量は、薄膜４の膜厚と真密度の関数であり、水素化アモルファス炭素膜の真密度測定への利用や前記実施例１〜３で行った生体適合性判定評価への利用が可能であることが示唆された。

本発明は上記実施例に限定されることなく、特許請求の記載した発明の範囲内で種々の変更が可能であり、それらも本発明の範囲に含まれることはいうまでもない。例えば、本発明のセラミックス薄膜の材質を、用途に応じて、炭化物系や窒化物系のセラミックスに適宜変更できることは明らかである。

本発明の生体適合性判定方法に用いられる判定装置の概略を示す図である。 本発明の生体適合性を判定する判定方法の主要なステップを示すフローチャートである。 本発明の予備光学特性解析ステップを示すフローチャートである。 本発明の実施例１（チタニア薄膜付きＳＰＲ素子）の素子自体のＳＰＲ角測定結果の一例を示した図である。 本発明の実施例１の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図である。 本発明の実施例１の生体適合性判定結果を示す図である。 本発明の実施例２（シリカ薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図である。 本発明の実施例２の生体適合性判定結果を示す図である。 本発明の実施例３（アルミナ薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図である。 本発明の実施例３の生体適合性判定結果を示す図である。 本発明の実施例４（水素化アモルファス炭素薄膜付きＳＰＲ素子）の膜厚変化とＳＰＲ角シフト量との関係を示した図である。 従来のＳＰＲ素子と本発明のＳＰＲ素子の構成及び検出対象を示した図である。

１ 生体適合性判定装置
２ 光学プリズム
３ 金属薄膜
４ セラミックス薄膜
５ ＳＰＲ素子
６ 生体分子注入セル
６ａ 注入口
６ｂ 排出口
７ 緩衝液
８ 生体分子（溶液）
１０ 励起光光源
１１ 絞り
１２ 偏光子
１３ 入射光
１４ 反射光
１５ 光検出器
１００ 本発明の判定方法におけるメインフロー
１０１ 評価すべきセラミックス薄膜の種類を設定するステップ
１０２ 光学プリズムに金属薄膜を積層するステップ
１０３ 金属薄膜の表面上にセラミックス薄膜を積層するステップ
１０４ セラミックス薄膜の表面を改質するか否かを選択するステップ
１０５ セラミックス薄膜の表面上に生体分子注入セルを配置するステップ
１０６ 緩衝液のみを注入した状態でのＳＰＲ角測定を行うステップ
１０７ 緩衝液及び生体分子溶液を注入した状態でのＳＰＲ角測定を行うステップ
１０８ 再び緩衝液のみを注入した状態でのＳＰＲ角測定を行うステップ
１０９ 他の評価対象セラミックス薄膜の存在の有無を選択するステップ
１１０ 生体分子と各セラミックス薄膜との生体適合性を評価・検証するステップ
２００ 本発明の予備光学特性解析ステップ
２０１ 評価すべきセラミックス薄膜の種類を設定するステップ
２０２ 膜厚の異なるＳＰＲ素子を複数用意するステップ
２０３ ＳＰＲ素子自体にＸＲＲ測定及びＳＰＲ測定を行うステップ
２０４ 測定結果からセラミックス薄膜の構造パラメータ（膜厚、密度など）の影響を検討するステップ

Claims (6)

1. 光学プリズムに金属薄膜を積層し、ＳＰＲ素子を作成するＳＰＲ素子作成ステップと、
   前記金属薄膜の表面上に２ｎｍ〜２５ｎｍの膜厚を有したセラミックス薄膜を積層する最表層積層ステップと、
   前記セラミックス薄膜の表面上に生体分子注入セルを配置するセル配置ステップと、
   前記生体分子注入セル内に緩衝液のみを注入してＳＰＲ角を測定する第１のＳＰＲ角測定ステップと、
   前記生体分子注入セル内に生体分子溶液を溶かした緩衝液を注入してＳＰＲ角を測定する第２のＳＰＲ角測定ステップと、
   前記生体分子注入セル内に再び緩衝液のみを注入してＳＰＲ角を測定する第３のＳＰＲ角測定ステップと、
   上記ステップにより測定されたＳＰＲ角を比較する比較ステップと、
   を含み、かつ、
   前記セラミックス薄膜は、水素化アモルファス炭素薄膜又はアモルファス炭素薄膜であることを特徴とする生体分子とセラミックスとの生体適合性を判定する判定方法。
2. 前記ＳＰＲ素子作成ステップにはスパッタリング法が使用され、かつ、
   前記最表層積層ステップには大気開放型ＣＶＤ法が使用されることを特徴とする請求項１に記載の判定方法。
3. 前記最表層積層ステップの後に、前記セラミックス薄膜の表面を改質するか否かを選択するステップをさらに含み、かつ、
   前記ステップで前記表面を改質する選択をした場合には疎水化処理又は親水化処理を施すことを特徴とする請求項１又は２に記載の判定方法。
4. 前記ＳＰＲ素子作成ステップと最表層積層ステップとを用いて、前記セラミックス薄膜の膜厚が異なったＳＰＲ素子を複数作製するステップと、
   前記作製されたＳＰＲ素子に対してＸ線反射率測定とＳＰＲ角測定とを行う解析ステップと、
   前記解析ステップから得られた測定結果から生体適合性判定に最適な膜厚のセラミックス薄膜を特定する特定ステップと、
   を含んだ予備光学特性解析ステップをさらに含み、かつ、
   前記予備光学特性解析ステップを行った後に、最適な膜厚のセラミックス薄膜を有するＳＰＲ素子を用いて、前記判定方法の各ステップを実行することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
5. 前記ＳＰＲ素子作成ステップと最表層積層ステップとを用いて、前記セラミックス薄膜の密度が異なったＳＰＲ素子を複数作製するステップと、
   前記作製されたＳＰＲ素子に対してＸ線反射率測定とＳＰＲ角測定とを行う解析ステップと、
   前記解析ステップから得られた測定結果から生体適合性判定に最適な密度のセラミックス薄膜を特定する特定ステップと、
   を含んだ予備光学特性解析ステップをさらに含み、かつ、
   前記予備光学特性解析ステップを行った後に、最適な密度のセラミックス薄膜を有するＳＰＲ素子を用いて、前記判定方法の各ステップを実行することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の判定方法。
6. 前記請求項１〜５のいずれかに記載の生体分子とセラミックスとの生体適合性を判定する判定方法に用いられる判定装置であって、
   光学プリズムに中間層の金属薄膜と最表層のセラミックス薄膜とが積層されたクレッシュマン配置のＳＰＲ素子と、
   前記セラミックス薄膜の表面を覆うように配置された生体分子注入セルと、を備え、
   前記生体分子注入セルには、生体分子を注入する注入口と排出口とが設けられ、かつ、
   前記セラミックス薄膜は、水素化アモルファス炭素薄膜又はアモルファス炭素薄膜であることを特徴とする判定装置。

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