JP5409827B2 - 臍帯血由来のｔ調節性細胞を用いるｔ細胞の増殖の抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒト臍帯血から単離されるＴ制御性（Ｔ_ｒｅｇ）細胞を用いるＴ細胞の増殖の抑制方法に関する。

自然発生するＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ調節性細胞（Ｔ_ｒｅｇ）は、免疫応答の大部分のタイプを制限するかもしくは改変することができる（非特許文献１）。最初に、Ｔ_ｒｅｇ細胞は自己免疫の制御にとって重要であることが記述され（非特許文献２；非特許文献３）、そして実験的自己免疫疾患を防ぐことが養子免疫伝達で見出された。さらに最近では、Ｔ_ｒｅｇは同種免疫応答を抑制することが示されており、そして移植拒絶を防ぐことができる（非特許文献４；非特許文献５）。さらに、これらの細胞は抗腫瘍（非特許文献６；非特許文献７）および抗微生物免疫応答（非特許文献８）を抑制することができる。従って、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇは免疫調節の中心的制御要素であるように思われ、そしてそれらの生物学を理解することは、免疫応答を治療的に操作することを目指す取り組みにとって重要である。

Ｔ_ｒｅｇ細胞は、それらがリンパ節および脾臓ＣＤ４^＋Ｔ細胞集団の５〜１０％を構成するマウスにおいて最もよく特性化される。それらは病原体を含まないマウスにおいて中枢胸腺発生機序によって生成され、そしてまたはっきり定義されていない末梢生成もしくは増殖機序によっても生じる（非特許文献９；非特許文献１０）。これまで、Ｔ_ｒｅｇ細胞は新鮮単離でのＣＤ４^＋およびＣＤ２５^＋抗原の共発現により主にとして定義されている。ＣＤ２５ならびにマウスＴ_ｒｅｇの他のマーカー、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ様受容体）は全て通常のＴ細胞上の活性化抗原であり、従って、特異的ではない。転写リプレッサーとして働くと考えられる核タンパク質、ＦｏｘＰ３は、Ｔ_ｒｅｇ細胞にもっと特異的であると考えられるさらに新しいマーカーである（非特許文献１１）。活性化（Ｔ細胞受容体に基づく、抗原特異的もしくは抗ＣＤ３）後に、Ｔ_ｒｅｇ細胞はＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方の増殖を非特異的に抑制できることが示された。抑制の機序は不明であり、そしてインビトロにおいて、細胞−細胞接触を必要とするように思われる。抑制の機能的結果は、ＩＬ−２の生産障害である（非特許文献１２；非特許文献１３）。インビボにおいて、抑制機序はさらに論議を呼び、インビトロ抑制には必要とされない、免疫抑制性サイトカインへの依存性を示す研究もある（非特許文献１４）。

骨髄移植（ＢＭＴ）のマウスモデルにおける研究により、新鮮なもしくは培養増殖したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は疾患を遅らせるかもしくは防ぐことができることが示されている（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７）。抗ＣＤ３に加えてＩＬ−２で１０日間エクスビボでポリクローン的に増殖させたＴ_ｒｅｇは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ；非特許文献１５）を防ぐことにおいて有効であることができることが以前の研究により示されている。放射線照射した同種ＡＰＣに加えて外因性ＩＬ−２でのＴ_ｒｅｇ細胞のエクスビボ増殖もまた、ＧＶＨＤを抑制することに有効である（非特許文献１７）。いくつかのモデル系において、Ｔ_ｒｅｇ細胞はＧＶＨＤを防ぐことができ、そしてさらに移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を可能にする（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。さらに、自己免疫疾患のマウスモデルにおける研究により、培養増殖した抗原特異的（トランスジェニックＴＣＲ）ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は糖尿病を防ぐかもしくは処置さえできることが示されている（非特許文献２１）。その結果として、インビボ注入用に十分な数を生成するためにヒトＴ_ｒｅｇ細胞を単離しそして培養において増殖させることができるならば、Ｔ_ｒｅｇ細胞は移植における臨床免疫抑制治療において役割を有する
。

マウスデータは非常に有望であるが、ヒト血液から純粋なＴ_ｒｅｇを単離する実際上の問題が依然として残る。幼若マウスにおいて、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は適度に豊富であり、そしてＣＤ２５^＋サブセットは容易に明らかである。ヒトでは、ＣＤ２５−ｄｉｍ細胞の大きなそして重複する集団が存在するので、ＣＤ２５^＋細胞は別個の集団（ａｓ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｏｆ ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）としてあるではない。Ｔ_ｒｅｇと通常のＴ細胞との共精製は、ヒトＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞の研究において認められる控えめなもしくは変わりやすいサプレッサー活性の理由である可能性がある（非特許文献２２）。最も高い１．７％のＣＤ２５^＋発現体（ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞）のＦＡＣＳセルソーティングは、サプレッサー細胞単離を可能にすることが報告されている（非特許文献２３）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞が強力なサプレッサー細胞系を生成するために十分純粋な成人血液由来のＴ_ｒｅｇ細胞の集団を単離するためにストリンジェントな磁気ビーズに基づく方法が必要とされた。それでも、強力に抑制性の細胞系はドナーのサブセット（約１／３）において生成することしかできず、そして効能は細胞系純度と相関した（非特許文献２４）。ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞のＦＡＣＳ分類（上位２．１％）は、成人血液からのさらに一貫性のあるサプレッサー細胞系生成を可能にすることが報告されている（非特許文献２５）。

成人血液からのＴ_ｒｅｇ細胞の精製は可能であるが、難しい。一貫性のあるサプレッサー活性のために十分に純粋である成人血液からのＴ_ｒｅｇ細胞を単離するために磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）精製を用いる以前の試みは、細胞機能の変動性をもたらしている。この変動性は、Ｔ_ｒｅｇ細胞と重複するＣＤ２５−ｄｉｍメモリー細胞の存在に主に起因する。セルソーターの使用はＴ_ｒｅｇ細胞の単離を容易にし（非特許文献２３）、そして成人血液からのサプレッサー細胞系の生成を可能にしている（非特許文献２５）。しかしながら、成人血液由来のＣＤ２５^＋細胞の分類された集団（上位２．９％）でさえ、クローニングおよび機能分析で通常のおよび調節性Ｔ細胞の混合を含有することが１つの報告において見出された（非特許文献２６）。

ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋成人血液細胞の約２０％は、ＣＤ４５ＲＡを発現する。サプレッサー細胞はＣＤ４５ＲＯ陽性であることがいくつかの報告において記述されているので、この抗原はサプレッサー細胞上に発現されると予想されない（ナイーブ細胞の活性化の間に一時的を除いて、一般に相互排他的発現）。しかしながら、これらの細胞の単離は、サプレッサー細胞系を生成することにとってＣＤ４５ＲＡ^―細胞よりはるかに優れていた（この方法により単離される１２／１２細胞系は、強力なサプレッサーであることが見出された）。ナイーブＴ細胞上で、ＣＤ４５ＲＡスプライスバリアントはＴ細胞表面上に発現される。いったんＴ細胞がメモリー細胞に分化すると、それは通常はＣＤ４５ＲＯアイソフォームを発現する（特許文献１）。

臍帯血は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞を含有することが以前に示されている（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。しかしながら、これらの細胞の機能に関して報告されるわずかなデータしかない。１つの報告は、ＬＤＡ頻度分析に基づいて抑制機能を推測している（非特許文献２８）。新鮮単離ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞の機能活性を評価する唯一の報告は、抗原特異的応答の抑制を示さなかった。さらに、ＣＤ２５^＋細胞枯渇後にＣＤ４^＋細胞の増加した抗原特異的反応性はなかった。しかしながら、抗ＣＤ３に基づくＴ細胞共培養アッセイにおいて控えめな抑制が認められた（１／１のレスポンダー細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）／サプレッサー細胞比で６０％）（非特許文献３０）。従って、大部分の臍帯血由来のＣＤ２５^＋細胞は抑制性であるために十分にまだ成熟していないことが以前の研究により示された（非特許文献３０）。

従って、本発明までに、Ｔ_ｒｅｇ細胞の特性および利点は認識されていたが、十分な数の強力なサプレッサー細胞を単離しそして生成する方法は知られていなかった。従って、Ｔ_ｒｅｇ細胞を単離しそして増殖させる方法の認識された必要性があった。本発明は、この必要性を満たす。

米国公開第２００５０１９６３８６

Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，２００４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：５３１−５６２ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：１１５１−１１６４ Ｓｈｅｖａｃｈ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：４２３−４４９ Ｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：５１４７−５１５６ Ｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：１９９−２１０ Ｐｅｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：４８１１−４８２１ Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０７：５−９ Ｂｅｌｋａｉｄ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：５０２−５０７ Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：７５６−７６３ Ｓｈｅｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：３８９−４００ Ｒａｍｓｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：７１８−２４ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：２８７−２９６ Ｓｈｅｖａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１８２：５８−６７ Ａｓｓｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９０：９９５−１００４ Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ，９９：３４９３−３４９９ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６：３８９−３９９ Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６：４０１−４０６ Ｅｄｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：１１４４−１１５０ Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，９：２４３−５６ Ｔｒｅｎａｄｏ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１２：１６８８−９６ Ｔａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９：１４５５−１４６５ Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：８９−９８ Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００１，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．，１６７：１２４５−１２５３ Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ，１０４：４５３−４６１ Ｈｏｆｆｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ．１０４：８９５−９０３ Ｌｅｖｉｎｇｓ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６：１３３５−１３４６ Ｐａｇａｎｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：４８６−４８９ Ｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｌｏｏｄ ９８：２７３６−２７４４ Ｗｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０６：１９０−１９９ Ｗｉｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３３：５７９−５８７

［発明の要約］
本発明には、表現型的にＣＤ４５ＲＡ^＋の血液細胞の集団から調節性Ｔ細胞を単離する方法が包含され、ここで、該Ｔ_ｒｅｇ細胞はＴ細胞増殖を抑制する。本発明の方法は、ヒト臍帯血サンプルから単核細胞の集団を単離すること；単核細胞−抗体複合体の形成に適する条件下でＣＤ２５に特異的に結合する抗体と単核細胞の集団を接触させること；および単核細胞の該集団から単核細胞−抗体複合体を実質的に分離し、それにより表現型的にＣＤ４５ＲＡ^＋の血液細胞の集団から調節性Ｔ細胞を単離することを含んでなる。本発明の１つの態様において、表現型的にＣＤ４５ＲＡ^＋の血液細胞の集団は臍帯血、好ましくはヒト臍帯血サンプルからである。

本発明には、さらに、ＣＤ３に対する抗体およびＣＤ２８に対する抗体を含んでなる培地において調節性Ｔ細胞を培養することを含んでなる、単離された調節性Ｔ細胞を増やす方法が包含される。培地はＩＬ−２をさらに含んでなることができる。

本発明は、さらに、Ｔ細胞の増殖を抑制する方法を含んでなる。該方法は、本明細書に記載の方法により単離される調節性Ｔ細胞とＴ細胞を接触させることを含んでなる。

本発明には、また、ヒト臍帯血サンプルから調節性Ｔ細胞を単離するためのキットも包含される。該キットは、物理的支持体に結合したＣＤ２５に特異的に結合する抗体、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料を含んでなる。

本発明には、また、ヒト臍帯血サンプルからＴ_ｒｅｇ細胞を増やすためのキットも包含される。該キットは、物理的支持体に結合したＣＤ３に特異的に結合する抗体、物理的支持体に結合したＣＤ２８に特異的に結合する抗体、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料を含んでなる。

本発明は、さらに、本発明の方法により単離される調節性Ｔ細胞を含んでなる。

前述の要約、ならびに以下の発明の詳細な記述は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解される。本発明を説明する目的のために、本発明のある種の態様が図面において表される。しかしながら、本発明は、図面において表される態様の正確な配置および手段に限定されない。全てのエラーバーは、平均より上および下の１つの標準偏差を表す。

［発明のある種の態様の詳細な記述］
本発明には、ＣＤ４５ＲＡ^＋表現型を有するＴ調節性細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の増大された集団の単離および増殖のための方法およびキットが包含される。「増大された」という用語は、本明細書において用いる場合、増大されない対象より少なくとも２０％多い、より好ましくは３０％、好ましくは４０％、さらにより好ましくは５０％、さらにより好ましくは約６０％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは約８０％、さらにより好ましくは９０％、そしてさらにより好ましくは１００％多いことをさす。例として、調節性細胞の増大された集団は、増大されない集団より少なくとも２０％多い調節性細胞を有する。そのような細胞の好ましい供給源は、ヒト臍帯血であることが見出された。成人ヒト血液のような他の供給源から多数の活性のある強力なサプレッサーＴ_ｒｅｇ細胞を製造する方法は、低〜中程度レベルでＣＤ２５を発現するメモリーＴ細胞（ＣＤ２５ｄｉｍ細胞）、およびＴ_ｒｅｇ細胞精製を妨げる通常の活性化Ｔ細胞（ＣＤ２５^＋）の存在により複雑にされていた。「Ｔ_ｒｅｇ」という用語は、ＣＤ４（ＣＤ４^＋）およびＣＤ２５（ＣＤ２５^＋）の両方を発現する調節性Ｔ細胞をさすために本明細書において使用する。しかしながら、本明細書に開示されるデータにより示されるように、Ｔ細胞のこれらのタイプは両方とも（メモリーおよび活性化）、一般に臍帯血において欠如しているかもしくはより低い数で存在する。これは、本明細書に開示されるように、臍帯血は保護された環境において発生し、そして免疫学的にナイーブであるからである。従って、本発明は、臍帯血におけるＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞がヒト成人末梢血のような他の供給源由来のものより容易に精製されることを示す。

「ＣＤ２５」であるかもしくは「ＣＤ２５を発現する」細胞は、ＣＤ２５⁻であるかもしくは検出可能なレベルのＣＤ２５を発現しない細胞と本明細書において対比される。「ＣＤ２５ｄｉｍ」である細胞は、本明細書において用いる場合、ＣＤ２５^＋細胞もしくは「ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ」細胞より低い検出可能なレベルのＣＤ２５発現を有する。さらに、Ｔ_ｒｅｇ細胞集団を増殖させるために支持細胞は必要ないので、これらの細胞を培養することおよび増やすことは容易になり、そして簡易化される。

Ｔ_ｒｅｇ細胞は、マウスにおいて自己および同種移植片耐性にとって重要である。ヒトＴ_ｒｅｇの研究は、末梢血に存在する低い数および困難な精製によって妨げられている。本明細書に開示されるデータは、臍帯血が成人血液と比較してＴ_ｒｅｇ単離および細胞系生成の優れた供給源であることを示す。臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞を精製し、そして同種ＭＬＲの＞９５％抑制（２９／３０ドナー）を有する、強力なサプレッサー活性を一貫して示す細胞系を生成した。培養したＴ_ｒｅｇ細胞は、ケモカイン生産の抑制を有して、ＭＬＲにおけるサイトカイン蓄積を阻止した。これらの細胞系はＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７および細胞内ＣＴＬＡ４を均一に発現した。さらに、ＦｏｘＰ３タンパク質は特異的に発現されたが、ｍＲＮＡはそうでなかった。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの再刺激の際に、培養したＴ_ｒｅｇは最小量のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０）を生産し、そしてＴＧＦ−ベータ潜伏関連タンパク質を優先的に発現した。しかしながら、サイトカイン生産は、ＰＭＡ／イオノマイシンでの再刺激により通常レベルまで回復された。臍帯血由来の培養したサプレッサー細胞機能は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータから顕著に独立していた。本明細書に開示されるデータは、培養活性化後に強力なサプレッサー機能の能力がある、かなりの数のＴ_ｒｅｇ前駆細胞を臍帯血が含有することを示す。バンク貯蔵臍帯血検体は、免疫治療用のＴ_ｒｅｇの容易に入手
可能な供給源として役立ち得る。

本発明にはさらに、他の供給源由来のものより強力なサプレッサー活性およびサイトカイン抑制能力を有するヒト臍帯血サンプルから単離されたＴ_ｒｅｇ細胞が包含される。先行技術と大いに異なり、本明細書に開示されるデータは、ヒト臍帯血から単離されたＴ_ｒｅｇ細胞がＴ細胞増殖を抑制するそしてＴ細胞活性化依存性サイトカインを抑制する強力な能力を有することを示す。さらに、本発明のデータはさらに、臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞が単離および培養後に強力なサプレッサー細胞を形成できることを示す。本発明には、そのようなサプレッサー細胞を単離するために容易な直接抗体に基づく精製系を使用してＴ_ｒｅｇ細胞を精製する方法が包含される。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの活性化および増殖ならびにＩＬ−２における培養後に、臍帯血由来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は強力なサプレッサー機能を獲得し、それは長期間にわたって維持された。従って、本発明にはさらに、Ｔ細胞増殖を抑制する方法およびサイトカイン生産を抑制する方法が包含される。

これまで、サプレッサー細胞表現型および機能の全てのアッセイは、臍帯血由来の細胞、および成人由来の細胞の最も純粋なものが同様なプロフィールを有することを示す。フローサイトメトリー分析、サイトカイン生産能力および機能プロファイリングは全て、本質的に同じであった。従って、本明細書に開示されるデータは、両方のタイプの系が、純粋である場合に、同等なサプレッサー機序および効能を発現することを示し、そして臍帯血の利点は主として精製および培養の容易さに関する。

多数のサプレッサー細胞を利用できることは、これらの特殊な細胞の生化学的および分子的特性化を可能にしている。本明細書に開示される方法を用いて、３億個より多い均一なそして強力なサプレッサー細胞が、セルソーターなしに１つの平均サイズの研究グレード臍帯血単位（〜３億個の細胞）から生成されることができる。これらの結果は、１％のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞回収および培養における１００倍の増殖を示す。細胞のこの数は、ＴＣＲシグナル伝達改変、ＦｏｘＰ３調節および機能、ならびにサプレッサーエフェクター機序のさらなる特性化を可能にする。さらに、これらの細胞の重要な有用性は、免疫治療の新規な形態の臨床試験を可能にすることである。サプレッサー細胞系は、同種移植片耐性誘導を増大するかもしくは自己免疫疾患を抑制的調節するために有用であることができる。

本発明は、臍帯血サンプルからＴ_ｒｅｇ細胞を単離する方法を含んでなる。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、該冠詞の文法的対象の１つをもしくは１つより多くを（すなわち、少なくとも１つを）さすために本明細書において使用する。例として、「Ｔ_ｒｅｇ細胞」は１個のＴ_ｒｅｇ細胞もしくは１個より多いＴ_ｒｅｇ細胞を意味する。本発明の方法を用いて単離されるＴ_ｒｅｇ細胞は、本明細書に開示されるデータにより示されるように、Ｔ細胞増殖を抑制する。本発明の方法は、臍帯血サンプルから臍帯血単核細胞の集団を単離することを含んでなる。「集団」は、単核細胞であることもしくはＣＤ２５ＲＡを発現することのような、実質的に同様な表現型特性を有する一群の細胞をさすために本明細書において使用する。臍帯血サンプルのような生物学的サンプルから単核細胞を単離する方法は当該技術分野において周知であり、そして血漿および赤血球のような血液成分が単核細胞から分離されるように密度勾配遠心分離技術を用いることが包含されるがこれに限定されるものではない。血液サンプルから単核細胞を単離する方法には、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）技術が包含される。

そのように単離される臍帯血単核細胞をＣＤ３４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６が包含されるがこれらに限定されるものではない、ある種の抗原を発現する細胞について枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、腹水のよう
な、抗体を含んでなる生物学的サンプル、物理的支持体に結合した抗体および細胞に結合した抗体を用いて成し遂げることができる。「抗体」という用語は、本明細書において用いる場合、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子をさす。抗体は、自然源にもしくは組み換え源に由来する完全な免疫グロブリンであることができ、そして完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子のテトラマーである。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を包含する様々な形態で存在することができる（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。「特異的に結合する」という用語は、本明細書において用いる場合、特定の分子を認識しそして結合するが、サンプルにおける他の分子を実質的に認識しないかもしくは結合しない化合物、例えばタンパク質、核酸、抗体などを意味する。

本発明の抗体は、磁気ビーズ、ダイナルビーズ（ｄｙｎａｌ ｂｅａｄ）、マイクロビーズ、カラム、吸着カラムおよび吸着膜のような物理的支持体に結合することができる。物理的支持体に抗体を結合することは、当該技術分野において周知である。同文献。あるいはまた、磁気ビーズのような物理的支持体に結合した抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のような様々な供給業者から購入することができる。

様々な抗体が本発明において有用である。当業者により理解されるように、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６のような、興味のあるＣＤ抗原を認識しそして結合することができる任意の抗体は、本発明において有用である。そのような抗体を製造しそして使用する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、本発明において有用なポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知である標準的な免疫学的技術に従ってウサギを免疫感作することにより生成される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８、上記を参照）。そのような技術には、マルトース結合タンパク質もしくはグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分のような別のタンパク質の部分、および／またはマーカータンパク質が免疫原性にされるような部分（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ＫＬＨと結合したマーカータンパク質）およびそれぞれのマーカータンパク質アミノ酸残基を含んでなる部分を含んでなるキメラタンパク質で動物を免疫感作することが包含される。キメラタンパク質は、ｐＭＡＬ−２もしくはｐＣＭＸのようなしかしこれらに限定されるものではない、この目的のために適当なプラスミドベクターにマーカータンパク質をコードする適切な核酸をクローニングすることにより製造される。

しかしながら、本発明はこれらの抗体を含む方法および組成物にもしくはタンパク質抗原のこれらの部分にのみ限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明はＴ_ｒｅｇ細胞表面マーカータンパク質に対する、その用語が本明細書において他の所で定義されるように、他の抗体、もしくはその一部を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明にはとりわけＴ_ｒｅｇタンパク質に結合する抗体が包含されると解釈されるべきであり、そしてそれらはウェスタンブロット上に、酵素結合免疫測定法において溶液中に、ＦＡＣＳアッセイにおいて、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）アッセイにおいて、そして免疫蛍光顕微鏡検査において存在するタンパク質に結合することができる。

当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、抗体がマーカータンパク質の任意の部分と特異的に結合することができ、そしてそれに特異的な抗体を生成するために全長タンパク質を使用できることを理解する。しかしながら、本発明は免疫原として全長タンパク質を使用することに限定されない。むしろ、本発明には、特定のＴ_ｒｅｇ細胞表面タンパク質と特異的に結合する抗体を製造するためにタンパク質の免疫原性部分を使用することが包含される。すなわち、本発明には、細胞表面マーカータンパク質の免疫原性部分もしくは抗原決定基を使用して動物を免疫感作することが包含される。

抗体は、ウサギ、マウスもしくはヤギのようなしかしこれらに限定されるものではない動物を本発明のタンパク質もしくはその一部で免疫感作することにより、Ｔ_ｒｅｇ細胞表面抗原の少なくとも一部を含んでなるタンパク質、もしくは適切なアミノ酸残基を含んでなる部分と共有結合した、例えばマルトース結合タンパク質タグポリペプチド部分を含んでなるタグポリペプチド部分を含む融合タンパク質を用いて動物を免疫感作することにより製造することができる。当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、これらのタンパク質のさらに小さいフラグメントもまたＴ_ｒｅｇ細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体を製造するために使用できることを理解する。

本発明には、ポリクローナル、モノクローナル、合成抗体などが包含される。本発明はさらに、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ＦｖフラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントのような、抗体の生物学的活性フラグメントの使用を含んでなる。本発明の抗体の重要な特徴は、抗体がＴ_ｒｅｇ細胞表面タンパク質と特異的に結合することであることを当業者は本明細書に提供される開示に基づいて理解する。すなわち、本発明の抗体は、ウェスタンブロット上で、細胞の免疫染色においてＴ_ｒｅｇ細胞もしくはそのフラグメント（例えば、その免疫原性部分もしくは抗原決定基）を認識するか、または当該技術分野において周知である標準方法を用いて該タンパク質を免疫沈降させる。

これらの抗体は、本明細書において他の所に詳細に記述されるように、そしてさらに当該技術分野において周知である方法を用いることによりそれらのコグネイト抗原を免疫沈降させそして／もしくは免疫親和性精製するために使用できることを当業者は本明細書に提供される開示に基ついて理解する。さらに、抗体は、臍帯血サンプル由来の臍帯血単核細胞の集団においてＴ_ｒｅｇを単離するために使用することができる。従って、ＣＤ２５のようなＴ_ｒｅｇ細胞表面マーカーに対する抗体を用いることにより、Ｔ_ｒｅｇを同定し、濃縮し、もしくは単離することができる。従って、Ｔ_ｒｅｇ細胞表面上に発現される天然のもしくは遺伝子操作されているいずれかの任意のマーカーは、本発明において有用であることを当業者は本明細書に提供される開示に基づいて理解する。

本発明には、単一のＴ_ｒｅｇ抗原を認識する単一の抗体の使用が包含されるが、本発明は単一抗体の使用に限定されないことを当業者は本明細書に提供される開示に基づいて理解する。その代わりに、本発明には少なくとも１つの抗体の使用が包含され、ここで、該抗体は同じもしくは異なるＴ_ｒｅｇ抗原に対してであることができる。

ポリクローナル抗体の生成は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８，上記）に記載のもののような標準的な抗体製造方法を用いて所望の動物に抗原を接種することおよびそれから抗原に特異的に結合する抗体を単離することにより成し遂げられる。

タンパク質もしくはペプチドの全長もしくはペプチドフラグメントに対するモノクローナル抗体は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８８，同文献）にそしてＴｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７２：１０９−１１５）に記載のもののような、任意の周知のモノクローナル抗体製造方法を用いて製造することができる。多量の所望のペプチドはまた、化学合成技術を用いて合成することもできる。あるいは
また、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローン化し、そして大量のペプチドの生成に適当な細胞において適切なプロモーター配列から発現させることができる。ペプチドに対するモノクローナル抗体は、本明細書に参考文献を載せるような標準的な方法を用いてペプチドで免疫感作したマウスから生成される。

本明細書に記載の方法を用いて得られるモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該技術分野において利用可能でありそして例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびそこに引用される参考文献に記述されている技術を用いてクローン化し、そしてシークエンスすることができる。さらに、本発明の抗体は、例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．同文献およびそこに引用される参考文献に、そしてＧｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ，７７：７５５−７５９）に記述されている技術、および当該技術分野において周知であるかもしくは開発される抗体をヒト化する他の方法を用いて「ヒト化する」ことができる。

いったん発現されると、全抗体、それ由来のダイマー、個々の軽鎖および重鎖、もしくは抗体の他の形態は、当該技術分野において既知である標準的な方法に従って精製することができる。

本発明の１つの態様において、ファージ抗体ライブラリーを作製することができる。ファージ抗体ライブラリーを作製するために、ファージ表面上に発現される所望のタンパク質（例えば所望の抗体）を発現する細胞（例えばハイブリドーマ）から単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを最初に得る。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを生成する。免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡはＰＣＲによって得られ、そして得られるＤＮＡを適当なバクテリオファージベクターにクローン化して免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを生成せしめる。異種ＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーを製造する方法は当該技術分野において周知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記に記述されている。

所望の抗体をコードするバクテリオファージは、例えばＴ_ｒｅｇ細胞表面抗原のようなその対応する結合タンパク質、例えばそれに対して抗体が向けられる抗原への結合に利用可能であるようにタンパク質がその表面上に提示されるように設計することができる。従って、特定の抗体を発現するバクテリオファージが対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベーションされると、バクテリオファージは細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは、細胞に結合しない。

本発明において使用する抗体は、臍帯血単核細胞−抗体複合体の形成に適当な条件下でヒト臍帯血サンプルから単離された臍帯血単核細胞の集団と接触して置かれる。すなわち、本発明の方法は、抗体がＴ_ｒｅｇ細胞上のＣＤ２５を包含する抗原に結合するように臍帯血単核細胞の集団においてＴ_ｒｅｇ細胞に特異的に結合する抗体と臍帯血単核細胞の集団を接触させることを含んでなる。「適当な条件」は、そのコグネイト抗原へのもしくはＴ_ｒｅｇ細胞のような細胞への抗体の結合を促進する温度、ｐＨ、バッファー、時間および他の因子をさすために本明細書において使用する。抗原へのもしくは細胞への、または細胞上の抗原への抗体結合に適当である条件は当該技術分野において周知であり、そして通常は約２分から約５分まで約３０分まで約１時間まで約２４時間までの期間にわたって約４℃から約２０℃まで約３７℃までである。様々なバッファーが当該技術分野において周知であり、そして例えばトリス、リン酸緩衝食塩水などが包含される。臍帯血単核細胞−抗体複合体の形成に適当な条件の様々な例は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，上記に記述されている。

本発明はさらに、臍帯血単核細胞の集団から臍帯血単核細胞−抗体複合体を実質的に分離する工程を含んでなる。すなわち、本明細書に開示されるデータにより示されるように、臍帯血サンプルからＴ細胞増殖を抑制するＴ_ｒｅｇ細胞を単離する本発明の方法は、サンプルにおける他の臍帯血単核細胞からそのようなＴ_ｒｅｇ細胞を実質的に分離することを含んでなる。「から実質的に分離される」もしくは「実質的に分離する」は、該用語を本明細書において用いる場合、第二の物質の集団の近くから取り除かれている第一の物質の集団の特性をさし、ここで、第一の物質の集団は第二の物質を必ずしも欠いておらず、そして第二の物質の集団は第一の物質を必ずしも欠いていない。しかしながら、第二の物質の集団「から実質的に分離される」第一の物質の集団は、第一および第二の物質の非分離混合物と比較した場合に第二の物質の測定可能により低い含有量を有する。

臍帯血単核細胞の細胞混合物から抗体に結合したＴ_ｒｅｇ細胞を取り除くことにより抗体に結合する細胞表面マーカーを有さない細胞から抗ＣＤ２５抗体のような抗体に結合したＴ_ｒｅｇを分離するために様々な技術を用いることができる。あるいはまた、抗体により結合されないＴ_ｒｅｇを細胞混合物から取り除くことにより抗体に結合する細胞表面マーカーを有さない細胞から抗体に結合する細胞表面マーカーを含有するＴ_ｒｅｇを分離するために様々な技術を用いることができる。

１つの態様において、抗体と結合していないＴ細胞および他の臍帯血単核細胞から抗体に結合したＴ_ｒｅｇを分離するためにＣＤ２５細胞表面マーカーを用いる。本発明の１つの態様において、粗分離を可能にするために抗体を固体支持体に取り付けることができる。用いる分離技術は、集められる画分の生存能力の保持を最大にすべきである。「比較的粗い」分離、すなわち、マーカーを有する存在する全細胞の１０％まで、通常は約５％以下、好ましくは約１％以下が、保持される細胞集団で残り得る分離には、異なる効能の様々な技術を用いることができる。用いる特定の技術は、分離の効率、方法論の細胞毒性、実行の容易さおよび速度、ならびに高機能装置および／もしくは技術的熟練の必要性により決まり、これらの全ては当業者の能力の範囲内である。

分離の方法には、抗体を被覆した磁気ビーズもしくはダイナルビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に連結するかもしくはモノクローナル抗体と併せて使用する細胞毒性薬、例えば補体および細胞毒素、ならびに固体マトリックス、例えばプレートに取り付けた抗体での「パニング」、または他の通常の技術を包含することができる。厳密な分離を与える技術には様々な程度の高度化、例えば複数のカラーチャンネル、小角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化セルソーター、ならびに磁気活性化セルソーターが包含される。

都合よく、特定の細胞タイプの分離の容易さを与えるために、直接分離を可能にする磁気ビーズ、支持体に結合したアビジンもしくはストレプトアビジンで取り除くことができるビオチン、蛍光活性化セルソーターで使用することができるＦＩＴＣのような蛍光色素などのようなマーカーと抗体を結合することができる。残留細胞の生存能力にとって過度に有害でない任意の技術を用いることができる。他の技術には、密度遠心分離用の高密度粒子、吸着カラム、吸着膜などが包含されるがこれらに限定されるものではない。

本発明の１つの態様において、臍帯血由来の細胞表面マーカーに特異的な抗体を磁気ビーズに結合する。抗原を提示するＣＤ２５のようなＴ_ｒｅｇ細胞表面抗原への抗体コンジュゲートの結合に適当な条件下で、臍帯血由来の単核細胞の集団を磁気ビーズ−抗体コンジュゲートと接触させる。４℃で２０分間のインキュベーションのようなしかしこれに限定されるものではない、結合に適当な条件下でのインキュベーション後に、磁気に基づく
分離装置に全サンプルを通すことにより抗原について陽性のＴ_ｒｅｇが選択される。装置からの自由溶液の排出もしくは溶出の際に、磁気的に保持されるマーカーを含有する細胞のみが残る。次に、抗原を含有するＴ_ｒｅｇ細胞を装置から溶出し、Ｔ_ｒｅｇ細胞の濃縮された、単離されたもしくは精製された集団がもたらされる。本発明の１つの態様において、Ｔ_ｒｅｇマーカーはＣＤ２５である。

一般に少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは約８０％、さらにより好ましくは約９０％もしくは９０％より大きい、ＣＤ２５のようなＴ_ｒｅｇ抗原を含んでなることを欠く細胞の実質的な単離後に、蛍光活性化セルソーターもしくは磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）のような高い特異性を有する他の方法論により細胞を分離することができる。多色分析は、特に都合がよいＦＡＣＳで用いることができる。

ヒト臍帯血サンプルからＴ_ｒｅｇ細胞を単離する本発明の方法のストリンジェンシーを上げるために、臍帯血単核細胞の集団から実質的に分離されているＴ_ｒｅｇ細胞を臍帯血単核細胞−抗体複合体の形成に適当な条件下でＣＤ２５に特異的に結合する抗体と再び接触させ、続いて臍帯血単核細胞の集団から臍帯血単核細胞−抗体複合体を実質的に分離することができる。この工程は、臍帯血サンプルからヒトＴ_ｒｅｇ細胞を単離するために１回もしくはそれ以上行うことができる。

本発明はさらに、本明細書に開示される方法を用いて単離されるＴ_ｒｅｇ細胞を増やすか、増殖させるかもしくはそうでなければ培養する方法を含んでなる。本明細書に開示されるデータにより示されるように、本発明の方法により単離されるＴ_ｒｅｇ細胞を増やすことは、本明細書に開示される方法を用いて約１００倍増加することができる。単離後に、Ｔ_ｒｅｇ細胞をある時間にわたってもしくは別の培養装置に細胞を移す前に細胞が飽和密度に達するまで培養装置において細胞培地中でインキュベーションする。培養装置は、インビトロで細胞を培養することにおいて一般に使用される任意の培養装置のものであることができる。好ましくは、別の培養装置に細胞を移す前に飽和密度のレベルは７０％より大きい。より好ましくは、飽和密度のレベルは９０％より大きい。ある時間は、インビトロでの細胞の培養に適当な任意の時間であることができる。Ｔ_ｒｅｇ細胞培地は、任意の時間でＴ_ｒｅｇ細胞の培養中に置換することができる。好ましくは、Ｔ_ｒｅｇ細胞培地は３〜４日ごとに置換される。次に、培養装置からＴ_ｒｅｇ細胞を採取し、その際にＴ_ｒｅｇ細胞はすぐに使用するかもしくは冷凍保存して後での使用のために保存することができる。Ｔ_ｒｅｇ細胞はトリプシン処理、ＥＤＴＡ処理、もしくは培養装置から細胞を採取するために用いられる任意の他の方法により採取することができる。

培養中の細胞を表すために様々な用語が使用される。細胞培養物は、生体から採取されそして制御条件下で培養された細胞を一般にさす。初代細胞培養物は、生物から直接採取されそして最初の継代培養の前の細胞、組織もしくは器官の培養物である。細胞は、それらが細胞増殖および／もしくは分裂を促進する条件下で増殖培地に置かれると培養において増殖され、細胞のより大きい集団をもたらす。細胞が培養において増殖される場合、細胞増殖の速度は、別名倍加時間として知られている、細胞が数を倍にするために必要な時間の量により典型的に測定される。

継代培養の各回は、〜代継代と呼ばれる。細胞が継代培養される場合、それらは継代されていると呼ばれる。細胞の特定の集団、もしくは細胞系は、それが継代されている回数によって呼ばれるかもしくはそれを特徴とすることがある。例えば、１０回継代されている培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と呼ぶことができる。初代培養物、すなわち、組織からの細胞の単離後の最初の培養物はＰ０と指定される。最初の継代培養後に、細胞は二次培養物（Ｐ１もしくは１代継代）として表される。第二の継代培養後に、細胞は三次培養物
（Ｐ２もしくは２代継代）になるなど。継代の期間中に多数の集団倍加がある可能性があり；従って、培養物の集団倍加の数は継代数より大きいことが当業者により理解される。継代間の期間中の細胞の増殖（すなわち、集団倍加の数）は、播種密度、基質、培地および継代間の時間が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の因子により決まる。

本発明のＴ_ｒｅｇ細胞を増やすために用いる培地は、ＣＤ３に対する抗体およびＣＤ２８に対する抗体およびサイトカイン、好ましくはＩＬ−２（しかしこれに限定されるものではない）を含んでなる。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるように、本発明の方法により単離される細胞は、ＣＤ３に結合する抗体およびＣＤ２８に結合する抗体およびＩＬ−２と細胞を培養することにより約１００倍増やすことができるからである。さらに、本明細書に同様に開示されるように、本発明の方法を用いて増やした細胞は均一であり、そして強力なサプレッサー細胞である。さらに、本発明のＴ_ｒｅｇ細胞は免疫学的にナイーブであるので、そのような細胞は、糖尿病、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、ＧＶＨＤ、増強（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）同種移植片耐性誘導、移植拒絶などのような自己免疫疾患に共通するもののような免疫反応を抑制するために動物、好ましくは哺乳類、さらにより好ましくはヒトに投与することができる。さらに、本発明の細胞は、減少したもしくはそうでなければ抑制された免疫応答、特に細胞性免疫応答が疾患を処置するかもしくは軽減するために望ましい任意の症状の処置に用いることができる。

本発明の方法において使用するＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体は、当該技術分野において既知である抗体、本明細書において他の所に開示されるもの、もしくはまだ発見されていないもののいずれかであることができる。さらに、そして好ましくは、本発明の抗体を磁気ビーズもしくはダイナルビーズのようなビーズに結合するかもしくはそうでなければ取り付ける。そのようなビーズは当該技術分野において既知であり、そして本明細書において他の所に記述されている。

本発明の培地はさらにサイトカイン、好ましくはＩＬ−２を含んでなる。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるように、本発明の方法において使用する培地へのＩＬ−２の添加は、本発明のＴ_ｒｅｇ細胞の約１００倍の増殖をもたらすからである。ＩＬ−２および他のサイトカインは当該技術分野において周知であり、そして様々な供給業者から市販されている。

本発明のＴ_ｒｅｇはさらにある種の抗原性マーカーを含んでなり、それらのあるものはＴ_ｒｅｇ細胞が臍帯血サンプルから単離される時に存在し、それらのあるものはＴ_ｒｅｇ細胞が本発明の方法に従って増やされ、培養され、もしくはそうでなければ増殖される時に存在する。そのような抗原性マーカーは、本発明のＴ_ｒｅｇ細胞の同定において有用であり、そして本発明の方法に従って単離されそして増やされたＴ_ｒｅｇ細胞が本発明のＴ_ｒｅｇ細胞の特性および生物学的活性を有するかどうかを当業者が決定することを可能にする。そのような生物学的活性には、同種免疫応答の抑制、ケモカイン生産のより少ない抑制を伴う免疫応答におけるサイトカイン蓄積の抑制、ＩＬ−２、ＩＬ−１０およびガンマインターフェロンの生産、ＴＧＦ−ベータ潜伏関連タンパク質（ＬＡＰ）の発現、ならびにＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータから独立したサプレッサー活性が包含されるがこれらに限定されるものではない。本発明のＴ_ｒｅｇ細胞上のマーカーには、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７、ＣＤ２６ＬおよびＦｏｘＰ３が包含されるがこれらに限定されるものではない。

本発明はさらに、Ｔ細胞の増殖を抑制する方法を含んでなる。そのような抑制は、インビトロもしくはインビボで、好ましくは動物において、より好ましくは哺乳類において、さらにより好ましくはヒトにおいて起こることができる。これは、本明細書に開示される
データにより示されるように、本発明の方法に従って単離されそして増やされたＴ_ｒｅｇ細胞の存在下で混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＨＬＡ不適合Ｔ細胞が約９５％より大きい規模で増殖するのを抑制されたからである。さらに、本明細書に開示されるデータにより示されるように、本発明の方法に従って単離されそして／もしくは増やされたＴ_ｒｅｇ細胞は、約１：１６〜約１：３２（Ｔ_ｒｅｇ：Ｔ細胞）の比率でＴ細胞増殖の強力なサプレッサーである。さらに、本発明のＴ_ｒｅｇ細胞は、樹状細胞のような抗原提示細胞が成熟しそして活性化される場合に免疫応答を抑制することにおいて有効である。従って、本発明の細胞は、能動免疫応答を抑制するためにもしくは免疫応答を防ぐために用いることができる。

本発明の方法は、Ｔ細胞の増殖が抑制されるように本発明の方法に従って単離されそして／もしくは増殖されたＴ_ｒｅｇ細胞とＴ細胞を接触させることを含んでなる。Ｔ_ｒｅｇ細胞は、Ｔ_ｒｅｇがＴ細胞、樹状細胞、形質細胞などのような免疫細胞に接触するかもしくはその近くにあるようにその技術分野において周知である技術を用いて投与することができる。

本発明の方法に従って単離されそして／もしくは培養されたＴ_ｒｅｇを用いてＴ細胞の増殖を抑制する方法には、有効成分として本発明のＴ_ｒｅｇを含んでなる製薬学的組成物の製造および使用が包含される。そのような製薬学的組成物は、被験体への投与に適当な形態において少なくとも１つの有効成分（例えば、有効用量のＴ_ｒｅｇ）の組み合わせとして、有効成分だけからなることができ、または製薬学的組成物は有効成分および１つもしくはそれ以上の製薬学的に許容しうる担体、１つもしくはそれ以上の追加（活性および／もしくは不活性）成分、またはこれらのいくつかの組み合わせを含んでなることができる。

本明細書において用いる場合、「製薬学的に許容しうる担体」という用語は、有効成分をそれと組み合わせることができ、そして組み合わせの後に、被験体に有効成分を投与するために使用することができる化学組成物を意味する。

本明細書に記載する製薬学的組成物の製剤は、薬理学の当該技術分野において既知であるかもしくは今後開発される任意の方法により製造することができる。一般に、そのような製造方法には、有効成分を担体または１つもしくはそれ以上の副成分と会合させる工程、そして次に必要もしくは所望に応じて、生成物を所望の単回もしくは複数回投与単位に成形するかもしくは包装する工程が包含される。

本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、ヒトへの倫理的投与に適当である製薬学的組成物に主に関するが、そのような組成物は一般に全ての種類の動物への投与に適当であることが当業者により理解される。組成物を様々な動物への投与に適当にするためのヒトへの投与に適当な製薬学的組成物の改変は十分に理解されており、そして普通に熟練した獣医薬理学者は、たとえあったとしても、単に通常の実験でそのような改変を考案しそして実施することができる。本発明の製薬学的組成物の投与が意図される被験体には、ヒトおよび他の霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳類を包含する哺乳類、ニワトリ、カモ、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を包含する鳥類、養殖魚および観賞魚を包含する魚類、ならびに養殖甲殻類のような甲殻類が包含されるがこれらに限定されるものではない。

本発明の方法において有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、病巣内、口腔、眼球、静脈内、器官内もしくは別の投与経路に適当な製剤において製造し、包装し、もしくは販売することができる。他の意図される製剤には、突き
出た（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再閉赤血球および免疫学的に基づく製剤が包含される。

本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、もしくは複数の単一単位用量として製造し、包装し、もしくは販売することができる。本明細書において用いる場合、「単位用量」は、有効成分の既定量を含んでなる製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与する有効成分の投薬量または例えばそのような投薬量の１／２もしくは１／３のようなそのような投薬量の都合のよい割合に等しい。

本発明の製薬学的組成物における有効成分、製薬学的に許容しうる担体および任意の追加成分の相対量は、処置する被験体の同一性、サイズおよび症状により、そしてさらに組成物が投与される経路により異なる。例として、組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の間の有効成分を含んでなることができる。

有効成分に加えて、本発明の製薬学的組成物はさらに、１つもしくはそれ以上の追加の製薬学的に活性の薬剤を含んでなることができる。特に意図される追加の薬剤には、シアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのような制吐剤およびスカベンジャーならびにサイクロスポリン、ステロイド、前炎症性サイトカインに対する抗体、ＩＬ−１０のような抑制性サイトカインなどのような他の免疫抑制化合物が包含される。

本発明の製薬学的組成物の制御もしくは持続放出製剤は、通常の技術を用いて製造することができる。

本明細書において用いる場合、製薬学的組成物の「非経口投与」には、被験体の組織の物理的突破を特徴とする投与および組織における突破口を通した製薬学的組成物の投与の任意の経路が包含される。従って、非経口投与には、組成物の注入による、外科的切開を通した組成物の適用による、組織を貫通する非外科的創傷を通した組成物の適用によるなどの製薬学的組成物の投与が包含されるがこれらに限定されるものではない。特に、非経口投与には皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入および腎臓透析注入技術が包含されるがこれらに限定されるものではないことが意図される。

非経口投与に適当な製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌等張食塩水のような製薬学的に許容しうる担体と組み合わせた有効成分を含んでなる。そのような製剤は、ボーラス投与にもしくは継続投与に適当な形態において製造し、包装し、もしくは販売することができる。注入可能な製剤は、アンプル剤におけるかもしくは防腐剤を含有する複数回投与容器におけるような単位投与形態物において製造し、包装し、もしくは販売することができる。非経口投与用の製剤には、懸濁剤、液剤、油性もしくは水性賦形剤における乳剤、パスタ剤、および埋め込み可能な持続放出もしくは生物分解性製剤が包含されるがこれらに限定されるものではない。そのような製剤はさらに、沈殿防止剤、安定剤もしくは分散剤が包含されるがこれらに限定されるものではない１つもしくはそれ以上の追加成分を含んでなることができる。

製薬学的組成物は、滅菌した注入可能な水性もしくは油性懸濁剤もしくは液剤の形態において製造し、包装し、もしくは販売することができる。この懸濁剤もしくは液剤は既知の技術に従って調合することができ、そして有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤もしくは沈殿防止剤のような追加成分を含んでなることができる。そのような滅菌した注入可能な製剤は、例えば、水もしくは１，３ブタンジオールのような無毒の非経口的に許容しうる希釈剤もしくは溶媒を用いて製造することができる。他の許容しうる希釈剤および溶媒には、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノもしくはジグリセリドのような不揮発性油が包含されるがこれらに限定されるものではない。有用
である他の非経口的に投与可能な製剤には、微晶質形態において、リポソーム製剤において、もしくは生物分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んでなるものが包含される。持続放出もしくは埋め込み用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーもしくは難溶性塩のような製薬学的に許容しうるポリマーもしくは疎水性材料を含んでなることができる。

本発明のＴ_ｒｅｇおよび／もしくは本発明の方法を用いて増殖させたＴ_ｒｅｇは、動物、好ましくはヒトに投与することができる。本発明のＴ_ｒｅｇが投与される場合、投与する細胞の量は約１００，０００細胞〜約３０００億細胞であることができ、ここで、細胞は動物、好ましくはそれを必要とするヒト患者に注入される。投与する正確な投与量は、処置する動物のタイプおよび病状のタイプ、動物の年齢ならびに投与の経路が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の数の因子により異なる。

Ｔ_ｒｅｇは毎日数回の頻度で動物に投与することができ、あるいはそれは１日に１回、週に１回、２週ごとに１回、月に１回のようなより少ない頻度で、または数ヶ月ごとに１回もしくはさらに年に１回もしくはそれ未満のようなさらに少ない頻度で投与することができる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであり、そして処置する疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢などのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の数の因子により決まる。

Ｔ_ｒｅｇは、様々な他の化合物（多数の他のものの中で、サイトカイン、化学療法薬、免疫抑制剤）と共投与することができる。あるいはまた、該化合物（１つもしくは複数）は、Ｔ_ｒｅｇより１時間、１日、１週、１ヶ月もしくはさらにそれ以上前にまたはその任意の変更で投与することができる。さらに、該化合物（１つもしくは複数）は、Ｔ_ｒｅｇの投与の１時間、１日、１週もしくはさらにそれ以上後にまたはその任意の変更で投与することができる。頻度および投与処方計画は当業者に容易に明らかであり、そして処置する疾患のタイプおよび重症度、動物の年齢および健康状態、投与する化合物もしくは複数の化合物の同一性、様々な化合物およびＴ_ｒｅｇの投与の経路などのようなしかしこれらに限定されるものではない任意の数の因子により決まる。

さらに、Ｔ_ｒｅｇが哺乳類に投与される場合、細胞が「増殖のない状態」である、すなわち、哺乳類に投与した場合に細胞が分裂できないようにそれらを処理できることが本明細書に提供される開示に基づいて当業者により理解される。本明細書における他の所に開示されるように、いったん哺乳類に投与すると細胞が増殖もしくは分裂できないようにするためにそれらに放射線照射することができる。特にヒトに投与する細胞を増殖できないようにするためにハプテン化（例えば、ジニトロフェニルおよび他の化合物を用いること）を包含する他の方法が当該技術分野において既知である。

本発明には、ヒト臍帯血サンプルからＴ_ｒｅｇを単離するために用いる試薬を含んでなる様々なキットが包含される。キットは、ＣＤ２５のようなＴ_ｒｅｇ細胞の表面上の分子に特異的に結合する抗体、アプリケーター、および本発明の方法を行うためにキットの使用を記述する説明用資料を含んでなる。典型的なキットが以下に記載されるが、他の有用なキットの内容は本開示に照らしてみると当業者に明らかである。これらのキットの各々は、本発明内に包含される。「アプリケーター」という用語は、該用語を本明細書において用いる場合、本発明の化合物および組成物を投与するための、皮下注射器、ピペットなどが包含されるがこれらに限定されるものではない、任意の装置を意味する。

「説明用資料」には、その用語を本明細書において用いる場合、本明細書に列挙する様々な疾患もしくは障害を軽減することもしくは処置することをもたらすためのキットにおいて本発明の組成物および／もしくは化合物の実用性を伝えるために用いることができる
公開、記録、図もしくは任意の他の表現媒体が包含される。場合により、あるいはまた、説明用資料は、本明細書において他の所に開示されるとおりを包含する、細胞もしくは組織もしくは哺乳類における疾患もしくは障害を軽減する１つもしくはそれ以上の方法を記述することができる。

本発明にはさらに、ヒト臍帯血サンプルからのＴ_ｒｅｇを増やすためのキットが包含される。キットは、ＣＤ３に特異的に結合する抗体およびＣＤ２８に特異的に結合する抗体を含んでなる。本発明のキットの抗体は、単離された抗体、磁気ビーズのような物理的支持体に結合した抗体、または本明細書において他の所に記載されるかもしくは当該技術分野において既知である他の抗体であることができる。キットはさらに、本発明のＴ_ｒｅｇを培養し、増やし、もしくはそうでなければ増殖させるためにＩＬ−２のようなサイトカインを含んでなることができる。キットは、本発明に開示される方法に従って使用される。キットはさらに、アプリケーターおよびその使用のための説明用資料を含んでなることができる。

本発明は、ここで、以下の実施例に関連して記述される。これらの実施例は説明の目的のためだけに提供され、そして本発明はこれらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。

実施例

成人ヒト末梢血からのＣＤ４５ＲＡ^＋細胞の単離および培養
培養用のＣＤ２５ ^＋ およびＣＤ２５ ⁻ 細胞のＭＡＣＳ精製
健常なボランティアドナー（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の全血から得られたバフィコート調製物から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。白血球に富んだバフィコート細胞をフィコール−ハイパック層上で遠心分離してＰＢＭＣを集めた。以下の間接抗体に基づくマイクロビーズを用いてＣＤ２５^＋細胞を単離した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ、クローン２Ａ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色し、洗浄し、そして次に抗ＦＩＴＣマルチソートマイクロビーズ（５マイクロリットル／１０^７細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に二次的に結合させ、そして陽性選択した。ＣＤ２５^＋細胞を第二のカラムに再びかけ、洗浄し、そして再溶出した。カラム精製後に、抗ＦＩＴＣマルチソートビーズを脱離させた。ＣＤ２５^＋細胞を系統枯渇（ｌｉｎｅａｇｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）用のｍＡｂ被覆マイクロビーズの混合物でＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ５６を発現する細胞についてさらに枯渇させた。次に、これらのＣＤ２５^＋系統枯渇細胞（ＤＣ−８ｘ−マイナス）を抗ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズ（２０マイクロリットル／１０^７細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）での直接陽性選択によりＣＤ４５ＲＡについて選択した。ある場合には、抗ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞のさらなる精製を抗ＨＬＡ−ＤＲマイクロビーズ（２０マイクロリットル／１０^７細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）での陽性選択によりＣＤ４５ＲＡ⁻細胞から単離した。ＣＤ２５⁻細胞を直接抗ＣＤ２５マイクロビーズ（２０マイクロリットル／１０^７細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）での２回目の枯渇によりＣＤ２５についてさらに枯渇させた。ＣＤ２５枯渇後にこれらの細胞を次に直接抗ＣＤ４マイクロビーズ（２０マイクロリットル／１０^７細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）でＣＤ４について陽性選択した。

ＣＤ２５ ^＋ およびＣＤ２５ ⁻ 細胞の培養
単離されたＣＤ２５^＋細胞、ＣＤ２５^＋サブセットもしくはＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻コントロール細胞を２４ウェルプレートにおいて百万個の総細胞／ｍｌで培養した。等しい数の
放射線照射したＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻支持細胞を培養物に加えた。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂ被覆ダイナビーズ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を増殖刺激として３：１のビーズ：細胞比で加え、そして中程度の用量のＩＬ−２を新鮮培地（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）において５０ＩＵ／ｍｌで３日目に加えた（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ，１０４：４５３−４６１；Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．，７：４３７−４８）。臍帯血培養物では、培養もしくはサプレッサー機能の維持に支持細胞が必要とされず、従って、使用しなかった。細胞培養物は、急増殖期中に３日ごとに約１／３、必要に応じて分割した。培養培地は、１０％のＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＬ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）であった。

成人血液からＴ_ｒｅｇ細胞系生成用にＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞の単離のためのＭＡＣＳに基づく戦略を用いて以前に単離された細胞系は変わりやすい効能を示し、それは混入する通常のＴ細胞により引き起こされると思われた。精製戦略を改善するために、ＣＤ２５^＋細胞をフローサイトメトリー分析によりサブセットについて分析した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞のサブセットはサプレッサー細胞についてさらに濃縮されることができ、もしくは逆に、サブセットは通常のＴ細胞について濃縮されるかもしれない。本明細書に記載する方法は、サブセットマーカーを特性化し、これらの細胞サブセットを選択的に精製し、そして次に強力なサプレッサー機能を有する細胞系を形成するそれらの能力を評価することであった。

分析した第一のマーカーはメモリー細胞のマーカー、ＣＤ４５ＲＯおよびナイーブＴ細胞のマーカー、ＣＤ４５ＲＡであった。新鮮単離ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋細胞はＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞のサプレッサー活性の大部分を含有したので、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞のＣＤ４５ＲＯ^＋サブセットはサプレッサー細胞を含有することが報告されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３：１２８５−１２９４）。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＯ−マイナス細胞は、機能アッセイ（二次同種ＭＬＲ）において最小のサプレッサー活性を有した。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＯ−マイナス細胞は、通常のＴ細胞であることが示唆された。通常のＴ細胞は典型的に培養においてサプレッサー細胞より増殖しすぎる（ｏｖｅｒｇｒｏｗ）ので、細胞系生成を改善するための手段としてＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＯ−マイナス細胞の枯渇を調べた。

精製されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞をＦＡＣＳ分析によりＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ発現について評価した（図１）。ＣＤ２５^＋細胞は、約８０％の細胞上でＣＤ４５ＲＯを共発現した（平均８０％、範囲６２〜８９、ｎ＝６）。ＣＤ２５^＋細胞はまた、約２０％の細胞上でＣＤ４５ＲＡを共発現する細胞のサブセットも含有した（平均２４％、範囲１５〜３８、ｎ＝６）。これらの抗原の高レベル発現は相互排他的であるが、少量の両方の抗原を発現するのみのかなりの数の二重陽性細胞があり、そして２色ドットプロットにより発現の全スペクトルが示される。ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞は最高レベルでＣＤ２５を発現せず、そして真のＴ_ｒｅｇ細胞であると考えられるＣＤ２５ ｂｒｉｇｈｔ細胞はＣＤ４５ＲＡを発現しないように思われる（図２）。従って、これらのデータは、ＣＤ４５ＲＡサブセットの枯渇がＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞についてさらに濃縮することを示唆し、そしてこれらのＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞の除去を試みた。

切断可能なマイクロビーズでの間接精製系は、ＣＤ２５^＋細胞の精製、磁気ビーズの除去、そして次にＣＤ４５ＲＡ^＋細胞の枯渇を可能にした。典型的なバフィコートを用いて、出発物質は約５億個の細胞であり、そして精製によって約１千万個のＣＤ２５^＋細胞、
７百万個のＣＤ２５^＋系統陰性細胞、５百万個のＣＤ４５ＲＡ−マイナス細胞および百万個のＣＤ４５ＲＡ^＋細胞が得られた。２人のドナーからの精製を示す（図１）。これらの様々なＣＤ２５^＋集団を抗ＣＤ３／２８ビーズでの１回の刺激で培養した。３週後に、アロＭＬＲを抑制する能力についてこれらの細胞系を試験した。

これらの細胞系のサプレッサー機能を評価するために、ＨＬＡ不適合アロ−ＭＬＲアッセイを機能読み取りとして用いた。ＣＤ４^＋応答細胞およびＤＣ刺激ＭＬＲアッセイは非常に強力であり、そしてドナー間で一貫性があり、それ故に抑制の標準的測定として役割を果たした。２〜３週の培養後に全ての細胞系をＭＬＲにおいてサプレッサー活性について最初にスクリーニングし、そしてそれから次の３〜４週にわたってさらに分析した。

驚くべきことに、強力なサプレッサー活性を示したのはＣＤ４５ＲＡ^＋由来の細胞系（これらは通常のＴ細胞でありそして活性を欠くと予想された）であった（図１１）。対照的に、ＣＤ４５ＲＡ−マイナス細胞由来の系は、非常に乏しいサプレッサー機能を有した。１２の細胞系ドナーを試験し、そして１０／１２のＲＡ細胞系は強力なサプレッサー活性を示し、そして２／１２のＲＡ−マイナス系は同様の活性を示した。これらのデータおよびこれらの細胞系により媒介される抑制パーセントは散布図に示され、それはまた成人血液および臍帯血からのストレートの（ｓｔｒａｉｇｈｔ）ＣＤ２５^＋選択細胞も含む（図３）。

ヒトＣＤ２５ ^＋ 細胞の２つの主要サブセット、ＣＤ４５ＲＡ ^＋ およびＨＬＡ−ＤＲ ^＋
ＣＤ２５^＋細胞サブセットのさらなる分析により、ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞は古典的に記載されているヒトＴ_ｒｅｇ細胞（Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：１２４５−１２５３；Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：８９５−９０３）、ＣＤ２５^＋ｂｒｉｇｈｔと異なることが示された。前の報告は、これらの細胞をＣＤ２５^＋ｈｉでありそしてＣＴＬＡ−４陽性であると記載している（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９３：１２８５−１２９４）。本明細書に開示されるデータは、ＣＤ４５ＲＡ細胞が異なることを示す。２色ドットプロットにおいて、ＣＤ４５ＲＡ細胞は細胞内ＣＴＬＡ−４陰性（図４）、ＨＬＡＤＲ陰性（図４）であることが示される。ＨＬＡ−ＤＲに対するＣＤ２５の二重染色は、ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞がＣＤ２５^＋ｂｒｉｇｈｔ細胞であることを示し（図４）、そしてそれらは細胞内ＣＴＬＡ−４について二重染色する（図４）。これは、２つの異なる細胞サブセットを示す。

ＨＬＡ−ＤＲ細胞の精製は、ＣＤ４５ＲＡ（−）細胞集団のさらなる陽性選択により行った。これはＣＤ２５^＋細胞の３つのサブセット、ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞、ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞および「二重陰性」を残した。３つのサブセット全てを培養し、そしてサプレッサー機能について試験した。ＣＤ４５ＲＡ^＋由来の細胞系は、最も強力なサプレッサー機能を媒介した。二重陰性細胞は中間レベルの抑制を媒介し、そしてＨＬＡ−ＤＲ^＋は最も悪い抑制活性を媒介した（図５）。

成人ヒトＣＤ４５ＲＡ^＋細胞はＴ細胞増殖を抑制する

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ培養用の応答および刺激細胞
ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻応答Ｔ細胞を健常なボランティアドナー（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の全血由来のバフィコート調製物から単離した。細胞をフィコール−ハイパック上で遠心分離してＰＢＭＣを集めた。ＣＤ４^＋Ｔ細胞を抗ＣＤ４ｍＡｂ被覆磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔ
ｅｃ）で陽性選択により単離する前に、ＰＢＭＣを抗ＣＤ２５ｍＡｂ被覆マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）でＣＤ２５^＋細胞について最初に枯渇させた。細胞は、ＦＡＣＳ分析により通常９６〜９８％純粋であった。磁気ビーズに基づく精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）により、ＰＢＭＣから単離された、ＣＤ１４^＋単球から未熟樹状細胞（ＤＣ）を生成せしめ（Ｓａｌｌｕｓｔｏ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８）、そしてＸ−ｖｉｖｏ−１５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）培地においてＧＭ−ＣＳＦ（最終５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（最終２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補足して百万個の細胞／ｍｌで培養した。ＭＬＲにおいてスティムレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）として使用する前に細胞を５〜１０日間培養した。ある実験では、ＤＣをＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、もしくはＴＮＦ−アルファ（最終２０ｎｇ／ｍｌ）およびポリＩ：Ｃ、トル様受容体（ＴＬＲ）−３アゴニストリガンド（最終２０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）で２日間成熟させた（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０３：１１５８−１１６５；Ｃｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９：８２１−８２９）。ＤＣ刺激細胞に３０Ｇｙで放射線照射した。

ＭＬＲアッセイ培養
５ｘ１０^４の応答ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞および５ｘ１０^３のＤＣ刺激抗原提示細胞（ＡＰＣ）を９６ウェルＵ底プレートにおいてウェル当たり培養した。培養したサプレッサーもしくは通常のＴ細胞系を標準アッセイではウェル当たり２．５ｘ１０^４で、もしくは滴定実験では段階的な数において加えた。抗体ブロッキング実験では、１０^４もしくは５ｘ１０^３のサプレッサー細胞を用いた。培地は、１０％のＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０であった。ウェルを３、５、６および７日目に培養の最後１６時間にわたって^３Ｈ−チミジンでパルス標識した。各時間点は、６つの反復実験を有した。結果は分当たりのカウントにおいて表した。データを直接ベータカウンター（液体シンチレーションなし）で集め、従って、結果の大きさはより低いが比例的に正確であった。

サイトカイン分析
ＭＬＲ培養上清を細胞なしに回転させ、そしてアリコートを−８０℃で凍結させた。再刺激には、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１：１のビーズ：細胞比で用いた。上清をラテックスビーズに基づく多検体システム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でルミネックスアッセイシステムにより評価した。

ＣＤ４５ＲＡ ^＋ 由来の細胞系により媒介される抑制の効能
抑制効能をさらに評価するために滴定実験を実施した。標準的なＤＣ刺激ＭＬＲ培養物に加えるサプレッサーの数を下げることにより、臍帯血由来のサプレッサーのほぼ完全な抑制活性は１：１６もしくは１：３２（５０，０００の応答細胞に対してわずか１５００のサプレッサー）の比率まで（ｏｕｔ ｔｏ）維持されることが示された。これは、選択された最も強力な成人由来の細胞系（ＣＤ２５^＋ｌｉｎｅａｇｅ⁻）よりわずかに強力である（〜２倍）。

効能のさらなる評価として、ＤＣ刺激細胞が成熟しているＭＬＲにおいてサプレッサー細胞系を評価した。リポ多糖（ＬＰＳ）、（ＴＬＲ４リガンド）、もしくはＴＮＦ／ポリＩＣ（二本鎖ＲＮＡアナログ−ＴＬＲ３リガンド）の組み合わせでのＤＣの活性化／成熟は、抑制の回避をもたらさなかった。さらに、ＭＬＲ培養にＬＰＳもしくはＴＮＦ／ポリＩＣを含むこともまた、抑制を回避しなかった。従って、ＣＤ４５ＲＡ^＋由来のＴ_ｒｅｇ細胞は強力で且つ活性化されたＤＣであり、それらは共刺激分子およびサイトカインを豊富に発現する。さらに、ＤＣおよび発現される共刺激分子は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞の抑制効果を回避することができなかった。

ＣＤ４５ＲＡ ^＋ 由来のサプレッサー細胞はＭＬＲにおけるサイトカイン生産を損なう
ＭＬＲアッセイにおける応答Ｔ細胞へのサプレッサー細胞系の効果を決定するために、培養上清を複数のサイトカインの存在および量について評価した。ＭＬＲアッセイへのサプレッサー細胞添加は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０を包含する、Ｔ細胞活性化依存性サイトカインの蓄積を顕著に減少した。活性化依存性サイトカイン蓄積は、抑制されたＭＬＲの間の全ての時間点で最小であった。これらのデータは、Ｔ細胞活性化の顕著な機能障害を示す。

サプレッサー細胞系の再活性化は最小のサイトカイン生産を誘導する
通常のＴ細胞系に対する抑制細胞系の機能的能力を決定するために、再刺激後のサイトカイン生産および細胞表面分子発現のそれらの能力を評価した。細胞系を強力な再活性化のために抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激し、そしてルミネックスビーズに基づくアッセイによるサイトカイン含有量の分析用に特定の時間点で上清を採取した。ＣＤ４５ＲＡ^＋由来の細胞系はＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−１０を本質的に生産せず、一方、コントロールのＣＤ２５⁻由来の細胞系は高レベルのこれらのサイトカインを生産した。ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５、ならびにケモカインＩＬ−８の蓄積もまた、コントロール細胞系と比較した場合に著しく減少された。

ＣＤ４５ＲＡ^＋表現型を有するヒト臍帯血の単離および培養
臍帯血免疫学および移植におけるＴ_ｒｅｇ細胞の重要な役割は、一般に理解されていない（Ｂａｒｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，４８：３５−４３）。多数の研究者は、免疫学的特性化の目的のために真にナイーブのＴ細胞の代表的なモデルとして全ＣＤ４^＋選択臍帯血集団を使用する（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｌｏｏｄ １０２：４６０８−４６１７）。しかしながら、本明細書に開示されるデータに照らしてみると、いくつかの前の研究はＣＤ２５枯渇ＣＤ４^＋細胞で再評価される必要があり得る（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２：１２１３−１２２２）。これらの細胞は、臍帯血移植（ＣＢＴ）において経験されるＧＶＨＤの低い割合への寄与因子であり得る（Ｗａｄｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ．Ｍａｒｒｏｗ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，８：６３７−６４７）。

ＣＤ２５ ^＋ およびＣＤ２５ ⁻ ＣＤ４ ^＋ Ｔ細胞のＭＡＣＳ精製
ＣＤ２５^＋およびＣＤ２５⁻ＣＤ４^＋Ｔ細胞を臍帯血（Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ，Ｓａｉｎｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ）から単離した。臍帯血単核細胞を製造業者の使用法に従ってフィコール−ハイパック上で遠心分離により調製した。磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ
Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）でのＣＤ３４^＋枯渇後に、直接結合した抗ＣＤ２５磁気マイクロビーズ（１０^７の細胞当たり４マイクロリットル；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での陽性選択によりＣＤ２５^＋細胞を単離した。次に、細胞を第二の磁気カラムにかけ、洗浄し、そして再溶出した。二重カラム方法の後に、細胞はＦＡＣＳ分析により通常＞９０％純粋であった（ＣＤ４／ＣＤ２５について）。次に、抗ＣＤ４ｍＡｂ被覆マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）での陽性選択によるＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞の単離の前に、あらゆる残留するＣＤ２５^＋細胞を枯渇させるために非ＣＤ２５画分を別の磁気カラムにかけた。成人ＣＤ２５^＋細胞のストリンジェントな精製は、抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣおよび抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（１０^７の細胞当たり２マイクロリットル）、ならびに２サイクルにわたる磁気カラム上の通過および溶出を使用した。この後に磁気ビーズを遊離させ、そして続いてＧｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）に記載のとおり抗ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９およびＣＤ５６直接結合マイクロビーズで系統枯渇させた（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋＋ｌｉｎ⁻）
。

臍帯血Ｔ _ｒｅｇ 細胞の培養
単離されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞もしくはコントロールＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞を３：１のビーズ：細胞比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ｍＡｂ被覆ダイナビーズ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから入手し、そしてＬｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．，７：４３７−４４８に記載される）とＧｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）に記載のとおり培養した。細胞は、２４ウェルプレートにおいて百万個の総細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−２を５０ＩＵ／ｍｌ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）で３日目に加えた。前の研究とは対照的に、全ての系を支持細胞なしに培養した。臍帯血培養物では、放射線照射した支持細胞（ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞）（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）の添加は増殖にもサプレッサー機能の維持にも役立たず、従って、培養プロトコルを簡素化するために支持細胞を省いた。細胞培養物は、急増殖期の間３日ごとに約１：３、必要に応じて分割した。培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）、ならびにＬ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）であった。

臍帯血はＣＤ４ ^＋ ＣＤ２５ ^＋ 細胞の異なった集団を含有する
臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）は、ＣＤ２５を共発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含有することが示されている。従って、本発明の結果は、サプレッサー機能およびサプレッサー細胞系生成のこれらの細胞の能力の評価を開示する。ＦＡＣＳ分析を用いてＣＢＭＣはＣＤ２５^＋を共発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の顕著な集団を含有すること、およびこれは細胞の別個の集団であることが確かめられた（図６Ａ）。対照的に、成人血液は、非抑制性ＣＤ２５−ｄｉｍ細胞の大きな集団を包含する、広範囲のレベルのＣＤ２５を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞を含有する（図６Ｂ）。臍帯血ＣＤ４^＋Ｔ細胞の約５％は、ＣＤ２５^＋を明確に発現する（平均５．２％、範囲２．３〜９．５％、ｎ＝２０）（成人末梢血ＣＤ４^＋Ｔ細胞に存在する（ＣＤ４^＋の平均３．８％）よりわずかに高いパーセンテージ）。精製の直接比較のために、ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を同一のＭＡＣＳに基づくプロトコル（直接抗ＣＤ２５に基づく選択）を用いて成人および臍帯血の両方から単離した。臍帯血から精製されたＣＤ２５^＋細胞は、ＣＤ２５^＋ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＭＦＩ３２０ｖｓ１３０）のより収束した集団、およびより少ないＣＤ２５−ｄｉｍもしくはＣＤ２５−陰性細胞を含有した（図６Ｃ）、それぞれ平均９％（範囲５〜２１％、ｎ＝１０）および３％（範囲１〜９％、ｎ＝１０）。比較して、成人血液由来のＣＤ２５^＋細胞はより多くのＣＤ２５−ｄｉｍおよびＣＤ２５−陰性細胞を含有することが見出された（図６Ｄ）、それぞれ平均３０％（範囲２５〜３８％、ｎ＝１０）および１０％（範囲２〜２４％、ｎ＝１０）。

臍帯血ＣＤ２５ ^＋ 細胞はＣＤ４５ＲＡ ^＋ である
臍帯血ＣＤ２５^＋細胞を直接選択により精製した。それらをＣＤ２５およびＣＤ４５ＲＡについて染色した。細胞は主にＣＤ４５ＲＡ^＋である（図７）。

ＭＡＣＳ選択した臍帯血ＣＤ４ ^＋ ＣＤ２５ ^＋ 由来の細胞系は強力なサプレッサー機能を一貫して有する
ＩＬ−２を補足して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８被覆ビーズでストリンジェントに精製された成人由来のＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞を刺激することは、著しい増殖を誘導する。精製された成人もしくは臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞、ならびに比較のための臍帯血ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞から細胞系を生成するためにこの培養戦略を用いた。臍帯血由来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞は培養において容易に増殖した；単一の初期刺激で３週にわたって約１００倍。３〜４週後に細胞系は数を増殖するのを停止し、そしてＩＬ−２において維持され
た。従って、これらの細胞系の増殖曲線は、成人血液由来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞系のものと同様であった。

ＣＤ４５ＲＡ^＋臍帯血細胞はＴ細胞増殖を抑制する

混合リンパ球反応（ＭＬＲ）培養用の応答および刺激細胞
健常なボランティアドナー（Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の全血由来のバフィコート調製物からＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻応答Ｔ細胞を単離した。細胞をフィコール−ハイパック上で遠心分離してＰＢＭＣを集めた。抗ＣＤ４ｍＡｂ被覆磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）での陽性選択によりＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離する前に、ＰＢＭＣを抗ＣＤ２５ｍＡｂ被覆マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）でＣＤ２５^＋細胞について最初に枯渇させた。細胞は、ＦＡＣＳ分析により通常９６〜９８％純粋であった。磁気ビーズに基づく精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ）により、ＰＢＭＣから単離された、ＣＤ１４^＋単球から未熟樹状細胞（ＤＣ）を生成せしめ（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１１０９−１１１８）、そしてＸ−ｖｉｖｏ−１５（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）培地においてＧＭ−ＣＳＦ（最終５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（最終２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を補足して百万個の細胞／ｍｌで培養した。ＭＬＲにおける刺激細胞としての使用の前に細胞を５〜１０日間培養した。ある実験では、ＤＣをＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、もしくはＴＮＦ−アルファ（最終２０ｎｇ／ｍｌ）およびポリＩ：Ｃ、トル様受容体（ＴＬＲ）−３アゴニストリガンド（最終２０μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）で２日間成熟させた（Ｓｐｉｓｅｋ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５０：４１７−４２７；Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０３：１１５８−１１６５）。ＤＣ刺激細胞を３０Ｇｙで放射線照射した。

ＭＬＲアッセイ培養
５ｘ１０^４の応答ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻Ｔ細胞および５ｘ１０^３のＤＣ刺激ＡＰＣを９６ウェルＵ底プレートにおいてウェル当たり培養した。培養したサプレッサーもしくは通常のＴ細胞系を標準アッセイではウェル当たり２．５ｘ１０^４で、もしくは滴定実験では段階的な数において加えた。抗体ブロッキング実験では、１０^４もしくは５ｘ１０^３のサプレッサー細胞を用いた。培地は、１０％のＦＣＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０であった。ウェルを３、５、６および７日目に培養の最後１６時間にわたって^３Ｈ−チミジンでパルス標識した。各時間点は、６つの反復実験を有した。結果は、分当たりのカウントで表された。データを直接ベータカウンター（液体シンチレーションなし）で集め、従って、結果の大きさはより低いが比例的に正確であった。

ＭＬＲアッセイにより決定した場合のＴ _ｒｅｇ 細胞のサプレッサー機能
細胞系のサプレッサー機能を評価するために、ＨＬＡ不適合アロ−ＭＬＲアッセイを機能読み取りとして用いた。ＣＤ４^＋応答およびＤＣ刺激ＭＬＲアッセイは非常に強力であり、そしてドナー間で一貫性があり、従って、抑制の標準的測定として役割を果たした。２〜３週の培養後に全ての細胞系をＭＬＲにおいてサプレッサー活性について最初にスクリーニングし、そしてそれから次の３〜４週にわたってさらに分析した。驚くべきことに、臍帯血ＣＤ２５^＋細胞由来の細胞系は、一貫してそして強力に抑制性であった（図８Ａ）。強力な抑制性細胞系は３０のドナーのうち２９から単離され、ここで、増殖の抑制は典型的に＞９５％であった（図８Ｂ）。成人もしくは臍帯血ＣＤ２５⁻細胞由来のコントロール細胞系は、抑制性ではなかった（図８Ｂ）。成人ＣＤ２５^＋細胞（直接単離された）由来の細胞系は、弱いそして変わりやすい抑制活性を示した（図８Ａおよび８Ｂ）。成
人ドナーのサブセットにおいて顕著な、強力なサプレッサー細胞系を生成するためにストリンジェントなＭＡＣＳに基づく選択が必要とされることが以前に報告された。これらの系（ＣＤ２５^＋＋ｌｉｎｅａｇｅ⁻）により媒介される抑制は図８Ａおよび８Ｂに示され、それは臍帯血由来の細胞系の驚くべき一貫性を示す。

抑制効能をさらに評価するために、滴定実験を行った。標準的なＤＣ刺激ＭＬＲ培養物に加えるサプレッサーの数を減らすことにより、臍帯血由来のサプレッサーのほぼ完全な抑制活性は１：１６もしくは１：３２（５０，０００の応答細胞に対してわずか１５００のサプレッサー）の比率まで維持されることが示された。これは、選択された最も強力な成人由来の細胞系（ｐＣＤ２５^＋ｌｉｎ⁻）よりわずかに強力である（〜２倍）（図２Ｃ）。直接選択された成人ＣＤ２５^＋細胞由来の細胞系は、滴定の際にあまり抑制性ではなかった。

効能のさらなる評価として、ＤＣ刺激細胞が成熟しているＭＬＲにおいてサプレッサー細胞系を評価した。リポ多糖（ＬＰＳ）、（ＴＬＲ４リガンド）、もしくはＴＮＦ／ポリＩＣ（二本鎖ＲＮＡアナログ−ＴＬＲ３リガンド）（Ｃｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８９；８２１−８２９）の組み合わせでのＤＣ活性化／成熟は、抑制を回避しなかった（図２Ｄ）。さらに、ＭＬＲ培養にＬＰＳもしくはＴＮＦ／ポリＩＣを含むことは抑制を回避しなかった。従って、臍帯血由来のＴ_ｒｅｇ細胞は最良の選択された成人由来の細胞系と同じくらい強力であり、そして共刺激分子およびサイトカインを豊富に発現する活性化ＤＣはそれらの抑制効果を回避することができなかった。

臍帯血サプレッサー細胞は、ケモカイン生産への効果はそれほどでなくサイトカイン生産を損なう
ＭＬＲアッセイにおける応答Ｔ細胞へのサプレッサー細胞系の効果を決定するために、上清を複数のサイトカインの存在および量について評価した。ＭＬＲアッセイへのサプレッサー細胞添加は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０を包含する、Ｔ細胞活性化依存性サイトカインの蓄積を顕著に減少した。重要なことには、ＴＧＦ−ベータ−１蓄積のレベルは改変されないようであった。活性化依存性サイトカイン蓄積は、抑制されたＭＬＲの間の全ての時間点で最小であり、コントロールＤＣ−ＭＬＲにおけるピーク検出時での結果を示す（図９Ａ）。これらのデータは、Ｔ細胞活性化の顕著な機能障害を示す。選択されたケモカイン発現への抑制の効果を決定するために、ＭＬＲ上清をＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＭＩＰ−１ａ（ＣＣＬ３）およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、前炎症性ケモカインの発現について評価した。早い時間点で、蓄積への効果は認められなかった（図９Ｂ）。しかしながら、ＭＬＲにおける遅い時間点で、蓄積は約５０〜７５％減少された。従って、ケモカイン生産は抑制によりそれほど影響されないようであり、そしてサプレッサー細胞の効果においてある程度の選択性がある。

ヒトおよびマウスＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の両方の研究は、インビトロ抑制の明らかな作用機序を示していない（Ｓｈｅｖａｃｈ，２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２：３８９−４００）。以前の研究と一致して、臍帯血由来の培養したサプレッサー細胞は機能に細胞接触を必要とし（半透膜を越えて抑制しなかった）、そして細胞毒性ではなかった。ＴＧＦベータはＴ_ｒｅｇに媒介される抑制における主要因子であることが可変的に報告され（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，１４：８５−８９）、そしてｒＬＡＰはサプレッサー機能を損なうことが報告されたので（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：８３４−８４２）、ＴＧＦ−ベータ経路をｒＬＡＰを包含する複数の中和試薬で注意深く評価した。ＴＧＦ−ベータの複数のアンタゴニストは、様々な組み合わせにおいてさえ、抑制に最小限に影響を及ぼすことが見出された。免疫抑制因子ＩＬ−１０もしくはその受容体に対する中和抗体は、抑制への効果を有さなかった。
これは、非常に強い活性化刺激でさえ臍帯血サプレッサー細胞によるＩＬ−１０生産がないことと一致する。従って、現在開示されるインビトロＭＬＲ系において、ＴＧＦ−ベータもＩＬ−１０も抑制の主要メディエーターではないように思われ、そして抑制を媒介する分子は特性化されないままである。

ヒト成人ＣＤ２５ＲＡ^＋Ｔ_ｒｅｇ細胞の特性化

モノクローナル抗体
精製を評価するために、細胞を抗ＣＤ２５−ＰＥ（クローンＭ−Ａ２５１）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、それは抗ＣＤ２５−マイクロビーズによりブロックされない。フローサイトメトリー用の他の抗体には、（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）からの抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ３）；（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）からの抗ＣＤ１５２−ＰＥ（ＢＮＩ３）、抗ＣＤ２７−ＦＩＴＣ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ（Ｄｒｅｇ５６）、抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ（ＦＮ５０）、抗ＣＤ１３４（ＡＣＴ３５）；および（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からの抗ＧＩＴＲ−ＰＥ（Ｉ１０４１６）が含まれた。抑制を阻止するために考案された機能実験において、中和抗体は１０μｇ／ｍｌで使用した。抗体には、抗ＣＴＬＡ４（ＢＮＩ３）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＰＤ１（Ｊ１１６）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からの抗ＯＸ４０（Ｌ１０６）、および（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からの抗ＧＩＴＲ（ＭＡＢ６８９）、抗ＧＩＴＲ−Ｌ（ＭＡＢ６９４１）、抗ＯＸ４０Ｌ（ＭＡＢ１０５４１）、抗ＩＬ１０（ＭＡＢ２１７）、抗ＩＬ−１０受容体−アルファ（ＭＡＢ２７４）、抗ＴＧＦベータ−１、２、３（１Ｄ１１）、抗ＴＧＦベータ−１（ＭＡＢ１８３５）、ポリクローナルニワトリ抗ＴＧＦベータ１／１．２（ＡＦ−１０１−ＮＡ）が含まれた。

培養したサプレッサー細胞はＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータから独立して機能する
培養したサプレッサー細胞系は既知の可溶性免疫抑制性もしくは細胞表面の負の調節タンパク質を介して働くかどうかを決定するために、ＤＣ−ＭＬＲサプレッサーアッセイを中和もしくはブロッキングモノクローナル抗体で処理した。アッセイは、増殖の回復による抑制の取り消しについて評価した。最初に、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲおよびＴＧＦ−ベータ１，２，３に対する抗体を単独でもしくは最小効果を有する様々な組み合わせで試験した。高用量（３０μｇ／ｍｌ）で３つの抗体全てを組み合わせることによってのみ、抑制効果のあまり多くないそしておそらく非特異的な取り消しが見られた。３つの抗体全てで処理した処理コントロール培養物はまた、３つの抗体全てで処理したＴ_ｒｅｇ細胞と同様に、増加した増殖を明白に示した。

フローサイトメトリー
免疫蛍光染色のために、細胞を４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で実行した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン４．５（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）により分析した。細胞内染色は２％パラホルムアルデヒド固定細胞を用いて行い、続いて０．１％サポニン含有バッファーにおいて透過化しそして染色した。

統計データ
全てのエラーバーは、平均より上および下の１つの標準偏差を表す。

ＣＤ４５ＲＡ ^＋ 由来のサプレッサー系の表現型
細胞系をサプレッサー細胞表現型と関連する抗原についてフローサイトメトリーにより
分析した。通常のＴ細胞コントロールとして役割を果たすＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻由来の細胞系と並行してサプレッサー細胞系を培養した。細胞系は、次の３〜５週にわたって比較的安定な表現型および機能を維持した。ＣＤ４５ＲＡ^＋由来のＣＤ２５^＋細胞系は、ＣＤ２５、細胞内ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを包含する複数の抗原の著しく均一な発現を維持する。比較して、ＣＤ４５ＲＡ（−）由来の細胞系は、これらの抗原について不均一であった。

ＣＤ４５ＲＡ^＋由来のＣＤ２５^＋細胞系は、Ｔ_ｒｅｇ表現型に典型的と考えられる発現パターン、細胞表面ＣＤ２５および細胞内ＣＴＬＡ４の高発現を維持した。これは、ＣＤ６９、ＣＤ７１およびＯＸ４０のような他の活性化抗原がベースライン発現に戻っていることにもかかわらず起こる。ＣＤ４５ＲＡ^＋由来のサプレッサー細胞系はまた、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７を両方とも均一に発現する。強力な成人由来のサプレッサー細胞系内で、サプレッサー機能を有する細胞はこの二重陽性サブセット内に存在する（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）。ＣＤ２５⁻由来の細胞系もまたＣＤ２７発現を維持するが、ＣＤ２５^＋由来の細胞系より低いレベルである。このＣＤ２７ｄｉｍ発現パターンはまた、成人由来のＣＤ２５⁻由来の細胞系でも認められた（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）。

ヒト臍帯血由来のＴ_ｒｅｇ細胞の特性化

リアルタイムＰＣＲ
ＴＲ１−試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）もしくはＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて１μｇの各ＲＮＡサンプルからｃＤＮＡを合成した。１０ｎｇを各ｑＰＣＲ反応において使用した。全てのサンプルを二重反復で行った。ＦｏｘＰ３およびサイクロフィリンＡのプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＦｏｘＰ３メッセージレベルは、サイクロフィリンＡにデータを正規化した後に決定した。

ウェスタンブロッティング
Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて製造業者の使用法に従って核抽出物を調製し、そしてレーン当たり７０μｇのタンパク質を載せた。サンプルをＮｕＰａｇｅ １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓミニゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で泳動した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、そしてヤギ抗ＦｏｘＰ３抗体（ＡＢ２４８１）（Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、続いてウサギ抗ヤギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼとインキュベーションした。ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＷｅｓｔＰｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で発色させた。

サイトカイン分析
ＭＬＲ培養上清を細胞なしに回転させ、そしてアリコートを−８０℃で凍結させた。再刺激のために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１：１のビーズ：細胞比で用いるか、もしくは２ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンを用いた。細胞を２４ウェルプレートにおいて百万個の細胞／ｍｌ培地で培養した。上清をラテックスビーズに基づく多検体システム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でルミネックスアッセイシステムにより評価した。

モノクローナル抗体
精製を評価するために、細胞を抗ＣＤ２５−ＰＥ（クローンＭ−Ａ２５１）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、それは抗ＣＤ２５−マイクロビーズによりブロックされない。フローサイトメトリー用の他の抗体には、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ３；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）からの抗ＣＤ１５２−ＰＥ（ＢＮＩ３）、抗ＣＤ２７−ＦＩＴＣ（Ｍ−Ｔ２７１）、抗ＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ（Ｄｒｅｇ５６）、抗ＣＤ６９−ＦＩＴＣ（ＦＮ５０）、抗ＣＤ１３４（ＡＣＴ３５）；および（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）からの抗ＧＩＴＲ−ＰＥ（Ｉ１０４１６）、ビオチニル化抗ＬＡＰ（２７２４０）が含まれた。抑制をブロックするために考案された機能実験において、中和抗体は１０μｇ／ｍｌで使用した。抗体には、抗ＣＴＬＡ４（ＢＮＩ３）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＰＤ１（Ｊ１１６）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、抗ＯＸ４０（Ｌ１０６；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ならびに抗ＧＩＴＲ（ＭＡＢ６８９）、抗ＧＩＴＲ−Ｌ（ＭＡＢ６９４１）、抗ＯＸ４０Ｌ（ＭＡＢ１０５４１）、抗ＩＬ１０（ＭＡＢ２１７）、抗ＩＬ−１０受容体−アルファ（ＭＡＢ２７４）、抗ＴＧＦベータ−１，２，３（１Ｄ１１）、抗ＴＧＦベータ−１（ＭＡＢ１８３５）、ポリクローナルニワトリ抗ＴＧＦベータ１／１．２（ＡＦ−１０１−ＮＡ）、ポリクローナルヤギ抗ＴＧＦベータＲＩＩ（ＡＦ−２４１−ＮＡ）、抗ＬＡＰ（ＭＡＢ２４６）、ポリクローナルヤギ抗ＬＡＰ（ＡＦ−２４６−ＮＡ）、組み換えＬＡＰ（２４６−ＬＰ）および組み換えＴＧＦ−ベータＲＩＩ−Ｉｇ（１００３−ＲＴ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれた。

フローサイトメトリー
免疫蛍光染色のために、細胞を４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で実行した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン４．５（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）により分析した。細胞内染色は２％パラホルムアルデヒド固定細胞を用いて行い、続いて０．１％サポニン含有バッファーにおいて透過化しそして染色した。

臍帯血由来のサプレッサー系の表現型およびＦｏｘＰ３発現
細胞系をサプレッサー細胞表現型と関連する抗原についてフローサイトメトリーにより分析した。通常のＴ細胞コントロールとして役割を果たすＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻由来の細胞系と並行してサプレッサー細胞系を培養した。３週の培養後に細胞系を評価し、その時点でビーズに基づく活性化はほぼ消失しており、そして細胞はより休止した状態に戻っていた。細胞系は、次の３〜５週にわたって比較的安定な表現型および機能を維持した。臍帯血由来のＣＤ２５^＋細胞系は、ＣＤ２５、細胞内ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを包含する複数の抗原の著しく均一な発現を維持する（図１０Ａ）。比較して、最もストリンジェントな精製により生成された、最良の成人由来のサプレッサー細胞系は、これらの抗原についてわずかに不均一であった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。

臍帯血由来のＣＤ２５^＋細胞系は、Ｔ_ｒｅｇ表現型に典型的と考えられる発現パターン、細胞表面ＣＤ２５および細胞内ＣＴＬＡ４の高発現を維持した（図１０Ａ）。これは、ＣＤ６９、ＣＤ７１およびＯＸ４０のような他の活性化抗原がベースライン発現に戻っていることにもかかわらず起こる。臍帯血由来のサプレッサー細胞系はまた、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７を両方とも均一に発現する（図１０Ｂ）。強力な成人由来のサプレッサー細胞系内で、サプレッサー機能を有する細胞はこの二重陽性サブセット内に存在することが以前に示された（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）。ＣＤ２５⁻由来の細胞系もまたＣＤ２７発現を維持するが、ＣＤ２５^＋由来の細胞系より低いレベルである。このＣＤ２７ｄｉｍ発現パターンはまた、成人由来の
ＣＤ２５⁻由来の細胞系でも認められた（Ｇｏｄｆｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４：４５３−４６１）。

転写因子ＦｏｘＰ３の発現は、マウスにおける調節性細胞の最も特異的なマーカーであることが提示されている（Ｒａｍｓｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：７１８−２４）。本明細書に開示される結果は、ＦｏｘＰ３メッセージがＣＤ２５⁻Ｔ細胞および系と比較してＣＤ２５^＋細胞および系において高いレベルで発現されたことを示す。臍帯血からの新鮮単離ＣＤ２５^＋細胞は、ＣＤ４^＋ＣＤ２５⁻細胞もしくは新鮮ＣＤ８^＋Ｔ細胞より約６４倍多いメッセージを含有した（図１１Ａ）。培養したＣＤ２５^＋由来の細胞系は、新鮮単離ＣＤ２５^＋細胞より２〜４倍多いメッセージを含有した。メッセージレベルは単離時にＣＤ２５⁻細胞において低いが、それらは培養時に約２５〜３０倍増加する。これは、培養の前のＣＤ２５ｄｉｍ／陽性細胞の完全な枯渇でさえ起こった（図１１Ａ）。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの３〜６週齢細胞培養物のさらなる再刺激はメッセージ発現を増加せず、むしろ両方のタイプの細胞系においてそれをわずかに減少した。

ｍＲＮＡメッセージレベルでのデータと対照的に、ポリクローナル抗体でのウェスタンブロッティングは、ＦｏｘＰ３タンパク質発現がＣＤ２５^＋由来の細胞系において主に発現されることを明らかにした。メッセージを発現することにもかかわらず、ＣＤ２５⁻由来の細胞系は最小／バックグラウンドレベルのＦｏｘＰ３タンパク質を発現した（図１１Ｂ）。重要なことには、ＣＤ２５^＋細胞系の再刺激はＦｏｘＰ３タンパク質発現を顕著に増加した。ＦｏｘＰ３タンパク質レベルの増加は、メッセージレベルの最小変化（実際の減少）にもかかわらず起こった。ＣＤ２５⁻細胞の再刺激は、ＣＤ２５⁻由来の細胞系においてＦｏｘＰ３タンパク質を依然として誘導しなかった。

本明細書に開示されるデータは、ＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡメッセージおよびタンパク質調節のいくつかの興味深い面を示す。最も重要なことには、ＦｏｘＰ３タンパク質は、ＣＤ２５^＋由来のサプレッサー細胞に比較的特異的であることが見出され、そしてＣＤ２５⁻由来の細胞系に最小限に存在した。また、完全にＣＤ２５を枯渇させたＣＤ４^＋Ｔ細胞由来の系でも、培養物活性化の際にかなりの量のＦｏｘＰ３メッセージ（休止ＣＤ２５⁻細胞に対して約２０〜３０倍多い）を作り得ることも決定された。ＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡとタンパク質発現との間の不一致は、ＦｏｘＰ３メッセージレベルがサプレッサー細胞を必ずしも同定もしくは定量するとは限らないことを示す。さらに、再刺激したＣＤ２５^＋細胞は、減少したメッセージレベルにもかかわらずさらに多くのＦｏｘＰ３タンパク質を発現した。これらの結果は、ＦｏｘＰ３発現が活性化で増大されることを示唆し、そして転写後の機序がＦｏｘＰ３タンパク質発現の調節に寄与し得ることを示唆する。

サプレッサー細胞系の再活性化は最小のサイトカイン生産および増大した表面ＴＧＦ−ベータＬＡＰ発現を誘導する
通常のＴ細胞系に対する抑制性細胞系の機能的能力を決定するために、これらの細胞を再刺激後のサイトカイン生産および細胞表面分子発現のそれらの能力について評価した。細胞系を強力な再活性化のために抗ＣＤ３／Ｄ２８ビーズで再刺激し、そしてルミネックスビーズに基づくアッセイによるサイトカイン含有量の分析のために特定の時間点で上清を採取した。ＣＤ２５^＋由来の細胞系はＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−１０を本質的に生産せず（図１２Ａ）、一方、コントロールのＣＤ２５⁻由来の細胞系は高レベルのこれらのサイトカインを生産した。ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５およびケモカインＩＬ−８の蓄積もまた、コントロール細胞系と比較した場合に著しく減少された（図１２Ａ）。対照的に、ＴＧＦ−ベータ、ならびにケモカインＭＩＰ１ａおよびＲＡＮＴＥＳの蓄積は、異なる細胞系間で著しく異ならなかった。

近位シグナル伝達経路（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ）を迂回することができる、薬理学的薬剤ＰＭＡおよびイオノマイシンでの細胞系の再刺激は、ＣＤ２５^＋およびＣＤ２５⁻由来の細胞系の両方によるほぼ同等レベルのサイトカイン生産をもたらした（図１２Ｂ）。従って、ＣＤ２５^＋由来の細胞系は、多数のサイトカインの正常な生産を不可能にする近位ＴＣＲおよびＣＤ２８シグナル伝達機能障害を有するように思われる。さらに、ＣＤ２５^＋由来の細胞系は免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の生産障害を有し、それはＰＭＡ／イオノマイシン刺激により回復されなかった。これは、ＩＬ−１０の生産がＣＤ２５^＋由来の細胞系により影響される抑制の主要機序ではおそらくないことを示唆する。

臍帯血由来のＣＤ２５^＋細胞系の一般的な活性化が損なわれたかどうかを決定するために、細胞表面活性化抗原の発現をフローサイトメトリー分析により評価した。細胞系を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激し、そして一晩培養後にＣＤ６９、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）およびＧＩＴＲ発現について評価した。３つの抗原は全て、Ｃ２５^＋およびＣＤ２５⁻由来の細胞系の両方の上で再発現された（図１２Ｃ）。ＯＸ４０およびＧＩＴＲの発現は、再活性化されたＣＤ２５⁻細胞系に対してＣＤ２５^＋由来の細胞系上でわずかに増大されるように思われた（ＭｕＨｕｇｈ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３１１−３２３）。重要なことには、ＣＤ２５^＋細胞系の再活性化は、サイトカイン蓄積について示される結果とは対照的に、細胞表面活性化抗原発現分析により決定した場合に、比較的損なわれていなかった。

ＴＧＦベータ前駆体タンパク質、ＴＧＦベータ潜伏関連タンパク質（ＬＡＰ）の細胞表面発現は、Ｔ_ｒｅｇ細胞と関連することが報告されている（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：８３４−８４２）。さらに、このタンパク質の組み換え型は、サプレッサー機能を部分的に中和することが最近報告されている（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：８３４−８４２）。従って、ＣＤ２５^＋およびＣＤ２５⁻由来の細胞系上のＬＡＰの発現を評価した。ＣＤ２５^＋もしくはＣＤ２５⁻系はいずれも３〜６週間の培養後にこのタンパク質を発現せず、しかしながら、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの再刺激後にＣＤ２５^＋由来の細胞系上で細胞表面ＬＡＰの明らかな発現があったが（図１２Ｄ）、ＣＤ２５⁻由来の細胞系ではなかった。ＴＧＦ−ベータの細胞表面発現は、検出可能でなかった。

サプレッサー細胞は、サイトカイン生産の限られた能力を有することが見出された（再刺激時に）。ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０生産の著しい欠如ならびにＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−５およびＩＬ−８を生産する著しく減少した能力が存在した。対照的に、ＣＤ６９、ＯＸ４０およびＧＩＴＲのアップレギュレーションされた発現、ならびにＭＩＰ−１ａおよびＲＡＮＴＥＳの生産により評価されるような活性化は、一般に損なわれていなかった。興味深いことに、サイトカイン生産能力はＰＭＡ／イオノマイシン刺激で回復された。これは、サプレッサー細胞における部分的な近位ＴＣＲシグナル伝達遮断を示唆し、そしてＴＣＲ刺激へのサプレッサー細胞のアネルギー応答特性と一致する。

培養したサプレッサー細胞はＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータおよび複数の共刺激分子から独立した未知の機序により機能する
培養したサプレッサー細胞系は既知の可溶性免疫抑制性もしくは細胞表面の負の調節タンパク質を介して働くかどうかを決定するために、ＤＣ−ＭＬＲサプレッサーアッセイを中和もしくはブロッキングモノクローナル抗体で処理した。アッセイは、増殖の回復による抑制の取り消しについて評価した。最初に、ＩＬ−１０、ＩＬ１０ＲおよびＴＧＦ−ベータ１，２，３に対する抗体を単独でもしくは最小効果を有する様々な組み合わせにおいて試験した。高用量（３０μｇ／ｍｌ）で３つの抗体全てを組み合わせることによっての
み、あまり多くないそしておそらく非特異的な効果が見られた（図１３Ａ）。処理したコントロール培養物もまた、増加した増殖を明らかに示した。負の共刺激シグナル伝達分子ＣＴＬＡ４およびＰＤ１に対する抗体もまた試験し、そしてそれら自体への効果を本質的に有さないことが見出されたが、この場合も同様に組み合わせにおいてのみ抑制へのわずかな効果が認められた（図１３Ｂ）。そのシグナル伝達が休止マウスＴ_ｒｅｇのサプレッサー機能を取り消すかもしくは減少することが報告されている受容体、ＧＩＴＲ（Ｊｉ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：５８２３−５８２７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）（Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：３５８０−３５８９）に対するアゴニスト抗体を試験し、そして培養したサプレッサー細胞への最小効果を有することが見出された。ＯＸ４０に対するアゴニスト抗体は、他のドナーよりあるドナーにおいてサプレッサー機能を損なうように思われた（平均３２％の取り消し、ｎ＝６、範囲１５〜７５％）。しかしながら、ＯＸ４０に対するアゴニスト抗体はまた、抑制の取り消しの大きさとほぼ相関して、コントロールＭＬＲの大きさも増加した（図１３Ｃ）。ＯＸ４０Ｌに対する抗体はＭＬＲを抑制したが（ドナー変動を有する）、抑制の見かけの大きさも増加した（コントロール培養物の９０％に対して、平均９６％の抑制、ｎ＝５、範囲９０〜９８％）（図７Ｃ）。

再活性化し培養したサプレッサー細胞上の特異的な増加した細胞表面ＬＡＰ発現、およびサプレッサー機能へのＴＧＦ−ベータの示唆される重要性のために（Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７２：８３４−８４２；Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．，１４：８５−８９）、ＴＧＦベータ経路の複数のアンタゴニストを評価した。モノクローナルおよびポリクローナルの両方の中和抗体、可溶性受容体、組み換えＬＡＰ、ならびにＬＡＰに対する抗体を全てＭＬＲ系において試験した。単独でもしくは複数の組み合わせにおいて全ての試薬は、培養したＴ_ｒｅｇ細胞系により媒介される抑制を取り消すことができなかった。実験は、抑制の能力を最小化するために、より少ない数のサプレッサー細胞、特に１：１０の応答刺激細胞比で行い、コントロールＭＬＲにおける約５０％の抑制をもたらした。これらの条件下でさえ、最小効果が認められた（図１３Ｄ）。

これらの研究は、成人血液と比較した場合に、臍帯血がＴ_ｒｅｇ単離および培養のための改善された供給源であることを示す。強力な抑制性細胞系は実質的にあらゆるドナーから単離され、そしてこれらの結果は容易な直接ＭＡＣＳに基づく精製で得られた。臍帯血Ｔ_ｒｅｇ細胞系上の抗原発現のフローサイトメトリープロフィールは、驚くほど均一であった。サプレッサー細胞表現型および機能をさらに特性化するためにこの系を用いた。

本明細書に引用するありとあらゆる特許、特許出願および公開の開示は、それらの全部が本明細書に引用することにより本明細書に組み込まれる。

本発明は特定の態様に関連して開示されているが、本発明の真の精神および範囲からそれることなしに当業者によって本発明の他の態様およびバリエーションが考案され得ることは明らかである。添付の請求項は、全てのそのような態様および同等なバリエーションを包含すると解釈されるものとする。

図１Ａ〜１Ｄを含んでなり、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ発現ならびにＣＤ４５ＲＡ^＋およびＣＤ４５ＲＯ^＋細胞の最適な精製のＦＡＣＳ分析を示す一連の画像である。 ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞が最高レベルでさえＣＤ２５を発現しないこと、およびＣＤ２５ ｂｒｉｇｈｔ細胞がＣＤ４５ＲＡを検出可能に発現しないことを示す画像である。 図３Ａおよび３Ｂを含んでなり、混合リンパ球反応により測定した場合のＣＤ４５ＲＡ^＋細胞における強力なサプレッサー活性を示す一連の画像である。 図４Ａ〜４Ｄを含んでなり、ＣＤ４５ＲＡ細胞がＣＴＬＡ−４陰性（図４Ａ）およびＨＬＡ−ＤＲ⁻（図４Ｂ）であることを示す一連の画像である。ＣＤ２５^＋ ｂｒｉｇｈｔ細胞はＨＬＡ−ＤＲ^＋であり（図４Ｃ）、そしてそれらは細胞内ＣＴＬＡ−４について二重染色し、従って、２つの異なる細胞サブセットを表す。 ＣＤ４５ＲＡ^＋細胞（ＲＡ＋）、ＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞（ＤＲ＋）および二重陰性細胞（ＤＮ）のサプレッサー活性を示すグラフである。最も強力なサプレッサー活性はＣＤ４５ＲＡ^＋細胞において、中程度の効能は二重陰性細胞において、そして最も少ない効能はＨＬＡ−ＤＲ^＋細胞において明らかである。 図６Ａ〜６Ｄを含んでなり、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋臍帯血細胞が異なった集団であることを示す一連の画像である。図６は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞（ＣＢＭＣ）および両方の供給源からの精製されたＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを含んでなる。図６は、１０人のドナーおよび１０回の細胞精製実験を代表する。図６Ａは、ＣＤ２５⁻細胞からのＣＤ２５^＋細胞の十分に開いた分離を有する臍帯血におけるＣＤ４^＋およびＣＤ２５^＋細胞の異なった集団を示す。図６Ｂは、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞がＰＢＭＣの１〜２％を構成すること、およびこれらの細胞の多数がＣＤ２５−ｄｉｍ（矢印）であることを示す画像である。図６Ｃは、直接抗ＣＤ２５マイクロビーズにより臍帯血から精製されたＣＤ２５^＋細胞がより純粋な集団であることを示す画像である。図６Ｄは、直接抗ＣＤ２５マイクロビーズにより成人血液から精製されたＣＤ２５^＋細胞を示す画像である。 臍帯血ＣＤ２５^＋細胞がＣＤ４５ＲＡ^＋であることを示し、そして精製されたＣＤ２５^＋臍帯血細胞が主にＣＤ４５ＲＡ^＋であることを示す画像である。 図８Ａ〜８Ｄを含んでなり、培養した臍帯血由来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞が、増殖抑制により測定した場合に混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を著しく抑制することを示す一連の画像である。図８Ａは、１週のＭＬＲにわたる増殖の反応速度曲線を示すグラフである。臍帯血由来の細胞はＭＬＲを本質的に阻止し（●）、ＭＡＣＳにより直接選択された成人細胞系は弱いサプレッサー機能を有し（□）、そしてストリンジェントに選択された成人細胞（ＣＤ２５^＋＋ｌｉｎｅａｇｅ⁻）は中程度の効能を有する（■）。ＣＤ２５⁻細胞は抑制性ではない（^＊）。図８Ａは１０回の実験を代表する。図８Ｂは、直接ＭＡＣＳ成人細胞系（□）もしくはストリンジェントに精製された成人系（ＣＤ２５^＋＋ｌｉｎｅａｇｅ⁻）（■）に対して、臍帯血由来（●）のＭＬＲの６日目での抑制の一貫性を示す散布図である。図８Ｃは、強力な抑制に必要とされる最小数を決定するためにＭＬＲ反応に加える培養したＴ_ｒｅｇ細胞の段階的な数を示すグラフである。ストリンジェントに精製された成人系（ｐＣＤ２５^＋＋ｌｉｎ⁻）（△）の選択された強力なサブセットの１：１６に対して、臍帯血由来のサプレッサー細胞系（●）を用いる場合に１：３２の希釈（おおよそ１，５６０のサプレッサー／５０，０００の反応細胞）までＭＬＲを著しく減じた。２つの系は各々、６つの成人および臍帯血由来のサプレッサー細胞系を代表して示される。図８Ｄは、リポ多糖（ＬＰＳ）もしくはＴＮＦ／ポリＩＣの組み合わせによる、ＭＬＲの前の樹状細胞（ＤＣ）の成熟を示すグラフである。ＭＬＲにこれらの刺激因子を含むことは、抑制を回避することができない。図８Ｄは、３回の実験を代表する。 図９Ａ〜９Ｂを含んでなり、培養したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋細胞が、サイトカインレベルの評価により分析した場合に、ＭＬＲにおけるサイトカイン蓄積を顕著に抑制することを示す一連の画像である。図９Ａは、活性化Ｔ細胞により生産されるサイトカイン、特にＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の蓄積の機能障害が認められることを示すグラフである。ＴＧＦ−ベータ１蓄積の改変は検出可能でない。図９Ａは、２日目のＩＬ−２レベルおよび６日目の他のサイトカインを示す（コントロールＭＬＲ培養物における蓄積のピークのそれぞれの時間）。図９Ｂは、Ｒａｎｔｅｓ、ＩＬ−８およびＭＩＰ−１ａの早い時間点（２日）でのケモカインレベルの最小の改変、および遅い時間点（７日）でのレベルの適度の減少を示すグラフである。図９は、４回のＭＬＲ実験を代表する。 図１０Ａおよび１０Ｂを含んでなり、３〜４週の培養増殖後のＣＤ２５^＋、ＣＤ２５⁻およびＣＤ２５由来の細胞系のフローサイトメトリー比較の代表的プロットを示す画像である。図１０Ａは、ＣＤ２５および細胞内ＣＴＬＡ４発現が臍帯血Ｔ細胞上で高いままであり、成人由来のＴ細胞では発現がより低く、そしてＣＤ２５由来の細胞系では発現がベースラインに大体戻ることを示す画像である。図１０Ｂは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７発現が臍帯血Ｔ細胞系上で、また成人系のサブセット上でも均一に高いままであり、そしてＣＤ２５由来の細胞系上で減少することを示す画像である。図１０は、４週の培養で分析した、各々１０の細胞系を代表する。 図１１Ａおよび１１Ｂを含んでなり、ＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す画像である。図１１Ａは、リアルタイムＰＣＲ分析により評価したＦｏｘＰ３ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。サンプルは、示されるように、新鮮単離細胞（ｆｒｅｓｈ ＣＤ２５）、４週の培養後の細胞系（ＣｘＣＤ２５）および抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの再刺激後２４時間の４週培養した細胞系（Ｒｅｓｔｉｍ ＣＤ２５）である。データは、新鮮単離ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８）に存在するｍＲＮＡレベルへの比較倍数としてプロットする。図１１Ｂは、４週間培養しそして抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで示される時間にわたって再刺激した細胞におけるＦｏｘＰ３タンパク質発現のウェスタンブロット分析の一連の画像である。ヒストンＨ３は、核タンパク質のローディングコントロールとして使用した。図１１は、４回の独立した実験を代表する。 図１２Ａ〜１２Ｄを含んでなり、サプレッサー系の再刺激後４８時間のサイトカイン生産欠損および細胞表面ＬＡＰ発現を示す一連の画像である。図１２Ａは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再活性化した細胞系を示すグラフである。図１２Ｂは、ＰＭＡ／イオノマイシンで再活性化したＣＤ２５⁻およびＣＤ２５^＋細胞を示すグラフである。図１２Ｃは、ＣＤ６９、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）およびＧＩＴＲの発現が損なわれていないことを示す画像である。図１２Ｄは、細胞表面ＬＡＰ発現がＣＤ２５^＋由来の細胞系に特異的であることを示す画像である。休止細胞系は、再刺激の前にこれらの活性化抗原について陰性であった。 図１３Ａ〜１３Ｄを含んでなり、ＣＤ４^＋Ｔ細胞−ＤＣ ＭＬＲの抑制への機能的効果についての複数の中和抗体および融合タンパク質のスクリーニングを示す一連の画像である。図１３Ａは、免疫抑制因子ＩＬ−１０およびＴＧＦベータに対する抗体、ならびに抗ＩＬ１０Ｒ、もしくは３つ全ての組み合わせが、培養したＴ_ｒｅｇ細胞系により媒介される抑制を取り消すことができないことを示すグラフである。図１３Ｂは、負のシグナル伝達分子、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１に対する抗体が抑制を取り消さないことを示すグラフである。図１３Ｃは、ＧＩＴＲもしくはＧＩＴＲ−Ｌに対する抗体からの抑制の欠如を示す画像である。ＯＸ４０に対するアゴニスト抗体は抑制を部分的に取り消し、一方、ＯＸ４０Ｌに対する抗体は抑制を部分的に増大する。図１３Ｄは、複数のＴＧＦ−ベータ中和抗体および可溶性受容体がサプレッサー細胞エフェクター機能を妨げないことを示すグラフである。図１３Ａ〜Ｃは６回の独立した実験を代表し、図１３Ｄは３回の独立した実験を代表する。

Claims (4)

1. Ｔ細胞をＴ_ｒｅｇ細胞と接触させることを含んでなるＴ細胞の増殖の抑制方法であって、該Ｔ_ｒｅｇ細胞が、
   表現型的にＣＤ４５ＲＡ^＋の血液細胞の集団から調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）を単離し、該細胞を培養活性化してＴ_ｒｅｇ細胞の集団を生成せしめ、ここで、該Ｔ_ｒｅｇ細胞は混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を９５％より多いファクターだけ抑制する方法であって、
   ａ）ヒト臍帯血サンプルから単核細胞の集団を単離すること；
   ｂ）単核細胞の該集団を単核細胞−抗体複合体の形成に適する条件下でＣＤ２５に特異的に結合する抗体と接触させること；
   ｃ）単核細胞の該集団から該単核細胞−抗体複合体を実質的に分離し；それによりＣＤ２５^＋細胞の集団を単離すること；
   ｄ）該単離されたＣＤ２５^＋細胞の集団を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズおよびＩＬ−２の存在下で少なくとも３週間増殖および活性化させること；
   ｅ）該増殖されたＣＤ２５^＋細胞の集団をＩＬ−２の存在下で維持すること；
   ｆ）該活性化されたＣＤ２５^＋細胞の集団を実質的に分離し；それによってＣＤ２５、細胞内ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを均一に発現するＴ_ｒｅｇ細胞を生成せしめること
   を含んでなる方法により単離されるＴ_ｒｅｇ細胞である
   Ｔ細胞の増殖の抑制方法。
2. 該Ｔ細胞がＣＤ４ Ｔ細胞である請求項１の方法。
3. 該Ｔ細胞がＣＤ８ Ｔ細胞である請求項１の方法。
4. 表現型的にＣＤ４５ＲＡ^＋の血液細胞の集団から調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ細胞）を単離し、該細胞を培養活性化してＴ_ｒｅｇ細胞の集団を生成せしめ、ここで、該Ｔ_ｒｅｇ細胞は混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を９５％より多いファクターだけ抑制する方法であって、
   ａ）ヒト臍帯血サンプルから単核細胞の集団を単離すること；
   ｂ）単核細胞の該集団を単核細胞−抗体複合体の形成に適する条件下でＣＤ２５に特異的に結合する抗体と接触させること；
   ｃ）単核細胞の該集団から該単核細胞−抗体複合体を実質的に分離し；それによりＣＤ２５^＋細胞の集団を単離すること；
   ｄ）該単離されたＣＤ２５^＋細胞の集団を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズおよびＩＬ−２の存在下で少なくとも３週間増殖および活性化させること；
   ｅ）該増殖されたＣＤ２５^＋細胞の集団をＩＬ−２の存在下で維持すること；
   ｆ）該活性化されたＣＤ２５^＋細胞の集団を実質的に分離し；それによってＣＤ２５、細胞内ＣＴＬＡ４、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを均一に発現するＴ_ｒｅｇ細胞を生成せしめること
   を含んでなる方法により単離されるＴ_ｒｅｇ細胞。

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