JPH06506465A

JPH06506465A - 細胞サブセットの欠落／陽性選択による免疫細胞の免疫療法活性の増強方法

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Publication number: JPH06506465A
Application number: JP4509389A
Authority: JP
Inventors: オコーア，オーギユスト・カルロス; ゲラー，ロビン・リー; バツク，フリツツ・エイチ
Original assignee: リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ミネソタ
Priority date: 1991-04-05
Filing date: 1992-04-06
Publication date: 1994-07-21
Also published as: US5641677A; AU663711B2; EP0578740A4; WO1992017567A1; AU692970B2; EP0578740A1; AU1746692A; AU4208496A; CA2116362A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞サブセットの欠落／陽性選択による免疫細胞の免疫療法活性の増強方法産業上の利用分野本発明は、免疫細胞の免疫療法活性の増強に関する。詳しくは、本発明は、Ｔリンパ球の特定細胞又は特定細胞サブセットの欠落（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）又は陽性選択による抗腫瘍活性の刺激に関末梢血単核リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）は、組換えインターロイキン−１（ＩＬ−２）の存在下、比較的短期間（３〜５日）の培養後、新鮮な腫瘍細胞及び、Ｄａｕｄ　を及びＩ（Ｌ６０の如きナチュラルキラー（ＮＫ）抵抗性標的に対する細胞溶解活性発現をラー細胞現象：インビトロ及びインビボに於ける研究”、　５（６ｈｅ＋＋及び１．　Ｏｐｐ＋ａｈｅｉｍ、　ｅｄ＋、、＾＋１ｄｅｍｉｃ　Ｐ＋ｅ＋＋、　Ｎｏｖ　Ｙｏｒｋ。

７３９ページ（１９８３年）参照。この機能は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性と呼ばれている。

初期の報告は、ＬＡＫ活性を有する細胞の前駆体が抗ＣＤ３結合によって測定されるようなＴ細胞受容体を発現しないことを示唆した。Ｅ、Ａ、Ｇｒｉｎｓ等、　１．　Ｅ！Ｌ　Ｍｅｄ、、１５７．　８８４　（１９ｇ３年）参照。更に最近の報告は、Ｉ　Ｌ−２の存在下短期間の培養（２〜５日）から得られるエフェクター細胞が、ＮＫママ−−ＣＤ１６及び／又はＣＤ５６を発現する細胞のＣＤ３ −集団で＋あることを示している。かかる培養から得たＣＤ３　細胞は、ＮＫ抵抗性標的に対し細胞溶解活性が低い。従って、ＮＫママ−−ＣＤ１６及び／又はＣＤ５６をもつＣＤ３−集団は、ＰＢＬ培養物中のほとんどのＬＡＫ活性の原因となる。即ち、ＣＤ３−細胞は、従来のＮＫエフェクター細胞であると考えらＩ　Ｌ−２及びインターフェロン（ＩＦＮ）に応答した、クローン化細胞毒性リンパ球に於けるＮＫ活性の可逆的誘導が報告されている。Ｃ，Ｇ、Ｂｒｏｏｋｓ、Ｎ＊１ａｒｅ、３０５．　１５５　（１９８３年）参照。

更に、ＩＬ−２との組み合わせで抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）ＯＫＴ３により刺激されたＰＢＬの比較的長期培養（１０〜３０日）を用いた、ＬＡＫ活性を有する大量の細胞の発生が報告されている（ＣＤ３−ＬＡＫ細胞又はＴ −ＡＫ細胞）　。Ａ、　Ｃ，０ｃｈｏｓ等、　Ｉ、ｌｉｍａ＋＋ｏ１．、　１３８．２７２８　（１９８７年）参照。これらの長期Ｉ　Ｌ−２及び０ＫＴ３培養物中のエフェクター細胞には、ＣＤ３−細胞及び、ＣＤ４及びＣＤ８の両者に陰性でありＴ細胞受容体のγδ鎖を発現するＣＤ３＋集団が含まれる。対照的に、ＩＬ−２及び０ＫＴ３の短期（２〜５日）培養物中のエフェクター細胞は、主としてＣＤ３−細胞である。

多数の研究が、古典的に記載されたＣＤ４　又はＣＤ８　Ｔ細胞により非常に僅かなＬＡＫ活性しか仲介されないことを示している。更に、抗ＣＤ３モノクローナル抗体０ＫＴ３の如きリンパ球表面受容体に対する抗体で活性化されＩ　Ｌ− ２の存在下で連続的に培養されるＰＢＬ集団の混合培養物から分離したＣＤ４　又はＣＤ８　細胞は、全集団からの分離後直ちに測定した如く有意なＮＫ活性又はＬＡＫ活性を発現しない。＾。

エフェクタ一対標的の比的３０＝１で、即ち細胞傷害性を調節し得るＴ細胞の数対腫瘍セルライン標的の数の比で、ＣＤ４”又はＣＤ８　サブセットの細胞毒性は、約１５〜２０％以下である。

ＰＢＬが混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）中で刺激を受けた場合、ＣＤ４　細胞は最小限度の細胞毒性であると言われている。

更に、ＣＤ４　集団が他のＴ細胞の非存注下ＭＬＣ中で刺激を受けた場合、それらは、より高い細胞溶解活性を発現する。

ε、Ｌ、Ｒｅ１ａｈｅｔ＋等、Ｐｒｏｅ、）ｈｌｌ、Ａｅｓｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、７６、　４０６１（１９７９年）参照。しかしながら、この細胞毒性は抗原特異性であり、腫瘍障害活性を含まない。

又、近年、ＣＤ８　ＣＤ１１ｂ　細胞もＬＡＫ活性を発現し得ることが示されている。この特定の状況に於いて、ｃＤ８＋Ｔ細胞が、Ｉ　Ｌ−２のみの存在下での培養開始前にＰＢＬ集団から単離された。しかしながら、この方法は、抗ＣＤ３ＭｏＡｂ刺激を含まないが、この方法は、ＣＤ２受容体を介した刺激性シグナルをそれ自体の中で創出することの出来るヒツジ赤血球とＴ細胞との分離を含む。従って、ｃＤ２受容体を発現するＮＫ細胞も活性化することが出来る。ｕ　Ｄ口ｎ＋ｘｎｉ等。

Ｅａｒ、１．　Ｉｎｏｎｏ１．、　１９．　１０３７　（１９８９年）参照。

ＩＬ−２のみの存在下で培養したＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞＋は、細胞溶解機構を発現することを示したが、ＬＡＫ活性は実証されていないし又細胞成長も報告されていない。Ｍ、ｌＳｍ７ｔｂ等、　１．　Ｅ！Ｉｔ、　Ｗｅｄ、　、１７１．　１２６９　（１９９０年）参照。最後に、充実性腫瘍の治療に有効であると考えられる腫瘍浸潤性リンパ球（Ｔ　Ｉ　Ｌ）は、主としてＣＤ８　であることが示された。

細胞毒性、例えばＬＡＫ活性を調節することの出来る細胞の同定は、免疫系の相互作用の理解及び、免疫療法に有効な方法の開発可能性の両者にとって重要である。腫瘍の治療に対する現在のＬＡＫ療法の限界の一つは、ＬＡＫ細胞が、ある場合には、ある種の腫瘍に対するＬＡＫ細胞の接近性（Ｉ　ＣＣを口１ｂｉｌｉｌｙ）を制限する細網内皮系を介して運ばれると考えられることである。例えば、＾　Ａ、　ＭＢｈｓｒ！ｃｈｉ等、　］、ｌａｍｕｎｏ１．．　１４１．　４０３９（１９８８年）参照。一方、Ｔ細胞は、リンパ系を（まなく循環し、はとんどの腫瘍へのより大きな接近性を提供する。

ｒ　ｒ−−２単独又は、Ｉｎ、−２と抗ＣＤ３で刺激された培養液中のほとんどのＮＫ活性及びＬＡＫ活性は、ＣＤ４＋又はＣＤ８　細胞によって仲介されないと考えられるが、要求されるのは、適当な条件下でこれらのＴ細胞が高い細胞毒性、例えば特異的又は非特異的細胞溶解活性を発現できるかどうが測定することである。すなわち、要求されるのは、抗腫瘍治療効能を提供することの出来るＴ細胞中での高い細胞毒性、好ましくは特異的であるなしに関わらない高い細胞溶解機能、例えばＮＫ活性又はＬＡＫ活性の刺激法である。

発明の概要免疫細胞集団の免疫療法活性、例えば細胞毒性をダウンレギュレートせしめることのできる少なくとも１個の細胞サブセットすなわち亜集団を該免疫細胞集団から分離して欠落型免疫細胞集団を形成し、リンパ球表面受容体に対する抗体及び必要に応じてサイトカイン、例えばＩＬ−２の存在下、この欠落型免疫細胞集団を培養することにより、免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法が開発された。

好ましくは、この方法は、残存細胞が免疫機能をより充分に発揮すべく免疫細胞集団から調節機構を低減又は排除する。細胞毒性又は細胞の抗腫瘍活性の尺度によって示される残存免疫細胞集団の免疫療法活性は、少なくとも約１．２倍（ｂｙ　＊　ｆ鳳ｅｌｏ＋　ｏｒ　ｓｔ　１ｃｘｓｌ　ｘｂｏｗｌ　１．２１　、好＊しくは少なくとも約２．０倍増加せしめることが出来る。

欠落型免疫細胞集団は、好ましくはＴＬ−２及び、リンパ球表面受容体に対する抗体の両者が存在する第一培地中で培養する。更に好ましくは、該細胞は、Ｔ　Ｌ−２及び、リンパ球表面受容体に対する抗体の両者の存在下、最初の４８時間だけ培養する。以後、好ましくはリンパ球受容体に対する抗体を追加することなくｒＬ−２の存在下で培養を続ける。或は、欠落型免疫細胞集団を、リンパ球表面受容体に対する抗体によって刺激した後、ＩＬ−２と共に培養することが出来るが、状況によってはＩＬ−２存在下での培養は必要としない。

免疫細胞集団には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージの如き免疫系の一部である全ての免疫細胞が含まれる。

これらの細胞のいずれか又はこれらの細胞の組み合わせを本発明の方法により欠落せしめることが出来、その結果、免疫療法効果、例えば抗腫瘍効果を増大せしめることが出来る。ここで用いた“免疫細胞集団”とは、全面サンプルから得られる如き全体集団、即ち未分離又は非欠落集団であっても良く、好ましくはそうであるが、“免疫細胞集団°は、より大きい集団の免疫療法活性をダウンレギュレートさせる細胞サブセットすなわち亜集団を含有する又は、それ自体免疫療法活性を発現することの出来る全集団の一部であってもよい。

好ましくは、本方法は、ＩＬ−２及び、リンパ球表面受容体に対する抗体を用いた培養開始前のＴ　ＩＪンパ球集団、例えばＰＢＬ集団の欠落を含む。更に好ましくは、分離される細胞は、ＣＤ４　又はＣＤ８＋リンパ球、又はこれら各集団のより特定のサブセットである。増強される細胞毒性又は抗腫瘍活性は、特異的又は非特異的細胞溶解活性であってもよい。好ましくは、非特異的細胞溶解活性、例えばＬＡＫ活性である。

抗腫瘍活性を阻害する特定の細胞サブセットの除去又は欠落の結果として、残存する免疫細胞は、好ましくは、同じ培養物中のＮＫ集団に見られるレベルに通常匹敵する細胞毒性のレベルによって示される増大した免疫療法活性を発現する。

所定の状況下では、培養したＮＫ細胞の細胞毒性活性も、本発明の方法により未培養のＮＫ細胞の活性以上に増加せしめることができる。従って、残存する免疫細胞集団は、好ましくは少なくとも約１．２倍、更に好ましくは約２．０倍の細胞毒性即ち抗腫瘍活性レベルの増加により示される増大した免疫療法活性を発現する。

この増強された免疫療法活性、例えば増加した抗腫瘍活性を実現すべく、欠落型免疫細胞集団の培養処理は、好ましくは少なくとも約２日間に亙り、更に好ましくは少なくとも約１０日間に亙り行う。本発明の特に好ましい実施態様によれば、培養処理は、Ｔ　Ｌ、−２をも含有する第一培地中で培養の初めの４８時間の間に欠落型免疫細胞集団をリンパ球表面受容体に対する抗体で刺激すること；欠落型免疫細胞集団を第一培地から取り出すこと：及びリンパ球表面受容体に対する抗体を更に追加することな（ＩＬ−２を含有する第二培地中で欠落型免疫細胞集団を継代培養することを包含する。リンパ球表面受容体に対する抗体は、好ましくは抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ、即ち、０ＫＴ３の如き抗原受容体複合体ＣＤ３に対する抗体である。

更に、培養免疫細胞集団を形成する免疫細胞集団を最初に培養すること：免疫療法活性例えば細胞毒性を発現することの出来る細胞サブセットすなわち亜集団を分離、即ち陽性選択すること；及びＩ　Ｌ−２の存在下第二培地中で分離細胞を別個に培養即ち継代培養すること、による免疫細胞の細胞毒性を増強する方法を開発した。

好ましくは、この方法を用い細胞並集団を陽性選択することにより、細胞毒性によって示される如きこの亜集団の免疫療法活性は、少なくとも約１．２倍、好ましくは少なくとも約２．０倍増加せしめることができる。好ましくは、分離する細胞は、ＣＤ４　又はＣＤ８　リンパ球又は、これらの各集団のサブセットである。

免疫細胞並集団のこの増強された免疫療法活性、例えば増加した抗腫瘍活性を実現すべく、初めの培養処理は、好ましくは、ＩＬ−２及び、リンパ球表面受容体に対する抗体を用い、ＣＤ３−ＬＡＫ細胞又はＴ活性化キラー細胞（Ｔ　−Ａ　Ｋ）と呼ばれる物質を産生ずる。未分離又は非欠落、即ち全体の免疫細胞集団の初期培養処理は、好ましくは少なくとも約３日間、更に好ましくは少な（とも約５日間に亙り行う。或は、初期培養処理は、リンパ球表面受容体に対する抗体による刺激を行い、しかる後Ｉ　Ｌ−２と共に培養することを包含し得るが、状況によってはＩ　Ｌ−２存在下での培養は必要としない。以後の各細胞サブセットのＩＬ−２を用いた継代培養処理は、好ましくは少なくとも約３日間、更に好ましくは少なくとも約１ｏ日間に互って行う。これらの結果を図１−５に示す。

図面の簡単な説明図１は、抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３で刺激されＩ　Ｌ−２と共に連続的に培養された、ＣＤ８＋欠落ＰＢＬ集団、ＣＤ４　欠落ＰＢＬ集団及び未分離のＰＢＬのＬＡＫ活性（細胞毒性％）を示す。

図２は、（ａ）抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３で刺激されＩ　Ｌ−２と共に連続的に培養された、ＣＤ４　欠落ＰＢＬ集団；　（ｂ）培養したＣＤ４＋欠落ＰＢＬから分離したＣＤ８＋＋細胞；及び（ｃ）培養したＣＤ４　欠落ＰＢＬから分離した残存ＣＤ４−　ＣＤ８−細胞集団のＬＡＫ活性（細胞毒性％）を示す。

図３は、（ａ）抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３で刺激されＩＬ−２と共に連続的に培養された、ＣＤ８４欠落ＰＢＬ集団：　（ｂ）培養したＣＤ８　欠落ＰＢＬから分離したＣＤ４”細胞；及び（Ｃ）培養したＣＤ８　欠落ＰＢＬから分離した残存ＣＤ４”　ＣＤ８−細胞集団のＬＡＫ活性（細胞毒性％）を示す。

＠４は、（ａ）抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３で刺激されＩＬ−２と共に連続的に培養された、非欠落、即ち未分離又は全体のＰＢＬ集団；　（ｂ）培養した非欠落型ＰＢＬから分離したＣＤ４　細胞；　（Ｃ）培養した非欠落型ＰＢＬから分離したＣＤ８　細胞；　（ｄ）培養したＣＤ８　欠落ＰＢＬ集団から分離したＣＤ４　細胞；及び（ｅ）培養したＣＤ４　欠落ＰＢＬ集団から分離したＣＤ８　細胞のＬＡＫ活性（細胞毒性％）を示す。

図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ、培養（ＯＫＴ３＋ＩＬ−２）した非欠落型ＰＢＬ集団から分離した後、ＩＬ−２のみと共に培養したＣＤ４　及びＣＤ８　細胞のＬＡＫ活性（細胞毒性％）を示す。５日間の非欠落型ＰＢＬの培養後即ち“細胞分別の日（ｄｘｔ　ｏｆ　＋ｏｒｌｌ”後、及び各細胞サブセットのＩ　Ｌ−２中での培養の１０日１及び１３日１にこのデータが得られた。

発明の詳細な説明本明細書で用いた如く、ＬＡＫ活性は、腫瘍細胞を溶解し且つ正常細胞を低度に溶解するリンパ球の能力として定義される。

リンパ球に於けるこの活性は、典型的にはＩ　Ｌ−２の如きリンホカインによって刺激される。本明細書の実施例に於いてＬＡＫ活性は、ヒトＮＫ抵抗性腫瘍標的ＨＬ８０を溶解する能力を指す。ＮＫ活性は、先の刺激に由来しない、腫瘍細胞は溶解するが正常細胞は溶解しない能力として定義される。本明細書の実施例に於いて、ＮＫ活性はヒト腫瘍系に５６２を溶解する能力を指す。両者の腫瘍系を用い同様の結果が得られたことから、ＨＢＯ２を用いたＬＡＫの結果のみを示す。

本明細書中で用いた“免疫細胞集団”とは、全血から得られる如き全体集団即ち未分離又は非欠落集団であっても良く、好ましくはそうであるが、”免疫細胞集団“は、より大きい集団の免疫療法活性をダウンレギュレートさせる細胞サブセットすなわち亜集団を含有するか又は、それ自体免疫療法活性を発現することの出来る全体集団の一部であってもよい。免疫細胞集団には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージの如き免疫系の一部である全ての免疫細胞が含まれる。これらの細胞のいずれか又はこれらの細胞の組み合わせを本発明の方法により欠落せしめることが出来、その結果、免疫療法効果、例えば抗膿瘍効果を増大せしめることが出来る。免疫細胞集団は、肺臓組織、末梢血、腫瘍組織、リンパ節組織、脳を髄液、膨水、腹水等を含む多数の異なる組織又は体液から得ることが出来る。

本明細書中で用いた“欠落型免疫ｍ胞集団（ｄｅｐＩｅｌｅｄ　ｉｉａ＋ａＤｅｃ！ｌｌ　ｐｏｐｏｌｇｔｉｏｎｌ”とは、全集団の免疫療法活性をダウンレギュレートせしめる少なくとも１個の細胞サブセットすなわち亜集団を含有する全血サンプルから誘導され、該サブセットすなわち亜集団を該サンプルから除去した全細胞集団を指す。しかしながら或は、°欠落型免疫細胞集団”は、細胞型の更なる除去により増大した免疫療法活性を示すことのできる亜集団すなわちサブセット自体であっても良い。

本明細書中で用いた“培養”とは、細胞の寿命を維持する栄養素及び成長因子Ｉ　Ｌ−２の如き他の添加物から成る組織培養培地中に細胞を置く処理を指す。この処理は、任意の容器又は装置中で行うことが出来る。この処理は、種々の段階の培養及び継代培養を含む。典型的には、細胞を初期培養して拡大せしめる、即ち大きさと数を増加せしめる。しかる後これらの拡大した細胞を計数し、更なる培養及び拡大用にグループ又は継代培養に分ける。これらの各継代培養から得た拡大ｍ胞を、更なる培養及び拡大用に更なる継代培養に分ける。各培養又は継代培養工程は、典型的には各培養に用いた新鮮な組織培養培地を用い約４８時間続ける。

本明細書中で用いた“免疫療法°とは、免疫細胞の種々の免疫応答の任意のものを指す。これには、細胞毒性効果又は抗腫瘍効果が含まれる。本明細書中で用いた“細胞毒性”及び“抗腫瘍活性”とは、互換出来る意味で用いており、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞及びナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞の特異的細胞溶解活性及び非特異的細胞溶解活性が含まれる。一般に本発明の方法は、好ましくは、免疫細胞、好ましくは１９２８球の細胞毒性即ち抗腫瘍活性の増強に関する。

細胞並集団の欠落全免疫細胞集団から免疫細胞集団の免疫療法活性をダウンレギュレートせしめる（即ち、エフェクター細胞が免疫療法機構、例えば細胞溶解機構を発現しないように防止する）ことの出来る、ＣＤ４　又はＣＤ８　細胞の如き細胞サブセットすなわち亜集団、又はこれらの細胞集団のいずれかの特定サブセットの内少なくとも１つを欠落させると、結果的に、増加した細胞毒性により示される増強された免疫療法活性の発現が生じる。特に、全免疫細胞集団から、全免疫細胞集団の抗腫瘍活性を阻害するＴリンパ球亜集団を欠落させると、その結果、残存する“ 欠落型”免疫細胞中で高水準のＬＡＫ活性が発現する。

この効果は、インターロイキン−２（ＴＬ−２）及び、リンパ球表面受容体に対する抗体の存在下の、欠落型免疫細胞集団の培養に応答して起こる。好ましくは、これは、ＩＬ−２の存在下での、リンパ球表面受容体に対する抗体を用いた初期刺激及び、連続培養又は継代培養に応答して起こる。即ち、細胞を、好ましくは、ＩＬ−２及びリンパ球表面受容体抗体を含む最初の組織培養培地中で培養する。しかる後、ＩＬ−２は含むがリンパ球表面受容体に対する抗体を追加しない二回目の組織培養培地中でこの細胞を培養又は継代培養する。又、Ｉ　Ｌ−２の存在下、更なる培養又は継代培養も行うことが出来る。或は、細胞をリンパ球表面受容体に対する抗体で刺激した後、必要に応じてＩＬ−２と共に培養することも出来る。

リンパ球表面受容体に対する抗体は、最初の４８時間経過後継代培養のいずれにも加えないのが好ましいが、ＩＬ−２は含むがリンパ球表面受容体に対する抗体を含まない二回目の組織培養培地の添加前に最初の培養から得た培養細胞を洗浄しない場合、後の各継代培養物中にこれが存在しても良い。しかしながら、免疫細胞が、培養工程全体を通していずれの時点でも又いずれの期間でもＩ　Ｌ−２及びリンパ球表面受容体に対する抗体の両者の存在下にあるような免疫細胞培養プロトコールはいずれも本発明の範囲に入る。更に、細胞を組織培養培地中で抗体のみで刺激し更なるＩＬ−２培養をしないプロトコールも本発明の範囲に入る。

本発明に於いて、細胞は、好ましくは、ＩＬ−２と共に少なくとも約２日間、更に好ましくは少なくとも約１０日間培養する。ｒＬ−２の存在下、継代培養をおよそ４８時間毎に行いながら３０日間の長期に亙って培養した細胞から同様の結果が得られた。前述の如く、細胞は、好ましくは、最初の４８時間の培養の間にリンパ球表面受容体に対する抗体で刺激する。抗体を用いた、ＩＬ−２を用いた又は用いない細胞の刺激は、短時間の３０分間、−晩、好ましくは２〜４日間であってもよい。

リンパ球表面受容体に対する抗体は、表面抗原受容体複合体に対する種々のモノクローナル抗体のいずれであってもよい。用いることの出来る抗体としては、抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）等が挙げられる。本発明に於いて用いる抗体は、好ましくは抗体ＣＤ３モノクローナル抗体である。抗体は、単独で又は他の抗体との種々の組合わせで用いることが出来る。

例えば、抗ＣＤ３は、効果的な結果を得るために抗ＣＤ２、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ２８、又は抗ＣＤ　１．１　ｂとの組合わせで用いることが出来る。抗Ｃ，Ｄ　３又は抗ＣＤ２は、培養物中で個々に抗体として用いることが出来る。

抗ＣＤ３　ＭｏＡｂは、０ＫＴ３、ｗＴ３２、Ｌｅｕ−４，５ＰＶ−Ｔ３ｃ。

ＲＩＶ９．６４．１等であってもよいがこれらに限定されるものではない。更に好ましくは、抗ＣＤ３　ＭｏＡｂは、オーツ（Ｏｉｈｏ１社（ジョンソン＆ジタンソン社の一部門）から入手可能である０ＫＴ３である。

インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、市販のＴ縮約成長因子である。これは、天然に存在するＩ　Ｌ−２であってもよいし、又は組換えＩＬ−２であってもよい。リンホカインを含む他のサイトカインも、リンホカイン活性化細胞を供給するために本発明に用いることが出来ると考えられる。これらとしてはＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−４、Ｉ　Ｌ−６、ＴＮＦＳＧＭ−Ｃ９Ｆ、インターフェロン等が挙げられる。これらは、培養培地中で単独で、順次に、又はＩＬ−２と組み合わせて用いることが出来ると考えられる。

免疫細胞、好ましくは１９２８球、更に好ましくは末梢血単核リンパ球は、任意の方法により特定のＴ細胞サブセットの欠落が可能である。好ましくは、ＰＢＬは、磁気ビーズを用いた陰性欠落（ｎｅＨ＋ｉｔｅ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により特定サブセットを欠落させられる。典型的には、これは、全ＰＢＬ集団から除去されるべきであるＴ細胞用のリンパ球表面受容体に対する抗体を用いてＰＢＬの標識を行うことを含む。しかる後、この標識及び未標識の細胞の混合物を、ヤギ抗マウスＩｇＧで被覆した磁気ビーズと混合する。ビーズと標識Ｔ細胞との複合体、即ち、リンパ球表面受容体に対する抗体と複合化した細胞を形成する。しかる後、ビーズ／標識Ｔ細胞複合体を磁気分離器を用いて混合物から分離する。

このようにして、特定のＴ細胞サブセット又はその一部を、ＰＢＬ混合物から除去することが出来る。

除去した特定の免疫細胞サブセットは、全免疫細胞集団の免疫療法活性、好ましくは細胞溶解活性をダウンレギュレートさせる任意のものであってよい。その例としては、ＣＤ４　又は、その任意のサブセット例えば２Ｈ４又は４Ｂ４　；　ＣＤ８　又はその任意のサブセット；　Ｎ　Ｋ　Ｈ胞又はその任意のサブセット：マクロファージ：Ｂ細胞等を挙げることができる。除去した免疫細胞サブセットは、好ましくはＴ細胞サブセットであり、更に好ましくはＣＤ４　又はＣＤ８　細胞である。

一般的に、ヒト全血サンプル由来の典型的ＰＢＬサンプルは、約２０〜３０％のＣＤ８＋細胞及び約３０〜５０９６０）ＣＤ４”細胞を含有する。本発明による免疫細胞集団の免疫療法的活性、例えば抗腫瘍活性を高めるために、細胞毒性により示される免疫療法活性が残存細胞集団で約１．２倍増加することが観察されるまで、集団の免疫療法活性を阻害又はダウンレギュレートさせる細胞を除去することのみが必要である。本発明による免疫細胞の免疫療法活性を高めるために、好ましくは、欠落型免疫細胞集団内のＣＤ４　又はＣＤ８　細胞の数を、少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約９０％まで減少させる。

しかしながら、最も好ましくは、“実質的に完全に欠落した“免疫細胞集団、例えばＰＢＬ集団は、除去される細胞サブセット約５％未満を含有する。例えば、 “実質的に完全にｃＤ４＋を欠落した免疫細胞集団”は、約５％未滴のＣＤ４＋細胞を含有する。従って、本発明の方法は、残存する“欠落”細胞集団の免疫療法活性、例えば抗腫瘍活性を高めるために、ＰＢＬからの、ＣＤ４　又はＣＤ８　細胞の好ましくは少なくとも約７５％、更に好ましくは少なくとも約９０％の分離を含む。

免疫細胞集団の増加した免疫療法活性は、放射性標識した腫瘍標的を破壊する免疫細胞の能力の尺度である％細胞毒性によりインビトロで測定される。即ち、抗腫瘍活性は、エフェクター／標的の組み合わせから組織培養培地中に放出される放射能のレベルと、標的のみから放出される培養培地中の放射能のレベルとの比較によって決定される。従って、本明細書で定義した如く、免疫細胞の増加した免疫療法活性は、ヒト腫瘍細胞のエフェクター細胞の％細胞毒性の増加により典型的に示される。

ヒト腫瘍細胞系は、白血病細胞及び新鮮な腫瘍標的を含む種々の市販の任意の細胞系であってよい。

本発明の特定の実施態様によれば、増加した抗腫瘍活性は、％細胞毒性レベルが少なくとも約１．２倍の増加によって示される。好ましくは、抗腫瘍活性は、％細胞毒性が少なくとも約２．０倍の増加によって示される。

図１から分かるように、ＣＤ４　欠落又はＣＤ８　欠落のいずれかの培養物の細胞毒性活性量は、エフェクタ一対標的の比にかかわらず、未分離ＰＢＬ、即ち全ＰＢＬ又は非欠落型ＰＢＬのそれより高い。ＬＡＫ活性は、培養の１０８から３０日の間のいくつかの時点で測定され、いずれの測定日でも同様の分析結果が得られた。ＣＤ４　欠落及びＣＤ８＋欠落集団を用いた短期間、即ち、約３日から５日の培養で同様の結果が得られた。更に短期間の培養に於いても同様の結果が得られると考えられる。

これらの観察結果はいくつかの観点から説明することが出来る。例えば、増加したＬＡＫ活性は、既にＬＡＫ活性を調節することが示されているＣＤ３−　ＣＤ１６　及び／又はＣＤ５６　ＮＫ１１胞、又１ｔＣＤ３　ＣＤ４−　ＣＤ８−　（ｙδ）Ｔ細胞に相対的に富む結果である可能性が有る。しかしながら、増加したＬＡＫ及びＮＫ活性は、好ましくは、欠落型培養物中に残存する細胞亜集団、即ち、ＣＤ４　又はＣＤ８　Ｔ細胞の活性化の結果であることが決定されている。

これは、（ＣＤ４　欠落培養物中の）抗ＣＤ８　ＭｏＡｂ又は（ＣＤ８　欠落培養物中の）抗ＣＤ４　ＭｏＡｂを用いた欠落型ＰＢＬ集団由来の細胞の標識、及び蛍光活性化細胞選択装置（Ｆ　Ａ　ＣＳ）を用いたそれらの陽性選択により決定される。ＣＤ４　欠落培養物由来の細胞をＣＤ８　及びＣＤ４−ＣＤ８−集団に分離し分別（＋　ｃ　ｒ　＋　ｒ　ｎ　ｇｌ　Ｌ、た直後にＬＡＫ及びＮＫ活性について試験する場合、ＣＤ８　細胞及びＣＤ４−ＣＤ８−細胞は有意のレベルのＬＡＫ及びＮＫ活性を仲介する。

図２に示す如く、ＣＤ４−　ＣＤ８−細胞は、約３０：１の工フェクタ一対標的の比で約６５％の細胞毒性を示す。ＣＤ８＋細胞は、約３０：】のエフェクタ一対標的の比で約４０％の細胞毒性を示す。ＣＤ８　欠落集団を抗ＣＤ４　ＭｏＡｂで標識し、ＣＤ４　及びＣＤ４　ＣＤ８−集団に分別する場合同様の結果が得られる（図３）。両者の型の培養物中のＣＤ４”ＣＤ８”’細胞の更なる表現型測定は、それらが主としてＣＤ１６　１．ｅｕ１９＋又はＣＤ３＋ＣＤ４−　ＣＤ８−であることを示す。

しかしながら、ＰＢＬの非欠落型集団中でＩＬ−２及びリンパ球表面受容体に対する抗体を用いて培養した場合を比較すると、分離したＣＤ４　又はＣＤ８＋細胞は、かかる有為なレベルのＮＫ又はＬＡＫ活性を発現しない。図４に示す結果から分かるように、エフェクタ一対標的比的１０，１で、ＣＤ４＋又はＣＤ８　細胞サブセットの細胞毒性は、約１０〜１５％以下であり、エフェクタ一対標的比的３０＝１で、ＣＤ４　又はＣＤ８　細胞サブセットの細胞毒性は、約１５〜２０％以下である。

Ｔ　Ｌ−２及び抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３を用いた非欠落型ＰＢＬの培養の１０日から３０日の間の種々の時間で図４に示すものと同様の結果が得られた。

ＣＤ４　又はＣＤ８＋細胞＋を陰性欠落により分離したが、陽性ＦＡＣ３選択による分離も可能である。ＣＤ４＋欠落又はＣＤ８　欠落細胞の対照培養物を分別してそれぞれＣＤ８＋又はＣＤ４＋細胞を得た。図４に示す如く、欠落型細胞から得たＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞は、有意のレベルのＬＡＫ活性、即ちエフェクタ一対標的比的３０：１で少なくとも約４０％の細胞毒性活性を発現した。すなわち、＋ＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞は有意のＬＡＫ又はＮＫ活性を示さないが、培養開始前にＰＢＬ集団からこれらのサブセットの一つを欠落せしめたならばＣＤ３−ＬＡＫ培養物から分離した直後に試験した場合ＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞は高いＬＡＫ活性を発現することが出来る。

所定の方法に限定するつもりはないが、これらの結果はＴ細胞亜集団によるＬＡＫ活性の発言がＰＢＬ培養物中で阻害されることを示唆している。この抑制効果は、他のＴ細胞サブセットによるＬＡＫ活性の発現を妨げる、Ｔ細胞或は、マクロファージ又はＢ細胞の如き他の免疫細胞の結果であると考えられる。

更に、一般的に、抑制Ｔ細胞は、全培養期間を通じて存在する場合のみその効果を及ぼすと考えられる。

細胞サブセットの陽性選択ＣＤ３−ＬＡＫ細胞、即ちＴ−ＡＫ細胞から分離した、ＣＤ４　又はＣＤ８　細胞の如き細胞亜集団又は、これらの集団の特定の細胞サブセットは、無視できる程度のＬＡＫ活性を示す。これらのＴ−ＡＫ細胞は、代表的にはＩ　Ｌ−２及びリンパ球表面受容体に対する抗体の存在下約５日間培養する。

しかしながら、ＣＤ４　及びＣＤ８　細胞を引き続いてＩＬ−２のみの存在下で別々に培養する場合、個々の集団は速やかにＬＡＫ活性を発現することが測定されている。

非欠落型ＰＢＬ集団の初期培養処理は、少なくとも約３日間、更に好ましくは少なくとも約５日間に亙って行う。各細胞サブセットのＩ　Ｌ−２を用いた次の培養処理は、好ましくは少なくとも約３日間、更に好ましくは少なくとも約１０日間に亙って行う。次の培養処理は、約３０日間まで行うことが出来る。

ＣＤ４　及びＣＤ８　細胞集団のそれぞれの次の培養は、好ましくは約１０〜１０００単位／ｍ１ｌＬ−２、更に好ましくは約１００〜１０００単位／’ｍ１ｌＬ−２の存在下で行う。

それぞれの細胞サブセットの培養処理の種々の時間にＬＡＫ活性について試験すると、両者の集団は高水準のＮＫ及びＬ　Ａ　Ｋ活性を速やかに発現し維持する。

特定の免疫細胞、好ましくはＴリンパ球は、免疫細胞好ましくはＰＢＬの未分離集団即ち全集団から任意の方法により分離することが出来る。好ましくは、特定の細胞亜集団は、蛍光標識モノクローナル抗体を用いた陽性選択により全集団から分離される。典型的には、これは、培養した免疫細胞集団にフルオレセインインチオシアネート結合ＭｏＡｂ又はフィコエリトリン結合ＭｏＡｂを添加し、４ ℃で３０分間結合物と共に細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、及び蛍光活性化細胞選択装置を用いて標識細胞を分別又は選択することを含む。ＣＤ８＋細胞の陽性選択にモノクローナル抗体０ＫＴ８を用いることが出来、ＣＤ４　細胞の陽性選択にモノクローナル抗体０ＫＴ４を用いることが出来る。この両者は、オーツ社（ジタンソン＆ジョンソン社の一部門）から入手可能である。

図５から分かるように、ＣＤ４　及びＣＤ８　細胞サブセットの両者は、ｒＬ− ２を用いた培養の１００日目増加した抗腫瘍活性を示す。示してはいないが、増加した抗腫瘍活性は、Ｉ　Ｌ−２を用いた培養のわずか３日目にも見られる。従って、この方法を用いて、ＣＤ４　及びＣＤ８　Ｔ細胞の両者は、高水準のＬＡＫ活性を発現することが出来る。

これに限定されるものではないが、欠落及び陽性選択実験の結果は、いったん分離したら効果的に廃止される、ＣＤ４　細胞とＣＤ８　細胞間の進行中の調節相互作用と阻害とが関連していること、並びに、阻害は初期の活性化過程に於ける事象に起因するものではないことを示唆している。即ち、ＰＢＬ培養物からいったん分離したら、ＣＤ４　又はＣＤ８　Ｔ細胞のいずれかが、速やかにＬＡＫ活性を獲得することが出来るという知見は、未分離集団中のこれらの細胞によるＬＡＫ活性の不発現が、不可逆作用の結果ではないことを示唆している。むしろ、阻害は、等価（＋ｅｃｉｐ＋ｏｅ＊ｌｌＴ細胞サブセットによる継続した相互作用を必要とする。この仮説の検証を意図した混合実験は、サプレッサー効果の維持には、代謝的に活性な生存Ｔ細胞サブセットの継続した相互作用が必要であることを示す。

阻害は、直接的細胞接触又は可溶性因子を通じて調節することが出来る。調節網は、機能抑制のために両者のＴ細胞サブせットが存在する必要がをると記載されている［Ｎ、　Ｋ、Ｄｘ＋ｏｌＰ等。

１、Ｅｘｐ、　Ｍｅｊ、、１５８．　１５９　（１９８３年）コ。これらのデータは、未分離、即ち全又は非欠落ＰＢＬ集団中のＣＤ４　又はＣＤ８＋Ｔ細胞によるＬＡＫ活性の発現を妨げる阻害シグナルがあることを示唆している。即ち、Ｔ細胞自体により仲介されると考えられるＰＢＬ集団中のＴ細胞機能の負の調節である。

インターロイキン−４（ＩＬ−４）及びトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）を含む、Ｔ細胞によるＬＡＫ活性の発現調節に関連する可能性のあるいくつかの可溶性因子がある。当然のことながら、両者のＴ細胞サブセットが同じ因子によって調節される必要はない。

Ｉ　Ｌ−４は、成長及びＬＡＫ細胞によるエフェクター機能の発現の両者を阻害することが示されてきたが、これらの効果は、主にＴ細胞よりもむしろＮ　Ｋ細胞にあると考えられる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって生産され、これはＣＤ８＋細胞内でＬ　Ａ、　Ｋ活性の発現調節の役割を果たすことが出来ることを示唆しているが、これは、なんら限定されるものではない。Ｄ、Ｂ参照。

又、ＴＧＦ−βも、ＮＫ及びＬ　Ａ　Ｋ活性の両者を阻害するこる場合には、ＩＬ−２及びＴＧＦ−βの水準間の釣合に基づく培養処理開始時点でのＣＤ４　欠落又はＣＤ８　欠落集団のいずれかにヒトＴＧＦ−β、（ＴＧＦ−β）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ＭＮから入手可能）を添加すると、欠落型集団の細胞溶解機能の阻害が起こる。特に、培養開始時点及び各継代培養段階での０．１〜３Ｑｎｇ／’ｍ＋の範囲の濃度のＴＧＦ−一βの添加は、Ｔ細胞の細胞溶解活性、即ちＬＡＫ活性の添加量に依存した減少を示す。この効果は、培養培地からのＴＧＦ−−βの除去時には可逆的である。

ＴＧＦ−βは、一定の培養条件−ドでＣＤ４＋及びＣＤ８　細胞の両者により産生される。両者のＴ細胞サブセットがＴＧＦ−βを産生ずるとずれば、ＣＤ４　及びＣＤ８　細胞の両者が存在する場合のみ、産生されるＴＧＦ−βのレベルが高レベルのＩＬ−２の存在下で抑制効果を有する水準点に達することは可能である。いずれかのＴ細胞サブセットの欠落後、ＴＧＦ−βのレベルが非常に低くてＴ細胞に及ぼす抑制効果を発揮できないと考えられるが、これにより、いかようにも限定されるものではない。

＋ＣＤ４　又はＣＤ８＋細胞のいずれかは、適当な条件下でＬＡＫ活性を発現出来ること及び、ＬＡＫ活性の発生は等価Ｔ細胞サブセットの存在により調節されるという観察結果は、養子免疫療法用プロトコールのために密接な関係をもつ。例えば、一定の条件下では、Ｔ細胞によって仲介されるＴ、　Ａ　Ｋ活性を有することが好ましい。従って、本発明は、将来の臨床試験に於いてＬＡＫ活性を有するＴ細胞を含めた可能性を開く。かかる細胞は、通常のプロトコールで観察されたよりも相補的又は異なる抗腫瘍効果を達成することが出来るだろう。

以下に本発明の特定且つ好ましい実施態様を実施例により具体的に説明する。本発明の範囲は、これらの実施例により如何ようにも制限されるものではない。本発明の思想及び範囲に入る種々の変形及び変更が本発明に含まれることは言うまでもな実施例１（１９６８年）（これらは、参照により本明細書に含めるものとする）の方法により、Ｆｉｅｏｌｌ−ＪｐＢｑｕｅ上での遠心によりヘパリン添加静脈血（ヒト全血）から末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を分離した。分離した単核細胞を燐酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、　ｐ　Ｈ７，４）（ＧＩＢＣＯ研究所、グランドアイランド、ＮＹ）で３回洗浄し計数した。ＣＤ４　及びＣＤ８＋に富む培養物を、磁気ビーズ（バクスターへルスケア社、ディアフィールド、ＩＬより入手、又アドバンストマグネティック社、マサチュウセッツ、又はダイナル社、ノルウェーからも入手可能）を用いた陰性欠落（ｎｅｇｓｔｉマｔ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）により得た。手短に言うと、モノクローナル抗体０ＫＴ４又は０ＫＴ８　（オーツ社、ラリタン、ＮＪ）のいずれかと共に水冷下で３０分間インキュベートすることによりＰ　Ｂ　Ｌを標識した。しかる後、細胞を冷ＰＢＳで三回洗浄し、ビーズ：細胞の比が１０：１のヤギ抗マウス■ｇＧ被覆磁気ビーズ（バクスターヘルスケア社より入手、又ダイナル社、ノルウェーからも入手可能）と混合した。

ビーズ／細胞混合物を５〜６ｒｐｍで回転させながら、４℃で３０分間保温した。保温終了時にビーズ／細胞懸濁液を冷ＰＢＳで２倍に希釈した。磁気分離装置（バクスターヘルスケア社、ディアフィールド、ＩＬ）を用いて５分間、ビーズを試験管の側面に集めた。続いて、未結合の細胞を含有する上澄を集め新しい試験管に移した。この処理をミロ繰り返してビーズ及びビーズに結合した細胞を完全に除去した。懸濁液（ＣＤ４＋欠落又はＣＤ８　欠落ＰＢＬ）中に残存する細胞を洗浄し計数した。これにより、除去されたＴ細胞サブセットによる約５％未満の混雑物を有する欠落型ＰＢＬ集団を得た。残存する細胞は、次の培養中実買的に変化しなかった。

末梢血リンパ球又は欠落型集団（５Ｘ１０’細胞）を１０ｍ１の組織培養培地（ＴＣＭ）を入れた２５ｃｍ２容量のフラスコ（コーニング社、コーニング、ＮＹ）中で培養した。

ＴＣＭ培地は、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ　［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’　−（２−エタンスルホン酸）］、２２ｍのし一グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ社、グランドアイランド、ＮＹから入手可能なペニシリン／ストレプトマイシン混合物）及び５％の熱不活性化ヒトブール血清を追加したローズウェルバーク記念研究所（ＲＰＭＩ）の１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社、グランドアイランド、ＮＹから入手可能）から成る。培養物には、Ｅ、ｃｏｌｉ由来の高度に精製した組換えヒトＴ　Ｌ−２（Ｈｏ　ｆ　ｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ社、Ｎｕ　ｔ　Ｉ　ｅｙ、ＮＪ）１０００単位／ｍｌを補充した。［Ａ。

Ｗｉｎｇ等、５ｃｉｅｎｃｅ、２２４．　１４３１　（１９８４年）；Ｓ、＾　Ｒｏ＋ｅｎｂｅｒｇ等。

５ｃｉｅｎｃｅ、２２３．　１４１２　（１９８４年）参照、これらは参照により本明細書に含めるものとする］。培養物には、Ｌｏｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３　ＭｏＡｂ　０ＫＴ３（ジョンソン＆ジランソン社の一部門であるオーツ社、ラリタン、ＮＪ）を補充した。０ＫＴ３は、初めの４８時間の間培養物中に存在する。

しがる後、０ＫＴ３は、新鮮なＴＣＭ及びＩＬ−２添加の結果希釈される。

培養処理中に更なる０ＫＴ３は添加しなかった。培養物を多湿の５％Ｃ０２雰囲気下３７℃でインキュベートした。初めの４８時間の培養後、細胞を計数し、Ｉ　Ｌ−２含有ＴＣＭ中で０．５Ｘ１０’細胞／ｍｌで継代培養した。次に、細胞を計数シ、Ｔ　Ｌ　−２含有Ｑ：）新鮮ｆ；Ｔ　ＣＭ中テ０．　５　Ｘ　１０　Ｇ細胞／ｍ】の濃度で４８時間毎に継代培養した。

ＰＢＬ、ＣＤ４　欠１ＰＢＬ又は、ＣＤ８　欠１１ｉＰＢＬをそれぞれ、前記の如＜　０ＫＴ３＋　Ｉ　Ｌ−２中で培養した。培養期間の種々の時点で、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣ８）上で細胞を分別した。フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合又はフィコエリトリン（Ｐ　Ｅ）結合ＭｏＡｂ（ＯＫＴ４及び０ＫＴ８（＊−７社）ＴＰＢＬＩＥｆｌを標１また。

ＣＤ４　欠落型集団は０ＫＴ８で標識し、ＣＤ８’欠落集団は、０ＫＴ４で標識した。細胞を４℃で３０分間保温した後、２％牛脂児血清を含有する冷ＰＢＳを用いて三回洗浄した。細胞をＦＡＣ５ＩＶ　（ベクトンディッキンソン社、マウンテンビュー、ＣＡ）上で分別した。分別した細胞を遠心し、そのアリコートを再染色して集団の純度を試験した。ＬＡＫ活性測定に用いるすべての陽性分別された集団は、所望の表面マーカーに対し９７％以上陽性であった。

ＣＭＬアッセイを、Ｓ、−Ｌ、　ｆｅｅ等、　Ｈ＋＋ｓ、ｌａｖ＊ｉｏ１．、　３．　４５（１９８１年）（これは参照により本明細書に含めるものとする）に記載の如く行った。ヒト腫瘍系に５６２　（慢性前随性白血病、＾ｍｅｔｉｃｘｅ　Ｔｉ１ｇ＊ｅ　Ｔ７ｐｅ　Ｃａｌ＋＋＋＋ｌＣｏ１１ｅｅｔｉｏａ　（ＡＴＴＣＣ）　より入手）及び、ＨＬ６０＜前骨随球性白血病（ｐｔｏＨｅＩｏｔｙｌ：ｔ　ｌｅｌｌｋｅｍ目）、ＡＴＴＣＣ）を、１０％牛脂児血清（ＧＩＢＣＯ社、グランドアイランド、ＮＹ）含有ＲＰＭＩ　１６４０中で培養した。細胞は、−週間にミロ新鮮な培地中に０．５Ｘ１０’／ｍｌで継代培養した。

細胞系ＨＬ６０の細胞は、未刺激のＰＢＬにより細胞溶解しなかつたことから、これはＮＫ耐性のためであると考えられる。

ＬＡＫ活性をＮＫ耐性標的ＨＬ６０に対する細胞溶解性として測定した。ＮＫ活性をに５６２標的に対する細胞溶解活性として測定した。

腫瘍細胞系標的を、２５０〜７５０μＣｉのＮ　ａ　５１Ｃｒ　０（５０００μ Ｃｉ　／　ｍ　ｌ　、ニューイングランドヌクレアー社、ボストン、ＭＡ）を用い３７℃で１時間標識した。これらの細胞をミロＴＣＭ中で洗浄し、Ｉ　Ｌ−２を含有しない培養培地中に再懸濁させ、計数し、実施例１で前述した如く培養した、エフェクター細胞、即ち末梢血リンパ球又は欠落型集団を所定の濃度で既に分注した９６−ウェルＶボトムプレート（コスタ−社、ケンブリッジ、ＭＡ）に５００標的（ｔｘｒｇｅｊｓ）／ウェルで分注した。エフェクター・標的の比は、３０・１から１：１の範囲である。プレートを６５ｇで５分間遠心し、３７℃ の５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした後、各ウェルから】、００μｌの培地を２．５ｍｌのシンチレーション液（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ、ニューイングランドヌクレアー社、ボストン、ＭＡ）が入っているシンチレーションバイアル中に回収した。放射能を液体シンチレーシタンカウンター（ＬＫＢ社、データ、フィンランド）上で計数した。

パーセント細胞毒性を次の式により決定した（ｃ　ｐｍ＝　１分当りのカウント）：（ここで、“自然放出平均（ｓｐｏｎ＋ｔｎｅｏａｘ　ｒｅＩｅｔｓｅ　ｒａｅａｎＶは、標的細胞のみから放出される５１Ｃｒの量（バックグラウンド）として定義される；　“最大放出°は、ＴｒｉｊｏｎＸ−１００の如き洗浄剤を用いた細胞溶解後の標的中の全５１Ｃｒである；　“実験平均（ｅｔｐｅｒｉｍｅｎｔ　ＩＩｅａｎ）”は、標的及びエフェクターと共にウェル中に放出される５１Ｃｒである。

全実験結果の代表例を図１〜５に示した。それぞれの図の各データは、同期間の培養、即ち１０日から３０日、同期間のエフェクターと標的との接触、即ち約４時間、後に分析した３個の別々のサンプルの分析結果を示す。

実施例４免疫表現型決定細胞（ＩＸＩＯ）をＨＢＳＳで３回洗浄した後、対応するモノクローナル抗体（オーツ社、ラレトン、ニューシャーシーから入手した０ＫＴ４又は０ＫＴ８）２０μｍと共に４℃でインキュベートした。これを、再度、２％牛脂児血清を含む冷／％ンクスの平衡塩類水溶液（ＨＢＳＳ）でミロ洗浄し、０．２％バラホルムアルデヒド中に再懸濁させた。二種類の発色蛍光測定を５Ｃｏｏｌｌｅ「Ｐｒｏｌｉｌ＋　（Ｃｏｕｌｌｅ＋　Ｃ７ｊｏｍｔｔＢ社、　Ｉ（ｉｉｌｓｉｈ　。

ＦＬ）又はＦＡＣ５ＩＹ　（ベクトンデイツキンソン社、マウンテンビ培養５日目の未分離のＰＢＬ　Ｔ−ＡＫ培養物から分離したＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞を、それぞれオートローガス培養０日のＣＤ４　欠落又はＣＤ８　欠落集団に１：１の比で加えた。

培養物のいくつかは、放射線照射した細胞と混合した。４日後に細胞溶解機能を％細胞毒性として試験した。以下に表１に示した結果は、放射線照射した死滅細胞の添加は細胞溶解活性の発現を妨げないことを示した。しかしながら、非放射線照射、即ち、代謝的に活性なＣＤ４　又はＣＤ８＋細胞の添加は、それぞれＣＤ４＋欠落又はＣＤ８　欠落集団によるＬＡＫ活性の発現を完全に抑制した。

表１ＰＢＬ培養物由来のＣＤ４　及びＣＤ８　細胞は、ＣＤ４　欠落及びＣＤ８＋欠落培養物による細胞溶解機能の発現を阻害する１ＣＤ４　欠落　３８　２６　１５＋　＋ＣＤ４　欠落＋ＰＢＬ由来のＣＤ４　−４−１１ＣＤ４＋欠落＋放射線照射ＣＤ４＋ｂ４２　２６　ｌｌＣＤ８　欠落　２５　＋４　９＋　＋ＣＤ８　欠落＋ＰＢＬ由来のＣＤＳ　川　２−４ＣＤ８　欠落＋放射線照射ＣＤ８＋ｂ４６　３Ｇ　１５”　０ＫＴ３＋　Ｉ　Ｌ−２で刺激し、５日間培養したＰＢＬから＋ＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞を陽性分別した。この細胞を、＋ＣＤ４　又はＣＤ８　細胞を欠落させたオートローガス培養物にそれぞれ１：１の比で加えた。細胞溶解機能を細胞系ＨＬ６０に対して分析した。

５　分離したＣＤ４　及びＣＤ８＋細胞は、２５００ラドの放＋射線照射を受けた。

種々の特定且つ好ましい実施態様及び技術を参照して本発明を説明してきた。しかしながら、本発明の思想及び範囲内に存する限り種々の変形及び変更が本発明に含まれることは言うまでもない。ここで引用した参考文献の関連部分を嘗照により本明細書に含めるものとする。

呂　８　ｇ　８　。

五傷擁や（べ）呂　ＯｏＯ。

五留→紀（ぺ）４が峰辺（ぺ）＜−Ｄ　Ｏぐ　ｎＮ茎普州東ダ（ぺ）ｏｏｏｏｏ。

唖　？　ｑ　Ｎ　− １！１２２　辺補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１０月５日特許庁長官　麻　生　渡　殿　ｅ町１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０２８７３２、発明の名称　細胞サブセットの欠落／陽性選択による免疫細胞の免疫療法活性の増強方法３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国、ミネソタ・５５４５５、ミネアポリス、サウス嗜イースト、チャーチ・ストリート・１００、モリル・ホール名　称　リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーンティ・オブ・ミネソタ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日　１９９３年６月７日６、添附ｆ類の目録請求の範囲１．免疫細胞の免疫療法活性の増強方法であって、（ａ）除去される細胞亜集団が免疫細胞集団の免疫療法活性をダウンレギュレートすることの出来る免疫細胞集団から少な（とも１つの細胞亜集団を分離して、欠落型免疫細胞集団を形成し、（ｂ）リンパ球表面受容体に対する抗体の存在下及び必要に応じてＩ　Ｌ−２の存在下で４８時間未滴該欠落型免疫細胞集団を培養して、刺激された欠落型免疫細胞集団を得、ここで該刺激された欠落型免疫細胞集団が、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示す、工程を含むことを特徴とする前記方法。

２、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４１Ｊツバ球を分離して、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１に記載の方法。

３、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団がＣＤ８　９７８球を含む、請求項２に記載の方法。

４、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ８　リンパ球を分＋離して、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１に記載の方法。

÷ ５、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団がＣＤ４＋リンパ球を含む、請求項４に記載の方法。

６、細胞分離工程が、少な（とも約７５％の細胞亜集団を免疫細胞から分離することを含む、請求項１に記載の方法。

７、リンパ球表面受容体に対する抗体が抗ＣＤ３モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。

８、免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）免疫細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離して、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団を形成し、（ｂ）抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下及び必要に応じてＩ　Ｌ−２の存在下で４８時間未満該ＣＤ４＋欠落免疫細胞集団を培養して、刺激されたＣＤ４　欠落免疫細胞集団を得、ここで該刺激されたＣＤ４　欠落免疫細胞集団が、同様に処理された非欠落型細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示工程を含むことを特徴とする前記方法。

９、免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）免疫細胞集団からＣＤ８　リンパ球を分離して、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団を形成し、（ｂ）抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下及び必要に応じてＩ　Ｌ−２の存在下で４８時間未満該ＣＤ８　欠落免疫細胞集団を培養して、刺激されたＣＤ８　欠落免疫細胞集団を得、ここで該刺激されたＣＤ８　欠落免疫細胞集団が、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示す工程を含むことを特徴とする前記方法。

１０、免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）除去される細胞亜集団が免疫細胞集団の免疫療法活性をダウンレギュレートすることの出来る免疫細胞集団から少なくとも１つの細胞亜集団を分離して、欠落型免疫細胞集団を形成し、（ｂ）ＩＪリンパ球表面受容体対する抗体の存在下で４８時間未満該欠落型免疫細胞集団を培養して、刺激された欠落型免疫細胞集団を得、ここで該刺激された欠落型免疫細胞集団が、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示す工程を含むことを特徴とする前記方法。

１１、リンパ球表面受容体に対する抗体が抗ＣＤ３モノクローナル抗体から成る、請求項１０に記載の方法。

１２、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離して、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１０に記載の方法。

１３、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団がＣＤ８＋リンパ球を含む、請求項１２に記載の方法。

１４、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ８＋リンパ球を分離して、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１０に記載方法。

１５、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団がＣＤ４＋ｌＪンパ球を含む、請求項１４に記載の方法。

１６、免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、＜ａ＞抗ＣＤ３モノクローナル抗体存在下で４８時間未満免疫細胞集団を培養して、刺激された欠落型免疫細胞集団を得、（ｂ）培養した欠落型免疫細胞集団からＣＤ４＋又はＣＤ８＋りンバ球のいずれかを分離し、（ｃ）抗ＣＤ３モノクローナル抗体含有第二培地中で該＋ＣＤ４　又はＣＤ８＋リンパ球のいずれかを継代培養し、ここ＋で該ＣＤ４　又はＣＤ８＋リンパ球のいずれかが、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示す工程を含むことを特徴とする前記方法。

１７、ＣＤ４＋リンパ球が、工程（ｂ）で分離され、工程（ｃ）で継代培養され、及び増大した免疫療法活性を示す、請求項１６に記載の方法。

１８．０Ｄ８＋リンパ球が、工程（ｂ）で分離され、工程（ｅ）で継代培養され、及び増大した免疫療法活性を示す、請求項１６に記載の方法。

１９、欠落型免疫細胞集団を培養して、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を有する刺激された欠落型免疫細胞集団を得る方法であって、本質的に（ａ）除去される細胞並集団が免疫細胞集団の免疫療法活性をダウンレギュレートすることの出来る免疫細胞集団から少なくとも１つの細胞並集団を分離して、欠落型免疫細胞集団を形成し、（ｂ）リンパ球表面受容体に対する抗体の存在下及び必要に応じてＩ　Ｌ−２の存在下で該欠落型免疫細胞集団を４８時間未満培養して、刺激された欠落型免疫細胞集団を得る工程からなることを特徴とする前記方法。

＋２０、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４　リンパ球を分離して、ＣＤ４＋欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１９に記載の方法。

２１、ＣＤ４＋欠落免疫細胞集団がＣＤ８＋リンパ球を含む、請求項２０に記載の方法。

２２、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ８＋リンパ球を分離して、ＣＤ８＋欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１９に記載の方法。

２３、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団がＣＤ４＋リンパ球を含む、＋請求項２２に記載の方法。

２４、細胞分離工程が、少な（とも約７５％の細胞並集団を免疫細胞から分離することを含む、請求項１９に記載の方法。

２５、欠落型免疫細胞集団を培養して、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を有する刺激された欠落型免疫細胞集団を得る方法であって、本質的に（ａ）除去される細胞並集団が免疫細胞集団の免疫療法活性をダウンレギュレートすることの出来る免疫細胞集団から少なくとも１つの細胞並集団を分離して、欠落型免疫細胞集団を形成し、（ｂ）ＩＪリンパ球表面受容体対する抗体の存在下で該欠落型免疫細胞集団を４８時間未滴培養して、刺激された欠落型免疫細胞集団を得る工程からなることを特徴とする前記方法。

２６、リンパ球表面受容体に対する抗体が抗ＣＤ３モノクローナル抗体から成る、請求項２５に記載の方法。

２７、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離して、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項２５に記載の方法。

２８、ＣＤ４　欠落免疫細胞集団がＣＤ８＋ｌＪンバ球を含む、請求項２７に記載の方法。

２９、細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ８＋リンパ球を分離して、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団を形成することを含む、請求項２５に記載の方法。

３０、ＣＤ８　欠落免疫細胞集団がＣＤ４＋リンパ球を含む、請求項２９に記載の方法。

３１、欠落型免疫細胞集団を培養して、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を有する刺激された欠落型免疫細胞集団を得る方法であって、本質的に（ａ）抗ＣＤ３モノクローナル抗体存在下で免疫細胞集団を４８時間未満培養して、刺激された免疫細胞集団を得、（ｂ）該刺激された免疫細胞集団からＣＤ４＋又はｃＤ８＋リンパ球のいずれかを分離し、（Ｃ）抗ＣＤ３モノクローナル抗体含有第二培地中でＣＤ４　又はＣＤ８　リッパ環のいずれかを継代培養し、ここで該ＣＤ４　又はＣＤ８　リッパ環が、同様に処理された非欠落型免疫細胞集団と比較して増大した免疫療法活性を示す工程からなることを特徴とする前記方法。

３２、ＣＤ４　リッパ環が、工程（ｂ）で分離され、工程（ｃ）で継代培養され、及び増大した免疫療法活性を示す、請求項３１に記載の方法。

３３、ＣＤ８　リッパ環が、工程（ｂ）　で分離サレ、工程（ｃ）で継代培養され、及び増大した免疫療法活性を示す、請求項３１に記載の方法。

フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ（７２）発明者　ゲラ−、ロビン・リーアメリカ合衆国、ミネソタ・５５４３５、エデイナ、ドーソン・レーン・６９２０（７２）発明者　バック、フリツツ・エイチアメリカ合衆国、ミネソタ・５５４１６、ミネアポリス、パーク・レーン・あ

Claims

【特許請求の範囲】

１．免疫細胞の免疫療法活性の増強方法であって、（ａ）除去される細胞亜集団が免疫集団の免疫療法活性をダウンレギュレートすることの出来る免疫細胞集団から、少なくとも１個の細胞亜集団を分離し、（ｂ）その欠落型免疫細胞集団をリンパ球表面受容体に対する抗体の存在下で培養し、ここで、該欠落型免疫細胞集団が少なくとも約１．２倍増加した免疫療法活性を示す工程を含むことを特徴とする前記方法。
２．欠落型免疫細胞集団を、リンパ球表面受容体に対する抗体及びサイトカインの存在下で培養する、請求項１に記載の方法。
３．サイトカインがＩＬ−２である、請求項１に記載の方法。
４．（ａ）細胞分離工程が、Ｔリンパ球の少なくとも１つの細胞亜集団を分離することを含み、（ｂ）欠落型免疫細胞集団を培養する工程が、その欠落型集団が少なくとも約１．２倍増加した細胞毒性により表わされるような増加した免疫療法活性を示すまで、ＩＬ−２とリンパ球表面受容体に対する抗体とを含有する第一培地中で該細胞を培養することを含む、請求項３に記載の方法。
５．細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離してＣＤ４＋欠落型免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．ＣＤ４＋欠落型免疫細胞集団が、増加した細胞毒性を示すＣＤ８＋リンパ球を含む請求項５に記載の方法。
７．細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ８＋リンパ球を分離してＣＤ８＋欠落型免疫細胞集団を形成することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
８．ＣＤ８＋欠落型免疫細胞集団が、増加した細胞毒性を示すＣＤ４＋リンパ球を含む、請求項７に記載の方法。
９．培養工程が、（ａ）初めの４８時間の培養の間、リンパ球表面受容体に対する抗体及びＩＬ− ２を含む第一培地中で欠落型免疫細胞集団を刺激し、（ｂ）第一培地から欠落型免疫細胞集団を取り出し、（ｃ）リンパ球表面受容体に対する抗体の量を追加せずにＩＬ−２を含有する第二培地中でその欠落型免疫細胞集団を継代培養することを含む、請求項４に記載の方法。
１０．細胞分離工程が少なくとも約７５％の細胞亜集団を免疫細胞から分離することを含む、請求項１に記載の方法。
１１．リンパ球表面受容体に対する抗体が、抗ＣＤ３モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
１２．増加した免疫療法活性が、少なくとも約２．０倍増加した細胞毒性によって表わされることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
１３．免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）ＩＬ−２とリンパ球表面受容体に対する抗体との存在下で免疫細胞集団を培養して、培養免疫細胞集団を形成し、（ａ）免疫療法活性を発現することの出来る少なくとも１つの細胞亜集団を、培養免疫細胞集団から分離し、（ｂ）その分離細胞亜集団をＩＬ −２含有第二培地中で継代培養し、ここで、該分離細胞亜集団が少なくとも約１．２倍増加した免疫療法活性を示す工程を含むことを特徴とする前記方法。
１４．（ａ）免疫細胞集団の培養工程が、ＩＬ−２とリンパ球表面受容体に対する抗体との両方を含有する第一培地中で該細胞を培養することを含み、（ｂ）細胞分離工程が、細胞毒性を発現することのできる少なくとも一つのＴリンパ球亜集団を分離することを含み、（ｃ）分離したＴリンパ球亜集団の継代培養工程が、該亜集団が少なくとも約１．２倍増加した細胞毒性により表わされるような増加した免疫療法活性を示すまで、継代培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
１５．細胞分離工程が、免疫細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離して分離ＣＤ４＋リンパ球亜集団を形成することを含む、請求項１４に記載の方法。
１６．細胞分離工程が、免疫細胞からＣＤ８＋リンパ球を分離して分離ＣＤ８＋リンパ球亜集団を形成することを含む、請求項１４に記載の方法。
１７．第一培地中での免疫細胞集団の培養工程が、（ａ）初めの４８時間の培養の間、リンパ球表面受容体に対する抗体及びＩＬ−２を用いて免疫細胞集団を刺激し、（ｂ）第一培地から免疫細胞集団を取り出し、（ｃ）リンパ球表面受容体に対する抗体の量を何ら追加せずにＩＬ−２を含有する第二培地中で免疫細胞集団を継代培養することを含む、請求項１４に記載の方法。
１８．分離したリンパ球亜集団の細胞毒性が少なくとも約２．０増加する、請求項１４に記載の方法。
１９．免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）ＩＬ−２及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下で免疫細胞集団を培養して、Ｔ−ＡＫ細胞集団を形成し、（ｂ）Ｔ−ＡＫ細胞集団からＣＤ４＋リンパ球を分離し、（ｃ）ＩＬ−２含有第二培地中でＣＤ４＋リンパ球を継代培養し、ここで、ＣＤ４＋リンパ球が少なくとも約１．２倍増加した細胞毒性により表わされるような増加した免疫療法活性を示す、工程を含むことを特徴とする前記方法。
２０．免疫細胞の免疫療法活性を増強する方法であって、（ａ）ＩＬ−２及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下で免疫細胞集団を培養して、Ｔ−ＡＫ細胞集団を形成し、（ｂ）Ｔ−ＡＫ細胞集団からＣＤ８＋リンパ球を分離し、（ｃ）ＩＬ−２含有第二培地中でＣＤ８＋リンパ球を継代培養し、ここで、ＣＤ８＋リンパ球が少なくとも約１．２倍増加した細胞毒性により表わされるような増加した免疫療法活性を示す、工程を含むことを特徴とする前記方法。
２１．養子免疫療法に応答する疾病をもつ患者を、刺激された免疫細胞を用いて治療する治療方法において、該免疫細胞の免疫療法活性を請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法によって増強することを改良の特徴とする前記方法。